Transformacin de bacterias

CLONAJE DE GENES EN PLSMIDOS BACTERIANOS: Transformacin de clulas competentes de Escherichia coli. Introduccin Para el clonaje y amplificacin del plsmido recombinante preparado en la prctica anterior es necesario introducirlo en una bacteria. Al proceso de incorporacin de un DNA aislado de forma estable por una bacteria se denomina transformacin. Salvo algunas excepciones, las bacterias son impermeables a la entrada de cidos nucleicos exgenos en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, disponemos de mtodos qumicos y fsicos que facilitan la entrada del DNA en la bacteria. Todos los mtodos qumicos de transformacin que se utilizan actualmente derivan de la observacin de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) segn la cual las bacterias tratadas en fro con una disolucin de CaCl 2, y a continuacin sometidas a un choque trmico a 37C o 42C, se hacen competentes y permiten la entrada del DNA del fago . Este mtodo se extrapol posteriormente a DNA de plsmidos (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Los mtodos actualmente en uso son variaciones del original, encaminadas a optimizar la eficiencia de transformacin de cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de DNA plasmdico. A pesar de las mejoras metodolgicas conseguidas, an desconocemos el mecanismo molecular por el que las clulas se hacen competentes a la entrada de DNA exgeno. Por otra parte, de entre los mtodos fsicos de transformacin de bacterias podemos destacar la electroporacin. Consiste en exponer las clulas de E. coli a una descarga elctrica, que induce la formacin transitoria de poros en las membranas por donde penetran las molculas de DNA. Los plsmidos que estamos usando en estas prcticas de clonaje tienen el gen de resistencia al Cloranfenicol (clo). Este gen codifica una -lactamasa que hidroliza el anillo -lactmico de la ampicilina, inactivndola. La ampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro. Inhibe la sntesis del pptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en clulas en fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plsmidos en este experimento utilizaremos una TOP 10 F, que contiene un episoma de resistencia a la tetraciclina, se pueden seleccionar crecindolas en presencia de Cloranfenicol y Tetraciclina . Obviamente, las bacterias que no han incorporado el plsmido no crecern en este medio de cultivo.

Objetivos Obtencin de clones bacterianos conteniendo el plsmido recombinante resistente a cloranfenicol (pLyss) Materiales Todo el material debe ser estril. E. coli BL21(DE3)pLysS o pLysE (Invitrogen). Estas cepas tienen el lisgeno del fago DE3 que expresa el gen de la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor lacUV5, cuando se induce con IPTG. Los plsmidos pLysS o pLysE

Transformacin de bacterias

expresan constitutivamente niveles bajos de lisozima T7 que inhibe los niveles basales de la RNA polimerasa de T7 y, de este modo, reduce el nivel basal de expresin del gen clonado. Otras caractersticas importantes de estas cepas son la deficiencia en la proteasa dependiente de la ATPasa Lon, que disminuye la degradacin de la protena recombinante expresada en la bacteria, y la ausencia del elemento lacZM15, requerido para el test de complementacin . TOP 10F Placas de Petri con medio LB slido (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15g de bacto agar, y agua destilada hasta 1000 ml). Palillos estriles o asas de siembra. Medio LB lquido (igual que el slido pero sin agar): tubos o matraces de 25 ml con 2 ml; natraces de 100 ml con 25 ml. Pipetas automticas y puntas. Pipetas normales, probetas. Bao termostatizado a 37C. Espectrofotmetro y cubetas. Hielo y recipientes para hielo; tubos Falcon de 50 ml, centrfuga de mesa refrigerada, papel de filtro. 0.1 M CaCl2. DMSO (dimetilsulfxido), hielo seco/etanol (ambos opcional). Tubos eppendorf. ddH2O estril. Plsmido pLysS sin digerir. Bao de agua o bloque trmico a 42C. Placas de Petri con medio LB slido y Cloranfenicol (100 g/ml). Asas de vidrio estriles para extensin de bacterias sobre las placas de Petri. Estufa a 37.

Procedimiento A) Crecimiento de Escherichia coli. 1. La tarde anterior picar una colonia de bacterias BL21 de un placa de Petri reciente y transferirla a 2 ml de medio LB. Incubar en bao con fuerte agitacin a 37C durante toda la noche. 2. A la maana siguiente, inocular 25 ml de medio LB con 0.5 ml del cultivo anterior. Incubar con fuerte agitacin en bao a 37C. Medio de cultivo y bao precalentados a 37C. 3. A los 60-90 min de incubacin, medir la A 550 nm del cultivo. Parar el crecimiento cuando se alcance un valor 0.28-0.32, poniendo el cultivo en hielo. Nota: En las condiciones en las que se est creciendo E. coli, el tiempo de generacin (tiempo en que se duplica el nmero de bacterias y la A 550 nm aumenta al doble) es aproximadamente de 20 min. B) Preparacin de clulas competentes.

Transformacin de bacterias

10

1. Enfriar el cultivo 5-10 min en hielo y transferir a un tubo Falcon estril de 50 ml en fro. 2. Recuperar las bacterias por centrifugacin a 3000 rpm durante 10 min a 4C, utilizando una centrfuga de mesa refrigerada. 3. Decantar el sobrenadante. Dejar el tubo invertido sobre un papel absorbente durante 1 min con objeto de eliminar los restos de medio. 4. Resuspender las bacterias en 5 ml de 0.1 M CaCl2 fro. Mezclar con suavidad, con ayuda de una pipeta, para no lisar las clulas. 5. Despus de unos 20 min en hielo, recuperar las bacterias por centrifugacin a 3000 rpm durante 10 min a 4C, y decantar de nuevo el sobrenadante como antes. 6. Resuspender las bacterias en 0.5 ml de 0.1 M CaCl2 fro y mantener en hielo. 7. En el caso de que las bacterias competentes no se vayan a utilizar inmediatamente para la transformacin se pueden dividir en alcuotas, congelar rpidamente y conservar a 70C siguiendo el protocolo siguiente: Al 1 ml de bacterias aadir 35 l de DMSO y mezclar suavemente, manteniendo la suspensin en hielo durante 15 min. Aadir otros 35 l de DMSO, mezclar y volver a poner en hielo. Enfriar tubos eppendorf en hielo seco/etanol (o nitrgeno lquido) y poner alcuotas de 100-107 l de la suspensin de bacterias con DMSO en cada tubo. Mantener congeladas a 70C. Cuando se necesiten, descongelar el tubo con la mano y mantener en hielo durante 10 min. C) Transformacin de las bacterias. 1. Preparar 5 tubos Eppendorf en hielo para las distintas transformaciones y aadir a cada uno de ellos 100 l de clulas competentes. 2. Aadir a cada tubo los DNAs siguientes: Tubo 1: 1 l de agua destilada (control negativo). Tubo 2: 1 l (10 ng) del vector pRSET no digerido de una disolucin 10 ng/ l en H2O preparada previamente (control positivo). Tubo 3: 1 l (10 ng de vector) de la mezcla de ligacin control sin inserto. Tubo 4: 1 l (10 ng de vector) de la mezcla de ligacin problema con inserto. Tubo 5: 2 l (20 ng de vector) de la mezcla de ligacin problema con inserto. 3. Mantener en hielo durante 30 min. 4. Transferir los tubos a un bao de agua o bloque trmico a 42C e incubar sin agitacin durante 30 segundos. 5. Transferir los tubos al hielo y mantener durante 2 min. D) Crecimiento y seleccin de los transformantes. 1. Aadir a cada tubo 500 l de medio LB e incubar a 37C con agitacin intensa durante 1 hora. Si la incubacin se hace sin agitacin, conviene agitar las clulas suavemente a intervalos de tiempo para resuspenderlas. 2. Plaquear alcuotas de 100 l de cada una de las muestras en placas de Petri conteniendo medio LB slido con ampicilina. Extender la suspensin sobre la superficie de la placa con un asa de vidrio doblada y estril. Dejar secar bien.

Transformacin de bacterias

11

3. Una vez secas, invertir las placas, comprobar que estn debidamente marcadas e incubarlas en estufa a 37C durante toda la noche. 4. Al da siguiente, recoger las placas de la estufa y analizar los resultados. Resultados y Cuestiones 1) Busque las caractersticas de la cepa bacteriana usada en esta prctica e interprtelas en su cuaderno. 2) Por qu se crecen las bacterias en medio LB lquido durante una hora antes de pasarlas al medio slido que contiene ampicilina?.

3) Por qu se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio slido con ampicilina?. 4) Determine la eficiencia de transformacin (nmero de colonias/ g de DNA) utilizando la placa de Petri procedente de la transformacin con pRSET no digerido. 5) Determine el nmero de colonias obtenidas en las placas procedentes de las transformaciones con las mezclas de ligacin control (sin inserto) y problema (con inserto). Analice los resultados obtenidos. 6) El mtodo de seleccin de bacterias conteniendo plsmidos recombinantes basado en la complementacin del fragmento falla en ocasiones, observndose resultados contrarios a lo esperado: colonias azules de bacterias transformadas con el plsmido recombinante y colonias blancas de bacterias transformadas con el plsmido sin inserto. A qu se pueden deber estos resultados?.