Prctica 8: DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA CASENA. OBJETIVO: 1. Aplicar una tcnica semi-cuantitativa para determinar el pI de la casena.

1. FUNDAMENTO TERICO La casena representa el 80% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida. La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca.

En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico).

Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Todas las protenas presentan una carga neta que depende de su secuencia primaria y que vara dependiendo del pH al cual se encuentra la molcula. Todas las protenas tienen un pH caracterstico en el cual presentan una carga neta de cero, este pH es conocido como el pI (punto isoelctrico) y es una de las propiedades de estas molculas que es de gran utilidad tanto en la industria como en la investigacin cuando se pretende utilizar o estudiar alguna protena en particular. En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin.

3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO. CONSULTAS PREVIAS.

1. Observe el siguiente oligopptido: Ala-Pr-Gly-His-His-Trp-Asn-Asp-Asn-Val-Glu, cul es su carga neta a pH 7? Explique:_____________________________ _____________________________________________________________________

2. Qu es el isoelectroenfoque? En qu consisteSe basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aqullas que se encuentran en medios con pH ms altos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo. La migracin las conducir a una regin donde el pH coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH

4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Mtodo 1: Aislamiento de la casena: (Este aislamiento lo realizan los monitores) Procedimiento. 1. Caliente a 380C 900 mL de leche. 2. Adicione cido actico 2M gota a gota y con agitacin constante, hasta que observe que se forma un precipitado. 3. Deje sedimentar, decante y filtre sobre papel de filtro rpido al vaco. 4. Lave el precipitado con 20mL de etanol en el mismo filtro 5. Seque el precipitado colocando varias toallas de papel absorbente. Desechar sobrenadante.

Mtodo 2: Preparacin de la Casena. Procedimiento. 1. Coloque 250 mg del extracto obtenido en el procedimiento anterior (casena) en un beaker de 50 mL, agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N; agite hasta lograr una solucin total de la casena. 2. Una vez disuelta la casena, adicione 5 mL de cido actico 1N

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Mtodo 3: pI de la Casena. Procedimiento. 1. En once tubos de ensayo, limpios y secos adicione exactamente los volmenes de los reactivos segn la siguiente tabla:

Reactivos

T 1 0, 5 9, 5 -

T 2 1

T 3 1, 5 8, 5 -

T 4 2

T 5 3

T 6 4

T 7 6

T 8 8

T 9 6

T1 0 8

BLAN CO 5

Acetato 0,1N(mL) cido actico 0,1N(mL) cido actico 0,01N(mL) pH terico resultante pH medido Absorbancia

3, 2

3, 6

3, 8

4, 2

4, 5

4, 7

5, 1

5, 5

6, 1

2. Confirme el valor de pH resultante de cada tubo con el pHmetro. 3. Luego agregue a cada tubo 1mL de la solucin de casena. 4. Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. 5. Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm (tener en cuenta agitar la suspensin antes de pasarla a la cubeta) y anotar.

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