Validacin de un mtodo para la determinacin de patulina en jugos y purs de frutas por HPLC Eyda Otero Fernndez-Trevejo,1 Jos Antonio

Arias Verds2 y Ramn Sersa Espinosa3

Resumen Se valid el mtodo de la Association of Official Analytical Chemist (AOAC) para la determinacin de patulina en jugo de manzana por cromatografa lquida de alta presin (HPLC) con detector ultravioleta a 275 nm y una columna RP18, para jugo de manzana y pur de frutas. Se emple como fase mvil una mezcla al 10 % acetonitrilo-agua con una velocidad de flujo de 2,7 mL/min. La patulina present un tiempo de retencin de 14,8 0,3 min. La ecuacin de regresin fue Y = 1952,5X + 1673,5 y el coeficiente de correlacin lineal de 0,9991. Se obtuvo un recobrado medio del 82,51 % y un coeficiente de variacin del 3,33 % para los niveles de contaminacin ensayados. La repetibilidad de una muestra contaminada con 33 g/L de patulina fue de 3,12 g/L. Se estableci para los jugos el lmite de deteccin en 1,72 g/L y el de cuantificacin en 5,2 g/L. Los purs de frutas fueron previamente diluidos y centrifugados, proponindose para el mango una purificacin adicional por columna. Fue diseado un control de calidad interno para el procesamiento de las muestras. DeCS: PATULINA; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION; ANALISIS DE REGRESIN.

La patulina es una micotoxina producida como metabolito secundario por un gran nmero de hongos de los gneros Penicillium y Aspergillus, entre los que se encuentra incluido el P. expansum. Se le confiere alta toxicidad para clulas de plantas y animales. Presenta carcter hepatotxico, nefrotxico e inmunotxico. Aunque su carcinogenicidad no ha sido demostrada, los expertos proponen continuar los estudios en animales de experimentacin en especies de no roedores. La patulina puede detectarse en frutas, hortalizas, cereales enmohecidos y piensos, no obstante, no puede excluirse la presencia de esta micotoxina en las frutas aparentemente sanas. El grado de contaminacin est relacionado con el grado de podredumbre y la patulina apenas se extiende fuera de los tejidos alterados; por consiguiente, la exposicin humana no es posible sino a partir de frutas elaboradas.1,2

Estudios realizados en diferentes pases indican una moderada a alta incidencia de patulina, particularmente en productos de manzana, aunque los niveles de contaminacin son generalmente bajos. Ocasionalmente, altas concentraciones de patulina se han encontrado, alcanzando 1 000 mg/L o ms. Varios pases han establecido un lmite regulatorio de 50 mg/L, valor que recomienda la Organizacin Mundial de la Salud. Varios mtodos analticos han sido publicados entre los que se encuentran la cromatografa de capa delgada3-5 con revelado de color, la cromatografa de gases con agentes derivatizantes y ms recientemente la cromatografa lquida de alta presin (HPLC) con detector UV o arreglo de diodo.6,7 El objetivo de este trabajo fue establecer y validar un mtodo de anlisis de patulina en jugos y compotas de manzanas por HPLC con deteccin ultravioleta. Mtodos Se realiz la validacin del mtodo oficial de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para la determinacin de patulina en jugo de manzana por HPLC,6 segn los principios del Codex. Este mtodo es aplicado para la deteccin y cuantificacin de patulina en jugo de manzana y fue extrapolado a otras matrices como pur de peras y mango. La patulina fue extrada con acetato de etilo y purificada por particin en una solucin de carbonato de sodio. La muestra extrada se sec con sulfato de sodio anhidro. Despus de evaporar el acetato de etilo, la patulina se redisolvi en 300 mL de fase mvil (10 % acetonitrilo-agua). Para laidentificacin y cuantificacin se inyectaron 20 mL de extracto en un cromatgrafo lquido de alta presin Knauer, con una bomba isocrtica de doble pistn acoplado a un detector Shidmazu UVvisible modelo SPD-6AV y un integrador Shidmazu modelo C R6A Chromatopac. Se emple una columna cromatogrfica de 25 cm x 4 mm, rellena con Spherisol C18 de 100 A y 5 mg de tamao de partcula. La columna se almacen con el 80 % de acetonitrilo agua bidestilada. Se trabaj con el flujo de la fase mvil en 2,7 mL/min. Se estableci la longitud de onda del detector UV a 275 nm y la sensibilidad a 0,04 unidades de absorbancia en la escala completa. Para verificar la linealidad de la respuesta del detector UV con respecto a la concentracin de patulina, se construy una curva de calibracin con 4 puntos por triplicado a partir de una solucin intermedia de 8,26 mg/mL en frascos volumtricos de 10 mL con las concentraciones siguientes: 0,248; 0,496; 1,24 y 2,478 mg/mL. La determinacin de la concentracin del patrn de patulina para la construccin de la curva fue realizada segn procedimiento de la AOAC. 8

Para ensayar el mtodo se emplearon muestras de 1 kg de jugo de manzana y de pur de mango, las cuales son representativas de otras frutas como pera, melocotn y fruta bomba en cuanto a las interferencias presentes. Las muestras se dividieron en 5 por ciones, una porcin fue utilizada como blanco muestra y las restantes fueron contaminadas con 33; 103,16; 51, 63 y 21,16 mg/L. La primera porcin contaminada se utiliz para los estudios de repetibilidad y el resto para conocer la exactitud del mtodo. Cada porcin de ensayo fue subdividida en muestras de 5 mL cada una. Se estableci el lmite de deteccin como la cantidad que equivale a 3 veces la desviacin causada por el ruido de fondo de una muestra de jugo de manzana sin contaminar y el de cuantificacin como 3 veces el lmite de deteccin del mtodo y se implant un sistema de control interno de la calidad.
Los resultados fueron sometidos a tratamientos estadsticos. Se realiz una prueba de Student para determinar los lmites superiores e inferiores de la pendiente de la curva de calibracin, y una prueba de Duncan con un nivel de significacin del 5 %, para determinar si existan diferencias significativas entre los valores de recobrado obtenidos para los 3 niveles de contaminacin empleados en los estudios de exactitud