Prctica 1 Principios bsicos de laboratorio, uso de pipetas y clculos de utilidad en Bioqumica

Objetivo: que el estudiante se familiarice con la metodologa, equipo y forma de trabajo dentro del curso de laboratorio de Bioqumica.

Fundamento 1. Algunos conceptos bsicos utilizados en la bioqumica experimental

En el ao de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de Pesas y Medidas con sede en Pars, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de informacin cuantificable y universalizar su uso. El SI es bsicamente una versin ampliada del sistema mtrico decimal y consta de siete unidades bsicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes fsicas. En el Cuadro 1 se describen estas unidades, adems de los smbolos que se deben utilizar cuando se hace mencin a stas. Cuadro 1. Unidades bsicas del SI Magnitud fsica Longitud Masa Tiempo Corriente elctrica Temperatura Intensidad luminosa Cantidad de sustancia Nombre de la unidad Smbolo metro kilogramo segundo amperio kelvin candela mol m kg s A K cd mol

Dos o ms unidades bsicas pueden ser combinadas mediante multiplicacin o divisin para generar unidades SI derivadas. Algunas de estas unidades poseen nombres particulares en honor a cientficos que contribuyeron al conocimiento de un tema en particular. En el Cuadro 2 se presentan algunos ejemplos de unidades SI derivadas.

Cuadro 2. Unidades SI derivadas de uso comn en medicina Magnitud fsica Nombre Smbolo Unidades m2 m3 m/s o m.s-1 mol/ m3 o mol.m3 K-273.16 J/s o J.s-1 W/A o W.A-1 V/A o V.A-1

rea Metro cuadrado Volumen Metro cbico Velocidad Metro por segundo Concentracin de sustancia Mol por metro cbico Temperatura Celsius Grado Celsius Potencia Watt Potencial elctrico Volt Resistencia Ohmio

C W V

Muchas veces las unidades bsicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeas para representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos que permiten formar mltiplos o submltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se muestran en el Cuadro 3. Cuadro 3. Prefijos utilizados en el SI. Prefijo Factor Smbolo Prefijo Factor Smbolo Ato 10-18 a Deca 101 da -15 2 Femto 10 f Hecto 10 h -12 3 Pico 10 p Kilo 10 k -9 6 Nano 10 n Mega 10 M -6 9 Micro 10 Giga 10 G -3 12 Mili 10 m Tera 10 T -2 15 Centi 10 c Peta 10 P -1 18 Deci 10 d Exa 10 E Los prefijos se anteponen directamente al nombre o smbolo de la unidad en cuestin, por ejemplo nanogramo o ng y no nano-gramo o n-g. Si bien es cierto, el uso del SI es la regla hoy en da, existen excepciones que la Oficina Internacional de Pesas y Medidas debi adoptar debido a su uso generalizado. Algunas de estas excepciones de uso en ciencias mdicas se muestran en el Cuadro 4.

Cuadro 4. Algunas unidades de uso comn que no pertenecen al SI. Magnitud fsica
Tiempo

Unidad
da hora minuto

Smbolo
d h min loL t Da ha cal

Valor en SI
86400 s 3600 s 60 s 10-3 m3 1000 kg 1.66 x 1027 kg 10000 m2 0.1 nm 1.1868 J

Volumen Masa rea Longitud Energa

litro tonelada dalton hectrea ngstrm calora

Debido a su uso rutinario en la bioqumica experimental, vale la pena mencionar algunas normas sobre la expresin de concentraciones de sustancias. La concentracin de sustancias cuya masa molecular se conoce, se expresa como cantidad de sustancia (moles o submltiplos como mmol, nmol) por litro (l). Ejemplo: concentracin de glucosa en suero humano: 3.6 mmol/l a 6.1 mmol/l. Los trminos concentracin molar, molaridad o M, normalidad o N son obsoletos y en su lugar debe usarse el trmino cantidad de sustancia concentracin de X o ms comnmente, concentracin de X. El trmino molal y su smbolo m no deben ser ms utilizados y en su lugar se utiliza el trmino cantidad molalidad del soluto X con las unidades SI mol/kg. La Conferencia General de Pesas y Medidas no recomienda el uso de la escala de pH y en su lugar, la concentracin de iones hidronio en una solucin debe ser reportada como nmol/l. Sin embargo, la eliminacin de la escala de pH no ha sido aceptada por la mayora de la comunidad cientfica. En el ao 2002, la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada elabor una propuesta para que dicha medida cumpliera con los requisitos solicitados por la Conferencia. A la fecha, esta propuesta se encuentra en discusin. A continuacin se enumeran algunas reglas para la consignacin de smbolos y cifras del SI: -Los smbolos se escriben siempre en singular. Ejemplo: 2 mm y no 2 mms. -El nombre completo de una unidad se pluraliza si es necesario. Ejemplo: 35 kilogramos. -Los prefijos no deben usarse solos, sino siempre acompaados de una unidad. Ejemplo: 14 gigawatts y no 14 gigas. -El punto no debe usarse despus de un smbolo, a menos que ste se encuentre al final de una frase. Ejemplo: 55 kg de masa y no 55 kg. de masa. -Siempre se deja un espacio entre el nmero que denota la cantidad y el smbolo de la unidad. Ejemplo: 15 s y no 15s.

-Nmeros muy grandes pueden ser separados en grupos de tres para facilitar su lectura, sin puntos o comas. Los puntos o comas se utilizan para las notaciones decimales. Ejemplo: 1 000 257, 35 y no 1.000.257,35. -Siempre se coloca un cero a la izquierda de la coma o el punto decimal para los nmeros menores de uno. Ejemplo: 0.38 o 0,38 y no .38 o ,38. -Los smbolos de las unidades o sus nombres no deben ser modificados mediante adicin de subndices. Ejemplo: Vmax= 1000 V y no V= 1000 Vmax. -La redaccin de la informacin no debe ser mezclada con los smbolos de las unidades o sus nombres. Ejemplo: el contenido de agua es de 20 ml/kg y no 20 ml H2O/kg o 20 ml de agua/kg. -Debe quedar explcito cul smbolo pertenece a cul valor numrico y qu operacin matemtica debe ser aplicada a cada valor numrico. Ejemplos: 45 cm X 46 cm y no 45 X 46 cm 20 oC a 30 oC o (20 a 30) oC y no 20 oC-30 oC o 20 a 30 oC -Los smbolos de las unidades o sus nombres no pueden ser mezclados y las operaciones matemticas no son aplicadas a los nombres de las unidades sino a los valores numricos. Ejemplos: pueden ser usadas formas como: kg/l, kg l o kilogramo por litro y no formas como: kilogramo/l, kg/litro, kilogramo/litro o kg por l. -Los valores de cantidades son expresados en forma numrica y con los smbolos de las unidades. Ejemplos: m= 5 kg y no m= cinco kilogramos o m= cinco kg, o la corriente fue de 15 A y no la corriente fue de 15 amperios.

2. Medicin de volmenes: pipetas y micropipetas.

Las mediciones y transferencias de volmenes exactos y precisos son requisitos bsicos de la bioqumica experimental. Estos procedimientos son hechos utilizando instrumentos como las pipetas manuales, las micropipetas, las buretas, las probetas o los balones de aforar. Cada uno de ellos cumple una funcin en particular dentro del laboratorio pero en algunos casos estas funciones pueden sobreponerse. El grado de precisin de los mismos puede variar considerablemente as que la escogencia del instrumento a utilizar para realizar una medicin en particular es un paso crtico para obtener el resultado esperado. Debido al uso rutinario dentro de las prcticas a realizar en este curso, se introducir el uso apropiado de las pipetas y micropipetas. Sin embargo, es recomendable que el estudiante realice una revisin de sus cursos de qumica anteriores para recordar el manejo y uso de otro tipo de instrumentos volumtricos.

2.1. Uso correcto de las pipetas.

Existen bsicamente dos tipos de pipetas manuales: aquellas para contener y aquellas para verter. Aquellas para contener deben ser enjuagadas con el solvente despus de haber dispensado la solucin en cuestin. Estas pipetas contienen un volumen exacto de lquido, el cual debe ser transferido completamente para que la medida sea precisa. Algunas pipetas de contener de uso comn en el laboratorio tienen nombres particulares como Micro-Folin, Sahli para medicin de hemoglobina, Kirk Micro, White-Black Lambda entre otros.

Figura 1. Tipos de pipetas de verter: de soplar (A) y no de soplar (B). Note las diferentes escalas y dnde terminan las graduaciones de la escala en cada tipo de pipeta. Estas pipetas no pueden ser utilizadas para la preparacin de soluciones y por lo tanto su uso en este curso es limitado. Nuestra atencin se enfocar en las pipetas para verter que son de utilidad para la preparacin de soluciones y mediciones durante el curso y de las cuales existen dos tipos. Aquellas pipetas para verter y que deben soplarse estn calibradas hasta la punta por lo que deben llenarse con el lquido a medir, dispensarse, y el lquido remanente en la punta debe soplarse. Son tambin conocidas como pipetas Ostwald-Folin o pipetas serolgicas (Figura 1). Estas pipetas pueden ser distinguidas fcilmente ya que sus graduaciones de escala se extienden hasta la punta de la pipeta. Adems, poseen uno o dos anillos esmerilados cerca de la boquilla. El otro tipo de pipeta para verter es aquella que no se sopla ya que est calibrada entre dos marcas que no incluyen la punta. Por lo tanto, estas pipetas nunca deben soplarse sino que el 5

volumen a dispensar debe ser regulado manualmente de forma tal que el lquido a dispensar se encuentre entre una marca y otra. Algunos nombres comunes que reciben este tipo de pipetas son: pipeta volumtrica, tipo Mohr o bacteriolgica (Figura 1).

2.2. Tcnica de pipeteo.

El primer paso de una buena tcnica de pipeteo es seleccionar la pipeta ms apta para el volumen que se desea medir. Es precisamente este volumen el que determina la pipeta a utilizar: el volumen a pipetear debe ser lo ms cercano posible a la capacidad mxima de la pipeta. Adems, debe considerarse que el volumen mnimo que una pipeta puede dispensar con precisin es aproximadamente el 10 % de su capacidad. A continuacin se describen algunos ejemplos. Usted tiene tres pipetas cuyas capacidades mximas son de 25 ml, 10 ml y 5 ml. Cul pipeta usara para pipetear las siguientes cantidades: a) 10 ml, b) 15 ml y c) 5.5 ml? Si se tiene en cuenta el criterio mencionado anteriormente entonces para dispensar 10 ml se debe utilizar la pipeta de 10 ml, para dispensar 15 ml se debe utilizar la pipeta de 25 ml y para dispensar 5.5 ml se debe usar la pipeta de 10 ml. Usted tiene tres pipetas cuyas capacidades mximas son de 0.1 ml, 1 ml y 2 ml. Cul pipeta usara para pipetear las siguientes cantidades: a) 100 l, b) 200 l y c) 1.1 ml? En este caso, es necesario tener claro que 100 l equivalen a 0.1 ml y 200 l equivalen a 0.2 ml (ver Cuadro 3). Por lo tanto, para dispensar 100 l se utiliza la pipeta de 0.1 ml, para dispensar 200 l se utiliza la pipeta de 1ml y para dispensar los 1.1 ml se utiliza la pipeta de 2 ml. Una vez seleccionada la pipeta, es necesario cerciorarse qu tipo de pipeta es, si es de soplar o no. Durante las prcticas de laboratorio se utilizarn pipetas con capacidades mximas que oscilan entre los 0.1 ml a los 25 ml que pueden ser de soplar o no. Es imperativo que se familiarice con estos tipos de pipetas y sus escalas. El siguiente paso es ajustar en la boquilla de la pipeta el dispositivo que se utilizar para crear vaco y succin. En nuestro caso utilizaremos la pera de hule, cuyo funcionamiento se describe en la leyenda de la Figura 2.

Figura 2. Dispositivo tipo pera para crear vaco y succin en la pipeta. Esta pera de hule cuenta con tres puntos rotulados con flechas o A, B y C o 1, 2 y 3. Al ejercer presin manual en uno de esos puntos, un baln interno permitir la entrada o salida de aire para que la pipeta pueda succionar (A) o dispensar (B) el lquido que contiene. El punto C o 3 es til para dispensar la ltima gota en aquellas pipetas que son de soplar (C). El uso correcto de este dispositivo requiere de prctica para ajustar la fuerza manual que debe usarse para ejercer presin. Si en algn momento su pera se humedece con el lquido a dispensar, dejar de funcionar pues no se podr ejercer vaco. Para proceder, es necesario secar antes bien la pera. La pipeta se debe llenar hasta un poco ms arriba del inicio de la graduacin de la escala y luego poco a poco se ajusta, frente a los ojos y en posicin vertical, al punto exacto de graduacin de la escala (generalmente 0). Recuerde que para lquidos transparentes, el fondo del menisco del lquido se ajusta a la graduacin, mientras que para lquidos no transparentes, los extremos del menisco se ajustan a la graduacin de la escala. Una vez ajustado el volumen, la pipeta conteniendo el lquido a dispensar es transferida al recipiente donde se depositar el lquido. En este momento se presiona la pera suavemente en el punto que permitir la salida del lquido, manteniendo la pipeta en posicin vertical y con la punta de la misma descansando en el recipiente. Una vez dispensado el volumen, se retira la pera y la pipeta se descarta cuidadosamente, con la punta hacia abajo en el recipiente para descartar pipetas. Si por algn motivo debe volver a utilizar una pipeta en la misma solucin en la que fue utilizada, es recomendable dejar la pipeta en posicin horizontal sobre la mesa de trabajo, con la punta de la misma unos centmetros fuera del borde de la mesa.

2.3. Uso correcto de las micropipetas.

Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volmenes pequeos que van desde 1 l hasta 1 ml o ms. Al igual que las pipetas stas pueden ser para contener o para verter volmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un volumen fijo o un volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta ms comnmente usada en los laboratorios de anlisis fue introducida por la compaa Eppendorf y este nombre se adopt de forma genrica para estos dispositivos, aunque hoy en da existen una gran cantidad de compaas y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones para operar. Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan puntas o tips descartables plsticos que se ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plstico es donde se deposita el lquido a medir.

Figura 3. Esquema general de las micropipetas marca BioRad a utilizar durante el curso. A1: botn pulsador, A2: tornillo del botn pulsador, B: rueda dentada de graduacin del volumen, C: cono de la pipeta, D: expulsor de punta y E: punta o tip descartable. Tomado del manual de manejo de micropipetas Biorad, BR/06/05 Para absorber el lquido, el pistn es presionado hasta una primera posicin, el tip es puesto en contacto con el lquido y luego, lentamente, se permite que el pistn vuelva a su posicin original. Este paso permite el llenado del tip con el

volumen correspondiente. El tip de plstico generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe lquido. A continuacin se describen las instrucciones especficas para los modelos de micropipetas que se utilizarn durante el curso (Figura 3). 1. Seleccin de la micropipeta a utilizar segn el volumen a dispensar. Para este paso, se aplican las mismas reglas que se utilizan para el manejo de las pipetas. El Cuadro 5 muestra los rangos de volmenes que se pueden pipetear con cada modelo de micropipeta de la marca Biorad, adems de los usos ms comunes. La mayora de la micropipetas indican en el botn pulsador el rango o volumen mximo que pueden pipetear. Para prevenir un dao en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar los volmenes mximos permitidos para cada micropipeta. Cuadro 5. Modelo, rango de volmenes y aplicaciones ms comunes de las micropipetas marca Biorad a utilizar durante el curso Modelo BR10 BR20 BR200 BR1000 Rango de volumen (l) 0.5-10 2-20 20-200 100-1000 Uso ms comn
Medida y transferencia de microvolmenes. Biologa molecular y ensayos enzimticos Medida y transferencia de soluciones acuosas en general, cidos y bases Igual a BR20 Igual a BR20

2. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es necesario seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen, compuesto de tres dgitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte ms baja del indicador hay una escala que permite el ajuste del volumen al ltimo dgito o decimal permitido segn el caso. En las micropipetas de 2 hasta 200 l, los dgitos negros indican microlitros y los dgitos rojos representan dcimas de microlitro. En el Cuadro 6 se muestran ejemplos de cmo debe lucir el indicador de volumen para medir diferentes volmenes. 3. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botn pulsador (Figura 3, A2) o la rueda de graduacin del volumen (Figura 3, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado. Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado prestando atencin para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el procedimiento de ajuste.

Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen ms alto disminuyendo las indicaciones del indicador.

Cuadro 6. Disposicin de los dgitos en el indicador segn la micropipeta a usar.

Micropipeta con volumen mximo a dispensar*: 10 l 20 l 100 l 200 l 1000 l

0 7 5 (rojo) Volumen a dispensar: 7.5 l

parntesis

1 2 5 (rojo) 12.5 l

0 7 5 75 l

1 2 5 125 l

0 7 5 750 l

* todos los dgitos deben aparecer en negro, excepto cuando se indique lo contrario en 4. Seleccionar la punta o tip plstico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al cono de la micropipeta (Figura 3). Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que aplicar una fuerte presin con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta con lquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plstica se encuentre en una caja tambin plstica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no est en caja, deber ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estar en contacto con la solucin a extraer. 5. Aspiracin: apretar el botn pulsador hasta el primer tope (Figura 4A) 6. Con la pipeta en posicin vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en la muestra. 7. Lentamente se aspira el lquido al relajar la presin del dedo sobre el botn pulsador (Figura 4B). Si este paso no se realiza con atencin, puede entrar aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada. 8. Esperar un segundo y retirar la punta del lquido. 9. Dosificacin: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se depositar el lquido, con un ngulo entre 10o y 40 o. 10. Apretar el botn pulsador suavemente hasta el primer tope (Figura 4C) y esperar un segundo. 11. Apretar el botn pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del lquido (Figura 4D). 12. Manteniendo apretado el botn pulsador en el segundo tope, retirar la pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botn pulsador (Figura 4E). 13. Expulsar la punta apretando el botn del expulsor (Figura 4F y Figura 3, D).

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Figura 4. Posiciones de la micropipeta a la hora de medir un volumen especfico. A: Botn pulsador en el primer tope, B: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la muestra para luego liberar el botn pulsador suavemente hasta su posicin original, C: Forma correcta de dispensar el lquido medido en el recipiente correspondiente, D: Posicin de la micropipeta al apretar el botn pulsador hasta el segundo tope, E: Vuelta a la posicin inicial, F: Expulsin de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado. Tomado del manual de manejo de micropipetas Biorad, BR/06/05 Para no daar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta: -el lquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta -nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo -nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene lquido -nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta Con respecto a la micropipeta multicanal, stas tienen la ventaja de que se puede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la vez. Estas micropipetas fueron diseadas principalmente para los ensayos en formato micro, donde se utiliza tambin un plato de plstico de 96 pozos para trabajar esa cantidad de ensayos de forma simultnea. Las micropipetas multicanal son dispositivos ms complejos que las micropipetas unicanal ya que bsicamente pueden repetir varias veces la funcin que realiza esta ltima en un solo momento. Para ello, poseen un solo mango, botn pulsador, etc pero un cono que permite la insercin de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo. En el curso se utilizarn micropipetas multicanales (12 canales) con un rango de volumen de 50 l a 300 l similares a las de la Figura 5. Para su uso, se deben tener los mismos cuidados que con las micropipetas unicanal, adems de cerciorarse que todas las puntas estn bien colocadas, extrayendo la misma cantidad de solucin y que no se observen burbujas de aire en ninguna.

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Figura 5. Micropipeta multicanal (8 canales), modelo Biohit de rango de volumen de 50 l a 300 l. Este tipo de micropipeta es muy til para microensayos semi automatizados o automatizados en platos descartables de 96 pozos.

3. Clculos bsicos de utilidad en bioqumica experimental. 3.1. Preparacin de soluciones

Una solucin es una mezcla homognea de al menos dos sustancias, una que se conoce como soluto y otra que se conoce como solvente, disolvente o diluyente y que generalmente est en mayor proporcin que la primera. El solvente universal es el agua y por lo tanto no es de extraar que casi todas las soluciones utilizadas en bioqumica utilicen agua como disolvente.

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Como se mencion anteriormente, la concentracin de una solucin debe ser expresada en unidades del SI, es decir en mol/l cuando el peso molecular del soluto se conoce, o en trminos de peso (masa) por litro si el peso molecular del soluto se desconoce. Sin embargo, existen todava algunas expresiones que no pertenecen al SI pero que su uso se ha mantenido, por razones histricas o prcticas. Aunque el uso de dichas expresiones en este manual no es estimulado, s es necesario introducirlos ya que muchos de los protocolos a utilizar todava son descritos con esta nomenclatura. Existen bsicamente dos tipos de expresiones que prevalecen: aquellas que expresan la concentracin de forma porcentual y aquellas que la expresan como molaridad. Las concentraciones expresadas de forma porcentual se refieren a partes de soluto por 100 partes de la solucin, de ah el trmino porcentaje o por cien. Estas pueden enunciarse como: -Peso por unidad de peso (o peso en peso o p/p): los dos, el soluto y el solvente son pesados en gramos y la proporcin de soluto se expresa por 100 g de solucin. Ejemplo: una solucin de NaCl al 24% (p/p) contiene 24 g de NaCl por cada 100 g de solucin, o 240 g de NaCl y 760 g de disolvente. -Volumen por unidad de volumen (o v/v): nmero de ml de soluto en 100 ml de solucin. Ejemplo: una solucin de HCl al 1% (v/v) contiene 1 ml de HCl puro por 100 ml de solucin. -Peso por unidad de volumen (o p/v): nmero de g de soluto en 100 ml de solucin. Si el porcentaje no especifica la forma de expresin, es decir, p/p, v/v o p/v, se asume que el porcentaje est expresado en peso por unidad de volumen. Ejemplo: una solucin de MgCl2 al 7% contiene 7 g de MgCl2 por cada 100 ml de solucin. Cabe destacar que al ser estas relaciones porcentuales, el volumen o peso final puede ser cualquier cantidad pero lo importante es mantener la relacin entre las partes. A continuacin algunos ejemplos: Calcule cuntos gramos de NaOH se pesaron para obtener 300 ml de una solucin al 10 % Una solucin al 10 % de NaOH contiene 10 g de NaOH por cada 100 ml de solucin. Sin embargo el enunciado menciona que se tena tres veces ms solucin (300 ml). Por lo tanto, conservando la proporcin porcentual, se puede decir que se pesaron 30 g de NaOH para obtener 300 ml de solucin al 10% o: 100 ml de solucin tienen 10 g de NaOH 300 ml de solucin tienen X g de NaOH X= 30 g de NaOH. Con respecto al trmino molaridad, ste expresa la concentracin de una sustancia en particular en trminos de nmero de moles por litro de solucin y su smbolo es M. Este trmino tambin debe ser descontinuado y reemplazado por la expresin mol/l o mol/m3. Ejemplo: calcule cuntos gramos de NaOH se deben pesar para preparar 2.5 l de una solucin de NaOH 0.1 M. El primer dato que se requiere para poder obtener lo solicitado es el peso molecular del NaOH, es decir, 40 g/mol. Posteriormente, es necesario saber que la expresin 0.1 M quiere decir que la solucin posee 0.1 mol/l. En este caso en 13

particular, se requiere no 1 l sino 2.5 l de solucin, por lo tanto hay que pesar 0.1 X 2.5= 0.25 mol. Esta cantidad corresponde a 0.25 mol X 40 g/mol= 10 g. Entonces para preparar 2.5 l de una solucin de NaOH 0.1 M se deben pesar 10 g de NaOH y llevar a 2.5 l con agua. 3.1.1 Clculo y expresin de diluciones. Una dilucin consiste en preparar una solucin menos concentrada a partir de una ms concentrada. Esta prctica es muy comn en los laboratorios y de ella depende en gran parte el resultado final analtico que se obtenga. Por lo tanto es imperativo el manejo de este tipo de clculos para cualquier persona que trabaje dentro de un laboratorio. Las diluciones generalmente se expresan como una razn matemtica, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso de una dilucin 1:5, sta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volmenes. Ntese que el volumen total o final estar compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4 volmenes del disolvente. Para calcular la concentracin final de una solucin diluida, se multiplica la concentracin de la solucin original por la dilucin expresada como fraccin. Ejemplo: una solucin de urea cuya concentracin es de 5 mg/ml es diluda 1/10. La concentracin final de la solucin diluida es 5 X 1/10= 0.5 mg/ml. La ecuacin ms comnmente utilizada para preparar soluciones es: V1 X C1 = V2 X C2 donde V1 es el volumen de la solucin concentrada que se debe aadir para preparar la solucin diluida, C1 es la concentracin de la solucin concentrada V2 es el volumen de la solucin diluida C2 es la concentracin de la solucin diluida. Al utilizar esta ecuacin debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V1 y V2 as como las de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente. Ejemplo: prepare 500 ml de una solucin de glucosa 5 mol/l a partir de una solucin de glucosa a 45 mol/l. Aplicando la ecuacin antes presentada tenemos: x X 45 mol/l= 500 ml X 5 mol/l x= 55.56 ml de glucosa 45 mol/l Entonces, para preparar 500 ml de una solucin de glucosa 5 mol/l, se requieren 55.56 ml de glucosa 45 mol/l y llevar a 500 ml con agua. Ntese que la solucin original fue diluida 1/9 o en otras palabras, se utiliz un factor de dilucin de 9: 45 X 1/x= 5 x= 9 14

El factor de dilucin representa el nmero de veces que fue diluida la solucin concentrada. Si se hace no una sino una serie de diluciones, la concentracin de la solucin final se obtiene al multiplicar la concentracin original por el producto de los factores de dilucin. Ejemplo: si la solucin de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentracin final de la solucin ser 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilucin de 900. Las diluciones seriadas son tambin muy tiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilucin. Ejemplo: para determinar la concentracin de protenas en un suero animal, la muestra es diluida 1/5 mediante la adicin de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solucin salina en el tubo nmero 1. Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solucin salina como diluyente. La dilucin seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar y transferir 0.5 ml del tubo 2 al tubo 3 y as sucesivamente hasta el tubo 8. La concentracin de suero en los tubos 2 al 8 decrece por un factor de 2, siendo cada dilucin: tubo 1:1/5, tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo 5: 1/80, tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y tubo 8: 1/640.

Materiales y reactivos
-Pipetas serolgicas de varias graduaciones: 25 ml, 10 ml, 5 ml, 1 ml y 0.1 ml -Una pera de hule con nmero: esta pera ser la que se le asignar y utilizar durante todo el curso. Asegrese de que funcione correctamente. La pera debe ser devuelta al finalizar cada prctica en perfecto estado. -Un erlenmeyer o beaker lleno de agua destilada -Un erlenmeyer o beaker vaco -Una micropipeta de una de las siguientes graduaciones: de 100 a 1000 l, de 20 l a 200 l o de 2 l a 20 l unicanal o multicanal de 50 a 300 l. Usted recibir en custodia una micropipeta para su uso durante todo el curso. Esta micropipeta deber ser utilizada por sus compaeros tambin. Es su responsabilidad entregarla al final del curso en perfecto estado. -Puntas de plstico descartable que se ajusten a las diferentes micropipetas -Envases para descartar las puntas usadas (habr uno por lado de mesa) -Envases para descartar las pipetas usadas (habr uno por mesa) -Equipo general de laboratorio para demostracin: balanza, agitadores, centrfuga, espectrofotmetro, etc.

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Procedimiento
Conozca el equipo con el que va a trabajar durante el curso: reciba y anote el nmero de pera que se le asignar. Esta pera deber ser entregada al asistente al final de cada sesin. Reconozca el tipo de pipetas que le fueron administradas. Reciba la micropipeta que se le asignar para su custodia durante el curso. Anote el nmero de micropipeta asignada. Es importante que se familiarice con la misma, conozca qu tipo de puntas debe utilizar, qu rango de volumen puede medir la micropipeta. Ensaye los puntos de tope de la micropipeta y luego siga el procedimiento para pipetear varios volmenes de agua con la micropipeta correspondiente. Por ejemplo: 7.5 l, 10 l, 200 l, 450 l, etc. Conozca el resto del equipo con el que trabajar durante el curso y que se encuentra dentro del laboratorio como la centrfuga, los agitadores tipo vortex, el termociclador, el espectrofotmetro, etc. Realice los clculos para diluir una solucin de NaCl al 0.145 mol/l para obtener: a) b) c) d) 1.1 ml de una solucin 0.12 mol/l de NaCl 5 ml de una solucin 0.045 mol/l de NaCl 3 ml de una solucin 0.033 mol/l de NaCl una dilucin seriada de 4 tubos con factor de dilucin de 5.

Describa detalladamente sus clculos en la seccin de resultados, as como el factor de dilucin utilizado en cada caso y el procedimiento que utilizara para realizar cada dilucin. Indique cul pipeta, de las que se le suministraron utilizara para realizar cada medicin

Resultados
1) Escriba o haga un esquema de cmo distinguir los diferentes tipos de pipetas y micropipetas que se le suministraron. Indique cules pipetas son de soplar y cules no, adems de cmo distinguir la escala tanto en las pipetas como en las micropipetas.

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2) Haga la descripcin de los clculos solicitados en la seccin de procedimiento aqu:

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Bibliografa
-Amato M, S y Granados P, F. Manual de Laboratorio. Ctedra de Bioqumica. Universidad Nacional, 1994 -Angulo Ugalde, Y. Bioqumica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999 -Kaplan, L et al. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. 2nd edition. CW. Mosby Company, 1989 -Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioqumica. Bioqumica y Biologa Molecular. Objetivos del curso y manual de prcticas de laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, Mxico, 2000. -Schosinsky, K et al. Manual de Tcnicas de Laboratorio en Qumica Clnica. X Edicin, Universidad de Costa Rica, 1997 -Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 -Manual de uso de micropipetas Biorad, versin BR0605 -http://www.bipm.fr/en/si/ consultado el 10 de enero del 2007

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EJERCICIOS (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio

independiente)
1. Calcule las siguientes concentraciones: 10 M NaOH, diluido 1:20 = _____ M 2 M HCl, diluido 1:5 = _____ M 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = _____ mg/L 250 ml de 5% NaCl contienen ____ g de NaCl Cunto CuSO4 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al 5%? PM del CuSO4 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol Qu porcentaje de CuSO4 5 H2O es agua?

2. Cuntos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2 3 H2O? PM del MgCl2 3 H2O: 149 g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol 3. Cuntos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar solucin 0.2M? 4. Qu porcentaje de Mg contiene el MgCl2 3 H2O? 5. Cunto CuSO4 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solucin que contenga 80 mg de CuSO4? 6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol , cuntos gramos son necesarios para preparar: 1 L de 0.1 M CaCO3? 50 mg/L de CaCO3? 20 ml de una

7. Una solucin estndar de hemoglina contiene 200 g/L. Cuntos ml deben usarse para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones: 200 g/L 150 g/L 100 g/L 50 g/L

8. La solucin salina normal tiene una concentracin de 0.85%. Cul es su molaridad? (PM NaCl : 58.5 g/mol) 9. Cuntos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solucin cuya concentracin es de 50 mg/ml? 10. Cul es la dilucin final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 l de suero, 500 l de solucin salina y 300 l de reactivo? 11. Cul es la concentracin en mol/l de una solucin que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol

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RESPUESTAS A LOS EJERCICIOS

1. Calcule las siguientes concentraciones: 10 M NaOH, diluido 1:20 = ___0.5__ M 2 M HCl, diluido 1:5 = __0.4___ M 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = __50___ mg/L 250 ml de 5% NaCl contienen __12.5__ g de NaCl Cunto CuSO4 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al 5%? PM del CuSO4 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol R/ 7.82 g Qu porcentaje de CuSO4 5 H2O es agua? R/ 36 %

2. Cuntos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2 3 H2O? PM del MgCl2 3 H2O: 149 g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol R/ 0.64 g 3. Cuntos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar solucin 0.2M? R/ 10 ml 4. Qu porcentaje de Mg contiene el MgCl2 3 H2O? R/ 16.1% 5. Cunto CuSO4 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solucin que contenga 80 mg de CuSO4? R/ 125 mg 6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol , cuntos gramos son necesarios para preparar: 1 L de 0.1 M CaCO3? R/ 10 g/l 50 mg/L de CaCO3? R/ 0.05 g 20 ml de una

7. Una solucin estndar de hemoglina contiene 200 g/L. Cuntos ml deben usarse para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones: 200 g/L R/ 6 ml 150 g/L R/ 4.5 ml + 1.5 ml de diluyente 100 g/L R/ 3 ml + 3 ml de diluyente 50 g/L R/ 1.5 ml + 4.5 ml de diluyente

8. La solucin salina normal tiene una concentracin de 0.85%. Cul es su molaridad? (Peso molecular NaCl es 58.5 g/mol) R/ 0.145 mol/l 9. Cuntos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solucin cuya concentracin es de 50 mg/ml? R/ 94.4 g 10. Cul es la dilucin final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 l de suero, 500 l de solucin salina y 300 l de reactivo? R/ 1:5 11. Cul es la concentracin en mol/l de una solucin que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol R/ 25 mol/l

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