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FEIJO TRANSGNICO

UM PRODUTO DA ENGENHARIA GENTICA


O feijoeiro A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) ocupa uma rea de 12 milhes de hectares e constitui-se na leguminosa mais importante para a alimentao de mais de 500 milhes de pessoas na Amrica Latina e frica. O Brasil o maior produtor, com uma produo anual na ordem de dois milhes de toneladas, o que equivale a cerca de 20% da produo mundial de feijo. O feijo um alimento bsico para a populao brasileira, constituindo-se em sua principal fonte de protena vegetal. O consumo anual per capta de 14 quilogramas. O teor de protena das sementes varia de 20 a 33%, sendo tambm um alimento energtico, contendo cerca de 340cal/ 100g. No Brasil, o feijo produzido basicamente por pequenos produtores. Aproximadamente 80% da produo e da rea cultivada encontram-se em propriedades menores que 100ha. O feijo produzido em todas as regies do pas. A Regio Nordeste detm a maior rea plantada (45%), seguida das regies Sul (26%) e Sudeste (21%). A Regio Nordeste detm o mais baixo ndice de produtividade, decorrente da baixa utilizao de insumos agrco-

Francisco J.L. Arago, Ph.D. Giovanni R. Vianna, MSc. Elbio L. Rech, Ph.D. elbrech@cenargen.embrapa.br CENARGEN - Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genticos e Biotecnologia. EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria. Fotos cedidas pelos autores.

las e problemas com a seca. Os maiores estados produtores so Paran, Bahia, Minas Gerais, So Paulo, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Gois. Em nosso pas, nas ltimas dcadas a produo e a rea ocupada com a cultura do feijoeiro aumentaram, entretanto a produtividade vem decrescendo. Vrios so os fatores que contribuem para este fato: scio-econmicos, fitossanitrios e agroecolgicos. Diante dos problemas que esta cultura possui e da sua grande importncia para as regies onde est estabelecida, h um grande interesse no desenvolvimento de tecnologias que possam acelerar o processo de melhoramento. Engenharia gentica Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi aberta a possibilidade de se isolar e clonar genes de bactrias, vrus, plantas e animais, introduzi-los e express-los em plantas. Desta forma, a barreira do cruzamento entre espcies e at entre diferentes reinos foi rompida. A transformao gentica de vegetais permite a introduo de genes especficos no genoma de cultivares comerciais. Esta tecnologia vem auxiliar os programas de melhora-

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Figura 2: Regio apical dos eixos embrionrios de feijo utilizados no processo de transformao, vistos ao microscpio eletrnico de varredura.

mento, permitindo o fluxo de genes para plantas, os quais seriam impossveis de serem transferidos atravs de cruzamentos sexuais ou fuso de genomas. As plantas obtidas no processo de transformao gentica devem ser introduzidas em um programa

de melhoramento para o desenvolvimento de novas cultivares. A transformao gentica de vegetais superiores tem tido avanos considerveis nas ltimas duas dcadas. Vrios mtodos de transformao foram propostos. Atualmente, os mtodos mais empregados so: o processo biobalstico, introduo de genes mediada por Agrobacterium e a eletroporao de protoplastos e tecidos. Durante a ltima dcada, numerosas tentativas foram feitas no sentido de regenerao de plantas transgnicas frteis do feijoeiro comum. Alguns pesquisadores demonstraram a possibilidade de introduo de genes exgenos para o feijoeiro atravs do sistema Agrobacterium e da eletroporao de protoplastos. No entanto, nenhuma transformao estvel, com uma prova molecular da presena dos genes introduzidos (transgenes) e uma anlise da prognie, foi demonstrada. As dificuldades para obteno de uma planta geneticamente modificada residiram na inexistncia de um processo para regenerao de plantas a partir das clulas transformadas. O processo biobalstico No final da dcada de 80, foi proposto o processo biobalstico como uma alternativa para introduo direta de material gentico no genoma nuclear de plantas superiores. Desde ento, sua universalidade de aplicaes tem sido avaliada. Valendo-se de diferentes equipamentos desenvolvidos no Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genticos e Biotecnologia ( E M B R A P A / CENARGEN), nosso grupo tem demonstrando ser um processo efetivo e simples para a introduo e expresso

de genes em bactrias, protozorios, fungos, tecidos vegetais e animais. A biobalstica utiliza microprojteis de ouro ou tungstnio acelerados a altas velocidades (superiores a 1.500km/h) para carrear e introduzir cidos nuclicos e outras molculas em clulas e tecidos in vivo. As micropartculas aceleradas penetram na parede e membrana celular de maneira no-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA dissociado das micropartculas pela ao do lquido celular, ocorrendo o processo de integrao do gene exgeno no genoma do organismo a ser modificado. Uma das vantagens do sistema de transformao atravs do processo de biobalstica que este permite a introduo e expresso gnica em qualquer tipo celular. Assim, foi aberta a possibilidade de trans-

Figura 3: Equipamento de biobalstica utilizado no processo de introduo de genes em meristemas apicais de feijo.

formao in situ de clulas diferenciadas sem necessidade de regenerao de novo. Desta forma, vislumbrou-se a possibilidade de obteno de plantas transgnicas atravs da transformao de clulas-me do meristema apical. A transformao destas clulas meristemticas atravs do processo biobalstico tem-se mostrado bastante eficiente. As micropartculas podem atingir as clulas das trs camadas do meristema apical. A freqncia de transformao, no entanto, pode ser significativamente aumentada atravs da induo de organognese na regio do meristema apical, isto , atravs da induo de uma multibrotao. Um sistema de multibrotao a partir do meristema apical de embries de feijoeiro foi desenvolvido atravs de seu cultivo em meio de cultura contendo benzilaminopurina (BAP). A BAP um regulador de crescimento vegetal sinttico (uma citocinina) que, entre outros efeitos, induz a diviso celular, gerando, no pice de eixos embrionrios, novas regies meristemticas e,

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conseqentemente, vrios brotos a partir de um nico meristema

preexistente. Baseado no bombardeamento de clulas do meristema apical e da induo de multibrotao em eixos embrionrios de feijo, foi desenvolvido na EMBRAPA/CENARGEN um sistema de transformao de cultivares elite, com uma eficincia de 1%. Esta freqncia

de transformao considerada muito alta se comparada a outros sistemas de transformao baseados na introduo de genes em meristemas apicais de outras espcies (0,007 a 0,03%). As plantas transformadas foram submetidas a anlises de prognie, bioqumicas e moleculares. A maioria das plantas apresentou um padro de segregao obedecendo primeira lei de Mendel e um baixo nmero de cpias do transgene, integradas em locus nico. Em se tratando da introduo de genes de interesse agronmico, esta a condio ideal para a introduo destas plantas transgnicas nos programas de melhoramento. Genes de interesse agronmico A transferncia de genes para plantas uma etapa-chave para a engenha-

ria gentica de vegetais. O desenvolvimento desta metodologia de transformao do feijoeiro foi fundamental para os demais estudos de integrao, expresso e estabilidade de genes que conferem caractersticas agronmicas. Uma das doenas de maior impacto na cultura do feijoeiro o mosaico-dourado, causado por um geminivrus, o vrus do mosaico-dourado do feijoeiro (BGMV). Esta doena est hoje disseminada por todas as reas produtoras de feijo do Brasil e em outros pases da Amrica Latina. No Brasil, em condies de campo, as perdas ficam em torno de 40 a 85%, podendo chegar a 100%, dependendo da cultivar, do estgio das plantas quando infectadas e do isolado do vrus. Experimentos foram conduzidos em conjunto com o grupo do Dr. Josias Faria, do Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo

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(EMBRAPA/CNPAF), e o nosso grupo na EMBRAPA/CENARGEN, com o objetivo de se obter plantas resistentes geneticamente modificadas. Seqncias do BGMV (AC1, AC2, AC3 e BC1) foram clonadas e posicionadas em antisenso e ento utilizadas para obteno de plantas transgnicas de feijoeiro. O objetivo da estratgia de anti-senso a expresso pela planta de RNAs complementares aos do vrus. Assim, estes RNAs anti-senso podem-se ligar aos RNAs virais, permitindo que este RNA hbrido possa ser inativado, interrompendo o ciclo de vida do vrus. As plantas transgnicas obtidas, contendo as seqncia do BGMV, foram autofecundadas durante cinco geraes

e ento desafiadas contra o vrus. A inoculao do vrus foi feita atravs de moscas-brancas virulferas (vetor responsvel pela transmisso do vrus na natureza). Algumas linhagens transgnicas no apresentaram qualquer diferena significativa nos sintomas, em relao s plantas notransgnicas. Entretanto, duas linhagens mostraram um retardamento no aparecimento dos sintomas, e estes foram mais fracos que aqueles normalmente apresentados pelas plantas-controle. Alm disso, uma quantificao atravs de anlises de Southern blot nas plantas inoculadas mostrou que havia uma quantidade inferior de DNA viral nas plantas transgnicas. As plan-

tas transgnicas tolerantes ao vrus esto sendo incorporadas ao programa de melhoramento da EMBRAPA/CNPAF com objetivo de introduo desta caracterstica em diferentes cultivares e avaliao no campo. Outro objetivo do melhoramento gentico de feijoeiro tem sido o aumento da qualidade nutricional, principalmente em relao ao teor de metionina e triptofano nos gros, uma vez que esta planta importante para a alimentao humana e extremamente deficiente nestes aminocidos essenciais. Embora tenha sido mostrada a possibilidade de se aumentar o teor de metionina atravs da seleo em populaes com grande variabilidade, pouco tem sido conseguido no sentido de se obter plantas com nveis desejveis deste aminocido. Desta forma, juntamente com o grupo do Dr. Eugen Gander (EMBRAPA/CENARGEN), numa tentativa de se obter gros de feijo contendo maiores teores de metionina, plantas transgnicas foram obtidas expressando o gene da albumina 2S de castanha-do-par. Esta protena possui um alto teor de metionina (18%). A albumina 2S foi corretamente processada em sementes transgnicas de feijo. Sementes das plantas transgnicas foram analisadas durante o perodo de desenvolvimento at a maturao para deteco do produto gnico. O padro de aminocidos foi analisado para se determinar a aplicabilidade da expresso heterloga de um gene de uma protena rica em metionina no melhoramento nutricional. Embora as sementes tenham apresentado altos nveis do aminocido metionina antes da maturao fisiolgica, obteve-se um aumento da ordem de 25% do teor de metionina em sementes maduras. Finalmente, estudos do comportamento das plantas transgnicas de feijoeiro em condies de campo sero conduzidos em breve. Nestes estudos, sero avaliadas as interaes das plantas transgnicas com outras plantas do ambiente agrcola, e tambm a estabilidade da expresso dos genes introduzidos. Alm disso, h a necessidade do estudo do comportamento destes genes, no que diz respeito a fatores relacionados interao destes e a complexa fisiologia destas plantas submetidas ao estresse natural, nas condies agroclimticas tropicais.
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