4to-Analisis m3 s3 2013-10

Gua Profesional
Anlisis y Tecnologa de los Alimentos Submdulo III

EFECTA ANLISIS MICROBIOLGICOS A CARNE Y PRODUCTOS CRNICOS
Mtro. Alonso Jos Ricardo Lujambio Irazbal

Secretario de Educacin Pblica
Lic. Miguel ngel Martnez Espinosa

Subsecretario de Educacin Media Superior
Lic. Luis Francisco Meja Pia

Director General de Educacin Tecnolgica Industrial
Ing. Celso Gabriel Espinoza Corona

Coordinador Nacional de Organismos Descentralizados Estatales del CECyTEs
Lic. Armando Mendoza Cruz

Responsables de Desarrollo Acadmico de los CECyTEs
ElenaPatriciaCamposChaves EnriqueGmezSnchez Veracruz Tabasco Nayarit NuevoLen
GuillerminaGalindoFigueroa MarioDenaSilva Adriana GarcaOrtiz Antonio IxChuc
Hidalgo Campeche Yucatn
Manuel G.MndezMonforte
Muy bien! Llevas recorrido hasta ahora dos mdulos de formacin profesional en los que seguramente aprendiste muchas cosas. Ahora ests por comenzar una nueva etapa de tu aprendizaje profesional, realizars el procesamiento de derivados de la carne con sus respectivos anlisis de calidad. Es lo referente a los anlisis microbiolgicos lo que trata esta gua de aprendizaje, pero en esta ocasin en productos elaborados a base de carne. Aprenders, apoyado por tu profesor, las prcticas necesarias y precisas para el anlisis microbiolgico de embutidos crudos y cocidos, carnes curadas, productos crnicos enlatados y carnes ahumadas entre otros. No olvides que lo importante es que tus habilidades y destrezas se desarrollen cada vez mejor, y lo logrars con los ejemplos, ejercicios y prcticas que te proporcionar ms adelante. Al final de todo el seguimiento de esta gua de aprendizaje, debido a lo importante del submdulo en lo que se refiere a la toma de decisiones y a las responsabilidades que implica, tendrs un nivel de competencia de categora 2.
Tcnico en Anlisis y Tecnologa de los Alimentos
Mdulo Submdulo
III III
Procesa Alimentos a Base de Carne. Efecta anlisis microbiolgicos a carnes y productos crnicos Competencia 2
1.- REALIZA ANLISIS MICROBIOLGICOS A DERIVADOS CRNICOS, DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA
Competencia 1
1.- REALIZA ANLISIS MICROBIOLGICOS A LA CARNE CRUDA, DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA
Atributos de la Competencia
Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella
Atributos de la Competencia
Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella.
Saberes
Fuentes de contaminacin para la carne cruda. Microbiologa de la carne. Toma de muestra. Cuenta de bacterias mesoflicas aerobias. NMX-F-253-1977. Cuenta de organismos coliformes. NMX-F254-1977. Mtodo de conteo de hongos y levaduras en alimentos. NMX-F-255-1978. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para sus anlisis microbiolgicos. NMX-F-285-1977.
Saberes
Toma de muestra. Toxicologa de los alimentos. Cuenta de bacterias mesoflicas aerobias. NMX-F-253-1977. Cuenta de organismos coliformes. NMX-F254-1977. Mtodo de conteo de hongos y levaduras en alimentos. NMX-F-255-1978. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgicos. NMX-F-285-1977. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgicos. NMX-
Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgicos. NMX-F-286-1992. Mtodo general de investigacin de Salmonella en alimentos. NMX-F-3041977. Cuenta de organismos coliformes fecales. NMX-F-308-1992. Determinacin de cuenta de estafilococo aureus, coagulasa positiva en alimentos. NMX-F-310-1978. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-092-SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras en alimentos para sus anlisis microbiolgicos. NOM-110-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. NOM-111-SSA11994. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. NOM112-SSA1-1994. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. NOM-114-SSA11994.
F-286-1992. Mtodo general de investigacin de Salmonella en alimentos. NMX-F-304-1977. Cuenta de organismos coliformes fecales. NMX-F-308-1992. Determinacin de cuenta de estafilococo aureus, coagulasa positiva en alimentos. NMX-F-310-1978. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-092-SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras en alimentos para sus anlisis microbiolgicos. NOM-110-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. NOM-111-SSA1-1994. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. NOM-112SSA1-1994. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. NOM-114-SSA1-1994 Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. NOM115-SSA1-1994.
Actitudes: Orden Limpieza Responsabilidad
Actitudes: Orden Limpieza Responsabilidad
Qu tal?! El presente Mdulo, te proporciona herramientas, para que, conserves y determines la calidad de la carne, con apego a estndares establecidos en un marco de sustentabilidad de los recursos; as como integres los conocimientos, habilidades y destrezas adquiridos, en los submdulos anteriores de microbiologa. El mdulo que estas por iniciar, es el tercero en tu carrera, y comprende todo lo relacionado al procesamiento de carnes, aprenders hacer anlisis microbiolgicos a la carne cruda y sus derivados procesados. Obtendrs conocimientos sobre los patgenos contenidos en la carne cruda y los principales derivados de sta, como son: embutidos crudos, cocidos, carnes curadas, carne seca y enlatados crnicos. Continuaras aprendiendo sobre las diferentes tcnicas para la identificacin de tales patgenos: as como conocimientos de toxicologa, microbiologa de a la carne y procesos de calidad. Podrs conocer los lmites microbiolgicos apropiados, de acuerdo con la muestra y el microorganismo a analizar. En esta gua se muestran ejemplos, ejercicios y prcticas que podrn ser desarrolladas en: tu saln de clases; como prcticas de campo en lugares fuera de la institucin; en un laboratorio de anlisis microbiolgico durante visitas industriales. Recuerda que debes reunir los documentos necesarios (gua de observacin, lista de cotejo) e integrarlos en el portafolio de evidencias, ya que stas sustentan t competencia. Para que logres los conocimientos tendrs que realizar actividades prcticas y debers seguir las indicaciones de tu profesor al pie de la letra, as como trabajar con orden, limpieza y responsabilidad. Todo lo que aprendas te dar las habilidades y destrezas necesarias para que puedas laborar en el campo del control de calidad microbiolgica de la carne y sus derivados.
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Realiza anlisis microbiolgicos a la carne cruda, de acuerdo a las normas vigentes en la materia
Cunto analizo? Y ahora qu?
Uso y manejo del microscopio Microorganismos de la carne
Manejo del microscopio ptico y tinciones de microorganismos Esquematizando los agentes causales
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Determinacin de Salmonella Determinacin de Staphylococcus aureus Deteccin de bacterias mesoflicas aerobias Deteccin de Escherichia colli Deteccin de toxina botulnica
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Al igual que en los mtodos de procesamiento de lcteos, de frutas y de hortalizas, en el procesamiento de carnes es importante el control de calidad por lo que debes aprender la realizacin de anlisis fisicoqumicos y microbiolgicos; como sabes, stos ltimos son tiles para asegurar la calidad sanitaria de los alimentos elaborados. Para lograr lo anterior se han desarrollado tcnicas para promover el crecimiento y desarrollo de los microorganismos e identificarlos con la ayuda del imprescindible microscopio. Esta gua te ayudar para que de una manera prctica desarrolles habilidades y destrezas con la finalidad de que logres desempearte en el rea de control de calidad microbiolgica en las empresas procesadoras de lcteos. Para apoyarte en tu aprendizaje visitars empresas procesadoras de carnes donde acudirs al laboratorio de anlisis microbiolgicos, adems realizars los anlisis correspondientes en el laboratorio de tu escuela a los alimentos que t mismo hayas procesado; despus debers comparar los resultados que obtengas con los estndares de calidad que dictan las normas oficiales, para que realices tu reporte sealando tus conclusiones, de tal manera que puedas demostrar desempeo durante la ejecucin de los anlisis y tengas evidencia a travs de tus reportes.
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ATRIBUTOS DE LA COMPETENCIA
Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella El estudiante efecta anlisis microbiolgicos a la carne y derivados crnicos, siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva para garantizar su calidad de acuerdo a las normas vigentes en la materia y a los requerimientos de la industria crnica.
RESULTADO DE APRENDIZAJE
El facilitador realiza la presentacin de la competencia a desarrollar la cual abarca la siguiente informacin: Aplicacin de una evaluacin diagnstica Resultado de aprendizaje. Atributos profesionales que componen a la competencia. Evidencias de desempeo y evidencias de producto a evaluar. Prcticas programadas y Prcticas integradoras. Normas oficiales vigentes a seguir. Criterios e instrumentos de evaluacin. Sobre las actitudes y valores que el estudiante debe de mostrar.
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Nombre Instrucciones para el Alumno Saberes a adquirir
Cunto analizo?
No.
Revisa el contenido de la norma NMX-F-285-1977 y realiza el ejercicio que se te pide. Contenido de la norma NMX-F-2851977 Manera Didctica de Lograrlos Elaboracin de un mapa conceptual sobre el muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
Elabora un mapa conceptual en el cual especifiques los pasos y aspectos importantes sobre el muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
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Nombre Instrucciones para el Alumno
Y ahora qu?
No.
Revisa el contenido de las normas presentadas en el cuadro y realiza el ejercicio que se te pide. Lmites permisibles de microorganismos en carne cruda y producto terminado Manera Didctica de Lograrlos Elaboracin de diversos cuadros con los lmites permisibles de los diferentes microorganismos detectados en las muestras analizadas.
Saberes a adquirir
Norma Oficial Mexicana o Norma Mexicana NOM-122-SSA1-1994.
Nombre de la norma. Bienes y servicios. Productos de la carne. Productos crnicos curados y cocidos, y curados emulsionados y cocidos. Especificaciones sanitarias. Productos y servicios. Especificaciones sanitarias en los establecimientos dedicados al sacrificio y faenado de animales para abasto, almacenamiento, transporte y expendio. Especificaciones sanitarias de productos. Productos y servicios. Productos crnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Mtodos de prueba. Productos y servicios. Especificaciones microbiolgicas para productos procesados en los establecimientos dedicados al sacrificio, faenado de animales para abasto, corte, deshuese, envasado, almacn y expendio. Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermtico y sometido a tratamiento trmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
NOM-194-SSA1NOM-213-SSA1-2002 NOM-EM-006-SSA12002 NOM-130-SSA1-1995
Localiza en las normas enlistadas en el cuadro anterior, las especificaciones sanitarias con los lmites permisibles de microorganismos detectados en las muestras analizadas de carne cruda y producto terminado. Llena los cuadros que se presentan a continuacin. Cuadro 1. Especificaciones microbiolgicas para productos procesados en los establecimientos dedicados al sacrifico, faenado de animales para abasto, corte, deshuese, envasado, almacn y expendio. Producto E coli (UFC/g*) Salmonella en 25 g lmite mximo Enterotoxina estafilococcica Lmite mximo Toxina botulnica
Congelado
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Refrigerado Envasado al vaco o en atmsfera modificada Carne molida refrigerada

1 = slo en caso de que la secretaria de salud lo requiera. *= Como microorganismo indicador
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Cuadro 2. Especificaciones sanitarias para carne molida y carne molida moldeada. Lmite mximo. Microorganismo Mesoflicos aerobios Salmonella spp Staphylococcus aureus Lmite Mximo Permisible
Cuadro 3. Lmites mximos permisibles para microorganismos y parsitos en productos crnicos procesados. Producto Cocidos Crudos Curados Marinados o en salmuera Fritos Mesfilos aerobios (UFC/g)
1 2 3
Coliformes fecales (NMP/g)
Salmonella spp en 25 g
Trichinella spiralis
Cisticercos
1 = En planta, 2 =En punto de venta, 3 = No aplica a maduros crudos, N. A. = No aplica
Cuadro 4. Especificaciones sanitarias para productos crnicos curados y cocidos, y curados emulsionados y cocidos
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Microorganismo Mesoflicos aerobios E. coli Hongos y levaduras Staphylococcus aureus Salmonella spp
Lmite Mximo Permisible En planta o frontera
Lmite Mximo Permisible En punto de venta
Cuadro 5. Especificaciones sanitarias de productos crnicos troceados y curados, productos crnicos curados y maduros. En planta ESPECIFICACIONES: (Lmite Mximo)
Mesoflicos aerobios UFC/g Coliformes fecales NMP/g Salmonella spp en 25 g muestra Staphylococcus aureus UFC/g
Curados madurados
Productos crnicos troceados y curados cocidos crudos madurados
En ESPECIFICACIONES: (Lmite Mximo)

Mesoflicos aerobios UFC/g Coliformes fecales NMP/g
punto
de Productos Crnicos
venta:
Curados madurados
troceados y curados cocidos crudos madurados
Salmonella spp en 25 g muestra Staphylococcus aureus UFC/g
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Nombre
Uso y manejo del microscopio
No.
Instrucciones Realiza la siguiente lectura y sigue las instrucciones de tu profesor para el Alumno Reconocimiento de los componentes del microscopio y sobre los diferentes tipos de tinciones necesarias para su uso
Saberes a adquirir
Manera Didctica de Lograrlos
Con el apoyo del profesor comparar un microscopio del laboratorio de la escuela con el que aparece en la imagen.
El microscopio es el instrumento ms necesario para un microbilogo, ya que permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en: Microscopios pticos: La fuente de iluminacin es la luz. a). De campo claro. Permiten la observacin de preparaciones, en su color natural o contrastado mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms brillante. b). De campo oscuro. Permiten la observacin de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. c). De contraste de fases. Gracias a la utilizacin de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el ndice de refraccin de las clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de clulas vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tincin de las mismas. d). De interferencia. Permiten observar clulas vivas sin teir, obtenindose una imagen en relieve de las mismas. e). De fluorescencia. La fuente de iluminacin proporciona luz ultravioleta que excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de formas naturales o aadidas a la preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible. Microscopios electrnicos: La fuente de iluminacin es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. a). De transmisin. Permiten la observacin de muestras teidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos se envan a una
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pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecern oscuras en un fondo ms brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos. b). De barrido. Permiten la observacin de clulas enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prcticas se emplear el microscopio ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos, de iluminacin y pticos) se muestran en la siguiente figura.
La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el nmero de aumentos y en el lmite de resolucin (LR). El nmero de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminacin y el ojo. Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observacin de un microscopio dado debemos incrementar el nmero de aumentos y disminuir el lmite de resolucin (LR). Para conseguir lo primero, casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar segn el tamao de la muestra a observar. Para disminuir el LR podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrnicos) o bien aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparacin y el objetivo un medio ms denso que el aire. Normalmente se utiliza aceite de inmersin. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite, slo si lo son puede utilizarse este producto. En los microscopios que se utilizarn en las prcticas, slo puede utilizarse el aceite de inmersin con el objetivo de 100 aumentos!!
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OBSERVACIN MICROSCPICA Para observar una muestra al microscopio ptico podemos recurrir a: a). Preparacin hmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensin de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. b). Preparacin fijada. Se coloca una suspensin homognea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes qumicos) y despus se tien mediante diferentes tcnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersin. TINCIONES Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos: a). Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. b). Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. c). Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn. Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos. Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de ZiehlNeelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.
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Nombre
Manejo del microscopio ptico y tinciones de microorganismos
No.
Instrucciones Elabora los ejercicios que se piden en cada caso para el Alumno Actitudes a formar Orden Limpieza Responsabilidad Manera Didctica de Lograrlas Siguiendo las indicaciones de manera secuencial y trabajando con pulcritud para evitar contaminacin por microorganismos no deseados.
Competencias Genricas a Desarrollar
1. Se conoce y valora a s mismo y aborda problemas y retos teniendo en cuenta los objetivos que persigue. 4. Escucha, interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante la utilizacin de medios, cdigos y herramientas apropiados. 5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de mtodos establecidos. 8. Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos. Se presenta a los alumnos el equipo, reactivos y material necesario para realizar anlisis microbiolgicos a carne. Se explica a los estudiantes el uso y manejo del microscopio, as como las tcnicas para tinciones diferenciales. Se presenta a los estudiantes los microorganismos que infectan la carne.
Manera Didctica de Lograrlas
En este ejercicio vas a proceder al aislamiento de microorganismos mediante estra en medio slido y a la resiembra de diversos microorganismos en tubos de agar inclinado. Por otro lado aprenders a manejar el microscopio ptico de campo claro y realizars preparaciones hmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que te permitirn observar la forma y tamao de distintos microorganismos, as como algunas estructuras especiales (por ejemplo esporas en Bacillus y corpsculos metacromticos en Lactobacillus). Tambin realizars tinciones diferenciales que te permitirn clasificar microorganismos en distintos grupos (tincin de Gram y de cido-alcohol resistencia).
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MATERIALES Asa de siembra, placas de medio slido y tubos de agar inclinado (Agar Comn: 0,8% Peptona, 0,3% Extracto de carne, 2% Agar, pH 7,2), mechero de alcohol. Microscopio ptico, portaobjetos, cubreobjetos, colorantes. Suspensiones de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Suspensin de yogourt con Lactobacillus. Resiembra de Mycobacterium phlei. 1. AISLAMIENTO. A partir de una suspensin de microorganismos se realizarn estras sucesivas en placas de medio slido. Las placas se incuban luego a 30C durante 24 horas.
2. RESIEMBRA. Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estriles. Luego se incuban a 30C durante 24 horas. Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estriles. Luego se incuban a 30C durante 24 horas.
3. PREPARACION HUMEDA. Con una pipeta Pasteur se coloca una gota de la suspensin de microorganismos en un portaobjetos. Se coloca un cubreobjetos encima y se observa con el objetivo 40 aumentos. 4. TINCIONES Tinciones simples Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular. Tie microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms intensamente con este colorante que el resto de la clula.
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Procedimiento 1. Extensin: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 2. Fijacin: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3. Aadir Azul de metileno y esperar 2 minutos. 4. Lavar con agua 5. Secar. 6. Observar primero con el objetivo x40; luego se aade aceite de inmersin y se observa con el objetivo x100. Dibuja tus observaciones:
Nigrosina (Tincin negativa). Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Procedimiento 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero x40 y luego x100 con aceite de inmersin). Dibuja tus observaciones:
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Tinciones selectivas Tincin de corpsculos metacromticos. Vamos a observar los corpsculos metacromticos en clulas de Lactobacillus, para lo que se toma una muestra de un yogourt con el asa de siembra y se coloca en un portaobjetos (no es necesario poner agua) y se realiza una tincin con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. En esta preparacin se observan dos microorganismos: Lactobacillus, con los corpsculos metacromticos en su interior, y Streptococcus, cuyas clulas forman cadenas en forma de rosario. Tincin de endosporas. Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana, pudiendo alcanzar un dimetro considerablemente mayor que el de la clula. La clula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los gneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax). Procedimiento 1. Extensin (Bacillus). 2. Fijacin. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisin de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Retirar el papel y lavar con agua. 5. Safranina 1 minuto. 6. Lavar con agua.
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7. Secar. 8. Observar (x40, x100).
Dibuja tus observaciones:
Tinciones diferenciales
Tincin de Gram. De gran importancia en Microbiologa porque permite hacer diferenciaciones taxonmicas, separando dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. Procedimiento 1. Extensin de la muestra (Escherichia y Bacillus). 2. Fijacin. 3. Cristal violeta 1-2 minutos. 4. Tirar el exceso de colorante (NO lavar con agua!).
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5. Aadir lugol, esperar 1 minuto. 6. Decolorar con etanol (20 segundos) 7. Lavar con agua. 8. Aadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. 9. Lavar con agua. 10. Secar. 11. Observar (x40, x100). Dibuja tus observaciones:
Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos por una mezcla de cido y alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos cidoalcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin por cido-alcohol. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, por la especfica composicin de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra). Procedimiento 1. Extensin (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). 2. Fijacin. 3. Fucsina fenicada (con emisin de vapores durante 5 minutos). 4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. 5. Aadir cido-alcohol y esperar 30 segundos. 6. Lavar con agua. 7. Aadir Azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Secar.
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10. Observar (x40, x100). Dibuja tus observaciones:
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Nombre
Microorganismos de la carne
No.
Instrucciones Realiza la siguiente lectura y sigue las instrucciones de tu profesor para el Alumno Reconocimiento de los microorganismos que pueden estar presentes en la carne y transmitirse a los humanos Manera Didctica de Lograrlos El profesor conduce la lectura y explica los trminos nuevos, as como las diferentes condiciones ambientales a las cuales se desarrollan dichos parsitos.
Saberes a adquirir
Los microorganismos que infectan la carne pueden tener acceso a la misma cuando el animal esta vivo, a esto se le llama infeccin endgena, o tambin de manera postmortem, conocida como infeccin exgena. Los microorganismos tipo bacteria no deseables pueden ser alterantes del alimento, tales cmo bacterias lcticas, levaduras y mohos, enterobacterias o pseudomonas; o bien patgenos, cmo Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum y bacillus cereus. Existen otro tipo de parsitos que tambin pueden llegar al ser humano y provocarle enfermedades, tales como Taenia solum y Trichinella spiralis. Una enfermedad transmitida por los alimentos es un conjunto de sntomas originados por la ingestin de agua y/o alimento que contengan agentes biolgicos o no biolgicos en cantidades tales que afectan la salud del consumidor en forma aguda o crnica a nivel individual o de grupos de personas. Las enfermedades transmitidas por alimentos pueden causar dos tipos de daos: Infecciones alimentarias: Son las provocadas por la ingesta de alimento y agua contaminados con agentes infecciosos como virus, bacterias, hongos y parsitos, que en el intestino pueden multiplicarse y producir toxinas. Intoxicaciones alimentarias: Son ocasionadas por la ingestin de toxinas producidas en los tejidos de plantas y animales o productos metablicos de organismos en los alimentos o sustancias qumicas incorporadas a stos. Las enfermedades transmitidas por alimentos provocan dolor de cabeza, nauseas, vmitos, diarrea, dolor abdominal, incluso pueden causar daos en rganos vitales como hgado, rin, corazn y sistema nervioso. Los brotes de las enfermedades pueden ser de origen bacteriano, vrico y parasitario.
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PRINCIPALES MICROORGANISMOS Y PARSITOS QUE INFECTAN CARNE Salmonella Es un bacilo pequeo, gran negativo, asporgeno (no esporula), con flagelos que lo rodean; es un microorganismo anaerobio facultativo con reaccin negativa a la oxidasa y positiva a la catalasa; se transmite por contacto directo, cruzado y va sexual. Las serovariedades que infectan personas son Salmonella typhi y Salmonella parathyphi A, S y C. Es muy difundida en la naturaleza, su hbitat es el tracto intestinal desde la boca hasta el ano. Contamina carne, huevos, lcteos, jugos, etc. Es causante de la salmonelosis, tiene un periodo de incubacin de 12 horas a 5 das. Los sntomas pueden durar de 2 a 3 das y causa una mortalidad del 4%. Salmonella tiene parmetros ptimos de crecimiento de pH entre 6.6 a 8.2 y de temperatura entre 35 y 37 C. Listeria monocytogenes Causa listeriosis. Es un bacilo corto, gran positivo, no esporulado, mvil por presencia de flagelos, inmvil a 35 C. Crece con poco oxgeno. Resiste el congelado pero se destruye con el pasteurizado (71 C drante 15 minutos). La contaminacin puede ser a partir de piel, pelos, heces, salas de matanza, salas de refrigeracin, transporte, carne cruda contaminada y carne cocida. Puede causar septicemia, meningitis, abortos, malformaciones, baja fiebre y gastroenteritis. Su periodo de incubacin es desde unos pocos das a tres meses. Crece de manera ptima en condiciones de pH de 7.0 y de temperatura de 37 C. Staphylococcus aureus Causa intoxicacin por txina estafiloccica. Es un coco que crece en grupos, es gran positivo, aerobio y anaerobio facultativo, inmvil y sin cpsula. Tiene un periodo de incubacin de 1 a 7 horas; causa los sntomas comunes cmo diarrea, fiebre, dolor abdominal y vmito. Contamina carne, huevo, leche, ensaladas y alimentos con manipulacin en su preparacin. Puede estar en el aire, aguas residuales, animales y humanos. Clostridium botulinum Causa la enfermedad llamada botulismo. El agente causal es un bacilo gram positivo, anaerobio y esporulado. Se desarrolla en un amplio rango de temperaturas, de 28 a 40 C y a pH superior a 4.5. Produce una neurotoxina potente y termolbil. Aunque su incidencia es baja (5%) causa sntomas con consecuencias fatales, tales cmo, visin doble, somnolencia, cefalea, dificultad para tragar y hablar, vmitos, diarrea, parlisis y muerte por paro respiratorio.
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La infeccin puede ocurrir a partir de productos crnicos procesados y mal conservados y sin coccin. La toxiinfeccin se debe a la supervivencia de esporas en la carne cocida y un crecimiento suficiente durante una refrigeracin insuficiente de productos cocinados (15 a 50 C). Mesfilos aerobios Conjunto de microorganismos aptos para multiplicarse en presencia de aire a temperaturas medias (25 a 40 C). Son capaces de dar lugar a la formacin de colonias visibles despus de 72 horas a 3O C sobre un agar de recuento, se incuba en condiciones de aerobiosis. Coliformes Grupo de microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a 37C y en presencia de sales biliares. Pertenecen a este grupo los gneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter. Su origen puede ser tanto fecal, tracto intestinal de hombre y animales, suelo, polvo, agua y plantas. Resiste en agua, suelo y alimentos durante largos periodos de tiempo, no resisten pasteurizacin ni la congelacin, aunque si la desecacin. Coliformes fecales Grupo de coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente E. coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. Escherichia colli Es un bacilo gran negativo, habitante normal del intestino humano y animal. Sus condiciones ptimas de crecimiento son de pH entre 6 y 7 y de temperatura entre 35 y 40 C; resiste temperaturas de hasta -20 C. E. Colli tiene un periodo de incubacin de 3 a 8 das; causa diarrea acuosa, dolor abdominal, ocasionalmente vmitos y poca fiebre. La cepa 0157:H7, entre otras, es enterohemorrgica causando falla renal. Cisticerco (Taenia solum) El adulto de Taenia solium es un parsito estricto que vive en el intestino delgado de los seres humanos y de algunos mamferos. Es un gusano plano y segmentado que en estado adulto puede alcanzar hasta 7 metros de longitud. Est compuesto por una cabeza o esclex, un cuello angosto y varios cientos de progltidos hermafroditas. En el intestino del hombre puede haber uno o ms individuos adheridos a la pared; stos crecen y se reproducen asexualmente o por fecundacin entrecruzada. Debido a la falta de higiene y a la ingesta de heces, el humano o el cerdo pueden ingerir huevos expulsados por la tenia adulta. Trichinella spirallis
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Es un nematodo que se reproduce sexualmente en la mucosa intestinal, produciendo larvas que forman quistes en msculos esquelticos. La especie Trichinella spiralis causa la enfermedad triquinosis, tambin llamada triquinellosis o triquiniasis. La infeccin por Trichinella ha sido confirmada en 104 especies de mamferos. Los huspedes principales de la Trichinella spiralis son la rata, el cerdo, y el hombre. Las larvas de Trichinella spiralis entran un humano por ingestin de carne cruda o cocinada a media que abrigan larvas infecciosas. Las enzimas digestivas en el estomago digieren la carne y las larvas quedan en libertad. Las larvas entonces escogen un sitio de infeccin en el intestino. Cerca de seis das despus de la ingestin, los gusanos hembra penetran la mucosa del intestino delgado y liberan muchas larvas recin nacidas. Cada hembra produce aproximadamente ente 500 y 1,500 gusanos vivos sobre un periodo de 2 a 5 semanas. Las larvas recin nacidas fluyen por la sangre y pueden penetrar en cualquier clula pero slo pueden sobrevivir en clulas esquelticas del msculo. Las larvas parecen preferir los msculos activos tales como el diafragma y la lengua.
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Nombre
Esquematizando los agentes causales
No.
Con el apoyo de tu profesor realiza esquemas de los agentes causales de las enfermedades descritas en el ejemplo dos. Indica las estructuras anatmicas Instrucciones que lo integran e ilumnalas con colores contrastantes. Puedes usar fuentes de para el Alumno informacin diversas como libros, revistas, folletos e internet. Es importante que los dibujes e ilumines tu mismo. Actitudes a formar Orden y responsabilidad Manera Didctica de Lograrlas
Bsqueda bibliogrfica y en internet.
Competencias Genricas a Desarrollar Manera Didctica de Lograrlas Salmonella
Expresa ideas y conceptos mediante representaciones lingsticas, matemticas o grficas. Identifica los sistemas y reglas o principios medulares que subyacen a una serie de fenmenos.
Haciendo uso del internet como herramienta didctica para desarrollar la competencia para el manejo de la informacin.
Listeria monocytogenes
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Staphylococcus aureus
Clostridium botulinum
Enterobacter (Coliformes fecales)
E. colli
Taenia solum
Trichinella spiralis
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Nombre Competencia a Desarrollar
Deteccin de Salmonella spp I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella
No.
Atributos de la competencia
Instrucciones para el Alumno
Realiza el seguimiento de esta prctica atendiendo las indicaciones del docente. Sigue con orden limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos para evitar fallas en tus resultados. Entregar a los alumnos todos los equipos e implementos necesarios para el desarrollo de la prctica en el laboratorio. Asegurarse que cuente con los instrumentos adecuados para registrar el logro de las competencias, as como las habilidades que requieren reforzamiento o correccin. Proporcionar al alumno los reactivos que utilizar y guiarlo con autoridad, buen trato y amabilidad para el buen logro de su competencia. Equipo de seguridad personal. Material y equipo de laboratorio. Reactivos. Limpieza Orden Responsabilidad
Instrucciones para el Docente
Recursos materiales de apoyo Actitudes a formar
Manera Didctica Atiende las instrucciones de la tcnica a realizar y a las del profesor. de Lograrlas 1. Se conoce y valora a s mismo y aborda problemas y retos teniendo en cuenta los objetivos que persigue. Competencias 5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de Genricas a mtodos establecidos. Desarrollar 8. Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos. Administrando los recursos disponibles teniendo en cuenta las restricciones para el logro de las metas Siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de los pasos contribuye al alcance de un objetivo. Asumiendo una actitud constructiva, congruente con los conocimientos y habilidades con los que cuentas dentro de distintos equipos de trabajo
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Los pasos que debes realizar para durante esta prctica son:
1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: Bata Cubre pelo Guantes
2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el anlisis a realizar 3. Verifica la temperatura y/o presin de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. 4. Limpia y desinfecta el rea de trabajo 5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estndares de calidad requeridos y el anlisis a realizar. En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparacin. Medios de preenriquecimiento Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenitocistina, Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solucin A, Solucin B, Solucin C, Caldo de soya tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio Medios de aislamiento Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para Salmonella y Shigella (SS), Agar entrico Hektoen. Medios para pruebas bioqumicas Agar de tres azcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer), Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rpido, Caldo infusin cerebro corazn Soluciones Solucin verde brillante al 0,1% (1:1000), Solucin de yodo-yoduro, Solucin salina al 0,85%, Solucin salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solucin de alfa-naftol al 5%, Solucin de rojo de metilo, Solucin de hidrxido de potasio al 40%, Solucin de gelatinasa al 5% Antisueros Antisuero polivalente somtico (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi 6. Realiza la toma de muestras aplicando la tcnica adecuada. 7. Prepara la muestra a analizar. Preparacin de los alimentos para el aislamiento de Salmonella
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Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una muestra de 25 g o ms. Procedimiento general para la preparacin de muestras Pesa aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico (stomacher). Adiciona 225 mL del medio de preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licalo si es necesario durante un minuto. Transfiere aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potencimetro. Ajusta, si es necesario, a un pH 6,8 0,2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezcla y cubre el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 2 h a 35C.
Procedimiento especfico para la preparacin de muestra segn el producto Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada Sigue el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicinala lentamente a un matraz Erlenmeyer con 225 mL de solucin verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo quede en la superficie del lquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60 minutos e incbala durante 24 horas +/-2 horas a 35C
8. Realiza la siembra de la muestra aplicando la tcnica adecuada Aislamiento de Salmonella Cierra firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agita suavemente, transfiere respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport. Incuba de 18 a 24 h a 35C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estralo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 2 h a 35C. Examina las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas: a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
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b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. c) Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. e) Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas. Identificacin bioqumica Selecciona al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo. Incubar por 24 2 h a 35C. Almacena en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar ms colonias. Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: f) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfhdrico. g) Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfhdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin. Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuacin: Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios.
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Contina el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta reacciones atpicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y siembra las pruebas bioqumicas nuevamente. Contina la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
Prueba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 2 h a 35C. Prueba de ureasa (rpida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rpida). Incuba 2 h a 37 0,5C en bao de agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Debers retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio). Identificacin serolgica Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) Coloca con asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspende en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI. Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mzclalas con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. Agita inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente un minuto. Observa bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro. Considera cualquier grado de aglutinacin como positiva. La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina. Si observas aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioqumicas complementarias. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los ms frecuentes). Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay aglutinacin con Vi calienta el cultivo a ebullicin y repite la aglutinacin con el antisuero polivalente O. Si se requiere, practica el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).
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Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e incubar de 4 a 6 h a 35C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo da), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 2 h a 35C (para ensayo al da siguiente). Adiciona 2,5 mL de solucin salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazn (BHI). Coloca 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serologa (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Prepara un control de solucin salina mezclando 0,5 ml de solucin salina formalizada con 0,5 ml del antgeno formalizado. Incuba las mezclas en bao de agua a 48-50C. Observa a intervalos de 15 min por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la mezcla de prueba pero no en el control. Debes interpretar como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica.
Pruebas bioqumicas complementarias Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuacin: Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: Agar citrato Simmons Inocula por estra el tubo. Incuba durante 96 2 h a 35 2C. Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde a azul. Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
Medio SIM Inocula por puncin. Incuba durante 24 h a 35 2C.
Movilidad. Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de cultivo. Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente. Produccin de cido sulfhdrico. Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que puede extenderse a todo el medio. Prueba negativa: ausencia de color negro.
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Produccin de Indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo RM-VP Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 2 h a 35 2C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. Prueba de Voges-Proskauer (VP) Transfiere a un tubo un ml del cultivo de 48 h. Adiciona 0,6 ml de solucin de alfa naftol. Adiciona 0,2 ml de solucin de hidrxido de potasio 40%. Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional). Interpreta los resultados despus de incubar durante 2 h a 35 2C o 4 h a temperatura ambiente. Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. Prueba negativa: sin cambio de color. Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h ms a 35 2C.
Prueba de rojo de metilo (RM) Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo. Interpreta los resultados inmediatamente. Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
Caldo malonato Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 40 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color azul. Prueba negativa: sin cambio de color.
Caldo manitol Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 24 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. Prueba negativa: sin cambio de color.
Nota: los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales. 9. Etiqueta y rotula los tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilucin con los datos correctos 10. Verifica la temperatura de incubacin 11. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos
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Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra. 12. Compara tus resultados con los estndares permitidos 13. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado
Recuerda que esta prctica la aplicars en carne cruda congelada, refrigerada, envasada al vaco o en atmsfera modificada, carne molida, carne molida congelada y moldeada!
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Deteccin de Staphylococcus aureus I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella
No.
Realiza el seguimiento de esta prctica atendiendo las indicaciones del docente. Sigue con orden limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos para evitar fallas en tus resultados. Entregar a los alumnos todos los equipos e implementos necesarios para el desarrollo de la prctica en el laboratorio. Asegurarse que cuente con los instrumentos adecuados para registrar el logro de las competencias, as como las habilidades que requieren reforzamiento o correccin. Proporcionar al alumno los reactivos que utilizar y guiarlo con autoridad, buen trato y amabilidad para el buen logro de su competencia. Equipo de seguridad personal. Material y equipo de laboratorio. Reactivos. Limpieza Orden Responsabilidad
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Los pasos que debes realizar para durante esta prctica son: 1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: bata cubre boca cubre pelo guantes
2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el anlisis a realizar 3. Verifica la temperatura y/o presin de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. 4. Limpia y desinfecta el rea de trabajo 5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estndares de calidad requeridos y el anlisis a realizar. Prepara la cantidad de los diferentes medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Baird-Parker, solucin de telurito, Emulsin de yema de huevo, Solucin salina isotnica, caldo de infusin cerebrocorazn, Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera, cloruro de calcio anhidro, solucin de azul de toluidina, solucin amortiguadora Tris pH 9, plasma de conejo). 6. Realiza la toma de muestras aplicando la tcnica adecuada. 7. Prepara la muestra a analizar. 8. Realiza el procedimiento aplicando la tcnica adecuada Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker. Distribuye el inoculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo recto, utilizando una para cada dilucin. Debes mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar. Voltea las placas y colcalas en incubacin durante 45 a 48 h a 35C. Selecciona las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas de Staphylococcus aureus; si no es posible, selecciona las placas de las diluciones ms altas no obstante tengan ms de 150 colonias. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas tambin pueden ser utilizadas y al informe debes agregar la nota de "valor estimado". Las colonias tpicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Selecciona las colonias de acuerdo con el cuadro del anexo 15 para realizar las pruebas de coagulasa y termonucleasa: Seleccionar el nmero de colonias y simbralas cada una en tubos con 0.5 ml de caldo de infusin cerebro-corazn. Incbalas a 35C durante 24 h.
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Inocula en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo. Despus del periodo de incubacin pasar con una pipeta de 1 ml, 0.3 ml de cada cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y consrvalo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo usalo para la prueba de coagulasa. Prueba de coagulasa Agrega a los 0.2 ml del cultivo anterior, 0.2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solucin salina estril. Incubalo en bao de agua de 35 a 37C y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formacin de cogulo, observa a las 24 h. Considera positiva la prueba si hay formacin de cogulo. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo aade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5 ml de plasma reconstituido empleado, formndose un cogulo en 10-15 seg. Prueba de termonucleasa Calienta durante 15 minutos 0.3 ml de cultivo en caldo de infusin cerebro-corazn en bao de agua hirviendo. Pasa una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, incluye testigo. Incuba a 35C en cmara hmeda durante 4 a 24 h. La aparicin de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforacin se califica como positiva. 9. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilucin con los datos correctos. 10. Realiza la incubacin de la muestra a analizar. 11. Verifica la temperatura de incubacin. 12. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos (Ver anexo 16) 13. Compara tus resultados con los estndares permitidos 14. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado
Recuerda que esta prctica la aplicars en carne molida y carne molida moldeada!
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Deteccin de bacterias mesoflicas aerobias I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne
No.
Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella Realiza el seguimiento de esta prctica atendiendo las indicaciones del docente. Sigue con orden limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos para evitar fallas en tus resultados. Entregar a los alumnos todos los equipos e implementos necesarios para el desarrollo de la prctica en el laboratorio. Asegurarse que cuente con los instrumentos adecuados para registrar el logro de las competencias, as como las habilidades que requieren reforzamiento o correccin. Proporcionar al alumno los reactivos que utilizar y guiarlo con autoridad, buen trato y amabilidad para el buen logro de su competencia. Equipo de seguridad personal. Material y equipo de laboratorio. Reactivos. Limpieza Orden Responsabilidad
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Los pasos que debes realizar para durante esta prctica son: 1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: bata cubre boca cubre pelo guantes 2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el anlisis a realizar. 3. Verifica la temperatura y/o presin de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. 4. Limpia y desinfecta el rea de trabajo. 5. Prepara los medios de cultivo de acuerdo con los estndares de calidad requeridos. En caso de contar con medios deshidratados sigue las instrucciones del fabricante. AGAR TRIPTONA- EXTRACTO DE LEVADURA.
FRMULA INGREDIENTES
Extracto de levadura Triptona Dextrosa Agar Agua destilada PREPARACIN Disuelve los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajusta el pH final de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 6.9 +/0.2 a 25C Esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121 +/- 1.0C 6. Realiza el vertido en placa de cultivo de acuerdo a la tcnica descrita. 7. Realiza la toma de muestras aplicando la tcnica adecuada. 8. Prepara la muestra a analizar. 9. Realiza la inoculacin de la muestra aplicando la tcnica adecuada. Distribuye las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin, la adicin del medio de cultivo y homogeneizacin lo hagas libre y cmodamente; marca las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculacin por duplicado.
CANTIDADES / LITRO
2.5 g. 5.0 g. 1.0 g. 15.0 g. 1.0 l.
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Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas en las cajas de petri, mzclalo con 12 a 15 ml del medio de cultivo preparado, mzclalo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa distribucin del inculo en el medio. Cuida que el medio no moje la cubierta de las cajas. Djalas solidificar. Incluye una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente como testigo de esterilidad. Incuba las cajas en posicin invertida por el tiempo y temperatura que se requiera. Etiqueta y rotula las cajas de ensaye de acuerdo al medio y dilucin con los datos correctos. Realiza la incubacin de la muestra a analizar a 35 +/- 0.5 C por 48 +/- 2 h.
10. Verifica la temperatura de incubacin. 11. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos. Despus de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas multiplicar por la inversa de la dilucin para obtener el numero de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondea la cifra obtenida en la cuenta de manera que solo aparezcan dos dgitos significativos al inicio de esta cifra. Ejemplo: 128 redondear a 130; 2417 redondear a 2400. Reporta como unidades formadoras de colonias (UFC)/g o ml de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o en agar nutritivo para cuenta estndar. Incubadas ________horas a ________C. 12. Compara tus resultados con los estndares permitidos. 13. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado.
Recuerda que esta prctica la aplicars en carne molida y carne molida moldeada!
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Deteccin de Escherichia colli I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne
No.
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Debers realizar primero la deteccin de coliformes totales y fecales; cuando la cuenta de coliformes en placa sea 10, confirma la presencia de E. colli siguiendo el mtodo del nmero ms probable (NMP). Los pasos que debes realizar durante esta prctica son: 1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: bata cubre boca cubre pelo guantes 2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el anlisis a realizar. 3. Verifica la temperatura y/o presin de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. 4. Limpia y desinfecta el rea de trabajo. 5. Prepara los medios de cultivo de acuerdo con los estndares de calidad requeridos. En caso de contar con medios deshidratados sigue las instrucciones del fabricante. Caldo EC (E. coli.) Bacto triptosa Bacto lactosa Bacto sales biliares No. 3 Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Agua destilada pH final: 6,9 a 25C. Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se disuelva por completo. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para evitar que queden burbujas en las campanas de Durham. 20,0 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1000,0 ml
Agar McConkey Ingredientes:
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Proteasa peptona o polipeptona Peptona o gelizante Lactosa Sales biliares No. 3 Cloruro de sodio Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada pH final: 7,1 a 25C Preparacin: a. Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. b. Calentar hasta ebullicin para disolver por completo. c. Ajustar el pH. d. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. e. Enfriar a 50-60C y vaciar en cajas Petri. Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L) Peptona Lactosa K2HPO4 Eosina Y Azul de metileno Agua destilada pH final: 7,1 a 25 C Preparacin a) b) c) d)
3,0 g 17,0 g 10,0 g 1,5 g 5,0 g 0,03 g 0,001 g 13,5 g 1000,0 ml
10,0 g 10,0 g 2,0 g 0,4 g 0,065 g 1000 ml
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua. Calentar hasta ebullicin para la disolucin completa. Distribuir en porciones de 100 o 200 ml y esterilizar a no ms de 121C por 15 minutos. Fundir antes de su uso y adicionar a cada porcin de 100 ml: 5 ml de solucin de lactosa al 20% 2 ml de solucin acuosa de eosina al 2% 4,3 ml de solucin acuosa de azul de metileno al 0,15%.
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Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Caldo triptona al 1% (triptofano) Triptona o tripticasa Agua destilada pH final: 6,9 Preparacin a. Disolver los ingredientes b. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm. c. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Caldo MR-VP Medio 1 Ingredientes: Peptona tamponada Glucosa K2HPO4 Agua destilada pH final: 6,9 a 25 C Procedimiento a) Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario. b) Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. c) Esterilizar a 121C por 15 minutos. Caldo citrato de Koser NaNH4HPO4 4H2O KH2PO4 (monobsico) MgSO4 7H2O Citrato de sodio 2H2O Agua destilada pH final: 6,7 a 25 C. Procedimiento a) Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. b) Esterilizar a 121C por 15 minutos. Esta formulacin se recomienda en los Mtodos de Anlisis Oficial de AOAC y en los Mtodos Estndares para el Anlisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere 1,5 g 1,0 g 0,2 g 3,0 g 1000 ml 7g 5g 5g 1000 ml 10 g 1000 ml
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de la composicin del medio deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso. Reactivos Reactivo de Kovacs p-imetilaminobenzaldehdo Alcohol amlico (normal) HCI concentrado 5g 75 ml 25 ml
Procedimiento a) Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico normal. b) Adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4C. Para la prueba de indol a) Adicionar 0,2-0,3 ml del reactivo a 5 ml del cultivo de bacteria en caldo triptona. b) Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Reactivo de Voges-Proskauer (VP) Solucin 1 alfa-naftol Alcohol absoluto Solucin 2 Hidrxido de potasio Agua destilada 40 g para llevar a 100 ml 5g 100 g
Prueba de Voges-Proskauer (VP). a) b) c) d) e) f) Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 horas de incubacin a un tubo de ensaye. Adicionar 0,6 ml de la solucin 1 y 0,2 ml de la solucin 2. Agitar despus de la adicin de cada solucin. Para intensificar y acelerar la reaccin adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente. Leer resultados despus de 4 horas de adicionar los reactivos.
El desarrollo de una coloracin rosa es una prueba positiva. Reactivos para la coloracin de Gram
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Cristal violeta Solucin A Cristal violeta (colorante 90%) Etanol 95% Solucin B Oxalato de amonio Agua destilada Indicador rojo de metilo (R44) a) Mezclar la solucin A y B. Almacenar por 24 horas b) Filtrar a travs de un papel filtro spero. Lodo de Gram Lodo Ioduro de potasio (Kl) Agua destilada a. b. c. d. e. f. g. h. Colocar el Kl en un mortero. Adicionar el yodo. Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. Adicionar 1 ml de agua y triturar Adicionar 5 ml de agua y triturar Adicionar 10 ml de agua y triturar Vaciar esta solucin en una botella de reactivo. Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 ml. 1g 2g 300 ml 0,8 g 80 ml 2g 20 ml
Colorante de contraste (solucin concentrada) Safranina O Etanol al 95% 2,5 g 100 ml
Solucin de trabajo: Adicionar 10 ml de la solucin concentrada a 90 ml de agua destilada. Procedimiento para la tincin de Gram a. b. c. d. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teir. Adicionar la solucin de cristal violeta al frotis. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente y escurrir.
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e. f. g. h. i. j. k.
Aplicar la solucin de yodo por un minuto. Lavar con agua corriente y escurrir. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloracin azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos). Inmediatamente despus enjuagar con agua corriente Escurrir. Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio. Medio EC-MUG
6. Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurnido (MUG) por litro antes de esterilizar (121C por 15 minutos). El caldo EC-MUG est comercialmente disponible.
Procedimiento Agua y hielo Prueba presuntiva a) Agitar la muestra y transferir volmenes de 10 ml a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa de doble concentracin, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml de caldo lauril sulfato triptosa de concentracin sencilla o las siguientes porciones: 10 tubos con 10 ml de muestra; 5 tubos con 20 ml de muestra o una porcin de 100 ml, consultar la tabla del inciso 2 en la preparacin del "caldo lauril triptosa" para la concentracin de caldo lauril triptosa requerido. Los tubos deben contener una campana de fermentacin (Durham). b) Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 horas y observar si hay formacin de gas; si la formacin de gas no se observa, incubar 24 horas ms. Prueba confirmativa a) De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin, para la determinacin de bacterias coliformes referirse a la NOM-112-SSA1-1994. Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del Nmero ms probable, para la determinacin de bacterias coliformes fecales, sembrar en caldo EC. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. b) Para la determinacin de coliformes fecales incubar los tubos a 44,5 0,2C en bao de agua con agitacin durante 24 horas, observar si hay formacin de gas; si la formacin de gas no se observa, continuar la incubacin 24 horas ms, hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de coliformes fecales. Prueba confirmativa para Escherichia coli (por identificacin bioqumica)
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a) Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos y sembrar por estra cruzada en agar EMB-L para su aislamiento. b) Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 horas. c) Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas. Incubar las placas a 35C por 18-24 horas. d) Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa. e) Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos. f) Pruebas bioqumicas Indol, Rojo de metilo, Voges Proskauer, Citrato (IMViC). g) Produccin de indol h) Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 horas. Adicionar 0,20,3 ml de reactivo de Kovacs. La presencia de una coloracin en la superficie del tubo se considera una prueba positiva. Voges-Proskauer (VP) Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35C por 48 horas. Transferir 1 ml a un tubo de 13X100 mm. Adicionar 0,6 ml de solucin de alfa naftol y 0,2 ml de hidrxido de potasio al 40% y agitar. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa. Rojo de metilo Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e incubar a 35C por 48 horas. Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa. Citrato Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un inculo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incubar a 35C por 96 horas. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva. Interpretacin de resultados Todos los cultivos que: 1. Fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 horas a 35C; 2. Sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no esporulados y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1++--, o Biotipo 2-+--, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli basada en la proporcin de los tubos positivos de caldo EC.
Recuerda que esta prctica la aplicars en carne congelada, refrigerada, envasada al vaco o en atmsfera modificada y carne molida refrigerada!
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Deteccin de toxina botulnica I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne
No.
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Fundamento Ratones inyectados intraperitonealmente (IP) con extracto de alimentos, conteniendo > 1 de la dosis letal mnima de toxina botulnica inactiva, presentan despus de 72 h los sntomas caractersticos de la intoxicacin por botulismo. Antitoxinas homlogas pueden proteger al ratn de los sntomas, mientras que otras no, as se determina el tipo serolgico. Esporas viables en alimentos pueden crecer en medios de cultivo adecuado y producir toxinas, la cual es detectada y tipificada. Aparatos Abridor de latas Jarra de anaerobiosis Cajas de petri de 10 mm de dimetro Centrfuga de alta velocidad, refrigerada Jeringas de 1 a 3,0 ml Microscopio Los pasos que debes realizar para durante esta prctica son: 1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: bata cubre boca cubre pelo guantes 2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el anlisis a realizar. 3. Verifica la temperatura y/o presin de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. 4. Limpia y desinfecta el rea de trabajo. 5. Prepara los medios de cultivo de acuerdo con los estndares de calidad requeridos. En caso de contar con medios deshidratados sigue las instrucciones del fabricante. Deteccin de Clostridium botulinum Medios de cultivo y reactivos Caldo de carne cocida Caldo de carne cocida con hgado de res a) Agrega 500 g de hgado fresco de res molido a 800 ml de agua. Calentar a ebullicin y cocer durante 1 h. b) Enfria y ajusta el pH a 7,0 y hervir 10 min. Filtra a travs de una estopilla, presionando el exceso de lquido. c) Aade al caldo 10 g de peptona, 1g de K2HPO4 y 1 g de solucin de almidn. Ajusta el pH a 7,0 y diluye a 1 litro con agua. Filtra a travs de papel grueso. (Si se desea
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puedes almacenar el caldo en congelacin para uso futuro). Para tubos de prueba de 18 o 20 X 150 mm aade hgado a una altura de 1 a 2 cm y de 10 a 12 ml de lquido. d) Esterilizalo en autoclave 20 min. a 121 C. Medio de carne cocida con corazn a) Usa el medio comercial con la siguiente frmula: Corazn de res 454 g Proteasa peptona 20 g Dextrosa 2 g NaCl 5 g b) Suspende 12,5 g del medio en 100 ml de agua fra, mezclalos muy bien y dejalos reposar hasta que las partculas estn bien humedecidas (aproximadamente 15 min.) (Alternativamente aade 1,25 g de medio slido dentro de los tubos de prueba, aade 10 ml de agua fra y mezcla bien para humedecer todas las partculas.). Esterilizalo en autoclave 15 min. a 121 C. pH final: 7,2 0,1. Caldo de tripticasa-peptona-glucosa-extracto de levadura con tripsina (TPGYT). a) Disuelve 50 g de tripticasa, 5 g de peptona, 20 g de extracto de levadura, 4 g de dextrosa y 1 g de tioglicolato de sodio en 1 l de agua, distribuye porciones de 15 ml en tubos de 20 X 150 mm o porciones de 100 ml en botellas de 6 onzas fluidas. Esteriliza en autoclave 10 min. los tubos, o 15 min. las botellas a 121C. Ajusta el pH final a 7,0 0,1. b) Refrigralo, pero descrtalo si no lo usas en dos semanas. Inmediatamente antes de usarlo, calintalo o hirvelo de 10 a 15 minutos para remover el oxgeno, enfrialo rpidamente y aspticamente aade 1,0 ml de solucin de tripsina/ 15 ml de caldo. c) Prepara la solucin de tripsina disolviendo 1,5 g de tripsina en 100 ml de agua. Esteriliza a travs de filtro millipore de 0,45 m o en un filtro equivalente y refrigralo. Agar hgado de ternera-yema de huevo a) Lavar 2 o 3 huevos con cepillo y estilar. Remojar los huevos en solucin 0,1% de cloruro de plata durante 1 h. b) Drena la solucin de cloruro de plata y reemplazar con alcohol al 70%, remojalo durante 30 min. c) Saca los huevos, rompe el cascarn aspticamente y descarta la clara. Remueve la yema con jeringa, colocalos en un contenedor estril y aade un volumen igual de solucin estril de cloruro de sodio al 0,85%. d) Mzclalo muy bien. A cada 500 ml del preparado estril comercial de agar de hgado de ternera deshidratado a 50C, aade 40 ml de suspensin de yema de huevo-NaCl. Mezcla muy bien y vierte en placa. Seca las placas 2 das a temperatura ambiente o durante 24 h a 35C. Descarta las placas contaminadas y almacena las placas estriles en refrigeracin. Agar anaerbico de huevo a) Disuelve 5 g de extracto de levadura, 5 g de triptona, 20 g de proteasa peptona, 5 g de NaCl y 20 g de agar en1 litro de agua. Ajusta el pH a 7,0 y distribuye 500 ml dentro de un frasco de 1 litro para luego esterilizar en autoclave 20 min. a121C.
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b) A 500 ml de agar fundido a 45 - 50C, aade 40 ml de suspensin de yema de huevoNaCl, prepralo como el medio anterior, mezcla y vacia inmediatamente en placas. Seca y almacena las placas estriles 2 das a temperatura ambiente o durante 24 horas a 35 C. Buffer gel-fosfato. pH 6,2. a) Disuelve 2 g de gelatina y 4 g de Na2HPO4 en 1 l de agua con calentamiento suave. Distribuye dentro de una botella de 100 ml de leche diluida. Esteriliza en autoclave 20 min. a 121C.
Preparaciones de antitoxinas Clostridium botulinum. Tipos desde A hasta F o polivalente A-F. rea de trabajo Debes trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra-limpio, clase 100. (El equipo debe proveer un ambiente libre de partculas de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% en un flujo de 100 pies/minuto. La desinfeccin de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la concentracin recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min. Antes de efectuar el trabajo. Para controlar la eficacia del flujo, debes poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centro del rea de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operacin. Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubculo perfectamente limpio, lavado con agua y jabn, desinfectndolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajar entre dos mecheros Bunsen. Preparacin de la muestra Examen preliminar Tener las muestras refrigeradas. Los alimentos enlatados cerrados no necesitan refrigeracin, a menos que la lata est abombada o haya sido abierta. Llevar anotaciones de las condiciones del contenedor. Limpiar e identificar el contenedor. Alimentos slidos Transfiere aspticamente una porcin con poca cantidad de lquido o libre de ste a un mortero estril. Aade una cantidad igual del buffer gel-fosfato estril y muele con el pistilo estril. Alternativamente inocula pequeas piezas de muestras con pinzas estriles dentro del caldo de enriquecimiento. Alimentos lquidos. Inocular con pipetas estriles directamente al caldo de enriquecimiento. Alimentos enlatados Lava el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabn; enjuaga y deja secar. Remoja con un sanitizante durante 10 a 15 min la tapa contraria a donde est grabado el lote. Escurre el lquido y scalo con la flama de un mechero. Destapa con un abridor de
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latas sanitario estril. En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fcil, abrelas por la cara opuesta. Frascos de vidrio Lava la tapa del frasco y sumrgelo durante 15 min en una solucin sanitizante, de manera que quede cubierta la tapa; esta solucin puede ser cloro 100 mg/kg. Coloca un algodn estril en torno a la tapa y con un punzn estril haz un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vaco y pueda abrirse con facilidad. Abre el frasco sin contaminar los bordes del mismo. Preparacin de latas alteradas Lava el envase con un cepillo, con agua caliente y jabn; enjuaga y secalo. Si la lata est muy inflada, gurdala en refrigeracin antes de abrirla. Limpia y desinfecta la tapa con una solucin de cloro 10 mg/kg o yodo al 2% en alcohol al 70% limpialo con gasa estril. En latas muy infladas de pH muy cido, es necesario hacer una prueba para hidrgeno, con objeto de conocer si el gas se debe a la accin del cido sobre el metal. Para ello, practica una pequea puntura en el centro de la tapa y recibe el gas en un tubo de ensaye invertido; inmediatamente ponlo sobre la flama. Una pequea explosin indica la presencia de hidrgeno. No debes flamear directamente el orificio de la lata. Para abrir latas infladas, coloca un embudo invertido sobre la tapa y pica con un picahielo estril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata. Examen visual Nota la apariencia, olor y si hay evidencia de descomposicin. NO PRUEBES EL PRODUCTO bajo ninguna circunstancia. Muestra reserva Despus de cultivar, remueve aspticamente una porcin de la muestra a una jarra estril para pruebas posteriores para cualquier aclaracin. Deteccin de C. botulinum viables. Enriquecimiento Elimina el oxgeno disuelto del medio antes de la inoculacin, aplicando vapor de 10 a 15 min. y enfriando rpidamente sin agitacin. Inocula dos tubos de caldo de carne cocida con 1-2 g o 1-2 ml del alimento o extracto/15 ml de caldo, introduciendo el inculo lentamente por debajo de la superficie del caldo. Incubalos a 35C. De forma similar inocula 2 tubos de caldo TPGYT e incubalos a 26C. Examen Despus de 5 das, revisa los cultivos determinando si existe turbidez, produccin de gas, digestin de partculas de carne y olor. Tambin examina con el microscopio de contraste de fases, los "montculos" hmedos que se forman en el medio o bien, haz la observacin de un frotis teido con Gramm, cristal violeta o azul de metileno con el microscopio de campo brillante. Observa la morfologa de los organismos y anote la existencia de clula "clostridiales" tpicas, la presencia y extensin relativa de la esporulacin, as como la localizacin de las esporas dentro de las clulas. Tratamiento posterior Por lo general, a los 5 das de la incubacin se produce el crecimiento ms activo y la mayor cantidad de toxinas y clulas esporuladas. Manten el cultivo en el refrigerador para hacer el aislamiento en cultivo puro. Si no hay crecimiento despus de 5 das, incuba
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adicionalmente 10 das para detectar una posible germinacin tarda de las esporas de C. botulinum antes de descartar el cultivo como estril. Aislamiento de cultivos puros Si existe buena esporulacin de C. botulinum, ste puede aislarse de la flora mixta en el medio de enriquecimiento o a partir de la muestra original. Pretratamiento Adiciona un volumen igual de alcohol absoluto esterilizado por filtracin en un tubo con tapn de rosca. Mezcla bien e incuba durante 1 hora, a temperatura ambiente. Alternativamente, calienta de 1 a 2 ml de medio de enriquecimiento a 80C durante 10-15 min para destruir clulas vegetativas. (No uses el tratamiento trmico para el C. botulinum tipo C no proteoltico). Siembra Con una asa de inoculacin, haz 1 o 2 siembras de cultivos tratados con alcohol o trmicamente, si es necesario diluidos en agar hgado/yema de huevo o agar yema de huevo anaerobio desecados con la finalidad de obtener colonias aisladas. Incuba los medios 48 h a 35C en condiciones anaerobias en sistemas Gas-Pak, jarra anaerobia o equivalente. Seleccin de las colonias Las colonias tpicas son ramificadas o planas, lisas o rugosas, presentando generalmente bordes extensos e irregulares. En el medio yema de huevo, las colonias usualmente presentan superficies iridicentes cuando es examinada con luz oblicua. La zona realzada es llamada tambin "capa perlada". La zona generalmente se extiende mas all y el contorno de la colonia es irregular adems de la zona perlada, las colonias de los tipos C, D, E, estn rodeadas comnmente de un amplio halo amarillo (2-4) mm). Esta zona es generalmente pequea para los tipos A, B. No todas las colonias tpicas producirn toxinas. Algunos miembros del gnero Clostridium tienen las caractersticas morfolgicas tpicas, pero no producen toxinas. Cultivos Con asa estril, inocula cada una de 10 colonias seleccionadas en un tubo con medio estril: Caldo TPGYT para C. botulinum tipo E, incubando 5 das a 26C. Caldo carne cocida para otros tipos de toxinas, incubando durante 5 das a 35C. Usa cultivos para confirmar como en el siguiente punto y para deteccin e identificacin de la toxina como se indica posteriormente. Confirmacin Haz una siembra por duplicado de los cultivos indicados con anterioridad en medios agar yema de huevo, incubando un medio anaerbicamente y otro aerbicamente, ambos a 35C. Si encuentras colonias tpicas de C. botulinum en el medio anaerobio, pero no en el aerobio, el cultivo puede ser puro. Si no se logra el aislamiento de C. botulinum a partir de >1 de las colonias seleccionadas puede indicar que la presencia de C. botulinum dentro de la flora mixta es baja. Repite las transferencias seriadas aumentando pasos de enriquecimiento, lo que puede dar como resultado el incremento en el nmero de colonias lo suficiente para permitir el aislamiento. Almacena el cultivo puro ya sea refrigerndolo o liofilizndolo.
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Deteccin de la toxina Preparacin de la muestra Extiende los alimentos slidos con una cantidad igual de buffer de gel - fosfato, macerndolo en un mortero enfriado y estril. Centrifuga el producto macerado y los alimentos lquidos que contengan slidos suspendidos bajo refrigeracin. Enjuaga los envases sospechosos de haber contenido alimentos con toxinas, con unos cuantos ml de buffer de gel-fosfato. Utiliza el mnimo volumen posible, a fin de evitar la dilucin de la toxina. Tratamiento con tripsina Las toxinas de tipo no proteoltico si estn presentes, pueden necesitar activacin con tripsina para ser detectadas. No uses este tratamiento con el cultivo en Caldo de tripticasa-peptona-glucosa-extracto de levadura con tripsina (TPGYT), ya que ste puede contener tripsina. El tratamiento posterior, puede degradar alguna toxina totalmente activada presente en el cultivo. Si es necesario, ajusta la porcin del sobrenadante del alimento, alimento lquido o medio de carne a un pH 6,2 con NaOH 1N o HCl, si es necesario. Prepara una solucin saturada de tripsina, por la dispersin de 1 g de tripsina en 10 ml de agua en un tubo de cultivo puro. Mezcla 0,2 ml de solucin de tripsina con 1,8 ml del lquido que vas a evaluar. Incuba a 37C por 1 h, agitando ocasionalmente de manera suave. Prueba de toxicidad Cada prueba se efecta por duplicado, por ejemplo: diluye parte del sobrenadante de alimentos tratados y sin tratar con tripsina, alimento lquido, o cultivo a diluciones 1:2, 1:10 y 1:1000, respectivamente, con buffer de gel-fosfato. Inyecta las diluciones a pares separados de ratones de 15-20 g de peso por va intraperitoneal. Calienta 1,5 ml de lquido original no tratado durante 10 min. a 100C para control. Enfra e inyecta 0,5 ml de este fluido a un par de ratones. Estos no deben morir, debido a que si hubo toxina, sta ya se inactiv por calor. Observa peridicamente a los ratones durante 72 h, registrando sntomas y el momento de las muertes. Los sntomas del botulismo se iniciarn usualmente a las 24 h con erizamiento del pelo, respiracin laboriosa, debilidad de las extremidades, finalmente parlisis total con jadeo, y muerte por falla respiratoria. La muerte sin sntomas de botulismo, no es suficiente evidencia de que el material inyectado contena la toxina. Puede haber muertes por contaminacin del inculo o por traumatismo. Si a las 72 h de haber recibido el inculo tratado trmicamente mueren estos ratones, repite la prueba usando diluciones mayores. Es necesario saber con qu diluciones mueren los ratones para establecer la Dosis Letal Mnima para poder conocer la cantidad de toxina presente. Esta DLM corresponde a la mxima dilucin que mata a los ratones inoculados. Clculo = DLM/ml Tipificacin de la toxina Diluye antitoxinas monovalentes contra los tipos A, B, E y F en una solucin de NaCl al 0,85% hasta una concentracin de 1 Unidad Internacional/0,5 ml. Prepara suficiente antitoxina diluida para inyectar 0,5 ml de todas las diluciones a ratones por cada dilucin de la preparacin a probar.
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Usa la preparacin que haya alcanzado la mxima DLM, ya sea tratada o no. Si es no tratada, la misma preparacin puede ser usada como se utiliz para la prueba de toxicidad; si la preparacin ms letal fue no tratada, prepara solucin tratada con tripsina fresca, ya que la accin de la tripsina puede ir inactivando la toxina. Prepara diluciones suficientes que sean por lo menos 10, 100 y 1000 veces menos potentes que el valor DLM determinado previamente. Inyecta intraperitonealmente varios grupos de ratones, inoculndo 0,5 ml a cada ratn de antitoxina diluida 30 a 60 min antes de desafiarlos con la inyeccin intraperitoneal de las preparaciones txicas. Inyecta parejas de ratones protegidas con anticuerpos monovalentes con cada dilucin de la toxina por va intraperitoneal. Asimismo, inyecta parejas de ratones no protegidos con cada una de las diluciones txicas como control (este protocolo requiere de 30 ratones) 3 pares para cada una de las 4 antitoxinas monovalentes, cada par debe desafiarse con alguna de las 3 diluciones de la preparacin txica (2X3X4 = 24), ms 1 par de ratones no protegidos para cada dilucin de material txico como control (2X3 = 6). Observa a los ratones durante 72 h para detectar sntomas de botulismo y registra el momento de las muertes. Si los resultados indican que la toxina no ha sido neutralizada, repita la prueba usando antitoxinas monovalentes para el C y D, adems de un juego de antitoxinas polivalentes de los tipos A a la F. Interpretacin La toxina en el alimento implica que si ste es consumido sin tratamiento trmico, podra causar botulismo. La presencia de la toxina en el alimento, es un requisito para que se presente el botulismo. La presencia de C. botulinum viable sin la toxina, no es una indicacin de que el alimento en cuestin provoque botulismo. Los organismos ingeridos pueden encontrarse en el tracto alimentario pero se considera que son incapaces de multiplicarse y producir toxinas en vivo. La presencia de la toxina botulnica y/o los organismos en alimentos enlatados de baja acidez (pH > 4,6) significa que los productos fueron mal procesados o contaminados despus. Es ms probable que las latas hinchadas contengan la toxina que las latas "planas", debido a que la bacteria produce gas durante su crecimiento. La presencia de la toxina en una lata plana o no abombada puede significar que las uniones estaban suficientemente flojas para que el gas escape. La toxina que se presenta en los alimentos generalmente es la de tipo A o la cepa proteoltica B, ya que las esporas de las cepas proteolticas son de las esporas ms termorresistentes. Las esporas de los tipos B, E y F no proteolticas no son muy resistentes a las temperaturas altas y no sobreviven a tratamientos trmicos moderados. La proteccin de los ratones contra el botulismo y la muerte de uno protegido con antitoxina botulnica monovalente confirman la presencia de la toxina y determina el serotipo de la muestra en la prueba. Si los ratones no estn protegidos por ninguna de las antitoxinas monovalentes, puede deberse a la presencia de una gran cantidad de toxina en la muestra, o ms de un tipo de toxina en la muestra, o bien la muerte puede deberse a muchas otras causas. En cualquier caso, es necesario volver a desafiar con las mayores diluciones, debiendo usarse mezclas o combinaciones de antitoxinas en lugar del suero monovalente. Si los ratones siguen desprotegidos, algn otro material txico termoestable podra ser responsable, si tanto las preparaciones calentadas y no calentadas causan muertes.
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Tambin es posible que alguna sustancia txica termoestable enmascare a la toxina botulnica.
Recuerda que esta prctica la aplicars en carne envasada al vaco o en atmsfera modificada!
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Olvidar la indumentaria requerida para el proceso No limpiar el rea de trabajo No comprobar las condiciones del equipo No verificar que las llaves de gas y agua estn bien cerradas No lavar el instrumental No esterilizar el material sucio y contaminado No separar el medio de cultivo para su desecho No checar el pH del medio No apagar los equipos que no estn usndose Olvidar verificar la temperatura y tiempo de esterilizacin Olvidar verificar la temperatura de incubacin Olvidar el tiempo de incubacin Pesar de manera equivocada los reactivos Olvidar rotular
Escribe en la columna de la derecha las posibles soluciones, de acuerdo a la contingencia planteada en la columna de la izquierda. Contingencia No hay agua destilada No hay agua esterilizada El equipo est sucio No hay energa elctrica Desconoces el equipo a usar Se descompone algn equipo Posible solucin
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El medio est contaminado con agentes extraos No rotulaste los cultivos Utilizar zapatos resbalosos y/o con tacn Falta algn reactivo El laboratorio no est disponible No rotulaste tus cultivos El equipo est sucio La indumentaria no es la correcta Desconoces el equipo a usar Se descompuso un equipo El medio est contaminado con agentes extraos
Haz terminado el desarrollo para lograr la primera competencia de este submdulo. La intencin ha sido guiarte para que desarrolles habilidades y destrezas que te permitan desempearte correctamente en los sitios de insercin laboral relacionados con esta competencia, pero adems de esto, esta gua tiene la intencin de que desarrolles habilidades para que seas cada vez una mejor persona en lo social, lo moral y lo laboral. En cuanto a conocimiento estamos seguros que lograste la comprensin de normas oficiales importantes, como ha sido durante el seguimiento de las guas anteriores, pero tambin esperamos que hayas trabajado ms cercano a tu profesor y realizando un verdadero trabajo en equipo con tus compaeros. Estamos seguros que ya eres competente para realizar anlisis microbiolgico a la carne.
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REALIZAR ANLISIS MICROBIOLGICOS A DERIVADOS CRNICOS, DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES DE LA MATERIA
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Toma de muestra. Toxicologa de los alimentos. Cuenta de bacterias mesoflicas aerobias. NMX-F-253-1977. Cuenta de organismos coliformes. NMX-F-254-1977. Mtodo de conteo de hongos y levaduras en alimentos. NMX-F-255-1978. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgicos. NMX-F-285-1977. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgicos. NMX-F-286-1992. Mtodo general de investigacin de Salmonella en alimentos. NMX-F-304-1977. Cuenta de organismos coliformes fecales. NMX-F-308-1992. Determinacin de cuenta de estafilococo aureus, coagulasa positiva en alimentos. NMX-F-310-1978. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-092-SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras en alimentos para sus anlisis microbiolgicos. NOM-110-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. NOM-111-SSA1-1994. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. NOM112-SSA1-1994. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. NOM-114-SSA1-1994. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. NOM-115SSA1-1994.
Toma de muestra, para su anlisis Importancia de la toxicologa en los productos crnicos !
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Nos unimos para trabajar Prcticos y eficientes!
Protagonistasenelcontroldeproceso Algunosmicrosyotrosmacrostodossonimportantes. Parientescercanos Escoco.peronosecome! Fielamiga,
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Hola que tal ?....Los alimentos en general, en su forma natural, poseen una carga determinada de microorganismos, estos pueden ser bacterias, mohos, levaduras, protozoarios o virus. Y la carne no es la excepcin. Los productos elaborados a base de carnes, forman una parte fundamental de la dieta actual del hombre. Esto deriva que los productos elaborados hayan sido preparados con la higiene y seguridad, adecuada y con las buenas practicas de manufactura requeridas para garantizar los estndares de calidad establecidos. Para ello, es necesario realizar una serie de anlisis microbiolgicos, que avalen dichos lineamientos, y legislaciones. en su elaboracin, presentacin y comercializacin. El papel del Tcnico en Anlisis y tecnologa de los Alimentos, ser entonces poder realizar los anlisis microbiolgicos, correspondientes para su respaldo de calidad, comercializacin y creciente desarrollo. Esta gua te ayudar para que de una manera prctica desarrolles habilidades y destrezas con la finalidad de que logres desempearte en el rea de control de calidad microbiolgica en las empresas procesadoras de carnes.
Recuerda que de las actividades que realizars, algunas las podrs desarrollar en el aula y otras en el laboratorio. Antes del desarrollo de cada prctica, verificars los servicios auxiliares, disponibilidad de equipo y contars con la indumentaria que requieres para trabajar. Se te proporcionan conocimientos, ejemplos y ejercicios que necesitas para desarrollar las competencias. No olvides colocar las evidencias (Gua de observacin y Lista de cotejo), en tu portafolio para lograr la competencia evaluada.
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ATRIBUTOS DE LA COMPETENCIA
Realiza el anlisis de cuenta total. Realiza el anlisis de conteo de hongos y levaduras. Realiza el anlisis de coliformes totales. Realiza el anlisis de coliformes fecales. Realiza el anlisis de Staphylococcus aureus (dorado). Realiza el anlisis de Salmonella El estudiante efecta anlisis microbiolgicos a derivados crnicos, de acuerdo a las NORMAS vigentes en la materia y a los requerimientos establecidos del sector productivo crnicos, siguiendo procedimientos e instrucciones de manera reflexiva.
RESULTADO DE APRENDIZAJE
El facilitador realiza la presentacin de la competencia a desarrollar la cual abarca la siguiente informacin: Aplicacin de una evaluacin diagnstica Resultado de aprendizaje. Atributos profesionales que componen a la competencia. Evidencias de desempeo y evidencias de producto a evaluar. Prcticas programadas y Prcticas integradoras. Normas oficiales vigentes a seguir. Criterios e instrumentos de evaluacin. Sobre las actitudes y valores que el estudiante debe de mostrar.
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Nombre
1. Toma demuestra.
No.
Con informacin proporcionada por el facilitador, ms la investigacin que Instrucciones realices, sobre la toma de muestras, mediante un diagrama de flujo represnta los para el Alumno pasos a seguir, en la toma demuestra. Describe los pasos a seguir para la toma de muestras por medio de un diagrama de flujo. Checar: norma
Saberes a adquirir
Toma de muestras para anlisis microbiolgico
Manera Didctica de Lograrlos
NOM-109-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico
Materiales:
Preparacindel materialparatoma demuestra:
Procedimiento;
Conservacinytrasporte Identificacindelamuestra: Informeparaentregade laboratorio:
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Nombre
Cmo y cuanto debo?
No.
Tu facilitador te expondr la forma y manera de tomar las muestras de un alimento Instrucciones para su anlisis microbiolgico, pon mucha atencin porque estos saberes los para el Alumno aplicaras en tus actividades Orden Limpieza Respons abilidad Manera Didctica de Lograrlas Pon atencin a la explicacin y toma las notas que consideres importantes, porque esto lo usars en las actividades que continan.
Actitudes a formar
Competencias Genricas a Desarrollar Manera Didctica de Lograrlas
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de mtodos establecidos. A) Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo. Siguiendo las instrucciones y los procedimientos de manera reflexiva para alcanzar el objetivo.
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De acuerdo alo que investigaste, te podrs dar cuenta que, son varios aspectos a considerar para la toma de muestras. Tipo de muestra, estado fsico, transporte, etc. Criterios Generales de Muestreo.

Todo el material que se use debe esterilizarse y envolverse. Al colectar la muestra hay que evitar contaminacin del ambiente (polvo, tierra, agua, saliva). Rotular o etiquetar. Consignar informacin que pueda afectar la prueba o el significado del resultado. Por ejemplo la presencia de algn conservador, olor, color, condiciones de conservacin, temperatura.
Para muestras slidas se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en recipientes o piezas grandes habr que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una muestra representativa. O bien manejar varias muestras independientes de reas que se considere pueden tener mayor riesgo.

En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la superficie y profundas (minimizando la contaminacin de la superficie). En alimentos congelados se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar.
Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeracin (2-8C) o en congelacin si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar el alimento.

Reducir el tiempo comprendido entre recoleccin y entrega de la muestra. Muestras lquidas deben encontrarse homogneas, emplearse de 100 a 500 ml. Obtencin de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda de bistur y pinzas, uso de hisopos inertes estriles humedecidos en solucin diluyente estril. Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmsfera y usar lquidos de dilucin con bajo potencial redox como el medio de Stuart (con tioglicolato) o medio enriquecido para clostridios (con cistena).
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Nombre
Nos unimos para trabajar
No. 1
Instrucciones 1. En el siguiente cuadro completa que tipo demuestra hace referencia, para su para el manejo y anlisis microbiolgico Alumno Orden Limpieza Responsabilidad Manera Didctica de Lograrlas Elije la palabra que complete de manera adecuada al manejo y tipo demuestra.
Actitudes formar
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de mtodos Competencias establecidos. Genricas a A) Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo. Desarrollar
Manera Didctica Lograrlas
Siguiendo las instrucciones y los procedimientos de manera reflexiva para de alcanzar el objetivo.
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slidas
Superficie y profundas
congeladas
1.- En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la (minimizando la contaminacin de la superficie). 2.- Para muestras..se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en recipientes o piezas grandes habr que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una muestra representativa. 3.- En alimentos: se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar
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Nombre 2.- Toxicologa de alimentos
No.
Instrucciones Mediante la informacin proporcionada por el facilitador y aunado a la investigacin para el Alumno que t realices, ejecuta una lectura comentada de la toxicologia delos alimentos. Aspectos toxicolgicos que afectan a los derivados crnicos Manera Didctica de Lograrlos
Saberes a adquirir
Analiza y comenta la lectura propuesta por el facilitador.
Deliciosa, pero... La carne o fibra muscular animal es un alimento que se critica severamente porque se suele relacionar con enfermedades como obesidad, problemas del corazn, colesterol elevado y hasta ciertos tipos de cncer; empero, estas afirmaciones son verdades a medias que deben matizarse para no caer en posiciones extremistas. En primer lugar podemos decir que, en efecto, el considerable abuso de carnes rojas en la dieta del ser humano occidental ha favorecido el incremento de enfermedades mortales o que generan incapacidad, debido a que a travs de este alimento se ingieren importantes cantidades de ciertas sustancias que en otras circunstancias seran benficas. El caso ms notable y alarmante es el colesterol, compuesto graso que se requiere para regular varias funciones del organismo a nivel celular, pero que en grandes cantidades puede agravar enfermedades como presin arterial alta (hipertensin) y desencadenar problemas tan delicados como aterosclerosis (acumulacin de grasas y taponamiento de las venas) y paro cardiaco. Tambin cabe mencionar el caso del cido rico, que normalmente facilita desplazamiento y movimiento corporal, pero que en grandes cantidades ocasiona dolor incapacitante y gota, que es la inflamacin en una o varias articulaciones debido a la cristalizacin y acumulacin de este compuesto. Otro problema notable se deriva de la manera en que se prepara este alimento, ya que cuando la carne se cuece y dora directamente al fuego vivo (al carbn o a la lea), se forman compuestos cancergenos que generan tumoraciones en estmago, intestino
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grueso y delgado. El riesgo de este problema aumenta si la dieta est basada en poca diversidad de alimentos, en donde no estn presentes productos de origen vegetal ricos en fibra y vitaminas C y E
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Nombre
! Importancia de la toxicologa en los productos crnicos !
No.
Tu facilitador te expondr la importancia que tiene la toxicologia delos nitritos en los embutidos carnicos, pon mucha atencin porque estos saberes los aplicars en tus actividades. Orden Limpieza Responsabilidad Manera Didctica de Lograrlas Pon atencin a la explicacin y has un apunte de acuerdo a tu criterio de importancia
Actitudes a formar
4.- Escucha interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante la utilizacin de medios, herramientas y cdigos apropiados
Siguiendo las instrucciones y los procedimientos de manera reflexiva para alcanzar el objetivo.
Las sales de sodio y potasio de los nitritos y nitratos se usan en la mezcla de curado de diferentes productos crnicos, principalmente en la elaboracin de embutidos. La funcin de estas sales es mltiple ya que: a) desarrollan un color caracterstico al formar la nitrosimilglobina; b) actan como agente inhibidor del crecimiento de Clostridium botulinum, y c) contribuyen al sabor de los productos crnicos. El mecanismo de accin antibacteriano de los nitritos y nitratos no se conoce totalmente, pero existen diferentes teoras al respecto. Se sabe que los nitritos forman sustancias toxicas para los microorganismos cuando reaccionan con los grupos sulfhidrilo de las protenas, o con algunos mono fenoles como la tirosina, de donde se derivan compuestos nitrados monoaminodisustituidos. Recientemente se ha desarrollado un gran inters por el estudio de los efectos biolgicos que los nitritos y nitratos ejercen sobre el humano; esto se debe a su capacidad de reaccionar con diferentes aminas parea formar nitrosaminas, que muestran un efecto cancerigeno cuando son suministradas a diferentes animales de laboratorio. Los estudios biolgicos de toxicidad de las nitrosaminas han sido efectuados con muy altas concentraciones de este compuesto, y por lo tanto los resultados se deben tomar con mucha precaucin
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Nombre Instrucciones para el Alumno
Prcticos y eficientes!
No.
En las expresiones siguientes escribe en el parntesis una V si es verdadero, y una F si falso, de acuerdo a las propiedades de los nitritos y nitratos. Orden Limpieza Responsabilidad
Actitudes a formar
Investiga las propiedades microbiolgicas de los nitritos y nitratos
1.- Se conoce y valora as mismo y aborda problemas y retos teniendo en cuenta los objetivos que persigue. D) Analiza crticamente los factores que influyen en su toma de decisiones. F) Administra los recursos disponibles teniendo en cuenta las restricciones para el logro de sus metas.
Analizando crticamente su toma de decisiones y aprovechando los recursos con los que cuenta para lograr el objetivo.
VerdaderoV.Falso F Retardan el desarrollo de rancidez
(
El nitrato de sodio es transformado en su correspondiente nitrito a travs de la accin de microorganismos externos de la carne Inhiben el crecimiento de cierta microflora, en especial de los clostridios, como Clostridium botulinum Contribuyen a impartir un sabor caracterstico a carne curada Reaccin presentada en los nitritos: NaNO3 bacterias NaNO2 + O2
) )
( ( (
) ) )
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Nombre Competencia a Desarrollar Atributos de la

competencia
Protagonistas en el control de proceso.
No.
Realizar anlisis microbiolgico, de acuerdo a las normas vigentes de la materia.
Realizar el anlisis de cuenta total
1. Realiza la tcnica de determinacin de cuenta total en muestras de derivados Instrucciones crnicos, atendiendo las indicaciones de tu facilitador. 2. Realiza con orden, limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos del para el Alumno procedimiento. 3. Entrega a tu facilitador el reporte de los resultados obtenidos. Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo
Guiar y auxiliar al estudiante para que realice la tcnica de cuenta total
Laboratorio de usos mltiples, guas de observacin, listas de cotejo, indumentaria de seguridad, material y equipo de laboratorio, materia prima a analizar.
Actitudes a formar
Orden Limpieza Responsabilidad
Aplicando sus habilidades para efectuar el desarrollo del procedimiento en la realizacin del anlisis e interpretacin del resultado obtenido.
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de mtodos establecidos. A) Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo. E) Sintetiza evidencias obtenidas mediante la experimentacin para producir conclusiones y formular nuevas preguntas. Desarrollando mtodos establecidos y siguiendo los procedimientos para alcanzar su objetivo; obteniendo conclusiones a partir de la experimentacin, y colaborando en equipo.
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Prctica sugerida Cuenta total: La cuenta total o flora aerbica total se determina con el fin de conocer el grado de contaminacin del producto y para comparar el resultado con las normas establecidas vigente.
Materiales y equipo. 1) Cajas petrit 2) Tubos de ensaye con tapa rosca 3) Pipetas 4) Autoclave 5) Cuenta colonias 6) Mechero 7) Tripie 8) Soporte universal 9) Campana de flujo laminar 10) Asa bacteriolgica 11) Probetas 12) Matraz erlenmeyer 13) Incubadora 14) Agua destilada 15) Material para esterilizar (algodn, papel absorbente, gasa ,masking tape) 16) Muestras de derivados crnicos 17) Medio recultivo para mesfilos aerobios Procedimiento: 1) Antes y despus de cada sesin practica los estudiantes debern portar su indumentaria completa y limpia(bata blanca abotonada, cofia y cubre bocas) 2) Antes y despus de cada sesin los estudiantes debern de limpiar y desinfectar sus mesas de trabajo, rea y equipo. 3) Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminantes sean colocados en recipientes especficos. 4) Cuando se utilice el mechero este deber de estar alejado del microscopio y otros equipos. 5) Pesar 5grs. De muestra slida 6) Vaciar la muestra a un frasco estril y agregar 45ml de agua destilada estril 7) Homogenizar la muestra con movimientos giratorios por aprox. 10 min. 8) Prepara y esterilizar medio de cultivo requerido. 9) Cerca del mechero etiquetar dos cajas petrit, una que ser la de muestra y la otra ser la testigo. El medio de cultivo con una temperatura de 40 a 50 se vaca a las cajas (aproximadamente de 25 a 30ml), en zona asptica.
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10) Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 min.), y posteriormente sembrar la muestra por estra, de manera directa con el asa bacteriolgica. poner a incubar en forma invertida en la estufa clnica, por 48Hrs a 37C 11) Esterilizar el asa bacteriolgica calentndola al rojo en la parte ms alta de la flama del mechero antes y despus de la siembra. 12) Flamear las bocas del os recipientes antes y despus de tomar la muestra a inocular. 13) Realizar la siembra en el menor tiempo posible a efecto de minimizar el tiempo de exposicin en el que puede ocurrir una contaminacin. 14) La muestra Testigo solo llevara el medio de cultivo. Misma que servir de referencia. En la cual no debe crecer ningn tipo de microorganismo, ser la referencia de nuestro trabajo realizado en el laboratorio, por lo que debe evitarse la contaminacin de polvo y saliva 15) Despus de pasado este tiempo, contar las colonias y reportar como UFC/gr. 16) Cuando el nmero de colonias es superior al reportado en la norma vigente, este no se debe comercializar o consumir. 17) La cuenta total tambin evala los mtodos de trabajo, limpieza y desinfeccin de una fbrica.
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RESULTADOS:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO 1. Definir el trmino inoculacin. 2. Por qu es necesaria la incubacin de los microorganismos? 3. En Microbiologa, Qu significa el trmino crecimiento
Olvidar la Bata , requerida para el anlisis No limpiar el rea de trabajo No etiquetar debidamente las muestras problema. No desechar adecuadamente el material ya inutilizable.
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Nombre Competencia a Desarrollar Atributos de la competencia
Algunos micros.. Y otros macrostodos importantes.
No.
Realizar el anlisis de conteo de hongos y levaduras
1. Realiza la tcnica de conteo de hongos y levaduras en muestras de derivados Instrucciones crnicos, atendiendo las indicaciones de tu facilitador. 2. Realiza con orden, limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos del para el Alumno procedimiento. 3. Entrega a tu facilitador el reporte de los resultados obtenidos. Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo Guiar y auxiliar al estudiante para que realice la tcnica de recuento de hongos y levaduras.
Laboratorio de usos mltiples, guas de observacin, listas de cotejo, indumentaria de seguridad, material y equipo de laboratorio, materia prima a analizar. Aplicando sus habilidades para efectuar el desarrollo del procedimiento en la realizacin del anlisis e interpretacin del resultado obtenido.
Actitudes a formar
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Practica sugerida
La mayora de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energa por respiracin o fermentacin de materiales orgnicos solubles presentes en estos ambientes. Todos los hongos se reproducen por esporulacin. Cuando la espora se encuentra en un medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o ms tubos germinativos que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan HIFAS, las cuales pueden ramificarse despus. A medida que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructferos grandes y de estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misin es la de dispersar el hongo a nuevos hbitats. Algunos hongos tambin producen esporas sexuales formadas como resultado de la reproduccin sexual. Las que estn encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de una hifa o basidio se denominan BASIDIOSPORAS. MATERIAL Y SUBSTANCIAS. 1) Asa bacteriolgica. 2) 2 Cajas Petrit, conteniendo cada una un portaobjetos, un cubreobjetos y un trozo de papel filtro, estriles. 3) Caja Petrit conteniendo medio de SDA en capa muy delgada. 4) Bistur. 5) Pinzas de diseccin. 6) Agua destilada estril. 7) Lacto-fenol-azul de algodn. 8) Esmalte de uas. 9) Masking tape. 10) Mechero Bunsen. 11) Cerillos encendedor. 12) Portaobjetos. 13) Cubreobjetos. 14) Microscopio. 15) Muestra de derivado carnico
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Procedimiento 1) Tomar una placa de medio de SDA. 2) Sembrar la muestra por estria 3) Incubar por 48-72 horas o ms a temperatura ambiente. 4) Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores. 5) Describir las observaciones hechas. 6) Anotar las caractersticas de las colonias seleccionadas para hacer los micro cultivos, ya que esta informacin es un criterio importante para la identificacin del
moho.
OBSERVACION DIRECTA 1. De las colonias de hongos aislados, tomar nota de sus caractersticas: Forma, aspecto del micelio (algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentacin, elevacin, consistencia, etc. 2. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriolgica con un pequeo ganchito en la punta, desprender una pequea porcin. 3. Extender el material obtenido en una gota de agua puesta sobre un portaobjetos y colocar con cuidado un cubreobjetos sobre ste. 4. Examinar al microscopio con objetivo seco dbil buscando estructuras representativas. 5. Dibujar las observaciones hechas. 6. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar mejor las estructuras seleccionadas, procurando que stas presenten la arquitectura completa del hongo para facilitar su identificacin. 7. Dibujar las observaciones hechas: Seco dbil. Seco fuerte.
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MICROCULTIVO 1. Tomar una caja Petri que contenga dentro un crculo de papel filtro del dimetro de la caja, un portaobjetos y un cubreobjetos estriles. 2. Con el asa estril y en ngulo recto, cortar en cuadritos de aproximadamente 3 a 5 mm por lado el medio de SDA en capa delgada contenido en una caja Petri, tomar un cuadrito y colocarlo en condiciones aspticas en el centro del portaobjetos, levantando la tapa de la caja slo lo suficiente. 3. En condiciones aspticas, tomar una pequea porcin del cultivo por estudiar con el asa bacteriolgica en ngulo recto y depositarla cuidadosamente sobre el cuadrito de agar en el portaobjetos dentro de la caja Petri. 4. Levantando con la mano izquierda la tapa de la caja Petri y con unas pinzas ligeramente flameadas en la mano derecha, tomar el cubreobjetos y colocarlo sobre el cuadrito de agar inoculado, procurando que quede bien centrado y aprisionndolo ligeramente para que se adhiera. 5. Con un gotero que contenga agua estril depositar las gotas necesarias sobre el papel filtro hasta lograr que ste se humedezca completamente. 6. Cerrar la caja y sellarla con un poco de masking tape. 7. Incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. 8. Observar el cultivo a simple vista y no hacer ninguna observacin microscpica hasta que haya desarrollo visible fuera del cuadrito del agar. Tener mucho cuidado, para evitar destruir la estructura del hongo. 9. Cuando esto suceda, abrir la caja, sacar la preparacin, secarla con gasa por debajo del portaobjetos si est hmedo, y observarlo al microscopio con objetivo seco dbil y el condensador muy bajo para reducir la cantidad de luz. 10. Cambiar al objetivo seco fuerte para distinguir mejor la estructura del hongo. 11. Dibujar lo observado: Seco dbil. Seco fuerte.
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12. Comparar la estructura observada con las mostradas en dibujos y lminas 13. Si se desea hacer una preparacin permanente, hacer fluir cuidadosamente entre porta y cubreobjetos un poco de lacto-fenol-azul de algodn o lacto-fenolfucsina cida, hasta que se haya llenado todo el cubreobjetos. 14. Flamear ligeramente inclinando la preparacin para eliminar las burbujas de aire atrapadas. 15. Dejar enfriar la preparacin y sellarla dando pinceladas de esmalte de uas alrededor del cubreobjetos.
CUESTIONARIO 1. Dibujar las estructuras de 5 hongos de diferente gnero. 2. Describir otra tcnica de aislamiento de hongos. 3. Consultar en qu consiste el medio de Micosel y cul es su utilidad. 4. Consultar la tcnica para la obtencin de una colonia gigante de hongo. 5. Mencionar la importancia de los hongos en derivados crnicos.
Principales grupos de microorganismos que se encuentran en la carne:
LEVADURAS
Trichosporon scottii
HONGOS
Thamnidium, Cladosporium, Geotrichum Sporotrichum, Mucor, Penicillium Alternaria, Monilia
Los microorganismos alteradores son hongos capaces de crecer a bajas Aw, ocasionan malos olores, mohosos y liplisis
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Olvidar la Bata , requerida para el anlisis No limpiar el rea de trabajo No etiquetar debidamente las muestras problema. No desechar adecuadamente el material ya inutilizable.
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Parientes cercanos
No.
Realizar el anlisis de conteo de coliformes totales y fecales
1. Realiza la tcnica de conteo de coliformes totales y fecales en muestras de Instrucciones derivados crnicos, atendiendo las indicaciones de tu facilitador. 2. Realiza con orden, limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos del para el Alumno procedimiento. 3. Entrega a tu facilitador el reporte de los resultados obtenidos. Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo
Guiar y auxiliar al estudiante para que realice la tcnica de recuento de coliformes totales y coliformes fecales
Actitudes a formar
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Practica sugerida.
Las colibacterias son consideradas microorganismo indicadores, La OMS incluye dentro del grupo coliformes todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram. Negativos, no esporulados, que producen cido y gas al fermentar la lactosa, a 35 37 C. Las especies clsicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. Estos microorganismos provocan enfermedades intestinales muy comunes en el organismo. La determinacin se hace con una prueba presuntiva y otra confirmativa.
Material y equipo 1) Muestras de derivado crnico 2) 5 Tubos de 20 x 180 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 20 mL de caldo lactosado lauril triptosa estril de doble concentracin. 3) 10 Tubos de 18x 150 mm campana Durham en su interior, conteniendo 10 mL de caldo lactosado estril de simple concentracin. 4) 1 Pipeta de 10 mL graduada en dcimas, estril. 5) 2 Pipetas de 1 mL graduadas en dcimas, estriles. 6) 10 Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 10 mL de caldo Lactosa bilis verde brillante (LBVB) estril de concentracin sencilla. 7) 10 Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 10 mL de caldo E.C. (Escherichia coli) estril de concentracin sencilla. 8) Mechero Bunsen. 9) Cerillos encendedor. 10) Asa bacteriolgica. 11) Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 20 x 200. 12) Agitador de tubos Vortex. 13) Incubadora a 35 C. 14) Bao Incubador para C. Fecales a temperatura constante de 44 C (0.5 C).
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Procedimiento. Descripcin de la metodologa de anlisis: La tcnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa. Esto es as porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presuncin, que habr de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodologa de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es especfica.
PRUEBA PRESUNTIVA: Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de asepsia. 1. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo lactosado, una de doble concentracin y las otras dos de concentracin sencilla. 2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 mL. 3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar. 4. Antes y despus de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deber ser flameada con objeto de evitar contaminacin. 5. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo de doble concentracin, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra en la segunda serie de tubos con concentracin sencilla. 6. Igualmente con la misma pipeta podr inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 mL de muestra. Normalmente, siempre que no se sospecha que la muestra contenga elevada carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos. En caso contrario, ser necesario inocular otras series y por lo tanto, realizar diluciones de la muestra original.
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7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24-48 horas. 8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en la campana Durham. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de gas sea resultado de la fermentacin de la lactosa en cuyo caso se observar turbidez en el medio de cultivo y no confundir con burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos que contengan burbujas de aire de alguna manera eliminar stas y as poder utilizarlos. 9. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales. 10. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos, continuarn en incubacin 24 horas ms. 11. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura final. 12. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni produccin de gas, los tubos se toman como negativos.
INTERPRETACION: Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitndolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB). 2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C. 3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas. INTERPRETACION: Si se observa turbidez y produccin de gas:
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La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del clculo del NMP. PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli). 2. Incubar durante 24 horas a 44 C (0.5 C), observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACION: Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP. Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
CALCULOS. De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales: Establecer los cdigos correspondientes para calcular por referencia en la tabla estadstica correspondiente (Tablas ) el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua. En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear para los clculos la siguiente ecuacin:
ELABORACION Y PRESENTACION DE RESULTADOS. Los resultados se elaboran de la siguiente manera: Si nicamente se inoculan tres series de cinco tubos cada una con 10, 1 y 0.1 mL de muestra, la lectura de los resultados nos permite tener dos cdigos de valores uno para
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coliformes totales y otro para coliformes fecales los cuales ledos en la tabla del NMP nos dar el valor de bacterias correspondientes en 100 mL de muestra, de manera directa. Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor cero. A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del NMP. Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete escogido. Se tendr un triplete de valores para cada tipo de determinacin. En general se tiene:
Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera: NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL
CONFIABILIDAD El procedimiento de fermentacin en tubos mltiples es el mtodo ms usado por su facilidad y economa. El resultado de esta prueba se expresa por el nmero ms probable (NMP), pero debe entenderse que este mtodo no es exacto ya que slo nos da la probable densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada. La confiabilidad est dada por los niveles superiores o inferiores del lmite de confianza al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 mL, no obstante, es una indicacin importante para evaluar la calidad sanitaria de la muestra
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Resultados;
1. Mostrar los clculos realizados para obtener el NMP de Coliformes Totales y Fecales en la muestra analizada 2. Cules son las caractersticas que debe reunir un Microorganismo Indicador? 3. Por qu el nmero de Coliformes Totales es siempre mayor que el de Coliformes Fecales? 4. De acuerdo a la normatividad mexicana vigente Cules son los lmites permisibles en cuanto a Coliformes Totales y Coliformes Fecales en derivados carnicos? Dar los nmeros de las Normas Oficiales Mexicanas correspondientes. 5. Por qu aun cuando los microorganismos patgenos se encuentran en poca concentracin en una muestra stos pueden causar enfermedad?
TABLA : ndice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con porciones de 1 cm3 y 5 con porciones de 0.1 cm3.
100
Diluciones para NMP:
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Es coco,! pero no se come.
No.
Realizar el anlisis de conteo de Staphylococcus aureus(dorado)
1. Realiza la tcnica de conteo de Staphylococcus aureus(dorado) en muestras de Instrucciones derivados crnicos, atendiendo las indicaciones de tu facilitador. 2. Realiza con orden, limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos del para el Alumno procedimiento. 3. Entrega a tu facilitador el reporte de los resultados obtenidos. Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo
Guiar y auxiliar al estudiante para que realice la tcnica de recuento de Staphylococcus aureus(dorado)
Actitudes a formar
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Prctica sugerida. Estafilococo dorado (Staphylococcus aureus), se encuentra de forma natural en nuestra piel, nariz, boca y manos. Crece rpidamente en alimentos hmedos y ricos en protenas no adecuadamente refrigerados, como la leche, quesos frescos, salsas, crema, y carnes. Los sntomas de su infeccin incluyen vmitos, diarreas y espasmos intestinales, producidos por una toxina que forma la bacteria en el alimento; en ocasiones, se sienten escalofros y mareos. Pueden aparecer a los pocos minutos o varias horas despus de ingerir el producto contaminado Los estreptococos provocan envenenamiento de los alimentos. El producto infectado no puede comercializarse La prueba consiste en dos partes: Aislamiento de las colonias Identificacin de las colonias Para el aislamiento se utiliza el medio de cultivo agar enterococos. De cada dilucin preparada, se transfiere por duplicado 1ml a cajas Petri y se mezclan con agar fundido en bao Mara a 40C. Despus de la solidificacin, se incuban las cajas a 37C durante 48hrs. Transcurrido el tiempo de incubacin se seleccionan las cajas en donde se pueden contar las colonias con facilidad y en donde las colonias sean del mismo tipo. La identificacin se realiza con caldo triptona glucosa salino extracto de levadura. De cada caja se transfiere una colonia con el asa bacteriolgica estril al tubo con caldo. Los tubos se incuban a 37C durante 48hrs. Se observa si hubo desarrollo bacteriano en los tubos. Estos se identifican porque el medio recultivo se vuelve turbio. El nmero de colonias por gramo de cultivo se calcula, contando las colonias de la caja que tiene el medio de cultivo turbio.
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Fiel amiga!
No.
Realizar el anlisis de Salmonella
1. Realiza la tcnica de conteo de Salmonella en muestras de derivados crnicos, Instrucciones atendiendo las indicaciones de tu facilitador. 2. Realiza con orden, limpieza y responsabilidad cada uno de los pasos del para el Alumno procedimiento. 3. Entrega a tu facilitador el reporte de los resultados obtenidos. Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo
Guiar y auxiliar al estudiante para que realice la tcnica de recuento de Salmonella

Actitudes a formar
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Prctica sugerida. Salmonella, que es la causante de ms de la mitad de las infecciones alimentarias. Se encuentra de forma natural en nuestro intestino y en el de los animales; por lo que las heces son el principal foco de contaminacin de los alimentos y el agua por esta bacteria. Los alimentos implicados con mayor frecuencia son los huevos crudos o poco cocinados, las aves mal cocidas y los alimentos cocinados que se han dejado sin refrigerar durante varias horas. Sus sntomas principales son las nuseas, el dolor abdominal, la diarrea y fiebre alta desde 8 hasta 36 horas despus de consumido el alimento. Los productos contaminados por salmonella no pueden comercializarse. Las tcnicas utilizadas para detectar este microorganismo varan de acuerdo con la composicin de la muestra, su carga microbiana y el procesamiento. Un mtodo sencillo para detectar esta bacteria se divide en tres fases: Enriquecimiento Aislamiento Pruebas bioqumicas determinativas. Medios de preenriquecimiento
Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenito-cistina, Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solucin A, Solucin B, Solucin C, Caldo de soya tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio
Medios de aislamiento Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para Salmonella y Shigella (SS), Agar entrico Hektoen
Medios para pruebas bioqumicas Agar de tres azcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer), Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rpido, Caldo infusin cerebro corazn
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Soluciones Solucin verde brillante al 0,1% (1:1000), Solucin de yodo-yoduro, Solucin salina al 0,85%, Solucin salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solucin de alfa-naftol al 5%, Solucin de rojo de metilo, Solucin de hidrxido de potasio al 40%, Solucin de gelatinasa al 5%
Antisueros Antisuero polivalente somtico (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi Realiza la toma de muestras aplicando la tcnica adecuada. Prepara la muestra a analizar.
Preparacin de los alimentos para el aislamiento de Salmonella _ Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una muestra de 25 g o ms.
Procedimiento general para la preparacin de muestras _ Pesa aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico (stomacher). Adiciona 225 ml del medio de preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licalo si es necesario durante un minuto. _ Transfiere aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potencimetro. Ajusta, si es necesario, a un pH 6,8 0,2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezcla y cubre el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 2 h a 35C.
Procedimiento especfico para la preparacin de muestra segn el producto
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Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). _ Productos procesados trmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento sealado anteriormente hasta la homogeneizacin. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras 24 2 h a 35C.
Aislamiento de Salmonella _ Cierra firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agita suavemente, transfiere respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport. _ Incuba de 18 a 24 h a 35C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. _ Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estralo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 2 h a 35C. _ Examina las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
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Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. _ Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas. Identificacin bioqumica _ Selecciona al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. _ Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo. Incubar por 24 2 h a 35C. _ Almacena en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar ms colonias. _ Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfhdrico. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfhdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin. _ Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuacin: _ Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios.
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_ Contina el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta reacciones atpicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y siembra las pruebas bioqumicas nuevamente. _ Contina la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. Prueba de ureasa _ Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 2 h a 35C. _ Prueba de ureasa (rpida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rpida). Incuba 2 h a 37 0,5C en bao de agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Debers retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).
Identificacin serolgica Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) _ Coloca con asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspende en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI. _ Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mzclalas con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. _ Agita inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente un minuto. _ Observa bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro. _ Considera cualquier grado de aglutinacin como positiva. _ La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina. _ Si observas aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioqumicas complementarias. _ Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los ms frecuentes).
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_ Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay aglutinacin con Vi calienta el cultivo a ebullicin y repite la aglutinacin con el antisuero polivalenteO. _ Si se requiere, practica el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). _ Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e incubar de 4 a 6 h a 35C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo da), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 2 h a 35C (para ensayo al da siguiente). Adiciona 2,5 ml de solucin salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazn (BHI). _ Coloca 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serologa (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Prepara un control de solucin salina mezclando 0,5 ml de solucin salina formalizada con 0,5 ml del antgeno formalizado. Incuba las mezclas en bao de agua a 48-50C. Observa a intervalos de 15 min por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la mezcla de prueba pero no en el control. Debes interpretar como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica. Pruebas bioqumicas complementarias _ Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuacin: _ Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: Agar citrato Simmons _ Inocula por estra el tubo. _ Incuba durante 96 2 h a 35 2C. _ Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde a azul. _ Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
Medio SIM _ Inocula por puncin. _ Incuba durante 24 h a 35 2C.
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Movilidad. _ Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de cultivo. _ Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente. _ Produccin de cido sulfhdrico. _ Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que puede extenderse a todo el medio. _ Prueba negativa: ausencia de color negro. _ Produccin de indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Pgina 29 de 103 Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo RM-VP _ Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 2 h a 35 2C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. _ Prueba de Voges-Proskauer (VP) _ Transfiere a un tubo un ml del cultivo de 48 h. _ Adiciona 0,6 ml de solucin de alfa naftol. _ Adiciona 0,2 ml de solucin de hidrxido de potasio 40%. _ Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional). _ Interpreta los resultados despus de incubar durante 2 h a 35 2C o 4 h a temperatura ambiente. _ Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. _ Prueba negativa: sin cambio de color. _ Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h ms a 35 2C. Prueba de rojo de metilo (RM) _ Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo. Interpreta los resultados inmediatamente. _ Prueba positiva: desarrollo de color rojo. _ Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. Caldo malonato _ Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 40 2 h a 35 2C. _ Prueba positiva: desarrollo de color azul.
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_ Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo manitol _ Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 24 2 h a 35 2C. _ Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. _ Prueba negativa: sin cambio de color. _ Consulta los resultados obtenidos en el anexo 14 para la identificacin de los gneros de las bacterias investigadas. _ Nota: los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales.
Etiqueta y rotula os tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilucin con los datos correctos Verifica la temperatura de incubacin Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos Para el clculo, expresin e interpretacin de reacciones bioqumicas y serolgicas.
Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra. Compara tus resultados con los estndares permitidos Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado
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Reacciones bioqumicas despus de 24 h a 35C

Agar kligler
Prueba de oxidasa
Agar TCBS
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Medio de SIM
Desc. de aminocidos
Utilizacin de Citrato
Utilizacin de malonato
Fenilalanina desaminasa
Medio de OF
Noolvidesqueentodoslosanlisis realizadosdebersconsultarsus respectivasNORMASvigentes
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Confundir el orden de la actividad. Olvidar los nombres de las actividades. Confundir las determinaciones.
No tener conocimiento previo a esta actividad. No contar con los reactivos qumicos. No tener las observaciones y anotaciones de la prctica. No contar con los equipos e instrumentos para las diferentes determinaciones. No contar con los servicios auxiliares indispensables.
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Visita al Laboratorio Central de SSA
No.
REALIZAR ANALISIS MICROBIOLOGICOS A DERIVADOS CARNICOS, DE ACUERDO CON LAS NORMAS VIGENTES DELA MATERIA. Realizar anlisis de cuenta total Realizar anlisis de conteo de hongos y levaduras
Realizar anlisis de coliformes totales y fecales Realizar anlisis de Staphylococcus aureus (dorado) Realizar el anlisis de Salmonella
Instrucciones Realiza una visita al Laboratorio Central de la SSA, y pon mucha atencin al para el Alumno desarrollo de las evaluaciones microbiolgicas que ah se realizan Instrucciones para el Docente Recursos materiales de apoyo Tramitar con el departamento de vinculacin de cada plantel, la visita guiada, al Laboratorio Central de SSA. Cuestionario para entrevistar al qumico de la SSA. Toma de notas. Orden Actitudes a formar Limpieza Responsabili dad
En orden y con atencin tomar nota en la asistencia ala visita de la SSA
8)Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos

C) Asume una actitud constructiva, congruente con los conocimientos y habilidades con los que cuenta dentro de distintos equipos de trabajo
En orden y con atencin tomar nota en la asistencia ala visita de la SSA.
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El Control de Calidad de los alimentos depende de 3 factores bsicamente: Seguridad: Un alimento no debe contener niveles de microorganismos patgenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando ste se consuma. Aceptabilidad: Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales que lo conviertan en sensorialmente inaceptable en poco tiempo. Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no mostrar variaciones de lote a lote desde ele punto de vista de seguridad como de aceptabilidad. Es por ello, que es de suma importancia realizar un anlisis de rutina microbiologicamente y en casos ms especficos de pruebas especiales. Aqu se da una gua y plantea un anlisis microbiolgico a derivados crnicos y as garantizar la sanidad de los mismos.
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Para tener un xito total en el desempeo del Modulo profesional, es necesario, Que realices las actividades que te proporcion en cada competencia con los ejemplos, ejercicios y prcticas de sta gua donde se encuentran integradas las habilidades y destrezas que requieres para ser competente. Cualquier aportacin, que enriquezca el modulo, es conveniente me compartas, para ampliar nuestro conocimiento y as extrapolarlo con tus compaeros Gracias.
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Bedolla Bernal Salvador. (2007) Introduccin a la Tecnologa de Alimentos. (Academia del rea de Plantas Pilotos de Alimentos). Mxico. Editorial Limusa. 2da Edicin. C. Fraizier, W, C. WsthoffD. (1993) Microbiologa de los Alimentos. Espaa. Editorial Acribia S,A. Traducido por: Dr. Manuel Ramis Vergs, Doctor en Veterinaria.(4ta Edicin). Guerrero Legarreta Isabel, Arteaga Martnez Mario Ricardo. (2001) Tecnologa de Carnes. Elaboracin y preservacin de productos crnicos. Mxico. Tercera reimpresin. Editorial Trillas. R, Meyer Marco. (1990) Control de Calidad de Productos Agropecuarios. Mxico, (Manuales para educacin agropecuaria. Industrias rurales). Editorial Trillas. (reimp. 2004).
PGINAS ELECTRNICAS
NORMA OFICIAL DE MXICO. http://www.colpos.mx/bancodenormas/index.php
(En
lnea)
Disponible
en
Manual. (En lnea) Disponible en http://docencia.izt.uam.mx
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Agar - Polisacrido complejo extrado de ciertas algas marinas, el cual no es digerido por la mayor parte de las bacterias. Est constituido por un 70% de agarosa y 30% de agaropectina. Se funde a temperaturas mayores a 100C y se gelifica a 40-50C. Entre sus aplicaciones se encuentran la preparacin de medios de cultivo slidos, emulsiones y como medio Agente infeccioso - Un organismo (virus, bacteria, hongo, protozoo, helminto) o protena (prion) que tiene la capacidad de producir una infeccin o enfermedad infecciosa. Infectividad expresa la habilidad de dicho organismo para entrar, sobrevivir y multiplicarse en el hospedero.de soporte para tcnicas de inmunodifusin y electroforsis. Anaerobio - Organismo que no requiere O2 libre para su crecimiento y multiplicacin y que es inhibido por las concentraciones atmosfricas de O2. Los anaerobios estrictos poseen sistemas enzimticos que solamente funcionan en ausencia de O2. Anaerobio facultativo - Organismo que no requiere de O2, pero puede crecer en condiciones microaerbicas o anaerbicas. Asptico - Estril, libre de organismos contaminantes. Bacilo - Bacteria de forma cilndrica (bastn). Bacterias - Organismos unicelulares procariticos sin ncleo diferenciado, aunque presentan un nucleoide, una estructura que contiene una molcula circular de ADN; sin organelos con membrana; presentan varias formas y se pueden encontrar prcticamente en cualquier ambiente (suelos, aguas, aire, y como simbiontes o patgenos del humano, otros animales y plantas). Hifa - Unidad estructural de la mayora de los hongos. Puede ser unicelular (levadura) o pluricelular (generalmente de forma filamentosa). El conjunto de hifas constituye el micelio.
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4to-Analisis m3 s3 2013-10

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Gua Profesional

Anlisis y Tecnologa de los Alimentos Submdulo III

Mtro. Alonso Jos Ricardo Lujambio Irazbal

Lic. Miguel ngel Martnez Espinosa

Lic. Luis Francisco Meja Pia

Ing. Celso Gabriel Espinoza Corona

Lic. Armando Mendoza Cruz

ElenaPatriciaCamposChaves EnriqueGmezSnchez Veracruz Tabasco Nayarit NuevoLen

GuillerminaGalindoFigueroa MarioDenaSilva Adriana GarcaOrtiz Antonio IxChuc

Hidalgo Campeche Yucatn

Tcnico en Anlisis y Tecnologa de los Alimentos

Actitudes: Orden Limpieza Responsabilidad

Actitudes: Orden Limpieza Responsabilidad

Cunto analizo? Y ahora qu?

Uso y manejo del microscopio Microorganismos de la carne

Nombre Instrucciones para el Alumno Saberes a adquirir

Nombre Instrucciones para el Alumno

Norma Oficial Mexicana o Norma Mexicana NOM-122-SSA1-1994.

NOM-194-SSA1NOM-213-SSA1-2002 NOM-EM-006-SSA12002 NOM-130-SSA1-1995

Refrigerado Envasado al vaco o en atmsfera modificada Carne molida refrigerada

Coliformes fecales (NMP/g)

1 = En planta, 2 =En punto de venta, 3 = No aplica a maduros crudos, N. A. = No aplica

Lmite Mximo Permisible En planta o frontera

Lmite Mximo Permisible En punto de venta

Productos crnicos troceados y curados cocidos crudos madurados

En ESPECIFICACIONES: (Lmite Mximo)

troceados y curados cocidos crudos madurados

Salmonella spp en 25 g muestra Staphylococcus aureus UFC/g

Uso y manejo del microscopio

Manera Didctica de Lograrlos

Manejo del microscopio ptico y tinciones de microorganismos

Competencias Genricas a Desarrollar

Manera Didctica de Lograrlas

7. Secar. 8. Observar (x40, x100).

Dibuja tus observaciones:

10. Observar (x40, x100). Dibuja tus observaciones:

Esquematizando los agentes causales

Bsqueda bibliogrfica y en internet.

Competencias Genricas a Desarrollar Manera Didctica de Lograrlas Salmonella

Enterobacter (Coliformes fecales)

Nombre Competencia a Desarrollar

Instrucciones para el Alumno

Instrucciones para el Docente

Recursos materiales de apoyo Actitudes a formar

Manera Didctica de Lograrlas

1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene: Bata Cubre pelo Guantes

Medio SIM Inocula por puncin. Incuba durante 24 h a 35 2C.

Nombre Competencia a Desarrollar

Instrucciones para el Alumno

Instrucciones para el Docente

Recursos materiales de apoyo Actitudes a formar

Manera Didctica de Lograrlas

Nombre Competencia a Desarrollar

Deteccin de bacterias mesoflicas aerobias I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne

Instrucciones para el Alumno

Instrucciones para el Docente

Recursos materiales de apoyo Actitudes a formar

Manera Didctica de Lograrlas

Nombre Competencia a Desarrollar

Deteccin de Escherichia colli I. Realiza anlisis microbiolgicos a la carne

Instrucciones para el Alumno

Instrucciones para el Docente

Recursos materiales de apoyo Actitudes a formar