GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS PARASITOLOGIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, PARASITOLOGIA E INMUNOLOGIA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES 2010

OBJETIVOS Al terminar los Trabajos Prcticos, se pretende que los estudiantes estn en condiciones de: 1) Relacionar las estructuras observadas en el Prctico con caractersticas biolgicas, localizacin en el husped, mecanismos patognicos y condiciones de transmisin de los parsitos correspondientes. 2) Identificar aquellos parsitos de mayor prevalencia en nuestro pas. 3) Comprender la mecnica del diagnstico de las parasitosis (toma de muestra, procesamiento e identificacin del parsito). 4) Adquirir destrezas mnimas en tcnicas elementales de diagnstico parasitolgico. 5) Respetar prcticas de higiene y bioseguridad en el laboratorio. REQUISITOS PARA ASISTIR A LOS TP -Haber ledo previamente la gua. -Llevar guardapolvo y guantes. MATERIAL DE CONSULTA -PARASITOSIS HUMANAS. Botero D, Restrepo M. (Cap.17: Tcnicas de laboratorio en Parasitologa Mdica). -Centers for Disease Control & Prevention (imgenes y metodologa diagnstica) http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/Default.htm -Swiss Tropical Institute, Basel, April 2005- Methods in Parasitology http://www.tropeduweb.ch/diagnostics/Methods_in_Parasitology.htm

CONTENIDOS COMUNES A LOS TP 1 Y 2 DE PARASITOLOGIA NORMAS DE TRABAJO Y BIOSEGURIDAD EN LABORATORIO Con el objeto de cumplimentar el objetivo de visualizar en tiempo y forma los preparados microscpicos y de minimizar accidentes de laboratorio y/o posibles contaminaciones se indican las siguientes precauciones:

No coloque los libros, carteras y ropa sobre las mesadas de laboratorio donde se realizarn procedimientos diagnsticos. No se siente sobre las mesadas de laboratorio. No apoye sus libros o apuntes al lado de los microscopios, ya que mover los elementos parasitarios enfocados y stos son frecuentemente difciles de volver a encontrar en el preparado. Por la misma razn expuesta en el punto anterior, no recorra el preparado, al menos sin el permiso y/o supervisin del docente. No coma, beba, fume, maquille o manipule sus lentes de contacto en el rea de trabajo. Utilice guantes y guardapolvo cuando maneje los especimenes. Si usted tiene cortadas o raspaduras en la piel o en sus manos, cubra ests con una cinta adhesiva. Evite salpicaduras de materia fecal, especialmente en la cara, siguiendo las precauciones que le indique su docente. Descarte los elementos de laboratorio empleados de la forma y en el lugar que su docente le indique. Decontamine la superficie de trabajo al finalizar la actividad o ante cualquier derrame de material potencialmente infeccioso. Squese los guantes y lvese las manos despus de completar cualquier tarea involucrada en el manejo de material biolgico. Descarte los guantes en bolsa roja.

Nota: Estas medidas de seguridad deben acatarse an cuando los especimenes estn fijados o estn en conservadores, puesto que pueden seguir siendo infectantes. (Adaptacin de las medidas de bioseguridad para especmenes fecales y sanguneos del sitio del CDC) CRITERIOS DE IDENTIFICACIN DE ELEMENTOS PARASITARIOS El diagnstico de los enteroparsitos es habitualmente morfolgico y la observacin microscpica tambin tiene relevancia en diagnstico de hemoparsitos como Trypanosoma cruzi y Plasmodium spp. La observacin de la morfologa de los parsitos permite tambin relacionar estructuras con mecanismos patognicos. Para bsqueda e identificacin de elementos parasitarios, se tomarn en cuenta las siguientes caractersticas: a) Muestra donde se encuentra el elemento: materia fecal, material perianal, sangre, adulto liberado espontneamente, etc. b) Forma: redonda, oval, elongada. c) Color. d) Tamao: Es muy importante tanto a nivel macro como microscpico. En el microscopio se aprecia mejor con un ocular graduado, pero si no est disponible realizar una estimacin comparando el tamao del elemento parasitario observado con otros elementos del preparado (por ej.leucocitos). Registrar el aumento del microscopio con el que se observa el elemento parasitario. Tener en cuenta que para la observacin de protozoarios habitualmente se necesitan aumentos mayores a 100x. e) Contenido: blastomerado, embrin hexacanto, esporozotos en ooquistes, etc. f) Elementos caractersticos: oprculo, ncleos, kinetoplasto, flagelos, placas cortantes. etc. En base a las caractersticas mencionadas se identifica el elemento parasitario con estado, gnero y de ser posible especie (por ej. quistes de Giardia intestinalis o huevo de Ascaris lumbricoides).

TRABAJO PRACTICO N 1: ENTEROPARASITOS CONTENIDOS PROTOZOARIOS Y HELMINTOS INTESTINALES. Estados parasitarios caractersticos y su morfologa. Ciclos biolgicos y de transmisin-relacin con profilaxis. Relacin de estructuras morfolgicas con biologa y mecanismos patognicos. Estados parasitarios que realizan diagnstico habitual. METODOLOGIA DE DIAGNOSTICO DE ENTEROPARASITOS. Diagnstico presuntivo y de certeza. Toma de muestra y su relacin con el ciclo biolgico. Metodologa habitual de diagnstico y sus fundamentos. Interpretacin de los resultados.

ACTIVIDADES Observacin microscpica de estados parasitarios: Protozoarios intestinales (heces): Trofozotos de Entamoeba histolytica (tinciones permanentes). Quistes de Entamoeba coli. Quistes de Giardia intestinalis. Ooquistes de Cryptosporidium spp (Kinyoun). Helmintos intestinales: Huevos de Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides (heces). Larvas rhabditoides de Strongyloides stercolaris (heces). Huevos de Enterobius vermicularis (Test de Graham). Corte histopatolgico de adulto de Enterobius vermicularis en apndice. Corte histopatolgico de larva de Ascaris lumbricoides en pulmn. Observacin de preparados macroscpicos (formol): Intestinos con lesiones por Entamoeba histolytica: lceras en botn de camisa, epitelio necrosado (colitis fulminante), masas pseudotumorales (ameboma). Adulto y progltides grvidos de Taenia saginata. Adultos de Ascaris lumbricoides y de Trichuris trichiura. Obstruccin intestinal por Ascaris lumbricoides. Realizacin del mtodo de enriquecimiento de materia fecal por sedimentacin Los estudiantes guiados por su docente realizarn en forma grupal el mtodo tal est descripto en Mtodo de enriquecimiento de materia fecal por sedimentacin , cumpliendo con las Normas de trabajo y bioseguridad en laboratorio. Durante le realizacin del mtodo se repasarn las condiciones de toma de muestra (ver Recoleccin, transporte, conservacin y procesamiento de muestras para estudios de enteroparasitos) Realizacin de montajes hmedos y observacin microscpica con y sin lugol de materia fecal de acuerdo a los Criterios de identificacin de elementos parasitarios.

ACTIVIDAD TP ENTEROPARASITOS METODO DE ENRIQUECIMIENTO DE MATERIA FECAL POR SEDIMENTACION OBSERVACION MICROSCPICA CON Y SIN LUGOL El mtodo de enriquecimiento por sedimentacin es el procedimiento ms empleado para concentrar quistes de protozoos, huevos y larvas de helmintos de la materia fecal. Las distintas variantes del mtodo reciben distintos nombres (Ritchie, Telemann, Carls Barthelemy). El objetivo general del mtodo es concentrar mediante sedimentacin los elementos de inters diagnstico y eliminar mediante centrifugacin y particin de fases, la mayor proporcin de materia orgnica constituyente de la materia fecal. El uso de acetato de etilo (menos txico y voltil que el ter etlico) permite eliminar grasas (que contribuyen significativamente a la masa de materia fecal) y pigmentos biliares (que oscurecen el preparado) que dificultan la observacin. El uso de formalina (formol 10% en solucin fisiolgica) es convencional en este tipo de preparaciones. Dado que destruye los trofozotos, se puede emplear alcohol polivinlico como alternativa. El lugol se emplea en tinciones semipermanentes, para resaltar vacuolas ricas en glucgeno, que muchas veces tienen carcter diagnstico. Materiales: -Materia Fecal fijada con 10% Formol -10% Formol en solucin fisiolgica -Acetato de Etilo -Solucin Lugol (Iodo 1% / Ioduro de Potasio 2% en agua destilada) -Gasa -Embudos de plstico -Varillas de vidrio -Tubos cnicos con tapa a rosca -Gradillas -Pipetas Pasteur de plstico -Portaobjetos -Cubreobjetos -Centrfuga clnica -Balanza para equilibrar tubos -Microscopio ptico -Elementos de limpieza y bioseguridad: Lavandina diluda Alcohol 70 Servilletas o rollo de papel Guantes Frascos de descarte Bolsa roja de descarte Procedimiento: 1) Disgregar la materia fecal con varilla de vidrio o madera. 2) Filtrar a travs de gasa (3 pliegues de gasa) 3) Centrifugar a 1300 rpm durante 3 minutos 4) Descartar el sobrenadante en frasco con hipoclorito de sodio al 0.5% (1/10 de lavandina comercial) 5) Resuspender con 10 ml de solucin salina 6) Agregar 2 ml de acetato de etilo 7) Tapar y agitar por inversin (4-5 veces) 8) Centrifugar a 1300 rpm durante 3 minutos Durante los pasos de centrifugacin se repasarn las condiciones de toma de muestra de materia fecal y material perianal. Al finalizar este paso, si el procedimiento fue correctamiente realizado deber observarse lo siguiente:

Fase orgnica (ter) Grasa extrada (debris) Fase acuosa Sedimento o precipitado
9) 10) 11) 12) Con una varilla de vidrio separar el tapn graso. Descartar el sobrenadante por inversin Resuspender el sedimento en el escaso lquido remanente Colocar una gota entre porta y cubreobjetos. Opcionalmente agregar una gota de Lugol y observar a 100X en el microscopio recorriendo el preparado en guarda griega.

13) Si se observan elementos sospechosos pasar a 400X inmediatamente. Si al terminar la bsqueda no se observaron elementos parasitarios, repetir la bsqueda a 400x para identificar protozoarios. 14) Anotar las caractersticas del supuesto elemento parasitario observado segn lo descripto en Criterios de identificacin de elementos parasitarios y determinar estad o parasitario, gnero y de ser posible especie (por ejemplo huevos de Hymenolepis nana).

CONTENIDOS ADICIONALES TP ENTEROPARASITOS

IMAGENES- A MODO DE ATLAS DE (NO EXCLUYE LA CONSULTA DE TEXTOS Y

ATLAS ESPECFICOS) A continuacin se indican las caractersticas morfolgicas salientes de los estadios de los parsitos ms frecuentemente hallados en exmenes coproparasitolgicos de la poblacin peditrica del conurbano bonaerense. Quiste de Giardia intestinalis. Mtodo de Charles-Barthelemy. Se distingue la forma oval, la pared gruesa, birrefringente (flecha hueca) y la presencia de restos del citoesqueleto (flecha). Aumento original: 400x.

Huevo de Hymenolepis nana. Se distingue la cutcula refringente (flecha) rodeando el espacio hialino periembrionario, el embriforo (flecha hueca), los filamentos polares (flechas punteadas) y el embrin hexacanto con ganchos (asterisco), dentro del embriforo. Mtodo de CharlesBarthelemy. Aumento original: 400x. Huevo de Ascaris lumbricoides. Se distingue la cutcula mamelonada (flecha) y el embrin (flecha hueca). A la izquierda, un huevo decorticado de la misma especie. Mtodo de Charles-Barthelemy. Aumento original: 400x.

Huevos de Enterobius vermicularis. Se distingue su aspecto hialino y morfologa plano-convexa. En el interior se observa la larva desarrollada (flecha). Mtodo de Graham. Aumento original: 100x.

RECOLECCION, TRANSPORTE, CONSERVACION Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE ENTEROPARASITOS La correcta obtencin de muestras es un prerrequisito fundamental para arribar a un diagnstico adecuado. Para tal fin, deben considerarse los factores que contribuyen al diagnstico presuntivo de las parasitosis, la preparacin fsica y emocional del paciente para la toma de las muestras, los procedimientos requeridos para su obtencin, transporte y preservacin y, finalmente, su procesamiento e identificacin del agente etiolgico. En el caso de la toma de muestra para diagnstico de enteroparasitosis se deben considerar cuatro abordajes posibles: la obtencin de materia fecal, la obtencin de muestras perianales, la obtencin de biopsias y la obtencin de suero o plasma (esto ltimo aplica slo al diagnstico serolgico de amebosis extraintestinal). Para una mejor orientacin con respecto a los posibles agentes etiolgicos responsables de la infeccin intestinal se requiere la elaboracin de una ficha tipo. con antecedentes epidemiolgicos y clnicos, accesible al laboratorio de diagnstico parasitolgico. Esta ficha debe incluir precisiones sobre los siguientes datos: 1. Nombre y apellido. Edad. Sexo. 2. Lugar de nacimiento. Residencia actual. Residencias anteriores. Viajes. 3. Ocupacin laboral. 4. Motivo de la consulta. 5. Sistemas de provisin de agua, de eliminacin de excretas y de gestin de residuos en el domicilio. Piso de tierra o material. 6. Hbitos (preparacin y consumo de alimentos, geofagia, contacto con el suelo, lavado de manos, etc.). 7. Presencia de animales domsticos y de vectores mecnicos. 8. Familiares/convivientes/contactos con parasitosis actuales o pasadas. 9. Medicacin especfica administrada actualmente o en forma reciente. 10. Sntomas dominantes (digestivos, prurito, respiratorios, etc.). 11. Evidencias de parasitosis ( antecedente de expulsin de parsitos). 12. Antecedentes de desnutricin e inmunodepresin. 1 . Preparacin del paciente El paciente debe someterse a una preparacin correcta, mnima e indispensable para evitar exmenes falsamente negativos o positivos. Por eso se recomienda evitar, por lo menos tres das antes y durante la recoleccin de las muestras, la administracin oral o rectal de medicamentos que: i. Sean empleados como medio de contraste radiolgico (P.ej., compuestos baritados). ii. Alteren el trnsito intestinal (P.ej., carbn vegetal, sales de bismuto, laxantes) iii. Aumenten el contenido lipdico de la materia fecal (P.ej., vaselina lquida) Asimismo, se recomienda suspender, por lo menos tres das antes y durante la recoleccin de las muestras, la ingestin de alimentos que produzcan abundante residuo no digerible, tales como: i. Fibras vegetales (P.ej., legumbres, frutos de cutcula gruesa) ii. Granos (P.ej., frutas con semillas abundantes y pequeas, tales como la frutilla u otros frutos del bosque). iii. Polen. 2 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras habituales 2.1 Mtodo recomendado por la OMS para estudios coproparasitolgicos 2.1.1 Recoleccin Se debe recolectar la materia fecal recin emitida en un frasco con fijador en forma seriada (las muestras nicas tienen una sensibilidad de alrededor del 60%). En casos de que las deposiciones sean formes o blandas se recomienda recolectar 3 muestras en das alternos en un lapso de 7 das, siempre de aquellas zonas ms llamativas. En aquellos pacientes con diarrea aguda se recomiendan tomar 3 muestras seriadas, y aquellos con diarrea crnica 6 muestras alternas en un lapso de 12 das. Las materias fecales tienen que ser homogeneizadas por el paciente con una esptula o elemento similar. En todos los casos la cantidad de muestra a recoger ser de una cucharita del tamao de las de t. En caso de emitir heces mucosanguinolentas se recomienda enviarlas en fresco (sin fijador) al laboratorio inmediatamente despus de emitidas o conservarlas a 4 C y enviarlas dentro de las 24hs. Si se observan estructuras similares a parsitos adultos, se deben recoger en frascos con agua o fijador y remitirlas al laboratorio. 2.1.2 Preservacin Los fijadores habitualmente empleados para la preservacin de muestras coproparasitolgicas incluyen: formol al 5% en agua o solucin fisiolgica; alcohol polivinlico, PVA; fenol-alcohol-formol, PAF; acetato de sodio-cido actico-formol. SAF o; merthiolate-iodo-formol, MIF) en una proporcin de 1 parte de heces por cada 3 partes de fijador (aproximadamente el volumen final no debe exceder la mitad del volumen del fijador). No debe estar mezclado con orina u otro lquido.

Transporte Las muestras fijadas pueden ser transportadas y permanecer utilizables para el diagnstico por meses a temperatura ambiente o refrigeradas a 4 C. Se recomienda dividir la muestra y recogerla por un lado en Formol 5% y por el otro en PVA y/o SAF, debido a que estos fijadores presentan ventajas y desventajas complementarias. El formol preserva mejor morfologa de huevos de helmintos y larvas; PVA y SAF son en general ms adecuados para realizar coloraciones permanentes de trofozotos y quistes de protozoarios. El formol, fijador habitual empleado en el diagnstico coproparasitolgico, tiene la ventaja adicional de desodorizar las muestras. Examen de heces seriado de 6 muestras con tcnica de Deschiens En un frasco de boca ancha con solucin de formol al 5% se recolecta una muestra (una cucharadita) de materia fecal por da, de las porciones que llamen ms la atencin (con moco, pus, sangre, etc.), hasta completar las 6 muestras. No es necesario que sean en das consecutivos. Ventajas del mtodo: i. El formol desodoriza y fija el material. ii. Puede enviarse a distancia. iii. Al ser seriado pone a cubierto las fases negativas de protozoarios (descargas cclicas de quistes). Desventajas del mtodo: i. El formol no preserva los trofozotos de protozoarios (en este caso puede reemplazarse por PVA). Examen de heces frescas: tcnica de Neghme Se recolecta una sola muestra de materia fecal en solucin fisiolgica; debe remitirse rpidamente al laboratorio y procesarse en el da (observacin inmediata o fijacin para ulterior observacin). Ventajas: Se pueden reconocer las formas vegetativas de los protozoarios. Desventajas: No es seriado. 2.4 Mtodos especiales de diagnstico-Enterobius vermicularis y Taenia spp 2.4.1 Mtodo de Graham-Garaguso para E.vermicularis 2.4.1.1 Preparacin del enfermo En todos los casos debe evitarse: i. El aseo de la regin anal y perianal antes de la realizacin de la obtencin de la muestra; esto reduce la sensibilidad del mtodo. ii. El uso de talcos, aceites o cremas en la regin afectada durante el perodo que abarque la recoleccin de las muestras. 2.4.1.2 Recoleccin, preservacin y transporte de la muestra. Se entregan 6 portaobjetos con cinta adhesiva de celofn adherido a estos, y 6 esptulas bajalenguas. El mtodo que se describe es adecuado para el diagnstico de enterobiosis en nios. Se deben tomar 6 muestras seriadas por las maanas sin previa higiene del margen anal, de la siguiente manera: i. Despegar la cinta adhesiva del portaobjetos y enrollarla en la esptula bajalenguas. La faz adhesiva debe quedar expuesta hacia afuera. El paciente en decbito ventral, debe separar los glteos. ii. Se debe aplicar repetidamente la faz adhesiva en la regin anal y perianal. iii. Pegar la cinta adhesiva sobre el portaobjetos, a modo de cubreobjetos. En adultos se recomienda reemplazar el procedimiento previo por el que se describe a continuacin, para el cual se entregan al paciente 5 gasas dobladas de 5x5 cm, aproximadamente, y un frasco de formol al 5%. Las muestras se toman seriadamente durante 5 das: i. El paciente en decbito ventral, debe separar los glteos. ii. Pasar la gasa, previamente humedecida en agua o solucin fisiolgica, por el ano y la regin perianal en forma repetida. iii. Colocar todas las gasas en el mismo frasco de formol. Debe tenerse en cuenta que los huevos de E. vermicularis son altamente infecciosos, por lo que deben extremarse las precauciones de higiene durante y despus de la toma de muestra. Recoleccin y preservacin de progltides y adultos de nematodes Ante la sospecha de infeccin por adultos de nematodes y de progltides de cestodes intestinales del gnero Taenia debe proveerse al paciente un frasco con formalina o solucin salina. No deben emplearse fijadores como el etanol (frecuentemente empleado en estos casos), ya que opacan la cutcula y dificultan la identificacin de la especie. Eventualmente, el paciente puede emplear agua corriente. Si se emplea agua o solucin salina la muestra debe ser refrigerada y enviarse sin demora al laboratorio. Debe tenerse en cuenta que el mantenimiento de adultos de nematodes o progltides 2.4.2 2.3 2.2

2.1.3

en solucin fisiolgica preserva la viabilidad de los huevos, siendo altamente infecciosos para el humano en el caso de T. solium, H. nana y E. vermicularis. 3 . Recoleccin, transporte y procesamiento de muestras para estudios especiales 3.1 Recoleccin de fluidos y tejidos De acuerdo al cuadro clnico y al diagnstico presuntivo, las formas evolutivas de los parsitos intestinales pueden ser investigadas en: i. Lquido duodenal. ii. Biopsias de intestino delgado o colon obtenidas mediante endoscopa. iii. Esputo. iv. Filtrado de materia fecal. La obtencin de estas muestras, complementarias a los estudios habituales, requiere la intervencin del mdico especialista, generalmente un gastroenterlogo. Se reservan para situaciones clnicas particulares (P.ej., coproparasitolgicos negativos en pacientes con sospecha fundada de giardiosis, amebosis, estrongiloidosis). En el caso de aspirados de lquido duodenal o esputo, estos deben colocarse en un tubo de vidrio o plstico transparente, limpio y seco. La cantidad de la muestra es de 2-5 ml y deber transportarse de modo inmediato al laboratorio o, en su defecto, refrigerarse a 4 C por un tiempo no mayor a las 4 horas. Las biopsias se recogern en solucin fisiolgica o paraformaldehdo al 4% para su ulterior preparacin histolgica con fines de microscopa de campo claro, fluorescencia o electrnica. Mtodo de la cpsula de Beal o Enterotest Consiste en hacerle tragar al paciente una cpsula con gelatina unida a una cuerda de nylon. La cpsula llega al duodeno y despus se la retira y se observa el material mucoso duodenal. Se emplea para identificar trofozotos de Giardia intestinalis y larvas de Strongyloides stercoralis. 3.3 Recoleccin de material y deteccin de antgenos y/o cidos nucleicos en materia fecal (recomendaciones del CDC) 3.3.1 Deteccin de antgenos de protozoarios en materia fecal: Por regla general deben consultarse las condiciones de recoleccin y preservacin sugeridas por el fabricante del equipo que se emplear para el diagnstico (materia fecal fresca, fijada o congelada). La deteccin de coproantgenos parasitarios se realiza tanto mediante ELISA como por inmunocromatografa. Antgenos particulados (p.ej., quistes de protozoarios intestinales) pueden detectarse mediante inmunofluorescencia directa. Se desaconseja el uso de PVA y los mtodos de concentracin, en el caso de deteccin de antgenos de Giardia intestinalis mediante ELISA. 3.3.2 Deteccin de cidos nucleicos: Las muestras deben recogerse en ausencia de fijadores y enviarse refrigeradas o congeladas (hielo seco). Como alternativa, las muestras se pueden mezclar en proporcin 1:1 con dicromato de potasio o etanol absoluto y enviarse refrigeradas. Para protozoarios intestinales, se recomienda previamente hacer tinciones y examinarlas microscpicamente; en caso de identificar al parsito por morfologa, la PCR no se realiza. Es necesario realizar la extraccin del ADN de la muestra de materia fecal previo a la realizacin de la PCR. 3.2

TRABAJO PRACTICO N 2: PARASITOS DE SANGRE Y TEJIDOS-ARTROPODOS CONTENIDOS PROTOZOARIOS DE SANGRE Y TEJIDOS-HELMINTOS TISULARES-ARTROPODOS DE IMPORTANCIA MEDICA Estados parasitarios caractersticos y su morfologa. Ciclos biolgicos y de transmisin-relacin con profilaxis. Relacin de estructuras morfolgicas con biologa y mecanismos patognicos. METODOLOGIA DE DIAGNOSTICO DE HEMOPARASITOS. Toma de muestra y metodologa y su relacin con el ciclo biolgico y perodo de infeccin.

ACTIVIDADES Observacin microscpica de estados parasitarios: Protozoarios de sangre y tejidos: Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi (frotis sanguneo-gota gruesa-Giemsa). Epimastigotes de T. cruzi (material cultivo axnico-Giemsa). Amastigotes de T. cruzi (miocardio o msculo esqueltico-H-E). Promastigotes de Leishmania spp (material cultivo axnico-Giemsa). Estados intraeritrocitarios de Plasmodium falciparum. Taquizotos de Toxoplasma gondii (Inmunoperoxidasa). Helmintos tisulares: Membrana cuticular y vesculas prolgeras de quiste hidatdico Huevos de Fasciola hepatica (heces). Corte histopatolgico de adulto de Fasciola hepatica en hgado. Larvas de Trichinella spiralis en corte histopatolgico. Artrpodos: Adultos de Phlebotomus spp Adultos de Sarcoptes scabiei. Observacin de preparados macroscpicos y elementos diagnsticos Protozoarios de sangre y tejidos-artrpodos: Capilares con sangre normal centrigugada (mtodo del microhematocrito) Cajitas para realizar xenodiagnstico Huevos, ninfa y adulto de Triatoma infestans (Vector biolgico de Trypanosoma cruzi) Helmintos tisulares: Quistes hidatdicos-Hidatidosis sea (formol) Cisticercos de Taenia solium (formol) Adultos de Fasciola hepatica libres y en hgado (formol) Caracoles de Limnaea spp (husped intermediario de Fasciola hepatica) Observacin en video de estados mviles de: Tripomadtigotes de T. cruzi (sangre perifrica) Epimastigotes de T. cruzi (cultivo axnico). Promastigotes de Leishmania spp (cultivo axnico). Estados mviles de Trypanosoma brucei (cultivo axnico) Tincin de frotis con sangre con tripomastigotes con Giemsa y observacin microscpica de los mismos con aceite de inmersin. Los estudiantes guiados por su docente seguirn las indicaciones de la gua. Por razones de bioseguridad los extendidos de sangre parasitada estarn previamente fijados para que no representen riesgo de infeccin. Se revisarn en clase las condiciones de toma de muestra de sangre y los mtodos de realizacin de frotis y gota gruesa descriptos en el anexo adjunto.

ACTIVIDAD HEMOPARASITOS TINCION DE EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFERICA CON GIEMSA Y OBSERVACION MICROSCOPICA La coloracin de metanol-Giemsa se emplea en diagnstico parasitolgico para identificacin de hemoparsitos: tripomastigotes de Trypanosoma cruzi y estados intraeritrocitarios de diversas especies de Plasmodium en frotis y gota gruesa (sangre perifrica), se usa para identificar amastigotes de Leishmania app en material de lesin cutnea o aspirado de mdula sea. La tincin de Giemsa tambin nos es til para observar los detalles morfolgicos diferenciales (posicin del kinetoplasto con respecto al ncleo) de tripomastigotes, epimastigotes (T. cruzi) y de promastigotes (Leishmania spp). Fundamento: El metanol-Giemsa es una tincin tipo Romanowsky que fue diseada originalmente para idenficar clulas sanguneas. Otras coloraciones tipo Romanowsky son Giemsa combinado con May-Grnwald, Wright, Leishman y Field; se diferencian entre s por la distinta proporcin de colorantes que emplean. Las tinciones de tipo Romanowsky emplean un colorante cido (eosina) y colorantes bsicos (tiacinas): Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidativa (colorantes tipo azur). La eosina se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas da una coloracin rosa a los eritrocitos y citoplasma de leucocitos. Los colorantes tiacnicos tien estructuras cidas de color azulado; la cromatina nuclear de los leucocitos reacciona con el azul de metileno siendo el color resultante distinto al habitual, de color azul violceo o prpura; este efecto metacromtico de cambio de color recibe la denominacin de efecto Romanowsky o efecto Giemsa. Materiales: -Extendidos de sangre perifrica de ratones con infeccin aguda por Trypanoaoma cruzi Por razones de bioseguridad los extendidos de sangre parasitada ya han sido fijados previamente. -Colorante de Giemsa (solucin de Azur eosina-azul de metileno segn Giensa) diludo 1/10 en agua a pH neutro (preparado diariamente y fraccionado en tubos cnicos de 15ml)) -Gradillas -Pipetas Pasteur de plstico -Bandejas de coloracin -Frascos con agua corriente para lavar los extendidos (opcional) -Aceite de inmersin -Eter de petrleo para limpiar objetivos -Microscopio ptico -Elementos de limpieza y bioseguridad: Lavandina diluda Alcohol 70 Servilletas o rollo de papel Guantes Frascos de descarte Bolsa roja de descarte Procedimiento: A los extendidos de sangre perifrica que se emplean en el TP ya se les hizo el paso previo de fijacin con metanol 5 min .previo a la coloracn con Giemsa. Discutir por qu en el caso de la gota gruesa la coloracin de Giemsa se realiza sin fijacin previa. 1) Agregar al extendido colorante de Giemsa diludo, cubriendo toda la superficie del preparado. Teir de 15 a 30 min. Durante la tincin se revisarn la toma de muestra de sangre puncin digital y venosa y los mtodos de realizacin de frotis y gota gruesa. 2) Volcar el colorante, lavar con agua corriente. 3) Dejar secar al aire los preparados en forma vertical. 4) Colocar una gota de aceite de inmersin y realizar observacin microscpica a 1000x. Verificar calidad de la tincin y realizar bsqueda de tripomastigotes. Si la tincin fue correctamente realizada, los preparados no deben tener manchas de colorante o precipitados, la coloracin debe tener la intensidad adecuada (ni muy plida ni muy intensa), los eritrocitos deben estar teidos de color rosado y los ncleos de los leucocitos de color prpura. Los tripomastigotes tienen un tamao aproximadamente equivalente a los eritrocitos; se observarn con un citoplasma azul claro, un ncleo rosado y el kinetoplasto de color prpura; puede o no llegar a observarse la membrana ondulante. Se discutir con el docente las posibles causas de defectos en la tincin. 5) Al finalizar la observacin, limpiar los objetivos con ter de petrleo. Los preparados se limpian aplastando los portaobjetos sobre papel, SIN FREGAR y SIN APLICAR SOLVENTE: Los estudiantes pueden conservar los preparados teidos.

Recomendaciones. -Aunque los extendidos fueron fijados previamente, por razones de bioseguridad se aconseja su manipulacin CON GUANTES. -Verificar tanto antes de agregar el colorante como antes de poner la gota de aceite de inmersin que se est trabajando sobre el lado del portaobjetos en que se realiz el extendido. -Al teir, tratar que el colorante cubra uniformemente toda la superficie del preparado. -Manipular el material de forma tal de minimizar salpicaduras de colorante; limpiar la mesada manchada con alcohol 70.inmediatamente.

CONTENIDOS ADICIONALES TP DE PARASITOS DE SANGRE Y TEJIDOS

IMAGENES- A MODO DE ATLAS DE (NO EXCLUYE LA CONSULTA DE TEXTOS Y

ATLAS ESPECFICOS) A continuacin se indican las caractersticas morfolgicas salientes de los dos hemoparsitos endmicos de Argentina. Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi. Se observa el flagelo que emerge por el extremo anterior (flecha), el kinetoplasto (flecha punteada) y el ncleo en posicin media (flecha hueca). La membrana ondulante se distingue particularmente en el ejemplar de la izquierda. May-Grnwald-Giemsa. Aumento original: 1000x.

Estadios sanguneos de Plasmodium vivax. May-Grnwald-Giemsa. Aumento original: 1000x Gametocito (flecha) y trofozoto joven (flecha hueca) en eritrocitos de sangre perifrica de un paciente infectado con Plasmodium vivax. Aumento original: 1000x.

Trofozoto maduro de Plasmodium vivax. Se observa acumulacin de hemozona (grnulos de Schffner) en el citoplasma del eritrocito infectado. Aumento original: 1000x

Esquizonte de Plasmodium vivax (flecha). Se observan claramente los mltiples ncleos resultantes de la esquizogonia. Aumento original: 1000x.

RECOLECCION, TRANSPORTE, CONSERVACION Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE PARSITOS DE SANGRE Y TEJIDOS Ficha tipo: Nombre y apellido. Edad. Lugar de nacimiento. Residencia actual y anteriores Tipo de vivienda y caractersticas de los alrededores. Viajes recientes. Animales domsticos. Personas parasitadas en la vivienda (si es nio, es de especial inters conocer los antecedentes maternos). Ingesta de carnes mal cocidas. Origen del agua. Reconocimiento de vectores y su presencia en el domicilio o alrededores. Fecha de comienzo de la enfermedad y diagnstico clnico presuntivo. Preparacin del paciente Para la preparacin del enfermo que va a ser investigado, ante la sospecha de infeccin de parsitos de sangre y tejidos. deben cumplirse las normas generales de higiene y antisepsia relativas a la obtencin de muestras de sangre y biopsias. Sin embargo, se justifican algunas precisiones: En el caso de muestras de sangre para serologa se aplica el requisito de un ayuno mnimo para evitar el exceso de lpidos que pudieran interferir en los mtodos de inmunodiagnstico. Sin embargo, este requisito no es necesario si se obtuviera la muestra de sangre para realizar un diagnstico directo (P.ej., para tripanosomosis americana, malaria o filariosis). En el caso de biopsias cutneas o transcuneas, la piel debe ser adecuadamente lavada con agua y jabn y desinfectada con iodo-povidona o etanol 70 %, antes de realizar el procedimiento quirrgico (o aspirado en el caso de biopsia de mdula sea o ganglios linfticos). 1 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras 1.1 Sangre 1.1.1 Recoleccin 1.1.1.1 Puncin digital Limpiar del pulpejo del dedo medio (mano izquierda si el paciente es diestro o viceversa), con alcohol 70%, dejar evaporar y punzar el pulpejo con lanceta o aguja estril (de preferencia en la cara lateral del dedo). En casos peditricos se puede emplear el mismo procedimiento para punzar el taln 1.1.1.2 Puncin venosa Se recogen dos muestras, una sin anticoagulante para estudios serolgicos y otra con anticoagulante en condiciones estriles, esta ltima muestra se emplear para realizar estudios de diagnstico directo (inocular medios de cultivo o animales), y realizar el examen microscpico en fresco con o sin previa concentracin. Las muestras para la determinacin directa de un hemoparsito debern ser remitidas al laboratorio de manera inmediata, a temperatura ambiente (22-25 C). Los materiales necesarios incluyen: Agujas y jeringas descartables estriles, algodn, alcohol, capilares heparinizados, tubos de ensayo, heparina, portaobjetos y cubreobjetos, plastilina, centrfuga para microcapilares y/o centrfuga clnica. 1.1.2 Procesamiento En el caso de investigacin de la muestra en fresco, sta debe ser estudiada de modo inmediato para limitar la prdida de sensibilidad, debido a la muerte de parsitos. Por el contrario, las muestras fijadas y coloreadas pueden ser enviadas con tiempo al laboratorio de referencia para su evaluacin. 1.1.2.1 Gota fresca (si se sospecha una tripanosomosis o filariosis) Colocar una gota entre porta y cubre-objeto y revisar microscpicamente el preparado recorrindolo totalmente en guarda griega. Si la muestra no se observara de manera inmediata, conviene recoger sangre con heparina u otro anticoagulante en un tubo y preparar la gota fresca en el momento de realizar la observacin. El reconocimiento de los parsitos se basa en su morfologa y movimientos. Los preparados deben ser observados nicamente con objetivos secos (4x-10x-40x). La sensibilidad es baja porque la muestra no est concentrada. 1.1.2.2 Extendidos o frotis (para tripanosomosis, filariosis, paludismo y babesiosis) Sobre un extremo de un portaobjeto seco, previamente desengrasado con una mezcla de alcohol-acetona, se coloca una pequea gota de sangre. La misma se extiende, ayudndose con un segundo portaobjeto que se colocar por delante, pero contactando la gota de sangre en un ngulo de 45 aproximadamente y que servir para deslizarla formando una fina pelcula. Dejar secar y transportar al laboratorio para su fijacin y tincin con colorantes adecuados (May-Grnwald-Giemsa o Wright-Giemsa). Al igual que la gota fresca, esta tcnica tiene baja sensibilidad. Sin embargo, permite visualizar detalles morfolgicos de los parsitos y ser mantenida como registro permanente. 1.1.2.3 Gota gruesa (para tripanosomosis, filariosis y paludismo) Colocar sobre el centro del porta una gota de sangre bastante grande; sobre ella se agregarn 1 a 3 ms, segn el espesor de las gotas que se extraigan. Con el ngulo de otro portaobjetos efectuar sobre las gotas un movimiento espiral desde el centro hacia la periferia raspando la superficie del portaobjeto. Extender la superficie de las gotas durante uno a dos minutos. De esta manera se desfibrinar la sangre y se extender la gota con un dimetro de 2 a 2,5 cm. Dejar

secar y enviar al laboratorio para su tincin con Giemsa diludo sin fijacin previa. Es una tcnica de sensibilidad mayor que las anteriores, pero tiene peor definicin de las estructuras parasitarias. 1.1.2.4 Microhematocrito Tomar sangre del pulpejo del dedo (o del taln) y cargar varios capilares heparinizados (en general se emplean seis microcapilares por paciente). Sellar un extremo con plastilina o calor y centrifugar a 1500-2500 rpm por 5 minutos. Si no se puede proceder a centrifugar inmediatamente, conviene tomar una muestra de sangre heparinizada en tubo y preparar con ella los microhematocritos en el momento de procesarlos. Luego de centrifugado se obtienen 3 fases: plasma, leucocitos y eritrocitos. Los tripomastigotes sedimentan junto con los leucocitos. Se observa microscpicamente la fase leucocitaria entre portaobjetos y cubreobjetos. Es la tcnica de eleccin para el diagnstico directo de transmisin congnita de enfermedad de Chagas. Tiene una sensibilidad de 90-95% en la infeccin aguda. 1.1.2.5 Xenodiagnstico (se utiliza para T. cruzi) Se emplean 40 ninfas de T. infestans de tercer estadio, con ayuno previo de 15 das, repartidas en 4 cajas (10 insectos por caja). Las cajas se cubren con una gasa bien fijada y se colocan simultneamente durante 30 min. en antebrazos y/o muslos del paciente. Se investigar el contenido intestinal de los insectos durante un lapso de 45-60 das. Este mtodo slo es usado en casos especiales en los centros de referencia, pues es laborioso y caro, pero su sensibilidad es cercana al 100% en la fase aguda de la infeccin. 1.1.2.6 Deteccin de antgenos en sangre mediante inmunocromatografa Se emplea para identificar gnero y especie de Plasmodium (P. vivax y P. falciparum). Sangre obtenida por puncin digital es lisada en solucin hipotnica, liberando antgenos parasitarios. Los antgenos reaccionan en fase lquida con anticuerpos especficos marcados con oro coloidal. Los complejos inmunes migran en una tira de papel (o dentro de un cassette) y se unen a anticuerpos especficos de captura, unidos covalentemente a la tira de papel. La reaccin es positiva si se observan bandas coloreadas, aparte de la correspondiente al control positivo. 1.1.2.7 QBC (Quantitative buffy coat o mtodo de naranja de acridina) Es una tcnica para detectar infeccin por Plasmodium y Babesia en muestras de sangre. La sangre se recoge en un tubo capilar con sus paredes internas recubiertas del fluorocromo naranja de acridina. Este fluorocromo se intercala en el ADN. Luego de centrifugar el capilar en una microcentrfuga, se observan los parsitos fluorescentes en los eritrocitos que se concentran debajo de la interfase leucocitaria, empleando un microscopio provisto de luz UV. Esta prueba tiene como ventajas ser ms rpida y ms sensible que la gota gruesa. 1.2 Tejidos slidos 1.2.1 Recoleccin 1.2.1.1 Obtencin por puncin con agujas finas Esta tcnica se utiliza habitualmente para el diagnstico de leishmaniosis visceral, para la cual se obtiene muestras por puncin-aspiracin generalmente de mdula sea (esternn o cresta ilaca) y excepcionalmente de bazo, ganglios o hgado. 1.2.1.2 Mediante acto quirrgico a partir de rganos Se pueden obtener muestras de todo tipo de rganos (pulmn, ganglios, hgado, bazo, piel, tejido celular subcutneo, etc), dependiendo del parsito sospechado. 1.2.2 Procesamiento 1.2.2.1 Frotis Con los aspirados de mdula sea, ganglio o bazo se pueden realizar extendidos. En estos es posible identificar Leishmania donovani mediante microscopa de campo claro, con los colorantes habituales para hematologa, o microscopa de fluorescencia, empleando anticuerpos conjugados con fluorocromos. 1.2.2.2 Improntas El material obtenido mediante ciruga (p.ej., ganglios, bazo, hgado) puede emplearse para realizar improntas. Luego de obtener la pieza, se elimina la sangre superficial por aposicin sobre papel de filtro. Las improntas se tien con colorantes habituales para hematologa. 1.2.2.3 Cortes histolgicos Para microscopia ptica (de campo claro o de fluorescencia) o electrnica. Actualmente, algunos laboratorios tambin realizan tcnicas de biologa molecular sobre el material de biopsia (PCR e hibridizacin in situ), pero su empleo an no est normatizado.