Aide la validation des mthodes en Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique Help for validation of analytical procedures in Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring Groupe de travail "Accrditation" de la Socit Franaise de Toxicologie Analytique Coordonnateur: Anne GRUSON, Laboratoire de Biochimie-Toxicologie, Centre Hospitalier, 57, avenue Winston Churchill- 62022 ARRAS Cedex - Tl: 03 21 211085 - E-mail: anne.gruson@ch-arras.fr Membres du groupe de travail: Bernard DINGEON, Marie-Franoise DREYFUSS, Yvan GAILLARD, Anne LE BOUIL, Michel LHERMITTE, Stphanie MAZZEGA, Mustapha MOULSMA, Gilbert PPIN, Martine PERRIN, Jocelyne PLESSE, Olivier ROUSSEL, Marie-Thrse THEVENGr, lisabeth VINNER, Marc DEVEAUX (membre associ) (Accept pour publication le 31 octobre 2005) SOMMAIRE 1. Introduction IT. tat des lieux - Contexte rglementaire et normatif m. Quelles sont les informations pertinentes connatre ? IV. Choix pralable la vrification des critres de performance et limites d'acceptabilit de la mthode, des vrifications exprimentales, des vrifications bibliographiques V. Vrification d'une mthode d'analyse quantitative - Contenu du dossier V.1 Vrification initiale d'une mthode quantitative V.2 Confirmation des performances en routine VI: Vrification d'une mthode d'analyse qualitative - Contenu du dossier VI. 1 Vrification initiale d'une mthode qualitative VI. 2 Confirmation des performances en routine VIT. Vrification d'une mthode d'analyse assimilable au quantitatif rsultat qualitatif - contenu du dossier VII. 1 Vrification initiale d'une mthode assimilable au quantitatif VII. 2 Confirmation des performances en routine vm. Matrise de la documentation - Mthodologie IX. Exemples mthodologiques IX.1 Fidlit IX.2 Justesse (biais) IX.3 Contamination IX.4 Limite de dtection et limite de quantification IX.5 Linarit IX.6 Stabilit IX.7 Corrlation de mthodes X. Terminologie - Autres dfinitions XI. Bibliographie 1 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 1. Introduction Ce document a pour but d'expliciter ce qui est entendu par les aspects de "validation de mthode" dans le cadre pr- cis des laboratoires engags ou souhaitant s'engager dans une dmarche de qualit dans le domaine des analyses en Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique, et notamment dans une dmarche d'accrditation COFRAC selon le programme 168. Dans ce domaine, la problmatique de la "validation" repose sur le fait que les mthodes d'analyses ne sont pas issues de normes publies. Cette "validation" s'inscrit alors dans une vrification des perfor- mances annonces par le fabricant ou souhaites par le laboratoire, lors de la mise en application des mthodes d'analyses dans son laboratoire. Ceci afin de lui apporter confirmation et preuve de la validit des rsultats rendus (phase de "qualification"), par rapport ses propres besoins. Cette validation est prendre en terme de matrise du processus analytique, au niveau initial. La validation d'une mthode devra s'envisager en fonction des diffrents contextes auxquels sera confront le bio- logiste ou le responsable technique. "La validation est toujours un quilibre entre les cots, les risques et les possi- bilits techniques" (extrait de l'ISO/CEl 17025, 5.4.5.3 note 3, et NF EN ISO 15189), et le temps. On entend par validation, ''[ ... ] la confirmation par examen et apport de preuves objectives du fait-que les prescriptions particulires en vue d'une utilisation dtermine sont remplies." (extrait de l'ISO/CEl 17025, 5.4.5.1). Au pralable, le biologiste ou le responsable technique devra lire attentivement le dossier des fournisseurs (notices, fiches techniques, rfrences bibliographiques, ... ). Il devra valuer et apprcier ces informations la lueur de recommandations ou de textes rglementaires, des critres de performance proposs par des socits savantes, des attentes du prescripteur ou du requrant. Dans un deuxime temps la validation sera effectue. Le champ et la profondeur de cette valuation dpendront des circonstances et de chaque cas particulier. Cette validation devra tre initiale, puis se continuer dans le temps (chan- gement de lots de ractifs [si effet de lot connu], extensions analytiques, maintenance lourde, ... ). Dans certains cas cette validation sera une confirmation des performances d'une mthode dj en cours d'utilisation. Les critres fondamentaux de l'valuation de la mthode (exemple dossier de marquage CE) sont en principe dter- mins par le fabricant. Si les coffrets ractifs et systmes sont utiliss strictement dans les conditions prconises par le fabricant, les mthodes qui y font appel sont prises en compte comme des mthodes normalises. Dans ce cas, le laboratoire doit uniquement valider (vrifier) la mise en application dans son environnement propre par rapport des critres et des limites acceptables (spcifications) qu'il s'est fix, pour correspondre aux besoins de ses clients. Il n'est en effet pas demand aux laboratoires d'effectuer de nouveau l'valuation des mthodes ou des automates, tudes qui ont dj t ralises par le fournisseur ou le fabricant, qui eux ne connaissent pas ces besoins. Notel: De la dfinition de la validation dcoule la mthodologie de la conduite d'un processus de validation. "Les prescriptions particulires" identifient les caractristiques, par exemple les spcifications pralablement dfinies sur certains critres galement choisis, conditions qui doivent tre remplies pour dclarer la mthode valide. Note 2 : Ce document a t labor partir du guide de validation des mthodes en biologie mdicale: document LAB GTA 04 (juin 2(04). " II. Etat des lieux - Contexte rglementaire et normatif Ce guide sert tablir un protocole d'valuation des mthodes utilises dans un laboratoire. Cette valuation per- met de constituer le dossier de validation des mthodes utilises dans le laboratoire. Cette validation est une exigence de la norme NF EN ISO/CEl 17025 dans son paragraphe 5.4 traitant des "Mthodes d'essai et d'talonnage et validation des mthodes", et plus prcisment au 5.4.5 Validation des mthodes, qui est dfinie au 5.4.5.1 : "La validation est la confirmation par examen et l'apport de preuves objec- tives du fait que les prescriptions particulires en vue d'une utilisation prvue dtermine sont remplies." Le paragraphe 5.4.2 indique que: "Lorsque le client ne spcifie pas la mthode utiliser, le laboratoire doit slec- tionner des mthodes appropries qui ont t publies dans des normes internationales, rgionales ou nationales, 2 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, nO 3, supplment 1, 2005 par des organisations techniques de renom ou dans des textes ou revues scientifiques spcialiss, ou spcifies par le fabricant de l'quipement. Des mthodes dveloppes par le laboratoire ou des mthodes adoptes par le labo- ratoire peuvent galement tre employes si elles conviennent l'usage prvu et qu'elles ont t valides. Le client doit tre inform de la mthode choisie. Le laboratoire doit confirmer qu'il peut correctement appliquer des mthodes normalises avant de les mettre en uvre pour des essais ou des talonnages. En cas de changement de la mthode normalise, la confirmation doit tre rpte." Cette exigence figure dans le Guide de Bonnes Excutions des Analyses de Biologie Mdicale (Arrt du 26 novembre1999 relatif la bonne excution des analyses de biologie mdicales) : Dfinition des termes Evaluation ( 2.6), Qualification ( 2.11), Transfrabilit ( 2.13), Valeurs de rfrence (2.14), Validation ( 2.15) ; dans le l.lc concernant les installations, l'quipement, l'instrumentation, les produits fongibles et les ractifs " ... s'assurer que les installations, l'quipement et l'instrumentation du laboratoire sont fonctionnels. " Dans la nouvelle norme ISO 15189, la validation est retrouve au niveau du 5.3.2, 5.3.4 et son point. h) mais surtout dans le paragraphe 5.5.1 : "Le laboratoire doit utiliser des procdures analytiques, incluant celle de slec- tion et d'aliquotage d'chantillons, qui correspondent aux besoins des utilisateurs des prestations de laboratoire et qui conviennent chaque type d'analyse. Les procdures analytiques conseilles sont celles qui ont t publies dans des manuels bien tablis et faisant autorit, dans des textes et des journaux revus par des experts ou des recom- mandations rgionales, nationales ou internationales. Si des procdures internes sont utilises, elles doivent tre valides de manire approprie pour l'utilisation prvue et parfaitement documentes.", et le paragraphe 5.5.2 : "Le laboratoire doit utiliser uniquement des procdures valides pour s'assurer qu'elles conviennent l'utilisation prvue. Les validations doivent tre aussi approfondies que ncessaires pour rpondre aux besoins de l'application ou du domaine d'application concern(e). Le laboratoire doit enregistrer les rsultats obtenus et la procdure uti- lise pour la validation. Les mthodes et les procdures slectionnes doivent tre values et donner des rsultats satisfaisants avant d'tre utilises pour les analyses mdicales. Une revue des procdures par le directeur du laboratoire ou une personne dsigne doit tre ralise l'origine intervalles dfinis. Ces revues sont gnralement effectues une fois par an. Ces revues doivent tre documentes." Le paragraphe suivant ( 5.5.3) dveloppe cet aspect de validation en prci- sant "[ ... ] Les performances et l'aptitude l'emploi prvu de chaque nouvelle version des trousses de ractifs prts l'emploi prsentant des modifications importantes en termes de ractifs ou de procdure doivent tre vrifies. Tout changement de la procdure doit tre dat et faire l'objet d'une autorisation comme pour les autres proc- dures." Le paragraphe 5.3.2 quant lui indique que "Il doit tre dmontr (lors de l'installation et au cours de l'utilisation courante) que le matriel est capable d'atteindre les performances requises et qu'il est conforme aux spcifications se rapportant aux analyses. La direction du laboratoire doit laborer un programme de surveillance rgulire permettant de dmontrer l'ad- quation de l'talonnage et du fonctionnement des instruments, des ractifs, et des systmes analytiques. Elle doit galement instaurer un programme de maintenance prventive document et enregistr [ ... ] respectant, au mini- mum, les recommandations dufabricant." Note: Cette nouvelle norme ISO 15189 se situe dans le prolongement des travaux mens par EC4 (European , Communities Confederation of Clinical Chemistry) publis dans l'article : Essential Criteria for Quality Systems of Medical Laboratories (Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997 ; 35(2) : 123-132 1997 by Walter de Gruyter Berlin New York). Cet article est consultable partir du site: http://www.uni-oldenburg.de/ec4/ec4qua1.htm#ECText. Outre la comptence du biologiste ou du responsable technique, l'utilisation et la gestion correcte des Contrles de Qualit (CQI, CQE), la validation permet d'assurer la qualit de la prestation d'analyse et du rsultat. Cette valida- tion sera mise profit pour estimer les incertitudes des mesures du laboratoire, notion prsente dans le GBEA : " 4. Expression des rsultats et comptes rendus d'analyses, 4.1. Expression des rsultats: L'expression des rsultats doit tre prcise et sans quivoque. Les valeurs de rfrence doivent tre indiques. La mthode d'analyse et/ou les ractifs utilis( e)( s) doivent tre mentionn( e)( s) chaque fois qu'ils peuvent influer sur l'expression du rsultat ainsi que lorsque la rglementation l'exige. Pour les rsultats quantitatifs, le cas chant, les performances analytiques de la mthode peuvent tre indiques. Les units du systme international (SI) doivent tre utilises quand elles existent." 3 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, nO 3, supplment 1,2005 Cette estimation de l'incertitude de mesure se retrouve dans la norme ISO/CEl 17025 au 5.4.6 "Estimation de l'in- certitude de mesure", avec au 5.4.6.2 "Les laboratoires d'essais doivent aussi possder et appliquer des proc- dures pour estimer l'incertitude de mesure. Dans certains cas, la nature de la mthode d'essai exclut un calcul rigoureux, mtrologiquement et statistiquement valable, de l'incertitude de mesure. Dans de tels cas, le laboratoire doit au moins tenter d'identifier toutes les composantes de l'incertitude etfaire une estimation raisonnable, tout en assurant que la manire d'en rendre compte ne donne pas une impression errone de l'incertitude. Une estimation raisonnable doit se baser sur une connaissance de la performance de la mthode et sur le domaine de la mesure et faire appel, par exemple, l'exprience acquise et aux donnes de validation antrieures." Cette approche des incertitudes est aussi une exigence de la nouvelle norme ISO 15189. Dans le paragraphe traitant de la validation, 5.5.3, son point h) indique "les sources potentielles de variation des rsultats." En outre, dans le 5.6.2, il est indiqu: "Le laboratoire doit dterminer l'incertitude des rsultats, dans le cas o cela est pertinent et possible. Toutes les composantes importantes de l'incertitude doivent tre prises en compte. Les sources contri- buant l'incertitude peuvent inclure l'chantillonnage, la prparation des chantillons, la slection des aliquotes d'chantillon, les calibrateurs, les matriaux de rfrence, les grandeurs d'entre, l'quipement utilis, les condi- tions exprimentales, l'tat de l'chantillon et les changements de manipulateurs." Le biologiste, ou le responsable technique, doit pouvoir mettre disposition du demandeur d'analyses, en cas de besoin, une approche de l'valuation des incertitudes de mesure. III. Quelles sont les informations pertinentes connatre ? D'une manire gnrale, une mthode d'analyse prsente plusieurs caractristiques essentielles que le laboratoire se doit de connatre. La connaissance de ces paramtres peut tre acquise par la bibliographie et/ou par l'exprimenta- tion sur site. Schmatiquement, on distinguera trois types de mthodes d'analyse que l'on sera amen traiter diffremment: 1. Les analyses de type quantitatif vrai: Elles fournissent un rsultat chiffr, sur une chelle continue dont les limites basses et hautes sont connues, en rela- tion directe avec une quantit ou une activit donne de l'analyte mesurer. Ex : Dosage de mdicaments dans le cadre du Suivi Thrapeutique Pharmacologique et dosage d'autres xnobio- tiques en Toxicologie. Analyses ralises par mthodes immunologiques et/ou chromatographiques. 2. Les analyses de type qualitatif: Le rsultat de ce type d'analyse n'apporte pas d'information sur la quantit de l'analyte, mais seulement sur sa pr- sence ou sa non dtection (positif ou non dtect). Ex : Dpistage de xnobiotiques par mthodes chromatographiques. Les pics des chromatogrammes obtenus sont identifis par les temps de rtention et par les spectres UV et/ou de masse. Ils peuvent tre compars une biblio- thque prdfinie de spectres. 3. Les analyses assimilables des analyses quantitatives : Dans ce cadre seront regroupes des analyses fournissant un rsultat de type qualitatif, extrapol partir de la mesu- re d'une donne quantifiable (Absorbance par exemple) avec un effet de seuil. Ex : En Toxicologie, dtermination d'une classe de molcules mdicamenteuses (benzodiazpines, antidpresseurs tricycliques ... ), ou de substances illicites (amphtamines, opiacs, cannabinodes, cocaniques ... ) avec des seuils pr- dfinis. En Suivi Thrapeutique Pharmacologique (observance du traitement), mesure d'une molcule cible (mtha- done, buprnorphine ... ). Les analyses sont ralises selon le principe d'immunocomptition (EMIT, ELISA, CEDIA. .. ). 4 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005 Selon l'appartenance de la mthode un de ces trois types d'analyse ainsi dfinis, les informations pertinentes connatre sont exposes dans le tableau ci-dessous: Mthode quantitative MthQde qualitative" Mthode 3.'ilSimilable au quantitatif Spcificit Spcificit Spcificit Fidlit NA Fidlit Justesse (approche de la) NA NA Domaine d'analyse NA NA Limite de dtection Limite de dtection Limite de dtection Limite de quantification Linarit NA NA Contamination entre chantillons Contamination entre chantillons Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) (s'il y a lieu) (s'il y a lieu) Stabilit Stabilit Stabilit Robustesse Robustesse Robustesse Valeurs de rfrence NA NA "ex-valeurs normales" Interfrences Interfrences Interfrences Corrlation avec mthode de rfrence ** Corrlation avec mthode de rfrence ** Corrlation avec mthode de rfrence ** Corrlation avec mthode dj Coorrlation avec mthode dj Coorrlation avec mthode dj utilise au laboratoire ** utilise au laboratoire ** utilise au laboratoire ** (* NA : Non applicable) ** Chaque fois que cela est ncessaire Note: Les paramtres de fidlit (rptabilit, fidlit intermdiaire et/ou de reproductibilit) d'une part, et de jus- tesse d'autre part, constituent les composantes de l'incertitude de mesure, dans le calcul d'incertitude globale selon l'approche ISO 5725, en tant que composantes de type A. Associe aux composantes d'talonnage le cas chant et aux composantes de type B, J'incertitude globale peut alors tre dtermine (voir chapitre IX. Exemples mthodo- logiques). IV. Choix pralable la vrification des critres de mthode, vrifications performance et limites d'acceptabilit de la des vrifications exprimentales, des bibliographiques A ce stade, il est fondamental de souligner que : Le choix des critres de performance (paramtres) et limites d'acceptabilit (spcifications, seuils) associs d'une , mthode doit se faire pralablement l'tude de validation. Ce choix est du ressort du biologiste ou du responsable technique. Ce choix doit reflter l'tat de l'art et la pertinence toxicologique et clinique. Il pourra s'appuyer sur des recom- mandations de socits savantes ou de groupes de travail, ou issues de confrences de consensus, sur des publica- tions scientifiques, sur des rsultats de campagne de comparaisons interlaboratoires, etc ... Les limites d'acceptabilit ainsi choisies doivent tre adaptes et notifies pour chacun des niveaux, pour chacun des analytes et pour chacune des matrices qui seront contrls dans l'tude. Ces limites d'acceptabilit peuvent reposer sur diffrentes approches: l'intervalle des valeurs de rfrence (prise en compte de la variation biologique inter individuelle et de la variation analytique), les variations inter-individuelles et l'opinion des cliniciens et/ou des mdecins lgistes et l'tat de l'art. 5 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 V. Vrification d'une mthode d'analyse quantitative - Contenu du dossier La vrification d'une mthode comprend une phase initiale, avant sa mise en uvre effective en routine, et une phase de vrification continue et de confirmation des performances dans le cadre du fonctionnement normal et quotidien du laboratoire. V.l Vrification initiale d'une mthode quantitative Dans ce cadre, le dossier devra apporter les lments de vrification suivants, par recherche bibliographique et/ou par vrification sur site : A VRIFIER ET/OU NNNtrnm _ ... ' . ' ,' sur
Spcificit Oui Non Fidlit Oui Oui Justesse (approche de la) Oui Si possible Domaine d'analyse Oui Si besoin Limite de dtection Oui Si besoin Limite de quantification Linarit Oui Si besoin Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui pour les paramtres sensibles Stabilit Oui Si besoin Robustesse Oui Non Interfrences Oui Si besoin Valeurs de rfrence "ex-valeurs normales" Oui Non Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique. Certains de ces lments peuvent ventuellement tre vrifis au dbut de la mise en uvre en routine de la mtho- de (la fidlit intermdiaire notamment). Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles. V.2 Confirmation des performances en routine Pour matriser pleinement une mthode, l'utilisation, la gestion et le suivi de contrles de qualit internes (CQI) et externes (CQE) si disponibles, sont indispensables. Leur exploitation statistique permet de vrifier et de confirmer les lments suivants : Fidlit, Justesse, ou du moins en faire une approche en l'absence de matriau de rfrence, Vrification (et adaptation ventuelle) des valeurs de rfrences de la mthode pour la population du laboratoire. VI. Vrification d'une mthode d'analyse qualitative - Contenu du dossier VI.I Vrification initiale d'une mthode qualitative Il sera souvent trs difficile pour les laboratoires d'obtenir des chantillons positifs (ou dpourvus d'analyte) en nombre suffisant pour vrifier la spcificit et la limite de dtection d'une mthode. En raison d'un recrutement for- cment insuffisant, cela ne sera possible que dans les laboratoires importants. 6 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005 La vrification bibliographique critique prendra donc ici toute son importance. Inversement, la vrification expri- mentale sur site sera plus rduite, et s'appuiera fortement sur l'tude des performances des Contrles de Qualit Externes (CQE) si disponibles. Dans ce cadre, le dossier pourra apporter les lments de vrifications suivants : PARAMTRES A VRIFIER ET/OU CONNAmE Billiographie Vriftcat;iOltSilr site - Spcificit Oui Non Limite de dtection Oui Non Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui Stabilit Oui Si besoin Robustesse Oui Non Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique. Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles. Note propos de l'tude de contamination: * Cette tude de contamination inter-chantillons est mener pour tous les systmes analytiques. * Cette tude sera rpter au moindre doute quant au fonctionnement correct du systme analytique, et en parti- culier du systme de lavage et/ou de dcontamination. VI.2 Confirmation des performances en routine Pour matriser pleinement une mthode, l aussi, l'utilisation, la gestion et le suivi de contrles de qualit internes (CQI) et externes (CQE) si disponibles sont indispensables. La surveillance de la spcificit et de la limite de dtection passe par l'tude des CQI et CQE, si disponibles (per- formances du laboratoire, comparaison avec les autres mthodes). VII. Vrification d'une mthode d'analyse assimilable au quantitatif resultat qualitatif - Contenu du dossier Ce cas de figure est trs proche de celui des mthodes purement qualitatives, mais certaines caractristiques sup- plmentaires peuvent tre vrifies sur site. VU.1 Vrification initiale d'une mthode assimilable au quantitatif S'agissant de mthodes fournissant un rsultat final de type qualitatif, les laboratoires se heurteront la mme dif- .. ficult pour obtenir des chantillons positifs (ou dpourvus d'analyte) en nombre suffisant pour vrifier la spcifici- t et la limite de dtection. La vrification bibliographique critique prendra donc ici toute son importance. Le fabricant devra fournir ces l- ments en s'appuyant sur des tudes menes par des experts indpendants. Inversement, la vrification exprimenta- le sur site sera plus rduite que pour une mthode quantitative, mais elle permettra nanmoins de vrifier certains lments. 7 , i Il 1 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005 Dans ce cadre, le dossier pourra apporter les lments de vrifications suivants : PARAMTREs A VRIFIER ET/OU CONNMTRE Bibliographie Vrification Sl!l" site Spcificit Oui Non Fidlit Oui Oui Limite de dtection Oui NA Contamination entre chantillons (s'il y a lieu) Oui Oui Stabilit Oui Si besoin Robustesse Oui Non Interfrences Oui NA Corrlation avec mthode de rfrence Oui Non Corrlation avec mthode dj utilise au laboratoire Si existe Si besoin Le dossier doit conclure sur l'avis d'aptitude ou d'inaptitude de la mthode ou du systme analytique. (*NA : Non Applicable) Le dossier de vrification peut renvoyer d'autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents internes au laboratoire, etc.), correctement identifis et accessibles. Note propos de l'tude de contamination: * Cette tude de contamination inter-chantillons est mener pour tous les systmes analytiques. * Cette tude sera rpter au moindre doute quant au fonctionnement correct du systme analytique, et en parti- culier du systme de lavage et/ou de dcontamination. VII.2 Confirmation des performances en routine La surveillance de la spcificit et de la limite de dtection passe : * Par la comparaison avec les rsultats obtenus par d'autres mthodes complmentaires ou par des mthodes de rf- rence mises en uvre pour vrifier un premier rsultat, * Par l'tude des CQE, si disponibles (performances du laboratoire, comparaison avec les autres mthodes). La fidlit devra tre galement rgulirement vrifie, surtout pour les valeurs proches du seuil dcisionnel ("eut-off'). VIII. Matrise de la documentation - Mthodologie Cette partie du guide est importante car si beaucoup d'informations et rsultats sont collects, ceux-ci doivent faire l'objet d'un document cohrent et clair, avec une acceptation formelle par le laboratoire de la validit oprationnel- le de ses techniques, c'est--dire une dcision ou dclaration quant la validation de la mthode. Le laboratoire pourra prsenter ses dossiers suivant le schma suivant, qui pourra tre celui de sa procdure (cf. document COFRAC N 1133) ou de sa mthodologie: * Prsentation de la mthode, de l'appareillage et du mode opratoire. But de la vrification/validation. Domaine d'application, * Dtermination des critres de performances (paramtres) vrifier (cf. chapitres IV, V, VI et VI!), * Dtermination des spcifications ou limites acceptables (objectifs atteindre) de ces critres remplir (cf. cha- pitre IV), * Vrification bibliographique, * Mise en uvre - Exprimentations (cf. chapitre Vill), * Compilation et traitement statistique des donnes obtenues, * Conclusion et dcision quant la validation oprationnelle de la mthode, au regard des spcifications (limites acceptables) initialement fixes. 8 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 IX. Exemples mthodologiques Ce paragraphe dcrit des principes mthodologiques ou des recommandations permettant de vrifier les paramtres essentiels d'une mthode: * Fidlit, * Justesse, * Contamination inter-chantillons, * Limite de dtection, limite de quantification, * Linarit, * Stabilit, * Corrlation de mthodes, * Vrification des valeurs de rfrence, ... Les laboratoires pourront s'en inspirer. D'autres dmarches pourront tre possibles, elles devront tre justifies. Remarque : Ce dossier peut dans certains cas tre constitu au fil du travail du laboratoire. Dans ce cas la priode doit tre la plus courte possible, le rappel ventuel de rsultats de patient devra tre document. Il est souhaitable de prvoir une srothque particulire ces essais afin de pouvoir assurer un raccordement entre deux mthodes suc- cessives. En cas de modification de mthode ou d'un couple analyseur/mthode il est souhaitable, dans la mesure du possible, de pouvoir disposer simultanment de la nouvelle et de l'ancienne mthode pour pouvoir mener des essais en parallle. Note: Dans le cadre de l'accrditation, le laboratoire doit prsenter au COFRAC, deux lments diffrents: 1. la procdure qui dcrit les lignes directrices et les modalits du processus qu'il suit pour la validation des mthodes en gnral (cf. ce guide), 2. le dossier de validation de la mthode proprement dit, qui est un enregistrement (lment de preuve; bibliogra- phie, donnes brutes, calculs, conclusions du biologiste ou responsable technique). IX.1- Fidlit Les essais de rptabilit et de fidlit intermdiaire sont obligatoires. IX.I.I - Rptabilit L'essai de rptabilit consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon pour le mme analyte dans des condi- tions identiques : mme oprateur, mme lots de ractifs, mme instrument, mme calibrateur. En pratique, cet essai sera ralis au cours d'une mme srie. Il est recommand d'utiliser au moins deux niveaux de concentration. Les niveaux seront choisis en fonction des valeurs physiopathologiques et/ou de la rglementation. Le nombre de dterminations dpendra du systme analytique, du cot des ractifs, ... Cet effectif devra tre 6. La valeur statistique des rsultats obtenus dpend de ces effectifs. L'exploitation des rsultats consiste calculer la moyenne (m), l'cart-type (s) et le coefficient de variation (CV) des valeurs exprimentales de chaque srie. Le CV reprsentera la rptabilit de la mthode en %. Il sera compar au CV limite d'acceptabilit. Le calcul sera rpt pour chacune des matrices (srum, urine, et sang total en mdicolgal, ... ) soumises analyse. Pour un mme analyseur, ce calcul devra tre effectu pour chaque analyte mesurer. IX.I.2 - Fidlit intermdiaire L'essai de fidlit intermdiaire consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon pour le mme analyte dans des conditions diffrentes: l'oprateur, les ractifs, l'appareillage, les calibrages et les gammes d'talonnage, les jours peuvent tre des donnes variables. Il est recommand d'utiliser au moins deux niveaux de concentration. Les niveaux seront choisis en fonction des valeurs et/ou de la rglementation. 6 dterminations minimum sont ncessaires pour chacun des chantillons de validation. Les modalits de calcul sont identiques celles de la rptabilit, avec calcul de la moyenne (m), de l'cart-type (s) 9 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 et du coefficient de variation (CV) sur les valeurs exprimentales de chaque srie; le CV ainsi calcul sera compa- r au CV limite d'acceptabilit. Le CV reprsentera la fidlit intermdiaire de la mthode, exprim en %. Ce calcul sera rpt pour chacune des matrices (srum, urine, et sang total en mdicolgal, ... ) soumises analyse. Pour un mme analyseur, ce calcul devra tre effectu pour chaque analyte mesurer. Note; Pour des raisons pratiques, cet essai pourra ventuellement tre men aprs l'installation du systme analy- tique et la mise en uvre de la mthode, si et seulement si, les autres spcifications sont bien atteintes. IX.1.3- Reproductibilit L'essai de reproductibilit consiste effectuer l'analyse d'un mme chantillon dans diffrents laboratoires. IX. 2 - Justesse (biais) En Toxicologie et Suivi Thrapeutique Pharmacologique, il n'existe pas, de rares exceptions prs, d'chantillons de contrles raccords sur le plan mtrologique des talons internationaux ; il est donc impossible de parler stric- to sensu de "valeur vraie" et par l-mme de justesse. En l'absence de matriau de rfrence certifi, on pourra utiliser des chantillons utiliss pour des CQE rguliers et dont la commutabilit aura t vrifie ou prouve. li est souhaitable (mais pas obligatoire) d'utiliser des chan- tillons de diffrentes origines commerciales. Lajustesse (biais) sera estime en comparant la moyenne obtenue (m) lors de l'tude de rptabilit et/ou de fidli- t intermdiaire la valeur cible attendue assimile la valeur "vraie" (v) de l'chantillon test. Elle sera exprime en pourcentage de la valeur cible, selon le calcul suivant ; Justesse en % = x 100 v Cette justesse pourra aussi tre contrle l'aide des valeurs de rfrence qui pourront tre compares celles de la littrature. Exemples d'application - Approche de l'inexactitude et calcul d'incertitude. Exemple 1 - Les paramtres de fidlit d'une part, et de justesse d'autre part, constituent les composantes de l'incertitude de mesure, dans le calcul d'incertitude globale selon l'approche ISO 5725, en tant que composantes de type A. Pour ce calcul, on prendra le cas de composantes indpendantes. Ainsi, si u} est l'incertitude de fidlit, celle-ci est gale l'cart-type de fidlit intermdiaire; Pour ce qui est de l'incertitude de justesse, U2' elle est donne par la relation; justesse u2 = (Loi rectangle) En l'absence de matriau de rfrence, c'est--dire "d'talon", de valeur "vraie" connue (avec une incertitude asso- cie, Uret), le laboratoire peut utiliser pour calculer l'incertitude de justesse, les donnes de Contrle de Qualit Externe (CQE), c'est--dire le biais moyen, l'cart-type de cette moyenne et toujours l'incertitude de la valeur cible, la valeur "vraie". U2 peut alors s'exprimer diffremment en fonction de ces diffrentes composantes. Ces ccmposantes d'incertitude, combines celle de matriau de rfrence (uret), celles d'talonnage (ueJ, et enfin aux composantes de type B (UB), le cas chant, permettent de dterminer l'incertitude globale, c'est--dire l'incer- titude combine (u c ), puis l'incertitude largie U, selon la relation issue de la somme quadratique des composantes d'incertitude, ,--------------------- U c = -VU}2 + U2 2 + urel + u et 2 + 10 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 Enfin, l'incertitude largie U est alors, U = 2.U c (avec 2 = intervalle de confiance de 95 %, dans le cas d'une distribution gaussienne). Le rsultat de la mesure analytique, R, s'exprimera alors : R = valeur mesure U (unit) Exemple 2 - Une autre approche de l'incertitude peut tre propose (session d'tude SFSTP du 23/10/2002 ; Mthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques : stratgie de validation. STP Pharma pratiques 1997). Les tudes de rptabilit et de fidlit intermdiaire donnent accs S2n variance de rptabilit et S 2g variance de fidlit intergroupes et S2 R variance de fidlit intermdiaire, telles que: S2 R = S2r + S 2g L'incertitude de mesure peut tre alors exprime ainsi : S2 S2 lC R = rsultat t(a.v) e .......!... + _7_ k ken Avec CI risque choisi, v degrs de libert de S2 R ,k nombre de sries ncessaires la dtermination du rsultat (condition de fidlit intermdiaire) et n nombre de rptitions ncessaires la dtermination du rsultat (conditions de rptabilit). Si k = n = 1, l'incertitude peut s'exprimer comme: lC R = rsultat t(a,v) e.JSf Ainsi exprime, l'incertitude devient un vritable outil pour l'analyste. En effet, lors de l'application en routine de la mthode valide, le nombre de srie k et le nombre de rptition n peuvent tre adapts une prcision requise. Ex: ~ C 'l + 2 10 4,56 11,27 .L' R = resu tat _, e --+-- k ken avec k = n = 1, IC R = rsultat 8.35% avec k = 1 et n = 2, IC R = rsultat 6.70 % avec k = 2 et n = 1, IC R = rsultat 5.90% avec k = 2 et n = 2, IC R = rsultat 4.74%, etc ... .. IX. 3 - Contamination Une tude des contaminations inter-chantillons sera effectue de la faon suivante: Aprs rinage de l'appareil, un chantillon lev (ou positif fort) sera analys 3 fois conscutivement (Hl, H2, H3 de moyenne H) suivi d'un chantillon bas galement pass 3 fois (BI, B2, B3) Le pourcentage de contamination entre les chantillons peut tre calcul selon la formule suivante : Contamination en % = (81 - 83) x 1 00 H Note: Compte tenh de l'importance clinique de certains paramtres, le niveau de la contamination doit tre main- tenue zro ou entraner des rgles de ranalyse argumentes. 11 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 IX. 4 - Limite de dtection et limite de quantification IX.4.1- Limite de dtection La limite de dtection est le plus petit signal exprim en quantit ou en concentration qui peut tre distingu avec une probabilit donne d'un blanc ralis dans les meilleures conditions. C'est la quantit minimale dtectable pour laquelle la rponse (en signal mesur) peut tre distingue avec une probabilit donne d'un blanc. L'tude de la limite de dtection est base sur l'analyse statistique de la diffrence de signaux observs pour les blancs et les chantillons. Mthode 1 : Pour l'estimer, on pourra effectuer 30 mesures rptes des blancs (matrice dpourvue de la substan- ce doser), dans une mme srie, et on calculera l'cart-type (s), exprim en concentration, de ces 30 mesures. La limite de dtection peut tre calcule selon la formule suivante : Limite de dtection = moyenne + 3 carts-type Mthode 2 : Une limite de dtection peut tre dtermine par excs et correspondre la limite de quantification. IX.4.2- Limite de quantification La limite de quantification correspond la plus petite valer exprime en concentration, rendue avec une confiance acceptable. C'est la valeur pour laquelle le CV et l'cart la valeur thorique sont infrieurs la limite d'accepta- bilit. Mthode 1 : la limite de quantification peut tre calcule partir des mesures de blanc Limite de quantification = moyenne + 10 carts-type Mthode 2 : Il est possible de raliser des dilutions du calibrateur ou de l'chantillon de Contrle de Qualit Interne le plus bas (diffrent de 0) avec le blanc chantillon, jusqu' satisfaire la limite d'acceptabilit dans les mmes conditions que les tudes de fidlit (n ~ 6) Pour dterminer la limite de quantification, on calculera, pour chaque srie de mesures des diffrentes dilutions, l'cart-type (s), le Coefficient de Variation (CV) et l'cart de la moyenne (m) la valeur thorique: Limite de quantification = valeur pour laquelle le CV et l'cart la valeur thorique sont infrieurs la limite d'acceptabilit IX. 5 - Linarit A partir d'une solution mre d'analytes, des solutions de concentrations diffrentes seront prpares. Ces solutions permettront de vrifier la linarit. IX. 5.1 Dfinitions Une ligne est un trait continu. Une relation linaire en statistique se dfinit comme une relation o les valeurs varient en restant proportionnelles. La linarit d'un test est sa capacit (pour une gamme donne) produire des rsultats proportionnels la concen- tration de l'analyte et tre modlise par une transformation mathmatique. Le modle mathmatique peut ventuellement tre une droite mais s'il est le plus facile calculer, il s'agit rarement d'un modle correctement descriptif. IX. 5.2 Types de modlisation Si l'on souhaite utiliser une droite comme modle mathmatique, il est indispensable de montrer au moyen d'une analyse de variance type ANOVA que ce modle est acceptable, c'est dire que la variation rsiduelle n'a pas de contribution significative et que la variation explique par la droite dcrit bien la variation totale. Une deuxime ana- lyse de variance ANOVA doit s'attacher montrer que les variations du manquement l'ajustement n'ont pas de 12 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 contribution significative et que l'erreur analytique pure explique bien la variation rsiduelle. Si l'on ne souhaite pas raliser de test ANOVA et chaque fois que cela est possible, nous recommandons et encou- rageons l'emploi de la rgression quadratique. IX. 5.3 Gamme de linarit La gamme de linarit doit tre adapte en fonction des exigences analytiques. En Toxicologie la gamme dynamique est souvent trs tendue puisque l'analyse cherche couvrir gnralement aussi bien les concentrations thrapeu- tiques que toxiques. L'utilisation de la rgression non pondre (chaque point de la gamme a une importance iden- tique), qui considre que les erreurs en "y" sont identiques pour toutes les valeurs de "x", ne pourra tre valide que si les variances sont homognes. Nous prconisons l'emploi du test de Hartley ou de Cochran afin de tester les variances (le nombre de mesures pour chaque variance doit tre identique pour tous les points de la gamme). Si les variances ne sont pas homognes, la rgression doit tre pondre par l'affectation d'un poids statistique inver- sement proportionnel la variance du point. Si l'on ne souhaite pas tester l'homognit des variances et calculer un modle pondr, et chaque fois que cela est possible, nous recommandons et encourageons l'emploi du calcul mathmatique en l/x ou lIx 2 , qui reprsente une approximation trs valide de la pondration statistique d'un point de gamme. Le nombre de points de gamme ne peut tre infrieur 5 et le nombre de mesures par point ne peut tre infrieur 3. Dans certains cas particuliers (si l'interprtation ne dpend pas strictement de la concentration), il peut tre jus- tifiable de restreindre encore le nombre de mesures. IX. 6 - Stabilit Il est ncessaire de dfinir pour chaque type d'analyte, en fonction des spcifications techniques du fabricant ou de la connaissance de la molcule de rfrence, un dlai de premption a priori (1,3 ou 6 mois ... ). A chance du dlai fix, prparer une nouvelle solution dont les caractristiques analytiques sont compares la solution arrive premption, afin de confirmer ou de modifier le dlai de premption pralablement fix. Les critres d'acceptabilit de la validit des solutions de rfrence sont fixs par le laboratoire pour chaque type d'analyte. IX. 7 - Corrlation de mthodes Les concentrations des chantillons de validation doivent tre choisies de faon couvrir l'tendue du domaine d'analyse. Chacun des n chantillons de validation (n ~ 5), est analys p fois (p 3) par la mthode A et par la mthode B. 1. A partir des valeurs observes, tester, pour chaque mthode, l'homognit des variances de chaque chantillon (soit n variances pour A et pour B) selon par exemple un test de Cochran, de Levene ou de Hartley, etc ... (Test d'ho- ,. moscdasticit) 2. Tester l'galit des variances entre les deux mthodes selon un test F (p(n-l ddl et (p(n-l ddl (Comparaison de deux variances par un test de Fisher). 3. Calculer les diffrences des rsultats obtenus pour chacun des chantillons: Calculer la moyenne de ces diffrences ainsi que sa variance et tester l'galit de cette diffrence moyenne zro selon un test t de Student, avec t (p-l) ddl (Comparaison de moyenne d'chantillons apparis). 13 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1, 2005 x. Terminologie - Autres dfinitions La liste des dfinitions n'est pas exhaustive. Note: dans la mesure du possible ces dfinitions ont t reprises partir des documents qui font rfrences. Dans ce cas l'origine de la dfinition est indique en exposant. 1 = Vocabulaire international des termes fondamentaux et gnraux de mtrologie (VIM) 2 = Guide pour l'expression de l'incertitude de mesure (GUM) 3 = Statistique : Vocabulaire et symboles NF ISO 3534-1 4 = Dcision de la commission du 7 mai 2002 portant spcifications techniques communes des dispositifs mdicaux de diagnostic in vitro [notifie sous le numro C(2oo2) 1344] (Texte prsentant de l'intrt pour l'EEE) (2002/364/CE) 5 = Norme XPT 90-210 (Protocole d'valuation d'une mthode alternative d'analyse physico-chimique quantitative par rapport une mthode de rfrence) dcembre 1999 6 = Guide STP Pharma Pratiques volume 13 - n03 - mai juin 2003 (Validation des procdures analytiques quantita- tives - Harmonisation des dmarches) 7 = Guide de validation des mthodes en biologie mdicale doc LAB GTA 04 rvision oo-juin 2004 8 = Techniques de l'Ingnieur, trait Analyse et Caractrisation (Validation interne des mthodes d'analyses) Acceptabilit, critres d' (Performance standard)': critres selon lesquels les performances d'une technique sont juges satisfaisantes dans les conditions d'emploi dfinies par l'utilisateur (ces critres s'appuient en particulier sur les concepts d'imprcision, d'inexactitude et d'erreur totale acceptable). Aliquote (Aliquot)' : terme gnrique se rfrant n'importe quelle solution, spcimen etc., dont on utilise uni- quement un fragment. C'est une portion mesure, d'un tout, de composition uniforme. Analyse, domaine d" : intervalle de concentrations (ou autres quantits) d'un analyte pour lequel la technique est applicable sans modification. Son valuation ncessite l'tablissement des limites de linarit et (ventuellement) de la limite de dtection de la technique. Synonyme: "domaine de mesurage, gamme de mesure, domaine d'applica- tion". Analyte' : composant, substance, matriau mesurer dans un milieu. Appareil de mesure! : dispositif destin tre utilis pour faire des mesurages, seul ou associ un ou plusieurs dispositifs annexes. Biais : voir justesse. Blanc 6 : essai ralis en l'absence de matrice (blanc ractif) ou sur une matrice qui ne contient pas l'analyte (blanc matrice). Par extension, la rponse instrumentale en l'absence d'analyte est utilise (blanc instrumental). Bruit de fond' : correspond aux variations alatoires du signal de mesure pour un niveau donn. li est mesur par l'cart-type d'une suite d'au moins 30 mesures du signal, au niveau considr. Calibrage! : positionnement matriel de chaque repre (ventuellement de certains repres principaux seulement) d'un instrument de mesure en fonction de la valeur du mesurande. Note: ne pas confondre calibrage et talonnage . Calibrateur' : matriau de concentration dtermine en analyte soit par pese, soit par titrage dont le milieu et les proprits sont imparfaitement connus. li peut prsenter des proprits physicochimiques ncessites par une tech- nique. Coefficient de corrlation 3 : quotient de la covariance de deux caractres par le produit de leurs carts-types. Note: il exprime la relation ventuelle entre deux variables rputes indpendantes. Sa valeur doit tre uniquement teste par rapport zro en fonction d'un risque (l choisi. li est habituellement sans intrt dans les comparaisons de techniques. Coefficient de variation 3 : pour un caractre non ngatif, rapport de l'cart-type la moyenne. Note: ce rapport peut tre exprim en pourcentage. Le terme cart-type relatif est parfois utilis la place de coefficient de variation , mais cet usage n'est pas recommand. 14 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 Composant de type A, (valuation de l'incertitude)l : mthode d'valuation de l'incertitude par l'analyse statis- tique de sries d'observations. Composant de type B, (valuation de l'incertitude)l : mthode d'valuation par des moyens autres que l'analyse statistique de sries d'observations. Consensus, confrence de' : accord exprs ou tacite tabli entre les membres d'un groupe institutionnel de concer- tation, permanent ou temporaire. Contamination' : phnomne physique li un transfert de volume et ayant pour consquence d'introduire une erreur sur le rsultat final. Contrle qualit interne (CQI) : il sert l'valuation interne des performances du laboratoire en vue de vrifier l'absence de drive des rsultats par mesurage rgulier des paramtres contenus dans ces contrles. Contrle qualit externe (CQE) : il sert l'valuation des performances du laboratoire par comparaison avec les rsultats obtenus par d'autres laboratoires sur le mme chantillon. Corrlation 3 : liaison entre deux ou plusieurs variables alatoires l'intrieur d'une loi. Note: la plupart des mesures statistiques de corrlation ne mesure que le degr de liaison linaire. Cut-otT : ce que l'on appelle communment le "eut-off' est la valeur au-del de laquelle les rsultats sont suscep- tibles de prsenter un intrt biologique ou toxicologique, ou dfinie par le fabricant. Degr de libert 3 , (ddl) : en gnral, le nombre de termes de la somme moins le nombre de contraintes sur les termes de la somme. Ecart ' : valeur moins sa valeur de rfrence. Ecart-type de la moyenne, s.e.m.("Standard deviation of the mean")' : paramtre statistique indiquant la dis- persion des valeurs au niveau de la moyenne d'une srie de mesures. Ecart-type exprimentaP : racine carre positive de la variance. Ecart-type rsiduel, Syx' : paramtre permettant de chiffrer la dispersion des points autour de la droite de rgression. Echantillon: on appelle souvent "chantillon" la quantit de liquide biologique (ou autre matrice) soumis l'analyse. Echantillon de validation : voir standard de validation. Erreur alatoire ' : rsultat d'un mesurage moins la moyenne d'un nombre infini de mesurages du mme mesuran- de, effectus dans des conditions de rptabilit. Notes: 1. L'erreur alatoire est gale l'erreur moins l'erreur systmatique. 2. Comme on ne peut faire qu'un nombre fini de mesurages, il est seulement possible de dterminer une estimation de l'erreur alatoire. Erreur de justesse (d'un instrument de mesure)l : erreur systmatique d'indication d'un instrument de mesure. Note: l'erreur de justesse est normalement estime en prenant la moyenne de l'erreur d'indication sur un nombre appropri d'observations rptes. Erreur relative l : rapport de l'erreur de mesure une valeur vraie du mesurande Note: tant donn qu'une valeur vraie ne peut pas tre dtermine, dans la pratique on utilise une valeur conven- tionnellement vraie. Erreur systmatique ' : moyenne qui rsulterait d'un nombre infini de mesurages du mme mesurande, effectus dans les conditions de rptabilit, moins une valeur vraie du mesurande. Notes: 1. L'erreur systmatique est gale l'erreur moins l'erreur alatoire. 2. Comme la valeur vraie, l'erreur systmatique et ses causes ne peuvent tre connues compltement. 3. Pour un instrument de mesure, voir "erreur de justesse". Erreur totale' : somme algbrique de l'erreur due l'inexactitude et de l'erreur due l'imprcision. Ces deux erreurs se compensent ou s'additionnent, dfinissant ainsi deux bornes de variation de l'erreur totale. 15 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII, n 3, supplment 1,2005 Etalonnage! : ensemble des oprations tablissant, dans des conditions spcifies, la relation entre les valeurs de la grandeur indique par un appareil de mesure ou un systme de mesure, ou les valeurs reprsentes par une mesure matrialise ou par un matriau de rfrence, et les valeurs correspondantes de la grandeur ralise par des talons. Notes: 1. Le rsultat d'un talonnage permet soit d'attribuer aux indications les valeurs correspondantes du mesurande, soit de dterminer les corrections appliquer aux indications. 2. Un talonnage peut aussi servir dterminer d'autres proprits mtrologiques telles que les effets de grandeur d'influence. 3. Le rsultat d'un talonnage peut tre consign dans un document appel certificat d'talonnage ou rapport d'ta- lonnage. Etat de l'art: dsigne l'ensemble des mthodes analytiques actuellement disponibles et .utiliser. li est habituelle- ment estim partir d'enqutes inter laboratoires. Exactitude 6 : l'exactitude exprime l'troitesse de l'accord entre le rsultat d'essai et la valeur de rfrence accep- te, aussi appel "valeur conventionnellement vraie". L'troitesse de l'accord ainsi observe est la rsultante de la somme des erreurs systmatiques et alatoires, en d'autres termes l'erreur totale lie au rsultat. Par consquent, l'exactitude est l'expression de la somme de la jus- tesse et de la fidlit. Evaluation 6 : tude visant prouver le protocole d'analyse (procdure analytique) afin de connatre les valeurs des critres de performance, retenus au pralable. Cette tude peut tre mene en intralaboratoire (par le fournisseur ou le fabricant) ou en interlaboratoires. Fidlit: la fidlit exprime l'troitesse de l'accord (degr de dispersion, coefficient de variation) entre une srie de mesures provenant de multiples prises d'un mme chantillon homogne (rsultats d'essais indpendants) dans des conditions prescrites. La fidlit fournit une indication sur les erreurs lies au hasard. La fidlit traduit uniquement la distribution des erreurs alatoires et n'a aucune relation avec la valeur vraie ou spcifie. La fidlit peut tre value trois niveaux : - la rptabilit: conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la mme mthode sur des chan- tillons d'essais identiques dans le mme laboratoire, par le mme oprateur, utilisant le mme quipement et pen- dant un court intervalle de temps. - La fidlit intermdiaire Cintralaboratoire) : conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la mme mthode sur des chantillons d'essais identiques dans le mme laboratoire, avec diffrents oprateurs en uti- lisant si possible des quipements diffrents et pendant un intervalle de temps donn. - La r<alroductibilit Cinterlaboratoires) : conditions o les rsultats d'essais indpendants sont obtenus par la mme mthode sur des chantillons d'essais identiques dans diffrents laboratoires, avec diffrents oprateurs et utilisant des quipements diffrents. Grandeur (mesurable)! : attribut d'un phnomne, d'un corps ou d'une substance qui est susceptible d'tre distin- gue qualitativement et dtermine quantitativement. Incertitude de mesure' : paramtre, associ au rsultat d'un mesurage, qui caractrise la dispersion des valeurs qui pourraient raisonnablement tre attribues au mesurande. Notes: 1. Le paramtre peut-tre, par exemple, un cart-type (ou un multiple de celui-ci) ou la demi-largeur d'un interval- le de niveau de confiance dtermin. 2. L'incertitude de mesure comprend, en gnral, plusieurs composantes. Certaines peuvent tre values partir de la distribution statistique des rsultats de sries de mesurages et peuvent tre caractrises par des cart-types exp- rimentaux. Les autres composantes, qui peuvent aussi tre caractrises par des cart-types, sont values en admet- tant des distributions de probabilit, d'aprs l'exprience acquise ou d'aprs d'autres informations. 3. li est entendu que le rsultat du mesurage est la meilleure estimation de la valeur du mesurande, et que toutes les composantes de l'incertitude, y compris celles qui proviennent d'effets systmatiques, telles que les composantes associes aux corrections et aux talons de rfrence, contribuent la dispersion. 16 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 Justesse (biais) : la justesse exprime l'troitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue partir d'une srie de rsultats d'essais et une valeur qui est accepte soit comme une valeur conventionnellement vraie, soit comme une valeur de rfrence accepte. La mesure de la justesse est gnralement exprime en terme de biais (erreur syst- matique). Signalons encore que la justesse tait galement appel "exactitude" ou "exactitude de la moyenne". Limite de dtectionS : plus petite quantit d'un analyte examiner dans un chantillon, pouvant tre dtecte et considre comme diffrente de la valeur du blanc (avec une probabilit donne), mais non ncessairement quanti- fie. En fait, il faut prendre en compte deux risques : le risque a de considrer la substance prsente dans l'chantillon alors que sa grandeur est nulle ; le risque B de considrer absente une substance alors que sa grandeur n'est pas nulle. Limite de quantifications: plus petite grandeur d'un analyte examiner dans un chantillon pouvant tre dtermi- n quantitativement dans des conditions exprimentales dcrites dans la mthode avec une variabilit dfinie (coef- ficient de variation dtermin). Linarits: capacit d'une mthode d'analyse, l'intrieur d'un certain intervalle, fournir une valeur d'informa- tion ou des rsultats proportionnels la quantit en analyte doser dans l'chantillon pour un laboratoire. Cette proportionnalit s'exprime au travers d'une expression mathmatique dfinie a priori. Les limites de linarit sont les limites exprimentales de grandeurs entre lesquelles un modle d'talonnage linai- re peut tre appliqu avec un niveau de confiance connu (gnralement pris gal 1 %). Matriau de rfrence 1 : matriau ou substance dont une (ou plusieurs) valeur(s) de la (des) proprit(s) est (sont) suffisamment homogne(s) et bien dfinie(s) pour permettre de l'utiliser pour l'talonnage d'un appareil, l'valua- tion d'une mthode de mesurage ou l'attribution de valeurs aux matriaux. Matriau de rfrence certifi 1 : matriau de rfrence, accompagn d'un certificat, dont une (ou plusieurs) valeur(s) de la (des) proprit(s) est (sont) certifie(s) par une procdure qui tablit son raccordement une ralisa- tion exacte de l'unit dans laquelle les valeurs de proprit sont exprimes et pour laquelle chaque valeur certifie est accompagne d'une incertitude un niveau de confiance indiqu. Matrice' : milieu dans lequel se trouve l'analyte. Mesurage 1 : ensemble d'oprations ayant pour but de dterminer une valeur d'une grandeur. Mesurande 1 : grandeur particulire soumise mesurage. Mthode: ce terme recouvre l'ensemble des moyens mis en uvre dans le processus analytique (ractif(s), appa- reil, mode opratoire, mode de calibrage, mode de contrle). Le terme de technique n'est pas utilis en mtrologie. Moyenne, m' : quotient de la somme des observations par leur nombre. Sauf indication contraire, le terme "moyen- ne" dsigne la valeur arithmtique. Mode opratoire (de mesure)l : ensemble des oprations, dcrites d'une manire spcifique, mises en uvre lors de }' excution de mesurages particuliers selon une mthode donne. Ordonne l'origine (Intercept)': endroit o la droite d'un graphique coupe l'axe des ordonnes. Dsign conven- tionnellement par la lettre "a". Pente (Slope)' : angle que fait une droite sur un graphe par rapport l'horizontale. Il est exprim sous forme d'un rapport entre les valeurs de Y et les valeurs de X. Dsign conventionnellement par la lettre "b". Performance, critres de' : paramtres caractrisant la procdure analytique (linarit, fidlit, justesse, ... ). Population' : ensemble (fini ou infini) d'lments ou d'individus, dfini de faons trs prcises. Processus de validation d'une mthode d'analyse 8 : action de confirmer par examen et apport de preuves tangibles obtenues par des tudes statistiques intralaboratoires et/ou interlaboratoires que les exigences particulires pour un usage spcifique prvu de la mthode d'analyse sont satisfaites. En gnral, les exigences particulires portent sur le domaine d'application, la linarit, la spcificit, la fidlit et la justesse. , Rptabilit : voir fidlit. Reproductibilit : voir fidlit. 17 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 Rsultat d'un mesurage 1 : valeur attribue un mesurande, obtenue par mesurage. Risque a ou risque de premire espce' : probabilit de rejeter une hypothse vraie l'issue d'un test statistique. Ce risque est fix avant de raliser un test (habituellement 5 ou 1 %). On l'appelle aussi seuil ou niveau d'un test. Risque fi ou risque de deuxime espce' : probabilit de considrer l'hypothse nulle Ho comme vraie quand elle est fausse. Le risque ~ dpend du test effectu, du risque a. choisi et du nombre de degrs de libert. Robustesse : par "robustesse" d'une technique d'analyse, on entend une mesure de sa capacit ne pas tre affec- te par des variations faibles mais dlibres des paramtres de la mthode, et qui fournit une indication sur sa fia- bilit dans les conditions normales d'utilisation. Sensibilit' : une mthode est dite "sensible" si une faible variation de la concentration ou de la quantit d'analyte entrane une variation significative de la rponse. Il convient d'viter de dfinir, par extension, la sensibilit de la mthode comme sa capacit dtecter de faibles concentrations. Srie' : ensemble de mesures conscutives effectues sans interruption et dont les rsultats sont obtenus partir d'une phase unique de calibrage. Signal de mesure 1 : grandeur qui reprsente le mesurande et qui lui est fonctionnellement lie. Spcificit' : la spcificit d'une procdure analytique est sa capacit tablir de manire univoque l'existence d'une substance analyser en prsence d'autres composants potentiellement prsents. Standard d'talonnage : voir matriau de rfrence. Standard de validation' : les standards de validation sont des chantillons, reconstitus dans la matrice ou tout autre matriau de rfrence, dont la valeur vraie a pu tre tablie par consensus et qui sont utiliss pour la validation de la procdure d'analyse. Valeur (d'une grandeur)l : expression quantitative d'une grandeur particulire, gnralement sous la forme d'une unit de mesure multiplie par un nombre. Valeur conventionnellement vraie (d'une grandeur)l : valeur attribue une grandeur particulire et reconnue, parfois par convention, comme la reprsentant pour une incertitude approprie pour un usage donn. Validation (validation des mthodes) : cf. dfinition de l'ISO/CEl 17025, au chapitre 1 Introduction. Variance' : paramtre statistique chiffrant la dispersion des individus autour de la moyenne. C'est la somme des car- rs des carts la moyenne de n observations divise par le nombre de degrs de libert. L'cart-type est la racine carre de la variance. Vrification: confirmation par examen et tablissement des preuves que les exigences spcifies ont t satisfaites. XI. Bibliographie - Analyse des produits agricoles et alimentaires - Procdure de validation intralaboratoire d'une mthode alternati- ve par rapport une mthode de rfrence - Cas de mthodes d'analyses quantitatives. Norme NF V03-110, dcembre 1998. - Vassault A., Grafmeyer D., de Graeve J., Cohen R., Beaudonnet A., Bienvenu J. Analyses de biologie mdicale: sp- cification et normes d'acceptabilit l'usage de la validation des techniques. Ann. Biol. Clin. 1999; 57(6) : 685-95. - Application de la statistique - Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure, parties 1 6. Norme NF ISO 5725, dcembre1994 et octobre 1998. - Journal officiel de la Rpublique franaise. Arrt du 26 novembre 1999 relatif la bonne excution des analyses de biologie mdicale. (GBEA). Il dcembre 1999 ; 287 : 18441. - Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA). http://www.cms.hhs.gov/clia (site consult en mai 2(05). 18 Annales de Toxicologie Analytique, vol. xvn, n 3, supplment 1, 2005 - Dsenfant M., Priel M., Rivier C. De la validation des mthodes d'analyse l'valuation de l'incertitude des rsul- tants de mesure. Actes du l1 me congrs international de mtrologie. Toulon, 20-23 octobre 2003. Document tl- chargeable sur le site : http://www.lne.fr/publications/actes_l1e30ngres_metrologie/81.pdf - Comit Franais d'Accrditation (COFRAC). Document 1133. Procdure de validation interne des mthodes d'essais. Octobre 1995 ; document tlchargeable sur le site : http://www.cofrac.fr/doc/docs/1_laboratoires/essais/1133vOO.doc - Jansen R.T.P. 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