UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER DIVISION DE BIBLIOTECA EDUARDO COTE LAMUS

RESUMEN TESIS DE GRADO

AUTOR (ES): NOMBRE (S): NOMBRE (S): NOMBRE (S): FACULTAD: JACK ANDRS APELLIDOS: APELLIDOS:_ APELLIDOS: RINCN PREZ

CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE INGENIERA DE PRODUCCION BIOTECNOLGICA

PLAN DE ESTUDIOS: DIRECTOR: NOMBRE (S):

MARIO

APELLIDOS:

ARIAS ZABALA

TTULO DE LA TESIS: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENSIONES CELULARES DE Thevetia peruviana Y ENSAYOS DE ESTABLECIMIENTO DE CALLOS PARA Petiveria alliacea

RESUMEN Se realizo el cultivo in vitro de las especies vegetales Thevetia peruviana y Petiveria alliacea, logrando el establecimiento de callos y cultivo de clulas en suspensin solamente con Thevetia peruviana. Ya que con Petiveria alliacea no se logro el establecimiento ya que es demasiado recalcitrante y los ensayos realizados no arrojaron resultados favorables en cuanto a su establecimiento e iniciacin de callos. Para lograr el establecimiento y la iniciacin de callos en Thevetia peruviana se utilizo como reguladores de crecimiento el acido 2,4-Diclorofenoxiacetico y kinetina. Palabras clave. Reguladores de crecimiento, callos, cultivo de clulas en suspensin, biomasa.

CARACTERISTICAS PGINAS: PLANOS: ILUSTRACIONES: CD ROOM: 1

ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENSIONES CELULARES DE Thevetia peruviana Y ENSAYOS DE ESTABLECIMIENTO DE CALLOS PARA Petiveria alliacea

JACK ANDRES RINCON PEREZ

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE PLAN DE ESTUDIOS INGENIERIA BIOTECNOLOGICA SAN JOS DE CCUTA 2012

ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENSIONES CELULARES DE Thevetia peruviana Y ENSAYOS DE ESTABLECIMIENTO DE CALLOS PARA Petiveria alliacea

JACK ANDRES RINCON PEREZ Trabajo de grado modalidad pasanta presentado como requisito para optar al ttulo de Ingeniero de Produccin Biotecnolgica

Director MARIO EVELIO ARIAS ZABALA Ingeniero Qumico, Ph. D. Profesor Asociado Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE PLAN DE ESTUDIOS INGENIERIA BIOTECNOLOGICA SAN JOS DE CCUTA 2012

AGRADECIMIENTOS A mis padres Yanith y Luis, que con su amor y todo su apoyo incondicional me ayudaron a salir adelante durante toda mi carrera estudiantil. A toda mi familia que siempre me apoyo y me incentivo a salir adelante. A mis abuelos Mara Luisa y Wilson por haberme apoyado en los momentos que mas necesitaba siempre estuvieron ah. A la familia Prez Quintero por haberme tendido la mano y brindarme su apoyo.

TABLA DE CONTENIDO

pg.

INTRODUCCION

14

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2 1.5 1.5.1 1.5.2 1.6 1.6.1 1.6.2

DESCRIPCIN PROBLEMA PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA FORMULACIN DEL PROBLEMA JUSTIFICACION OBJETIVOS Objetivo general. Objetivos especficos. ALCANCES Y LIMITACIONES Alcances. Limitaciones. DELIMITACIONES Delimitacin Espacial. Delimitacin temporal.

17 17 17 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19

2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2

MARCO REFERENCIAL ANTECEDENTES MARCO TERICO Thevetia peruviana. Petiveria alliacea 6

20 20 21 21 23

2.3 2.3.1

MARCO LEGAL Constitucin Poltica de Colombia

25 25

3 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4

METODOLOGA TIPO DE INVESTIGACIN POBLACIN Y MUESTRA Poblacin. Muestra. FASES O ETAPAS Revisin bibliogrfica. Ensayos con Petiveria alliacea. Introduccin y establecimiento de Thevetia peruviana. Diseo experimental.

26 26 26 26 26 26 26 26 32 35

4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.2.1 4.3

RESULTADOS Y ANALISIS ENSAYOS CON Petiveria alliacea Evaluacin de desinfectantes para Petiveria alliacea. Evaluacin de medios de cultivo para Petiveria alliacea. INTRODUCCIN Y ESTABLECIMIENTO DE Thevetia peruviana Cultivo de clulas en suspensin. DISEO EXPERIMENTAL

38 38 38 42 42 47 48

CONCLUSIONES

51

RECOMENDACIONES

53

BIBLIOGRAFA

54

ANEXOS

59

LISTA DE CUADROS

pg.

Cuadro 1. Metabolitos de Thevetia peruviana con actividad biolgica conocida (adaptado de Duke, 2008). 22 Cuadro 2. Principales metabolitos producidos por Petiveria alliacea (Anam) con su respectiva actividad. 24 Cuadro 3. Tratamientos de desinfeccin para explantes de Petiveria alliacea. Cuadro 4. Medio SH tratamiento de medio de cultivo 1 para introduccin de explantes de Petiveria alliacea. 28

29

Cuadro 5. Medio MS como base principal de los tratamientos de medio de cultivo a utilizar para Petiveria alliacea. 30 Cuadro 6.Tratamientos de medio de cultivo MS modificado para iniciacin y establecimiento de explantes de Petiveria alliacea.

31

Cuadro 7. Medio SH medio de cultivo para introduccin de explantes e iniciacin y establecimiento de callos de Thevetia peruviana. 32 Cuadro 8. Tratamientos de desinfeccin utilizados para explantes de Thevetia peruviana.

33

Cuadro 9. Cantidad de material vegetal de Petiveria alliacea introducido en medio de cultivo. 38 Cuadro 10. Descarte de material vegetal de Petiveria alliacea. 39

Cuadro 11. Cantidad de material vegetal de Thevetia peruviana introducido en medio de cultivo. 43 Cuadro 12. Descarte de material vegetal de Thevetia peruviana. Cuadro 13. Datos de toma de peso de la biomasa. Cuadro 14. Anlisis De Varianza Para Peso 43 48 49

Cuadro 15. Medio bsico Murashige Skoog (1962) formulado por Dvila en 2004. 60 9

Cuadro 16. Medio MS (1 l de medio) formulado por Davila, (2004). Cuadro 17. Tratamientos de desinfeccin de explantes de tallos y hojas de T. peruviana con NaClO

61

63

10

LISTA DE FIGURAS

pg.

Figura 1. Thevetia peruviana. Figura 2. Petiveria alliacea.

21 23

Figura 3. Toma de muestra de cultivo de clulas en suspensin para revisin al microscopio. 35 Figura 4. Clulas de T. peruviana teidas con azul de Evans en el microscopio. 35 Figura 5. Diseo experimental. Figura 6. Proceso de filtracin de cultivo de clulas en suspensin. Figura 7. Toma de peso de la biomasa. Figura 8. Muestra de biomasa luego del proceso de secado. 36 37 37 37

Figura 9. Explante de hoja de Petiveria alliacea recin introducida en medio de cultivo. 40 Figura 10. Explante de hoja de Petiveria alliacea contaminado por hongo. Figura 11. Explante de P. alliacea en medio de cultivo solido sin ninguna respuesta. 40

42

Figura 12. Explantes de Thevetia peruviana con iniciacin de callos trascurridos 15 das de su introduccin en medio de cultivo. 44 Figura 13. Explantes de Thevetia peruviana con callos trascurridas 7 semanas de su introduccin en medio de cultivo. 45 Figura 14. Explantes de Thevetia peruviana fenolizados transcurrida 1 semana de su introduccin en medio de cultivo. 46 Figura 15. Explantes de T. peruviana, con presencia de contaminacin fngica y necrosamiento. 46 Figura 16. Explantes de T. peruviana con 18 das de haber sido sembrados en medio de cultivo SH solido. 47 11

Figura 17. Explantes de Thevetia peruviana en medio de cultivo SH solido, con apariencia friable. 47 Figura 18. Cultivo de clulas en suspensin de Thevetia peruviana en medio de cultivo SH liquido. 48 Figura 19. Diagrama de Pareto estandarizado para el peso. Figura 20. Reguladores de crecimiento utilizados por Castellar et al., en 2011. Figura 21. Porcentaje de contaminacin de explantes de tallos y hojas de T. peruviana luego de los tratamientos con NaClO. 50 62

63

Figura 22. Porcentaje de necrosamiento de explantes de tallos y hojas de Thevetia peruviana luego de los tratamientos con NaClO. 64 Figura 23. Efecto del medio de cultivo sobre la formacin de callos en Thevetia peruviana. 65 Figura 24. ndice de crecimiento promedio obtenido con cada uno de los medios de cultivo evaluados para Thevetia peruviana. 65

12

LISTA DE ANEXOS

pg.

ANEXO A ANEXO B ANEXO C ANEXO D

60 62 63 65

13

INTRODUCCION

El cultivo de tejidos vegetales de forma in vitro usando el mtodo de callognesis supone la colocacin de un explante (clula vegetal, protoplasto, meristemo, yema, hoja, etc.) en un medio de cultivo solido o semislido, para lograr una rpida proliferacin de tejido, el cual forma un callo, que contina creciendo y proliferando. Con este tejido se puede lograr iniciar suspensiones celulares en medios lquidos, los cuales son agitados para airear y disgregar las clulas. En este trabajo se intentar el establecimiento de callos de Thevetia peruviana y Petiveria alliacea, que son unas plantas poco estudiadas, segn PREZ et al1., Y 2 OLUWANIYI and IBIYEMI : Thevetia peruviana y Petiveria alliacea. Producen metabolitos secundarios principalmente glucsidos cardiotnicos (tales como thevetina, peruvosido y digitoxigenina, entre otros) y tambin algunos flavonoides, estos ayudan a combatir enfermedades como algunos tipos de cncer, leucemia y enfermedades cardiovasculares entre otras.
El investigador ARIAS, Juan (Laboratorio de Bioconversiones, Medelln, Colombia, informe no publicado 2011) sealo en su trabajo que Arora et al: Thevetia peruviana Merr. Es un rbol pequeo comnmente ornamental, perteneciente a la familia Apocynaceae, ampliamente distribuido en los continentes Americano, Asitico y Africano. Sus semillas, hojas, frutos y races han sido usados en medicina tradicional como purgativo, emtico y para tratamiento de fiebre intermitente. Esta planta es particularmente conocida por su habilidad para producir glicsidos cardacos, tales como thevetina y peruvosido, los cuales tienen un ndice teraputico relativamente alto comparado con la digoxina. En Europa, esta planta fue reconocida como venenosa en el S. XVI. Sin embargo, en aos recientes es considerada como una fuente potencial de compuestos biolgicamente activos, a saber, insecticidas, rodenticidas, fungicidas y bactericidas, entre otros, habiendo sido descubierta su actividad cardiotnica en 1863.3 El investigador ARIAS, Juan (Laboratorio de Bioconversiones, Medelln, Colombia, informe no publicado 2011) sealo en su trabajo que Evans: Las semillas de Thevetia peruviana constituyen una fuente rica del hetersido thevetina, que por hidrlisis parcial y la prdida de dos molculas de glucosa produce el peruvosido cuyas propiedades teraputicas cardio-activas son bien
1

PREZ LEAL, R., et al. ACTIVIDAD CITOTXICA Y ANTIOXIDANTE DE Petiveria alliacea L. . Chapingo, Mexico : Revista Chapingo. Serie Horticultura, enero-junio 2006. Vol. 12, 001, pp. 51-56. ISSN (Versin impresa): 0186-3231. 2 OLUWANIYI, Omolara O., and IBIYEMI,Samuel A. Extractability of Thevetia peruviana glycosides with alcohol mixture. [Online] September 19, 2007. [Cited: Diciembre 20, 2011.] http://www.ajol.info/index.php/ajb/article/viewFile/57995/46358. ISSN 16845315. 3 Pharmacological evaluation of peruvoside, a new cardiac glycoside from Thevetia neriifolia with a note on its clinical trials in patients with congestive heart failure. ARORA, R.B., SHARMA, J.N., and BHATIA, M.C. 1, Indian : Indian J. Exp. Biol., 1967, Vol. 5. Citado por ARIAS, Juan (informe no publicado).

14

conocidas. El peruvsido se compone de L-tevetosa unida a la genina canogenina. La thevetina ha encontrado uso en Europa continental, siendo considerada especialmente til en casos de insuficiencia miocrdica suave y cuando hay intolerancia a la digital (Digitalis lanata), productora del hetersido digoxina, ampliamente utilizado en el tratamiento de la fibrilacin auricular y en el fallo cardaco congestivo.4

Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) es una planta herbcea perenne caracterizada por ramas erguidas, alternando hojas y flores blancas muy pequeas5, las cuales se encuentran en reas tropicales de Sur Amrica y Centroamrica, el Caribe y frica6. Como dice Rodrguez et al7., Esta especie es tradicionalmente usada en la medicina popular debido a varias propiedades farmacuticas. El extracto alcohlico es recomendado para uso externo para tratamientos de parlisis y reumatismo, mientras que la raz en polvo tiene propiedades analgsicas para el alivio del dolor de muelas. El uso continuo del polvo de raz tiene efectos neurolgicos resultando en sper excitacin, insomnio y alucinaciones, seguidas por convulsiones y muerte8. JOHNSON et al.: Distintas propiedades se han reportado para Petiveria alliacea, incluyendo repelente de insectos9, ZOGHBI et al.: narctico10, OLUWOLE y BOLARINWA: abortivo11, PONTE et al. Y WILLIAMS et al. Afrodisaco, depurativo, diurtico, expectorante, nematicida1213, RUFFA et al. antiviral 14, LOPESMARTINS et al., Antinflamatorio y analgsico15. CCERES et al., Tambin los extractos muestran actividad contra Trypanosoma cruzi16, QUADROS, et al.
4

EVANS, W.C. Farmacognosia Trease-Evans. 13 ed. Mexico : Interamericana McGraw-Hill, 1991. Citado por ARIAS, Juan. (informe no publicado). 5 ALMEIDA, Mara Zlia de. Plantas medicinais. 2 ed. Salvador (BA) : EDUFBA, 2003. ISBN : 8523202447. 6 MORTON, Julia F. Atlas of medicinal plants of Middle America : Bahamas to Yucatan. s.l. : Springfield, Ill. : C.C. Thomas, 1981. ISBN: 0398040362 9780398040369. 7 LEMUS RODRGUEZ, Z., et al. Biblioteca Virtual En Salud Cuba. [En lnea] 8(3), 8 CASTELLAR, A., GAGLIARDI, R.F., MANSUR, E. In vitro propagation and establishment of callus and cell suspension cultures of Petiveria alliacea L., a valuable medicinal plant. [En lnea] 2011. 9 An Insecticidal and Acaricidal Polysulfide Metabolite from the Roots of Petiveria alliacea. JOHNSON, L., WILLIAMS, L. A. D. and ROBERTS, E. V. 1997. Citado por CASTELLAR, et al.. Op. cit., p. 1113. 10 Volatile constituents from Adenocalymma alliaceum Miers and Petiveria alliacea L., two medicinal herbs of the Amazon. ZOGHBI, M. d. G., ANDRADE, E. H. and MAIA, J. G. 2002. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 11 The uterine contractile effect of Petiveria alliacea seeds. OLUWOLE, E.S., BOLARINWA, A.F. 1988. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 12 Preliminary investigation on the nematicide potential of Guine's plants (Petiveria alliacea). PONTE, J.J., FRANCO, A., SILVEIRA-Filho J. 1996. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 13 A sulfonic anhydride derivative from dibenzyl trisulphide with agro-chemical activities. WILLIAMS, et al. (8), 2003. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 14 Antiviral Activity of Petiveria alliacea against the Bovine Viral Diarrhea Virus. RUFFA, et al. 2002, Vol. 48, pgs. 144-147. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 15 The anti-Inflammatory and analgesic effects of a crude extract of Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae). LOPES-MARTINS, R.A.B., PEGORARO, D.H., WOISKY, R., PENNA, S.C., SERTI, J.A.A. 2002. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 16 Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. I. Screening of activity to bacteria, fungi

15

Listeria monocytogenes 17. DE-SOUSA et al. Varios componentes biolgicamente activos fueron identificados en P. alliacea, con diferentes concentraciones entre las partes de la planta. Compuestos principalmente extrados a partir de races incluyendo benzaldehido, dibencilo disulfuro, dibencilo trisulfuro (DTS), cido benzoico, cumarina, trithiolaniacine y cis- y transestilbeno18. ROSNER et al. DTS es un compuesto lipoflico identificado como uno de los principios activos inmunomoduladores en los extractos de P. alliacea19. Por todo lo dicho anteriormente se pretendi en esta investigacin dejar una base para futuras investigaciones sobre el establecimiento de callos y cultivo de clulas en suspensin ya sea para Thevetia peruviana o Petiveria alliacea.

and American trypanosomes of 13 native plants. CACERES, et al. 1988. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 17 Petiveria alliacea. extract protects mice against Listeria monocytogenes infection effects on bone marrow progenitor cells. QUADROS, et al. 1999. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113. 18 Dibenzyl trisulphide and trans-N-methyl-4-methoxyproline from Petiveria alliacea. SOUSA et al. 1990. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1114. 19 Disassembly of microtubules and inhibition of neurite outgrowth, neuroblastoma cell proliferation, and MAP kinase tyrosine dephosphorylation by dibenzyl trisulphide. ROSNER, et al. 2001. Citado por CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1114.

16

1 1.1

DESCRIPCIN PROBLEMA

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Debido a los altos costos de los medicamentos para los tratamientos de enfermedades como el cncer o el sida la poblacin ha recurrido a la medicina naturista ya que es muchsimo ms econmica y al parecer en algunos casos hasta ms efectiva que la medicina moderna.
En consonancia con el modo de accin y los procedimientos empleados, la medicina naturista tiene una vocacin de medicina total que bien puede ser utilizada como procedimiento teraputico de eleccin ante muchas enfermedades, como alternativa por su eficacia y mnimos efectos secundarios, o coadyuvar en el tratamiento de otras como complementaria de la medicina convencional, sirviendo a sta para el sostn de los mecanismos de defensa de la persona enferma20. La propia OMS admite que en Australia, Norteamrica y Europa la medicina complementaria y alternativa se utiliza cada vez ms en paralelo con la medicina aloptica, en especial para el tratamiento y control de enfermedades crnicas. Enfermedades cardiovasculares, cncer, obesidad, diabetes y otras, digestivas, respiratorias, genitourinarias, dermatolgicas, del sistema nervioso, del aparato locomotor, etc., pueden beneficiarse de los mtodos y prcticas naturistas21.

Por lo tanto se pretende realizar una investigacin que llegue a dar unos resultados favorables para la obtencin del establecimiento de callos e iniciacin de suspensiones celulares y que estos resultados se han aprovechados por los investigadores que se encuentren en el laboratorio de Bioconversiones de la Universidad Nacional Sede Medelln para futuras investigaciones.

1.2

FORMULACIN DEL PROBLEMA

Se lograr el establecimiento de callos e iniciacin de suspensiones celulares para la produccin de metabolitos de alto valor agregado y mdico-farmacuticos a partir del establecimiento de callos y suspensiones celulares in vitro de las especies vegetales a trabajar?

20 21

JIMNEZ D., Juan F. PLANTAS MEDICINALES. [Online] 2007. [Cited: Septiembre 4, 2011.] Ibid., p. 15.

17

1.3

JUSTIFICACION

Observando los altos costos de los medicamentos para enfermedades como el cncer, sida o problemas cardiacos o los complicados tratamientos como quimioterapias, radioterapia, cirugas, inyecciones, etc... Se plantea producir metabolitos que puedan contrarrestar esas enfermedades a partir del establecimiento de callos y luego la suspensin de los mismos a partir de las especies vegetales Thevetia peruviana y Petiveria alliacea. Segn PREZ et al22., Y OLUWANIYI and IBIYEMI23:Las especies vegetales Thevetia peruviana y Petiveria alliacea con las cuales se piensa trabajar son importantes por sus metabolitos que tienen propiedades medicinales, actividad cardiotnica, fungicida, bactericida, insecticida, utilidad antiproliferativas en clulas de cncer gstrico, leucemias y ndulos mamarios. Ya que la produccin de metabolitos seria a partir de estas especies vegetales Thevetia peruviana y Petiveria alliacea que son plantas silvestres y ornamentales se pensara que la produccin de estos metabolitos resultara ms econmica y presentara mejores efectos que los antibiticos y tratamientos que se utiliza en la actualidad para controlar este tipo de enfermedades. A dems sera un proyecto investigativo innovador, ya que se pretendera estandarizar los protocolos de desinfeccin y los medios de cultivo con su respectivo balance de reguladores de crecimiento tanto para el establecimiento en la induccin de callos como en la fase de cultivo de clulas en suspensin tanto para Thevetia peruviana como para Petiveria alliacea, ya que en trminos de produccin de metabolitos de estas especies ha sido tan poco estudiado.

1.4

OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo general. Establecer callos en medios slidos, subcultivar a medio lquido y lograr la iniciacin de cultivo de clulas en suspensin de Thevetia peruviana en el laboratorio de Bioconversiones de la Universidad Nacional Sede Medelln.

1.4.2 Objetivos especficos. Realizar ensayos para tratar de establecer protocolos de desinfeccin y de medios de cultivo con sus respectivos reguladores de crecimiento para el establecimiento de callos y luego la iniciacin de suspensiones celulares de
22 23

PREZ, et al. Op. cit., p.52. OLUWANIYI, et al. Op. cit., p. 2166.

18

Petiveria alliacea. Definir el protocolo ms adecuado para la de desinfeccin de los explantes de Petiveria alliacea. Identificar tipo de explantes con mejor respuesta para la formacin de callos friables de Petiveria alliacea. Determinar el medio de cultivo ideal y el balance de reguladores de crecimiento ptimo para formacin de callos de Petiveria alliacea. Establecer cultivos de clulas en suspensin en medio de cultivo lquido, a partir de los callos obtenidos de Thevetia peruviana.

1.5

ALCANCES Y LIMITACIONES

1.5.1 Alcances. El alcance de este trabajo es el establecimiento de callos de Thevetia peruviana y Petiveria alliacea en medio de cultivo slido y adaptacin a cultivo de clulas en suspensin para lograr la produccin de ciertos metabolitos que son de alto valor agregado ya que contrarrestan el efecto de enfermedades como el cncer, sida y afecciones cardiacas.

1.5.2 Limitaciones. Las limitaciones serian la obtencin de un material vegetal apropiado para la siembra en cultivo in vitro ya que el material vegetal se dispondr en un principio de los alrededores del campus de la Universidad Nacional Sede Medelln, otra limitante ser la respuesta del material vegetal en cultivo in vitro, tambin el proyecto ser afectado por disponibilidad de la cabina de flujo laminar ya que por ser una laboratorio de investigacin y extensin hay varios estudiantes con diferentes proyectos de investigacin con diferentes tipos de microorganismos como levaduras, bacterias y hongos.

1.6

DELIMITACIONES

1.6.1 Delimitacin Espacial. El presente proyecto se desarrollar en las instalaciones de la Universidad Nacional Sede Medelln en el Laboratorio de Bioconversiones.

1.6.2 Delimitacin temporal. El tiempo estipulado para el desarrollo del proyecto ser de 6 meses, de los cuales se dispone de 30 das para la elaboracin del anteproyecto. 19

2 2.1 ANTECEDENTES

MARCO REFERENCIAL

En 2011 un estudio realizado por H. S. Taha et al en Egipto, el protocolo aplicable para la mejora de la produccin de callos, regeneracin brotes, evaluacin y determinacin de los glucsidos cardacos crecimiento de Thevetia spp. Se estableci. Callos y brotes regenerados fueron inducidos a partir de las semillas inmaduras (IS), hoja, tallo y raz de explantes Thevetia neriifolia Jussieu. Y T. thevetioides Kunth. (Apocynaceae). Medio MS suplementado con 1 mg / L 2,4-D + 3 mg / l de Kin mostr los mejores resultados de produccin en masa de callos. Explantes de semillas dio el valor ms alto de la formacin de callos en cualquier condicin de luz o de oscuridad. La 3 semana de cultivo durante 5 semanas registr el crecimiento ms importante dinmica de la produccin en masa de callos a partir de explantes de semillas. T. neriifolia exhiben alto grado de proliferacin brotes mltiples en MS + 1 mg / L 2,4-D + 3 mg / L de BAP a partir de explantes madre en comparacin con T. thevetioides. El mejor resultado de raicillas en vitro / formacin de los brotes registrados en MS + 1 mg / L de ANA. Determinaciones cualitativas y cuantitativas de thevetina B, digitoxigenin, neriifolia y contenidos peruvosido se llevaron a cabo utilizando la tcnica HPLC24. En 2011 un estudio realizado por Castellar, A., Gagliardi, R.F., Mansur, E. en Brasil la propagacin in vitro de Petiveria alliacea L. fue lograda basada en el desarrollo de yemas axilares a partir de segmentos nodales cultivados en medio Murashige Skoog (MS0). El enraizamiento de brotes fue inducido en mitad de MS suplementado con 0,6 M cido indol-3- actico (AIA). Despus del enraizamiento, las plantas fueron transferidas a condiciones de invernadero. Alteraciones morfolgicas no se observaron entre los regenerantes. Segmentos de hojas a partir de plantas in vitro fueron cultivadas en medio MS suplementado con concentraciones diferentes de cido naftalenacetico (ANA) (2.7; 5.4; 10.7; 16.1 y 26.9 M), 6-Bencilaminopurina (BAP) (2.2; 4.4; 8.9; 13.3 y 22.2 M), Kinetina (KIN) (2.3; 4.6; 9.2; 13.8 y 23 M), Picloram (PIC) (2.0; 4.0; 8.0; 12.0; and 20.0 M) o 2,4 -Acido diclorofenoxiacetico (2,4D) (2.2; 4.5; 9.0; 13.6 and 22.6 M) para promover el desarrollo de callos friables. Las tasas ms altas de induccin fueron obtenidas in la presencia de 13.6 and 22.6 M 2,4D tan bueno como el 20 M PIC. Cultivos de clulas en suspensin fueron establecidas a partir de callos formados en estas condiciones25.

24

In vivo and in vitro studies on Thevetia species Growing in Egypt Establishment of in vitro tissue culture system and production of cardiac glycoside. H. S. Taha et al (3), 2011, Journal of American Science, Vol. 7, pgs. 1-12. ISSN: 1545-1003. 25 CASTELLAR, et al. Op. cit., p. 1113.

20

2.2

MARCO TERICO

2.2.1 Thevetia peruviana.

Reino: Subreino: Divisin: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Tribu: Gnero: Especie:

Plantae Tracheobionta Magnoliophyta Magnoliopsida Asteridae Gentianales Apocynaceae Rauvolfioideae Plumerieae Thevetia T. peruviana26

Figura 1. Thevetia peruviana.

Fuente. CARR, Gerald D. Cascabela http://www.botany.hawaii.edu/faculty/carr/images/cas_the.jpg

thevetia.

[Online]

Thevetia peruviana es un rbol pequeo comnmente ornamental, perteneciente a la familia Apocynaceae, ampliamente distribuido en los continentes Americano, Asitico y Africano. Sus semillas, hojas, frutos y races han sido usados en medicina tradicional como purgativo, emtico y para tratamiento de fiebre intermitente. Esta planta es particularmente conocida por su habilidad para producir glucsidos cardacos, tales como thevetina y peruvosido, los cuales tienen un ndice teraputico
26

PRIETO-PUGA, J. Gua de Plantas de Jardn. Madrid:Pirmide. (1993).ISBN 84-368-0694-8.Citado por: colaboradores de Wikipedia. [En lnea] 47568840. [Citado el: 3 de Septiembre de 2011.] http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Thevetia_peruviana&oldid=47568840.

21

relativamente alto comparado con la digoxina. En Europa, esta planta fue reconocida como venenosa en el siglo. XVI. Sin embargo, en aos recientes es considerada como una fuente potencial de compuestos biolgicamente activos, a saber, insecticidas, rodenticidas, fungicidas y bactericidas, entre otros, habiendo sido descubierta su actividad cardiotnica en 186327.

2.2.1.1 Metabolitos y actividad biolgica de T. peruviana. Gupta et al., investigaron los glicsidos cerbersido, cerberina, nerifolina, ruvsido y peruvsido de T. neriifolia, con relacin a sus actividades cardiotnica y antiveratrnica y en comparacin con la ouabana, determinando que el orden de potencia de estos glucsidos con relacin a su actividad cardaca, determinada sobre la base de la concentracin mnima de glucsido requerida para parar el corazn en sstole, es: ouabana<cerberina<cerbersido<ruvsido<nerifolina<peruvsido. El 28 peruvsido fue, aproximadamente, 3 veces ms potente que la ouabana .

Cuadro 1. Metabolitos de Thevetia (adaptado de Duke, 2008) 29.

Metabolito cido linolnico

peruviana con actividad biolgica conocida

cido urslico

Aucubina

Beta-sitosterol

Betulina Cerbersido Lupeol

Neriifolina Peruvsido

Actividad Biolgica Antiacn, antialopcico, antianafilctico, antifibrinoltico, antiarterioesclertico, antiartrtico, nematicida, anticoronario, antihemorrgico, carcinognico, hepatoprotector. Analgsico, antialzheimer, antiartrtico, anticancergeno (colon), antidiabtico, antiedmico, antihepatotxico, antihistamnico, antiVIH, antiinflamatorio, antileucmico, antimalrico, antimetasttico, antimutagnico, antioxidante, antitumoral (pulmn, colon, estmago), antiviral, citotxico, hepatoprotector, pesticida. Antibacteriano, antdoto (amanitina), antiedmico, antileucmico, antioxidante, pesticida, colagnico, antiprolactina, antiestafilococo, antiinflamatorio, diurtico. Anticancergeno (pulmn), antiviral, pesticida, antibacteriano, antileucmico, antimutagnico, antiedmico, antitumoral (pulmn, cuello del tero), espermicida. AntiVIH, anticarcinmico, antitumoral, antiviral, citotxico. Cardiotnico. Antiedmico, antihiperglicmico, antiinflamatorio, antimalrico, antioxidante, antirreumtico, antitumoral, antiviral, citotxico, hipotensivo, pesticida. Antitumoral, cardiotnico, cardiotxico, citotxico, insecticida, pesticida. Cardiotnico, digitlico.

27 28

ARORA, et al. Op. cit. Citado por ARIAS, Juan (informe no publicado). Gupta et al. Citado por ARIAS, Juan (informe no publicado). 29 DUKE, 2008. Citado por ARIAS, Juan (informe no publicado).

22

Cuadro 1. (Continuacin) Quercetina Alergnico, analgsico, antiaflatoxina, antianafilctico, antiartrtico, antiasmtico, antiarterioesclertico, antibacterial, anticarcinmico (pulmn), anticisttico, antidermattico, antidiabtico, antihepatotxico, antihipertensivo, antiencefaltico, antigstrico, antihistamnico, antiVIH, antileucmico, antimalrico, antimelanmico, antimutagnico, anti-metasttico, antimiocardtico, antipancreattico, antitumoral (pulmn, piel, ovario, colon, vejiga), antiviral, bradicardaco, inhibidor de VIH-TR, vasodilatador, teratolgico. Tevetina Cardiotnico, digitlico, tranquilizante.

Fuente. ARIAS, 2011.

2.2.2 Petiveria alliacea

Reino: Orden: Familia: Gnero: Especie: Nombre comn:

Plantae Caryophyllales Phytolaccaceae Petiveria P. alliacea Anam30.

Figura 2. Petiveria alliacea.

Fuente. MILD, Christina. Garlic Guinea Weed photographed at Nature Conservancys Southmost Preserve, Brownsville.

Hierba, a veces leosa hacia la base, de hojas alternas y largos racimos terminales con flores poco evidentes y separadas entre s; flores con 4 tpalos (sin
30

MORALES, J. Francisco. Instituto Nacional De Biodiversidad.

23

separacin de spalos y ptalos) frutos secos y alargados, acompaados de 4 espinas, girados sobre el eje del racimo (pegados a l y apuntando hacia abajo). Petiveria alliacea es una planta herbcea perteneciente a la familia Phytolaccacea, conocida como mapurite. Se encuentra ampliamente distribuida de manera silvestre en Mxico y otros pases del Caribe y Sudamrica. Recientemente, la especie ha llamado la atencin por sus diferentes y muy variados usos medicinales, los estudios etnobotnicos sealan su uso por los curanderos tradicionales como31 antirreumtico, antiespasmdico, abortivo3233, anticancergeno34. Cuadro 2. Principales metabolitos producidos por Petiveria alliacea (Anam) con su respectiva actividad3536.
Metabolito Cumarinas Alantona Pinitol Nitrato potasio Betasitosterol cido linoleico Actividad Antimicrobiano, raticida, usado en problemas de la piel Cicatrizante natural Antidiabetico de Tratamiento de la hipersensibilidad que afecta a la pulpa dentaria, produccin de cido ntrico Bloquean la absorcin del colesterol a nivel intestinal, alivio de los sntomas derivados de la hiperplasia benigna de prstata Sube las defensas, disminuye los niveles de grasa corporal, disminuye la presin arterial, antiinflamatorio

31 32

PEREZ-LEAL, et al. Op. cit. p.: 51. OLUWOLE, et al. . Op. cit. p. 4. Citado por PEREZ-LEAL, et al. Op. cit. p.: 51 33 OLIVEIRA, G. M. Screening de plantas nativas da amazonia competencial inhibidor da fertilidade em plantas. 1988. Citado por PEREZ-LEAL, et al. Op. cit. p.: 51 34 Antimitotic action of extracts of Petiveria alliacea on sea urchin egg development. MALPEZZI, E. L., DAVINO, S. C., COSTA, L.V. , FREITAS, J. C., GIESBRECHT, A. M., ROQUE, N. F. 1994, Brazilian Journal Medical Biologyc Research, Vol. 27, pgs. 749-54. Citado por PEREZ-LEAL, et al. Op. cit. p.: 51 35 Guin: erva medicinal ou txica? . SOUSA, J. R. de, et al., et al. (7), 1987, Cincia e Cultura, Vol. 39, p. 645-646. Citado por MUOZ, Ismael. EVALUACIN DE LOS CONTENIDOS METABLICOS EN CULTIVOS DE CLULAS DE Petiveria alliacea L. (ANAM). 36 6-C-formyl and 6-C-hydroxymethyl flavanones from Petiveria alliacea. MONACHE, F. And CUCA, L.E. 6-Cformyl and 6-C-hydroxymethyl flavanones from. 7, 1992, Phytochemistry, Vol. 31, pp. 2481-2482. Citado por MUOZ. Op. cit. p. 5.

24

2.3

MARCO LEGAL

2.3.1 Constitucin Poltica de Colombia

Artculo 27. El Estado garantiza las libertades de enseanza, aprendizaje, investigacin y ctedra37. Artculo 69. Se garantiza la autonoma universitaria. Las universidades podrn darse sus directivas y regirse por sus propios estatutos, de acuerdo con la ley. La ley establecer un rgimen especial para las universidades del Estado. El Estado fortalecer la investigacin cientfica en las universidades oficiales y privadas y ofrecer las condiciones especiales para su desarrollo. El Estado facilitara mecanismos financieros que hagan posible el acceso de todas las personas aptas a la educacin superior38. Artculo 70. El Estado tiene el deber de promover y fomentar el acceso a la cultura de todos los colombianos en igualdad de oportunidades, por medio de la educacin permanente y la enseanza cientfica, tcnica, artstica y profesional en todas las etapas del proceso de creacin de la identidad nacional. La cultura en sus diversas manifestaciones es fundamento de la nacionalidad. El Estado reconoce la igualdad y dignidad de todas las que conviven en el pas. El Estado promover la investigacin, la ciencia, el desarrollo y la difusin de los valores culturales de la Nacin39.

37 38

COLOMBIA. CONSTITUCION POLITICA DE COLOMBIA. Artculo 27. COLOMBIA. 1991. Ibid. p.: 12. 39 Ibid. p.: 12.

25

3 3.1 TIPO DE INVESTIGACIN

METODOLOGA

Se llevo a cabo una investigacin de tipo experimental ya que se pretende es lograr la estandarizacin del protocolo de desinfeccin y de los medios de cultivo con sus reguladores de crecimiento para Petiveria alliacea (anam) y seguir con la investigacin que llevan en el laboratorio de Bioconversiones con Thevetia peruviana basndonos en investigaciones anteriores y contemporneas que se han realizado en el Laboratorio de Bioconversiones y con el apoyo de revisiones bibliogrficas relacionados con las especies mencionadas.

3.2

POBLACIN Y MUESTRA

3.2.1 Poblacin. Se tendr como poblacin las plantas de Thevetia peruviana y Petiveria alliacea recolectadas de los alrededores del campus del ncleo el volador y del rio de la Universidad Nacional sede Medelln y por si alguna razn no se llega a contar con las plantas en los alrededores de la Universidad se obtendrn del jardn botnico de Medelln.

3.2.2 Muestra. Se considerara como muestra cualquier explante (tallo, hojas, yemas, races, flores, semillas y partes del fruto) de Thevetia peruviana y Petiveria alliacea.

3.3

FASES O ETAPAS

3.3.1 Revisin bibliogrfica. La revisin bibliogrfica se realiz buscando en

internet, se hace una revisin peridica y continua para conocer la evolucin de investigaciones con respecto al tema de cultivo in vitro, micropropagacin, produccin de metabolitos, produccin de callos, estandarizacin de mtodos de desinfeccin y de medios de cultivo con sus respectivos reguladores de crecimiento.

3.3.2 Ensayos con Petiveria alliacea. Se realizaron ensayos de cultivo in vitro de Petiveria alliacea para intentar lograr su establecimiento y formacin de callos ensayando con diferentes tipos de explantes de la planta, tratamientos de desinfeccin y tratamientos de medio de cultivo con sus respectivos reguladores de crecimiento.

26

3.3.2.1 Seleccin del Explante. Fueron seleccionados los explantes de Petiveria alliacea teniendo en cuenta su calidad fitosanitaria (sin sntomas de enfermedades o presencia de insectos) y calidad fisiolgica (tejido sin lesiones o con signos de fenolizacin, etc.) Los explantes fueron tomados de plantas que se encuentran en el campus de la Universidad Nacional sede Medelln del ncleo el Volador o de sus alrededores. Luego se llev al proceso de introduccin (desinfeccin y siembra en medio de cultivo), debidamente en cabina de flujo laminar en el laboratorio. Los medios de cultivo, agua destilada para uso de lavado y enjuagado de los explantes y otros utensilios como pinzas, toalla, frascos, etc. fueron esterilizados en autoclave a una temperatura de 121C y 15 lb de presin durante 20 min y los medios de cultivo se sirvieron en frascos de vidrio (frascos de compota) 20 ml por c/u. El proceso de introduccin de los explantes en el medio es el siguiente: se recolectaron los explantes teniendo cuenta los parmetros descritos anteriormente; se cortaron los explantes de la planta y se depositaron en una bolsa plstica o una bolsa ziploc, se llevaron al laboratorio y se hizo una desinfeccin preliminar con jabn antibacterial y luego se llevo a cabina de flujo laminar y se le aplico un tipo de tratamiento de desinfeccin que se describir ms adelante; los explantes fueron cortados de tal manera que quedaron de un 1 cm 2, aproximadamente, se destapo el frasco con el medio de cultivo y se flameo el frasco (no se debe colocar con la boca hacia arriba para prevenir contaminacin) luego de esto con las pinzas se introdujo el explante en el medio cultivo.

3.3.2.2 Evaluacin de desinfectantes para Petiveria alliacea. Primero se hace una desinfeccin preliminar del material vegetal a utilizar con jabn antibacterial, antes de ser llevado a cabina de flujo laminar, donde se realiz la desinfeccin final. Se formularon y aplicaron ocho tratamientos de desinfeccin para los explantes de Petiveria alliacea. Posteriormente los explantes desinfectados fueron introducidos en medio de cultivo para su establecimiento. Los tratamientos de desinfeccin para Petiveria alliacea, han sido propuestos por el autor del proyecto. Hasta el momento se ha trabajado con estos desinfectantes, porque son los que estn disponibles en el laboratorio de Bioconversiones de la Universidad Nacional sede Medelln, son de fcil manejo y cumplen con la funcin que necesitamos.

27

Cuadro 3. Tratamientos de desinfeccin para explantes de Petiveria alliacea. TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Petiveria alliacea
Tto. 1 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 15 min Enjuague En cmara de flujo Alcohol 70% x 30 s Enjuague con ADE x3 NaClO 1% x 10 min Enjuague ADE x 3 Tto. 2 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 15 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 30 s Enjuague ADE x 3 Perxido de hidrogeno x 7 min Enjuague ADE x 3 Tto. 3 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 20 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x3 NaClO 5.25% x 5 min Enjuague con ADE x3 Tto. 4 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 30 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo NaClO 5% x 10 min Enjuague con ADE x3 Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x3

Cuadro 3. (Continuacin) TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Petiveria alliacea

Tto. 5 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 50 min En cmara de flujo Enjuague ADE Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x3 NaClO 5% x 7 min Enjuague con ADE x3 Tto. 6 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 20 min NaClO 1% x 1 h En cmara de flujo Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 5% x 1 min Enjuague con ADE x 3 Yodo 1% Tto. 7 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague NaClO 1,5% x 1 h En cmara de flujo Enjuague ADE Alcohol 70% x 5 min Enjuague ADE x 3 NaClO 10% x 5 min Enjuague ADE x 3 Yodo 0.2% Tto. 8 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague ADE En cmara de flujo Alcohol 70% x 2 min Enjuague ADE x 3 NaClO 3% x 10 min Enjuague ADE x 3

Los parmetros de evaluacin para los tratamientos de desinfeccin son tipo de contaminacin (bacterias y/o hongos) y necrosis en los tejidos. En los tratamientos 6 y 7 se prob con un nuevo desinfectante que es el yodo para 28

ver si arrojaba alguna mejora en los resultados. Se utilizo estos desinfectantes porque son los que estaban disponibles en el laboratorio de Bioconversiones, lo que se hizo fue modificar las concentraciones de los desinfectantes por sugerencia del Dr. Mario Arias, realizando ensayos de prueba y error.

3.3.2.3 Evaluacin de medios de cultivo para Petiveria alliacea. Se formularon y aplicaron seis tratamientos de medios de cultivo para el establecimiento e iniciacin de callos, por bibliografa se ha decidido trabajar principalmente con medio Murashige y Skoog (MS) modificado, pero tambin se aplic el medio formulado por Schenk y Hildebrandt (SH) que es el que se utiliza para la especie vegetal Thevetia peruviana.

Cuadro 4. Medio SH tratamiento de medio de cultivo 1 para introduccin de explantes de Petiveria alliacea. MEDIO SH TRATAMIENTO 1

Componente

Cantidad a adicionar

Volumen de la solucin madre por litro de medio

Solucin madre 1 Macronutrientes (1 L) - Almacenar a 4C KNO3 MgSO4*7H2O CaCl2*2H2O NH4H2PO4 50 g 8g 4g 6g 50 ml

Solucin madre 2 Fosfato (1 L) - Almacenar a 4C NH4H2PO4 6g 50 ml Solucin madre 3 Microelementos (400 ml) - Almacenar a 4C KI H3BO3 MnSO4*4H20 ZnSO4*7H2O CuSO4*5H2O Na2MoO4*2H2O CoCl2*6H2O 80 mg 400 mg 1055.6 mg 80 mg 16 mg 8 mg 8 mg 5 ml

29

Cuadro 4. (Continuacin) Solucin madre 4 Hierro (200 ml) - Almacenar a 4C FeSO4*7H2O Na2EDTA 600 mg 800 mg 5 ml

Solucin madre 5 Compuestos orgnicos (200 ml) - Almacenar a -20C Acido Nicotnico Piridoxina Tiamina HCl 200 mg 100 mg 1000 mg Reguladores de crecimiento (50 ml) - Almacenar a 4C Kinetina 2,4-D 25 mg 100 mg 1 ml 1 ml 5 ml

Fuente. Schenk y Hildebrandt40.

Cuadro 5. Medio MS como base principal de los tratamientos de medio de cultivo a utilizar para Petiveria alliacea. MEDIO MS Concentracin de la Volumen de la solucin madre (g/L) solucin madre Componente por litro de medio Solucin madre 1 Macros NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H20
CuSO4.5H2O 10 ml de solucn 25mg/100ml CoCl2.6H2O 10ml de solucin 25 mg/100ml
40

16,5 19 4,4 3,7 1,7 Solucin madre 2 Micros 1,69 0,86 0,62 0.083 0.025

100 ml

10 ml

SCHENK, R.U. And HILDEBRANDT, A.C. Medium and Techniques for Induction and Growth of Monocotyledonous and Dicotyledonous Plant Cell Cultures. Canadian Journal Botanica. 1972. pp. 199-204. Vol. 50.

30

Cuadro 5. (Continuacin)

Solucin madre 3 Fuente de hierro FeSO4.7H2O 0.00556 Na2EDTA.2H2O 0.00746 Solucin madre 4 - Vitaminas Inositol Acido nicotnico HCl-Piridoxina Glicina HCl-Tiamina 10 0,05 0,05 0,2 0,01 10 ml

10 ml

Fuente. Murashige y Skoog41.

Cuadro 6.Tratamientos de medio de cultivo MS modificado para establecimiento de explantes de Petiveria alliacea. Tto. 2 Compone nte ANA BAP KIN 2,4-D g/L 0.0 05 0.0 05 0.0 05 0.0 05 Tto. 3 Compone nte 2,4-D g/L 0.0 08 Tto. 4 Compone nte 2,4-D Myoinositol g/L 0.0 05 0.4 Tto. 5 Compone nte Myoinositol 2,4D Acido ascrbico g/ L 2 1 5

iniciacin y Tto. 6

Compone nte AIA Thiadiazo l

g/L 0.00 5 0.00 15

*A cada tratamiento se le agreg 30 g/l de sacarosa y 7 g/l de agar-agar y se ajust el pH entre 5.7 5.8.

Los parmetros de evaluacin de los tratamientos de medio cultivo son la iniciacin o produccin de callos que es la meta a lograr.

41

MURASHIGE, Toshio and SKOOG, Folke. A REVISED MEDIUM FOR RAPID GROWTH AND BIO ASSAYS WITH TOBACCO TISSUE CULTURES. s.l. : PHYSIOLOGIA PLANTARUM,, 1962. pp. 473-497. Vol. 15.

31

3.3.3 Introduccin y establecimiento de Thevetia peruviana. El explante utilizado para esta especie es el mesocarpio, al igual que con Petiveria alliacea se siguen algunos protocolos como la recoleccin de los explantes, mtodo de introduccin al medio de cultivo, preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y utensilios utilizados dentro de la cabina de flujo laminar; lo que cambia es la utilizacin del medio SH como nico medio y el tratamiento de esterilizacin ya que por ensayos anteriores realizados por el investigador Juan Pablo Arias del grupo de investigacin de bioprocesos perteneciente al laboratorio de Bioconversiones se ha demostrado que el medio SH y el tipo de tratamiento de desinfeccin para Thevetia peruviana son hasta el momento los ms ideales ya que ha presentado buenos resultados con investigadores que han trabajado la especie en el laboratorio de Bioconversiones, tambin se utilizo un tratamiento de desinfeccin propuesto por el autor del proyecto.

Cuadro 7. Medio SH medio de cultivo para introduccin de explantes e iniciacin y establecimiento de callos de Thevetia peruviana.
MEDIO SH

Componente

Cantidad a adicionar

Volumen de la solucin madre por litro de medio

Solucin madre 1 Macronutrientes (1 L) - Almacenar a 4C KNO3 MgSO4*7H2O CaCl2*2H2O NH4H2PO4 50 g 8g 4g 6g Solucin madre 2 Fosfato (1 L) - Almacenar a 4C NH4H2PO4 6g 50 ml Solucin madre 3 Microelementos (400 ml) - Almacenar a 4C KI H3BO3 MnSO4*4H20 ZnSO4*7H2O CuSO4*5H2O Na2MoO4*2H2O CoCl2*6H2O 80 mg 400 mg 1055.6 mg 80 mg 16 mg 8 mg 8 mg 5 ml 50 ml

Solucin madre 4 Hierro (200 ml) - Almacenar a 4C FeSO4*7H2O Na2EDTA 600 mg 800 mg 5 ml

32

Cuadro 7. Continuacin Solucin madre 5 Compuestos orgnicos (200 ml) - Almacenar a -20C Acido Nicotnico Piridoxina Tiamina HCl 200 mg 100 mg 1000 mg Reguladores de crecimiento (50 ml) - Almacenar a 4C Kinetina 2,4-D
42

5 ml

25 mg 100 mg

1 ml 1 ml

Fuente. Schenk y Hildebrandt .

Cuadro 8. Tratamientos de desinfeccin utilizados para explantes de Thevetia peruviana.

TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Thevetia peruviana Tto. 1 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 15 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 10 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 10% x 10 min Enjuague ADE x 3 Tto. 2 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 20 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo Enjuague con ADE Alcohol 70% x 1 min Enjuague ADE x 3 NaClO 5% x 10 min Enjuague ADE x 3

Fuente. Tratamiento 1 Arias Juan, 2011.

El tratamiento de desinfeccin 2 se utilizo mas que todo con explantes que eran un poco jvenes o con explantes que estuvieran un poco maduros, ya que estos explantes tendan a necrosarse fcilmente con el tratamiento de desinfeccin 1, los explantes que tuvieran una edad media se les aplico el tratamiento de desinfeccin 1 ya que este tipo de explantes son mas resistentes y no se necrosan tan fcilmente.
42

SCHENK, R.U. And HILDEBRANDT, A.C. Medium and Techniques for Induction and Growth of Monocotyledonous and Dicotyledonous Plant Cell Cultures. Canadian Journal Botanica. 1972. pp. 199-204. Vol. 50.

33

Los explantes al ser introducidos en medio SH solido empiezan a establecerse y al cabo de 2 o 3 semanas empieza a generarse la iniciacin de callos, al transcurrir un tiempo aproximado de 11 14 semanas se pueden evidenciar callos friables listos para ser cultivados en medio SH liquido. Los explantes se subcultivan aproximadamente entre 15 a 20 das renovando as el medio de cultivo para los explantes.

3.3.3.1 Cultivo de clulas en suspensin de Thevetia peruviana. El medio de cultivo siempre fue SH solido para la iniciacin y establecimiento de callos, cuando los callos tuvieron una apariencia friable fueron subcultivados a medio SH lquido en agitacin para la iniciacin de cultivo de clulas en suspensin. La iniciacin de clulas en suspensin se realiz agregando aproximadamente en una proporcin de 30 70 de callos y medio SH liquido, utilizando frascos Erlenmeyer y llenando aproximadamente 1/5 de la capacidad del frasco de Erlenmeyer. Cuando se tuvieron los cultivos de clulas en suspensin se realiz una serie de subcultivos estos se realizaron en un promedio de 10 a 15 das y estos fueron realizados de la siguiente manera se sacaron los frascos de Erlenmeyer de la agitadora y se dejaron quietos y reposando en la cmara de flujo laminar aproximadamente de 20 a 30 minutos luego se descarto el sobrenadante que es el medio que ha sido utilizado y en el fondo quedo la biomasa y se le agrego el nuevo medio SH liquido. Cuando los callos no se disgregaron totalmente se agito fuertemente de manera manual y se paso el sobrenadante a otro frasco de Erlenmeyer donde se le agrego nuevo medio de cultivo SH lquido. Los cultivos de clulas en suspensin se revisaban al microscopio para eso se tomaban muestras en tubos eppendorf generalmente cada vez que se hacia un subcultivo, ya teniendo la muestra se le hacia una tincin con azul de Evans para ver su viabilidad, y al mismo tiempo se revisaba si haba alguna contaminacin.

34

Figura 3. Toma de muestra de cultivo de clulas en suspensin para revisin al microscopio.

Figura 4. Clulas de T. peruviana teidas con azul de Evans en el microscopio.

3.3.4 Diseo experimental. Se realiz un diseo experimental donde se calculo el promedio de biomasa generada por peso seco, donde las variables fueron agitacin (180 rpm y 150 rpm) y ambiente (fotoperiodo natural y oscuridad total) con un promedio de temperatura de 28 - 30 C cada ensayo por triplicado. Se utilizo el software statgraphics para el desarrollo del anlisis estadstico con un nivel de significancia del 95%. Para esto se tomo una muestra de 20 ml de cada cultivo de clulas en suspensin y se filtro utilizando un frasco Erlenmeyer con desprendimiento lateral y una motobomba generando el vaco, luego del filtrado se peso en una balanza analtica este dato se obtuvo para tener una correlacin entre peso fresco y peso seco, pero el verdaderamente importante y que se va a utilizar con el programa estadstico es el peso seco, luego se llevo a un horno a una temperatura de 60C durante 24 horas y se peso nuevamente teniendo el peso seco. 35

Figura 5. Diseo experimental.

36

Figura 6. Proceso de filtracin de cultivo de clulas en suspensin.

Figura 7. Toma de peso de la biomasa.

Figura 8. Muestra de biomasa luego del proceso de secado.

37

4 4.1

RESULTADOS Y ANALISIS

ENSAYOS CON Petiveria alliacea

Se ha seleccionado el material vegetal de Petiveria alliacea (hojas y ramas con o sin yemas) teniendo en cuenta las caractersticas ptimas de calidad del material vegetal.

4.1.1 Evaluacin de desinfectantes para Petiveria alliacea. A continuacin se puede observar los datos de las hojas, tallos y ramas de Petiveria alliacea introducidas en medio de cultivo y el descarte de las mismas.

Cuadro 9. Cantidad de material vegetal de Petiveria alliacea introducido en medio de cultivo.

MATERIAL VEGETAL INTRODUCIDO LOTE 0310 0410 1110 1910 2110 0311 0911 1811 2211 3011 1212 2712 1101 2001 2501 TOTAL 6 7 7 162 131 160 11 4 10 11 6 39 36 HOJAS 20 30 51 16 15 24 20 68 44 28 RAMAS TALLOS

38

Cuadro 10. Descarte de material vegetal de Petiveria alliacea.

DESCARTE LOTE MUERTE 0310 H 0410 H 1110 R 1910 H 1910 R 2110 R 0311 R 0311 H 0911 T 1811 T 2211 T 2211 H 3011 T 1212 H 1212 R 2712 1101H 1101R 2001 2501 1 10 5 5 5 28 11 4 44 1 3 6 16 15 1 12 6 23 27 2 68 12 30 48 3 27 HONGOS CAUSA BACTERIAS 20 SIN RESPUESTA 20 30 51 36 16 15 24 39 20 68 44 6 28 11 4 10 6 11 7 7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 TOTAL %

5 7 7

H: Hojas, R: Ramas

Como se puede observar en los cuadros los resultados no fueron muy positivos, en esta pasanta se pretenda ensayar con esta especie y llegar a obtener un estandarizacin del mtodo de desinfeccin pero no se logro descubrir un balance de concentraciones del hipoclorito de sodio NaClO que es el principal desinfectante ya que dependiendo de su concentracin si es muy alta se produce una necrosis en el tejido del explante y si la concentracin no es lo suficiente se produce una prolifera contaminacin cuando se siembran los explantes en medio de cultivo.

39

Figura 9. Explante de hoja de Petiveria alliacea recin introducida en medio de cultivo.

Figura 10. Explante de hoja de Petiveria alliacea contaminado por hongo.

Contaminacin

Los mejores resultados fueron los presentados por los tratamientos de desinfeccin 3 y 4 en los lotes 1910 H, 0911 T, 1212 H y 1212 R ya que no se contaminaron demasiados y tampoco hubo mucha necrosis en los tejidos pero los explantes no presentaron ninguna respuesta, no hubo crecimiento ni iniciacin de callos que era lo que se pretenda. Estos lotes fueron cultivados en los tratamientos de medio de cultivo 3 y 4. Por otro lado los lotes 2001 y 2501 que se les aplico los tratamientos de desinfeccin 7 y 8 respectivamente, en estos lotes no hubo presencia de contaminacin y la necrosis en el tejido fue prcticamente nula, pero sin embargo estos explantes de estos lotes no fueron capaces de establecerse y menos llegar a la iniciacin de callos, cabe destacar que los dos lotes fueron introducidos en el tratamiento 6 de medio de cultivo, el cual tenia el componente thiadiazol segn Siddiqui, et al43., Es un herbicida que posee actividad antimicrobial.
43

Thiadiazoles: Progress Report on Biological Activities. SIDDIQUI, et al . (1), New Delhi : s.n., 2009, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, Vol. 1, pp. 19-30. [Online] http://jocpr.com/first-issue/JOCPR-2.pdf. ISSN : 09757384.

40

Los medios de cultivo y reguladores de crecimiento fueron formulados basndose en investigaciones anteriores Davila en 2004 y Castellar en 2011, donde ambos autores utilizaron el medio Murashige & Skoog como base principal del medio de cultivo y aplicando diferentes reguladores de crecimiento de los cuales en esta investigacin se utilizaron algunos como son el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4D), kinetina (KIN), 6-Bencil aminopurina (BAP), cido naftalnactico (ANA), (vase Anexos A y B). Al comparar estos resultados con los resultados obtenidos por Dvila en 2004 y Castellar et al., en 2011 se puede decir que por algn motivo contaminacin de reactivos, o algn otro no se ha logrado producir un establecimiento e iniciacin de callos de P. alliacea. Los autores reportan un establecimiento e iniciacin de callos segn la utilizacin del regulador de crecimiento cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) como factor principal para que se produzca este mismo, y como se ha descrito antes se ha utilizado el regulador de crecimiento cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D), en 5 de 6 tratamientos de medio de cultivo. Los medios de cultivo de los tratamientos 5 y 6 se formularon principalmente con la adicin de reguladores de crecimiento derivados de auxinas, como lo es (Acido Indol Actico, Acido Ascrbico y cido 2,4-diclorofenoxiactico) Prez et al44., ya que la induccin de tejido calloso se produce con la presencia de auxinas superior a las citocininas. Se tiene las hiptesis del porqu de la contaminacin a) en las primeras introducciones de explantes se realiz sin guantes, pero se realiz una desinfeccin de las manos y los brazos con jabn antibacterial y alcohol al 96% pudiendo haberse contaminado, b) tambin puede llegar a ser que como en la cabina de flujo laminar la utilizan en otros proyectos con microrganismos como (hongos, bacterias y levaduras) y los procesos de cultivos de tejidos vegetales son tan sensibles a contaminarse, c) las cuchillas se reutilizan, se aclara que aunque son reutilizadas se esterilizan cada vez que se van a utilizar en cabina de flujo laminar.

44

Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. PEREZ, E.M., RAMREZ, R., NEZ, H.G. Aguascalientes, Mexico : UAA, 1999, pp. 153-169. ISBN: 968-6259-62-7.

41

Figura 11. Explante de P. alliacea en medio de cultivo solido sin ninguna respuesta.

Como se puede observar en la foto el explante fue sembrado y no creci y al transcurrir el paso del tiempo el color del explante empez a ponerse plido y amarillento empezando por las puntas hacia el centro, sin tener alguna respuesta de crecimiento o iniciacin de callos.

4.1.2 Evaluacin de medios de cultivo para Petiveria alliacea. Ninguno de los tratamientos de medios de cultivo logr servir para la iniciacin de callos de Petiveria alliacea, sin embargo los explantes de los lotes 1910 H, 1910 R, 2110 R, 0311 R, 0311 H y 0911 T que se cultivaron en el tratamiento de medio de cultivo 3 se vea como si hubiera una iniciacin de callos pero era muy insignificante y al cabo del tiempo los explantes no tuvieron ninguna otra respuesta. Por otro lado los explantes de los lotes 2001 y 2501 que fueron sembrados en el tratamiento de medio de cultivo 6 que tenia el componente thiadiazol que es un herbicida que posee actividad antimicrobial45 no hubo presencia de contaminacin, pero los explantes no respondieron ni establecindose ni generando la iniciacin de callos, los explantes se mantuvieron verdes alrededor de 20 das luego empezaron a tomar un color verde plido o amarillento, por eso se decidi realizar su descarte.

4.2

INTRODUCCIN Y ESTABLECIMIENTO DE Thevetia peruviana

A continuacin se pueden observar los datos de material vegetal de Thevetia peruviana introducido teniendo en cuenta las caractersticas ptimas de calidad del material vegetal.

45

SIDDIQUI, et al., Op. Cit.

42

Cuadro 11. Cantidad de material vegetal de Thevetia peruviana introducido en medio de cultivo. EXPLANTES EXPLANTES LOTE LOTE INTRODUCIDOS INTRODUCIDOS 0610 1010 2610 0411 2812 0602 1402 24 64 32 88 76 56 84 1702 2302 TOTAL 32 68 524

Cuadro 12. Descarte de material vegetal de Thevetia peruviana. DESCARTE LOTE MUERTE O FENOLIZ ACION 0610 1010 2610 0411 2812 0602 1402 1702 2302 64 28 4 8 12 8 CAUSA HONGOS BACTERI AS SIN RESPUES TA 12 34 32 8 50 53 100 9 100 0 0 0 0 TOTAL %

4 34

Todos los explantes de Thevetia peruviana fueron introducidos en medio SH solido y a excepcin del lote 0411 el tratamiento de desinfeccin fue el tratamiento 1 basndose en los ensayos realizados por Arias en 2011. Los lotes 0411, 0602, 1402, 1702 y 2302 tuvieron un buen establecimiento e iniciacin de callos, no se presencio una contaminacin o una fenolizacin en los 43

explantes a excepcin del lote 0411 donde hubo una contaminacin ligera por hongos que pudo deberse a contaminacin cruzada. Los explantes de los lotes que sobrevivieron mostrados en la tabla anterior fueron subcultivados 4 veces en medio SH solido y se logro la iniciacin y establecimiento de callos al transcurrir los das los callos fueron creciendo y tomando diferentes apariencias, cambiando de color y tamao pasando de color verde a colores amarillentos, beige y blancos y tomando apariencia friable. Al transcurrir entre 2 o 3 semanas se empieza a evidenciar la iniciacin de callos sobre el explante, tomaron un color verde y blanco, transcurrido este tiempo se le realiz un subcultivo que por lo general se le realiz entre 15 a 25 das y se siguieron subcultivando aproximadamente hasta que los explantes tuvieron un tiempo de 11 14 semanas en medio SH solido y/o hasta que hubo una buena proporcin de callos donde se le realiz un raspado y se subcultivo sin el explante madre en un nuevo medio de cultivo y en el subcultivo siguiente que se realiz en medio SH liquido para iniciar el cultivo de clulas en suspensin. La contaminacin que se ha presentado en los explantes de Thevetia peruviana es por las hiptesis que se plantearon anteriormente comentadas en los ensayos de Petiveria alliacea. Se piensa que los explantes que se murieron o se fenolizaron es debido a la edad del fruto recogido de Thevetia peruviana ya que entre ms edad tenga el fruto se ha visto que tiene mayor tendencia a fenolizarse ms rpidamente, por lo general siempre se escogen frutos de tipo mediano pero a veces no todos son medianos y toca escoger aleatoriamente. Los lotes 0610 y 1010 presentaron un porcentaje de descarte igual o mayor al 50% pero a pesar de esto los explantes que sobrevivieron progresaron y produjeron callos.

Figura 12. Explantes de Thevetia peruviana con iniciacin de callos trascurridos 15 das de su introduccin en medio de cultivo.

44

Figura 13. Explantes de Thevetia peruviana con callos trascurridas 7 semanas de su introduccin en medio de cultivo.

En la anterior ilustracin se pueden observar los callos formados sobre el explante madre, un explante con este tipo de produccin de callos es el que se necesito para realizar el raspado de los callos y cultivarlos sin el explante madre en un nuevo medio de cultivo, ya que cuando hubo que realizar el cultivo de clulas en suspensin se necesitan solamente los callos y no el explante madre. Por el contrario podemos observar en la siguiente ilustracin unos explantes de Thevetia peruviana fenolizados, el mesocarpio de Thevetia peruviana tiene la desventaja que se fenoliza muy rpido y si en el momento de cortar el explante se demora un par de minutos sin ser introducido en el medio de cultivo lo ms probable es que se fenolice y no haya iniciacin de callos. Haciendo una comparacin con los resultados de la investigacin de Arias en 2011 donde reporta necrosamiento en explantes de hojas y tallos de T. peruviana cuando le realiz una desinfeccin con hipoclorito de sodio NaClO a diferentes concentraciones (vase anexo C). Se dice que el medio SH es el mejor para el mantenimiento de los cultivos, pues los callos cultivados en ste presentan mejores caractersticas de friabilidad46 en comparacin con los otros medios de cultivo que el autor hizo sus investigaciones (vase anexo D).

46

ARIAS, Juan. Investigacin Medelln, 2011.

no publicada sobre Thevetia peruviana. Laboratorio de Bioconversiones,

45

Figura 14. Explantes de Thevetia peruviana fenolizados transcurrida 1 semana de su introduccin en medio de cultivo.

El lote 2610 y 2812, no presentaron buenos resultados ya que todos los explantes se descartaron, hubo una contaminacin fngica y un alto necrosamiento de los tejidos, se tiene la hiptesis de que el necrosamiento se puedo haber presentado porque los explantes eran demasiado jvenes y no soportaron la alta concentracin de hipoclorito de sodio, en cuanto a la contaminacin se piensa que es una contaminacin cruzada.

Figura 15. Explantes de T. peruviana, con presencia de contaminacin fngica y necrosamiento.

46

Figura 16. Explantes de T. peruviana con 18 das de haber sido sembrados en medio de cultivo SH solido.

4.2.1 Cultivo de clulas en suspensin. Con los lotes que sobrevivieron y los que presentaron callos se decidi el 18 de enero de 2012 realizar la iniciacin de cultivo de clulas en suspensin ya que los callos mostraban a la vista una apariencia friable
Figura 17. Explantes de Thevetia peruviana en medio de cultivo SH solido, con apariencia friable.

47

Figura 18. Cultivo de clulas en suspensin de Thevetia peruviana en medio de cultivo SH liquido.

4.3

DISEO EXPERIMENTAL Variables Muestra 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. Peso hmedo (g) 1,20 1,79 2,01 3,38 2,61 2,79 0,75 0,75 0,35 1,80 1,44 1,07 Peso seco (g) 0,14 0,20 0,25 0,23 0,18 0,46 0,069 0,083 0,024 0,19 0,14 0,12

Cuadro 13. Datos de toma de peso de la biomasa.

180 rpm oscuridad total 180 rpm ambiente con luz 150 rpm oscuridad total 150 rpm ambiente con luz

48

Cuadro 14. Anlisis De Varianza Para Peso Suma de media Fuente Df cuadros cuadrtica A:agitacion B:luz AB Total error Total (corr.) 0,057963 0,0255763 0,000003 0,0551673 0,13871 1 1 1 8 11 0,057963 0,0255763 0,000003 0,00689592

FProporcin 8,41 3,71 0,00

P-Valor 0,0199 0,0903 0,9839

R-cuadro = 60,2282 por ciento R-cuadro (ajustado para d.f.) = 45,3138 por ciento Error standard de Est. = 0,0830417 Media de error absoluto = 0,0502222 Durbin-Watson statistic = 2,04301 (P=0,1169) Lag 1 auto correlacin residual = -0,284405 Al analizar los P-valores que son la probabilidad, deducimos que para la interaccin entre las variables (AB) el P-valor es 0,9839 ese es mayor que el 5% (0.05), por lo tanto no es significativo, en la variable de respuesta luz (B) tiene un P-valor= 0,0903, el cual tampoco es menor o igual que 0.05 por lo tanto no es significativo o su influencia no es significativa en la variable de respuesta, la agitacin tiene 0,0199 el cual es menor que 0.05 entonces es significante en la variable de respuesta por lo tanto es la nica variable que influye de manera significativa en la respuesta. El 0.05 o sea el 5% es un valor que normalmente se toma para asegurar que uno esta seguro al 95 % que los resultados son ciertos Las particiones de la tabla de ANOVA la variabilidad en piezas de peso separado para cada uno de los efectos. Luego el examen estadstico significativo de cada efecto por comparacin de la media cuadrtica contra un estimado de error experimental. En este caso, 1 efectos tiene los P-valores menos que 0,05 indicando que son significativos diferentes de cero en el nivel de confianza de 95,0%. El R-cuadro estadstico indica que el modelo ajustado explica que el 60,2282% de la variabilidad en el peso. El R-cuadro estadstico el cual es ms adecuado para comparar modelos con diferentes nmeros de variables independientes, es 45,3138%. El error estndar de la estimacin muestra la desviacin estndar de los residuos a ser 0,0830417. El error absoluto medio (MAE) de 0,0502222 es el valor promedio de los residuos. El Durbin-Watson (DW) pone a prueba los residuales para determinar si existe alguna correlacin significativa basada 49

en el orden en que aparecen en el archivo de datos. Puesto que el P-valor es mayor que 0,05, no hay ninguna indicacin de auto correlacin serial en los residuos.

Figura 19. Diagrama de Pareto estandarizado para el peso.

En la grafica de barras se ve que la variable agitacin es la influyente pues sobrepasa el nivel de significancia adems se ve q es positiva por lo tanto esta influyendo positivamente en la variable de respuesta que es el peso.

50

CONCLUSIONES

Podemos concluir que Petiveria alliacea es una especie muy recalcitrante en cultivo in vitro y su establecimiento o iniciacin de callos en medio de cultivo Murashige y Skoog no ha sido posible como si lo han logrado en la bibliografa revisada.

El medio de cultivo Schenk y Hildebrandt (SH) no mostro efectividad para el establecimiento e iniciacin de callos para los explantes de Petiveria alliacea.

A pesar de llevar a cabo mtodos de tratamientos de desinfeccin similares a los que se han aplicado en Petiveria alliacea no se logro obtener resultados muy favorables como se ha observado en la revisin bibliogrfica.

Thevetia peruviana es una especie que se fenoliza rpidamente pero en especial los frutos maduros, por eso su introduccin a medio de cultivo debe ser lo mas rpido posible.

Los tratamientos de desinfeccin aplicados para Thevetia peruviana mostraron una buena efectividad ya que su contaminacin fue muy poca.

El hipoclorito de sodio NaClO mostro lograr una buena desinfeccin a concentraciones de 10% y 5% ha un tiempo mnimo de 10 min de inmersin sobre los explantes de Thevetia peruviana.

El medio de cultivo SH solido mostro lograr una efectividad en la iniciacin y establecimiento de callos de Thevetia peruviana.

Los explantes de Thevetia peruviana mostraron buenos resultados a pesar de que en un principio algunos explantes se hayan contaminado o fenolizado, los explantes que lograron sobrevivir mostraron un buen establecimiento e iniciacin de callos.

Dado los resultados obtenidos mediante el software statgraphics sobre la biomasa generada por Thevetia peruviana podemos concluir que la agitacin si es un factor relevante para la produccin de biomasa, sin importar si los explantes tienen o no 51

luz.

Las dos velocidades utilizadas 150 y 180 rpm no muestran una diferencia significativa ya que los resultados en cuanto a la generacin de biomasa fue muy similar.

52

RECOMENDACIONES

Trabajar en cmaras de flujo laminar preferiblemente donde solo se trabaje con material vegetal y no con microrganismos, para evitar la contaminacin cruzada.

Utilizar nuevos medios de cultivo y reguladores de crecimiento para la investigacin sobre la produccin de callos de Petiveria alliacea.

Estudiar el efecto de diferentes velocidades de agitacin sobre la generacin de biomasa en cultivos de clulas en suspensin de Thevetia peruviana.

53

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58

ANEXOS

59

ANEXO A. Informacin investigacin de Dvila, 2004.

Cuadro 15. Medio bsico Murashige Skoog (1962) formulado por Dvila en 2004. MEDIOS SOLUCIN STOCK (g/l) SOLUCIN CULTIVO (mg/l) MACRONUTRIENTES KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O K2SO4 CaCL2.2H2O KNO3 EDTA disdico MICRONUTRIENTES ZnCl2 MnCl2.H2O FeSO4.7H2O H3BO4 CuCl2.7H2O NH4MoO4.H2O CoCl2 300 900 3 2.86 60 250 15 0.6 1.8 0.6 5.7 0.12 0.5 0.03 5.44 6.96 49.3 17.4 14.7 101.1 5.0 34.0 26.1 49.3 17.4 14.7 1011.0 10.0

Fuente. Murashige & Skoog, citado por Dvila en 2004.

60

Cuadro 16. Medio MS (1 l de medio) formulado por Davila, (2004). SOLUCIONES CONCENTRACIN Solucin Stock 1 Solucin Stock 2 20 ml 1 - 1 ml 2 - 1 ml 3 - 1 ml 4 - 1 ml Solucin Stock 3 Solucin Stock 4 Solucin Stock 5 Myo-inositol Glicina Piridoxina Tiamina cido Nicotnico 2,4 D Quinetina Sacarosa Agar cido Ascrbico 1 ml 1 ml 5 ml 2 ml 2 ml 0.5 ml 80 ul 5 ul 1 ml 0.2 ml 30 gr. 5.5 gr. 5 ml/l

61

ANEXO B. Informacin investigacin de Castellar et al., 2011.

Desarrollo de callos friables a partir de explantes de hojas de P. alliacea en respuesta a diferentes reguladores de crecimiento por Catellar et al., en 2010.
Figura 20. Reguladores de crecimiento utilizados por Castellar et al., en 2011.

Fuente. Castellar et al., 2011. Explantes de hojas fueron cortados a partir de plantas in vitro e inoculados en medio MS suplementado con diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento. Los datos fueron tomados despus de 30 das de su cultivo.

62

ANEXO C. Informacin investigacin de Arias, 2011.

Cuadro 17. Tratamientos de desinfeccin de explantes de tallos y hojas de T. peruviana con NaClO Concentracin Tiempo de Tratamiento de NaClO (% exposicin v/v) (min) 1 5 3

10

10

Fuente. Arias, 2011.

Figura 21. Porcentaje de contaminacin de explantes de tallos y hojas de T. peruviana luego de los tratamientos con NaClO.

Fuente. Arias, 2011.

63

Figura 22. Porcentaje de necrosamiento de explantes de tallos y hojas de Thevetia peruviana luego de los tratamientos con NaClO.

Fuente. Arias, 2011.

64

ANEXO D. Informacin investigacin de Arias, 2011.

Figura 23. Efecto del medio de cultivo sobre la formacin de callos en Thevetia peruviana.

% de Obtencin de Callos

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SH B5 MS 1/2 MS

Medio de Cultivo
Fuente. Arias, 2011.

Figura 24. ndice de crecimiento promedio obtenido con cada uno de los medios de cultivo evaluados para Thevetia peruviana.
3
ndice de Crecimiento

2,5 2 1,5 1 0,5 0 SH B5 MS 1/2 MS Medio de Cultivo

Fuente. Arias, 2011.

65