Noes Bsicas para o Laboratrio de Microbiologia

Uso interno do LSA

Fevereiro / 2008

Noes bsicas para laboratrio de Microbiologia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIAS ESCOLA DE ENGENHARIA DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA CIVIL LABORATRIO DE SANEAMENTO AMBIENTAL

Noes Bsicas para o Laboratrio de Microbiologia

Uso interno do LSA

Laboratrio de Saneamento Ambiental

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIAS DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA CIVIL

LABORATRIO DE SANEAMENTO AMBIENTAL

Pesquisadores Responsveis
Lourdinha Florencio Mario Takayuki Kato Savia Gavazza Letcia Oliveira

Coordenador do Laboratrio
Ronaldo Melo Fonseca

Colaboradores
Elizabeth Pastich Amaral Luiza Feitosa Cordeiro de Souza

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SUMRIO

1. NORMAS DE SEGURANA NORMAS DE SEGURANA 2. LIMPEZA, DESINFECO E ESTERILIZAO 2.1. LIMPEZA 2.2. DESINFECO 2.3. ESTERILIZAO: 2.3.1. ESTERILIZAO POR CALOR SECO 2.3.2. ESTERILIZAO POR CALOR MIDO 2.3.3. CONTROLE DA ESTERILIZAO 2.3.4. CONSIDERAES IMPORTANTES
3. MICRORGANISMOS

05 06 06 07 09 09 10 11 11 12 14 15 17 19 19 20 21 21 22 22 23 26

4. MEIOS DE CULTIVO 4.1. CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTIVO 4.2. TCNICA DE SEMEADURA 5. MICROSCOPIA 5.1. UNIDADES DE MEDIDA UTILIZADAS EM MICROSCOPIA 5.2. MICROSCOPIA PTICA 5.3. CUIDADOS A TER COM O MANUSEAMENTO DO
MICROSCPIO

5.4. FOCAGEM DO OBJECTO. 5.5. COLOCARO 5.5.1. CLASSIFICAO DOS

MICROSCOPIA PTICA

CORANTES

PARA

5.5.2. TCNICAS DE COLORAO 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Apresentao Esta apostila tem como finalidade, apresentar noes e cuidados bsicos para trabalhar num laboratrio de microbiologia. A idia de confeco desta apostila partiu da necessidade de dispor um apoio didtico, para pessoas de qualquer rea do conhecimento, que nunca trabalharam anteriormente com anlises microbiolgicas. Neste sentido, o presente trabalho apresenta conceitos bsicos importantes, e principalmente, procedimentos laboratoriais para que o pesquisador possa garantir a sua segurana e a do ambiente de trabalho, bem como produzir dados cientficos confiveis.

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1. NORMAS DE SEGURANA O uso de bata obrigatrio. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no entrar em contato com
reagentes e equipamentos. No comer, beber ou fumar no laboratrio. manter canetas, dedos e outros objetos longe da boca. No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. Limpar com pano mido e, posteriormente, desinfetar com lcool a 70% a superfcie das bancadas antes e depois do trabalho. No incio e no final das anlises e quando sair do laboratrio, lavar as mos com sabo neutro e, posteriormente, passar lcool a 70%. No caso do uso de luvas retir-las e descart-las sempre que necessrio. Identificar cada material que ser utilizado e no deix-los sobre as bancadas. Sempre deixar um recado, no conjunto dos materiais que esto sendo utilizados. Exemplo: material estril reservado, material contaminado, no mexer, material apenas limpo, no estril, etc. Utilizar exclusivamente material estril para a anlise. Pesquisar sobre que tipo de esterilizao deve ser empregada para cada material. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a limpeza e desinfeco do local. O mesmo procedimento dever ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. Comunicar o tcnico do laboratrio em caso de contaminao acidental. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deix-los sobre a bancada. Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. Os meios de cultura contaminados, ou seja, j utilizados, devem ser esterilizados, em autoclave, antes de serem descartados na pia ou no lixo. Ao acender o Bico de Busen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias inflamveis por perto. Trabalhe sempre prximo ao fogo, pois a rea mais estril aquela mais prxima da chama.

OBS: A utilizao do Bico de Bunsen essencial, pois visa diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia, deve ser utilizada a chama azul porque ela atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a Flambagem) (fig. 1).

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Figura 1

2. LIMPEZA, DESINFECO E ESTERILIZAO

Para obter um material ausente de microrganismos algumas etapas devem ser realizadas. A limpeza o primeiro passo, ela remover a maioria dos microrganismos e sujeira. Aps esta etapa podem ser feitos dois tipos de processos: desinfeco ou esterilizao. A desinfeco consiste em reduzir o nmero de microrganismos presentes, mas no removem os esporos, organelas especiais presentes em algumas espcies de bactrias, que se transformam em uma nova bactria aps a morte da clula. J a esterilizao o processo que elimina totalmente os microrganismos e os esporos. A escolha entre a desinfeco e esterilizao depender do grau de limpeza necessrio. Os trs processos ser descritos com maior detalhes nos tpicos seguintes.

2.1.

LIMPEZA

A limpeza consiste em remover com detergente ou similar a sujeira, como gordura, poeira, etc., pois estes materiais podem favorecer o crescimento de microorganismos e dificultar os processos de desinfeco ou esterelizao. A remoo da sujeira deve ser feita com sabo bacteriolgico ou neutro, para no ficar resduos de corantes e aromas. Para auxiliar podem ser utilizados escovas e esponjas que facilitam a remoo, mas deve-se ter cuidado para no arranhar o material e criar ranhuras onde pode se desenvolver microrganismos que, posteriormente, resistir ao processo de limpeza e desinfeco ou esterilizao. Estes materiais tem um tempo de vida til curto, para aumentar a sua durabilidade, eles devem ser mantidos secos nos momentos em que no estiverem sendo utilizados e devem ser trocados quando estiverem gastas. O enxge uma etapa muito importante, pois todo o sabo deve ser removido, desta forma, o material deve sofrer sucessivos enxges at a certificao de que todo o sabo foi removido. A presena do sabo, mesmo bacteriolgico, poder interferir no desenvolvimento dos microrganismos nos ensaios posteriores. O material deve ser identificado com caneta marcadora e, antes da limpeza, deve ser removido com lcool comum. Aps a limpeza, o material deve ser colocado em um local para secagem e s deve ser guardado seco, pois os materiais midos guardados em armrios possibilitam o crescimento de microorganismo sobretudo de fungos.

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2.2.

DESINFECO

Este processo inativa os microrganismos na forma vegetativa, exceto esporos, pode ser classificado de acordo com a quantidade de microrganismos inativados em: Desinfeco de alto nvel: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Desinfeco de nvel intermedirio: aquela que inativa bactrias na forma vegetativa, fungos e a maioria dos vrus. Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vrus. A desinfeco pode ser realizada por processos fsicos ou qumicos: Desinfeco por agentes fsicos: a) Expor o material que se deseja desinfetar a temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C). b) Expor o material desejado a uma Pasteurizao que o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de microrganismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos.

Desinfeco por agentes qumicos: a) Mtodo de Desinfeco de alto nvel:

- Glutaraldedo: indicado para qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida

desinfeco de itens reutilizados. Colocar o material que se deseja desinfetar em soluo de glutaraldedo a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. - Formaldedo: pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por 30 minutos sendo a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa. - Perxido de Hidrognio: age em presena de matria orgnica. Fazer a imerso do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos.

- cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo

que o tempo de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos.

b) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio: - Compostos Clorados: causam a inibio de reaes enzimticas intracelulares, desnaturao de protenas, e inativao de cidos nuclicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ao rpida, entretanto seu uso limitado, pois causa irritaes na pele e nos olhos, instvel por 24 horas, fotossensvel e voltil, alm de ser corrosivo para metais. Apresenta-se na forma lquida (ex: Hipoclorito de sdio) e na forma

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slida (ex: Hipoclorito de Clcio), e o tempo de exposio dos materiais a estes compostos de aproximadamente 10 minutos. - lcoois (Etlicos e Isoproplicos): o mecanismo de ao se d atravs da desnaturao de protenas. So usados em concentrao de 70% peso/peso por 10 minutos, para a desinfeco de superfcies. O uso destas substncias contra-indicado para materiais mdico-cirrgicos, borracha, plstico e acrlico. - Fenlicos: o mecanismo de ao se d atravs do rompimento da parede celular, precipitando protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. A concentrao para uso de 0,4-5% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. O uso indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos nocrticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido toxicidade (hiperbilirrubinemia crianas berrios), e ao residual em materiais porosos. - Iodforos: A ao se d atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. a) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel

lcoois Compostos Clorados Fenlicos: em concentrao menor que 5%

Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm Compostos de Amnio Quaternrio: age atravs da inativao de enzimas, desnaturao de protenas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentrao para uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies) - Detergentes: so agentes tensoativos, com ao detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de Amnio), Aninicos (p. ex. sabes, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase e lpases, e, portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras (ex: Endozime)
Quadro 1 - Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia
Agente lcoois (7080%) Espectro de ao* Gram-positivas Gram-negativas BAAR** Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas Uso Antisspticos Desinfectantes Modo de ao Desnaturao protica dissoluo de lipdeos Desnaturao protica Alterao da membrana Tempo de exposio Curto (10-15 min) Desvantagens Pouco ativo contra esporos Fenol puro corrosivo e de odor desagradvel No age sobre BAAR e esporos

Fenis Compostos Quaternrios

Desinfectantes Antisspticos Sanitizantes

Efeito imediato Curto (10-30 min)

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de amnio

Desinfectantes (instrumentos cirrgicos) Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas Tratamento da gua Antisspticos Desinfectantes Antisspticos Desinfectantes Desinfectantes (instrumentos e superfcies) Antisspticos

celular bacteriana Inativao enzimtica agente oxidante Inativao enzimtica Inativao enzimtica Desnaturao protica agente alquilante Inativao enzimtica Efeito imediato Efeito imediato Efeito imediato Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos) S agem enquanto em contato Odor irritante pouco ativo contra esporos Odor irritante pouco ativo contra esporos Pouco ativo contra esporos Tempo de exposio longo No atuam sobre BAAR e esporos

Cloro

Iodo

Iodforos

Aldedos***

Metais pesados

Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. *- Formas vegetativas; **- Bacilos lcool-cido resistentes; ***- Ativos contra esporos

2.3.

ESTERILIZAO:

A esterilizao o processo que inativa todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto o mtodo indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminao. A melhor maneira de garantirmos a destruio de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infeces em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas prximas a do corpo, ou seja, 37C. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, so destrudos; o que no acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e no destrudo. Alguns microrganismos produzem esporos, que so formas de resistncia, podendo permanecer inativos por longos perodos e depois voltar ao estgio inicial de infectividade. Portanto, as tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. Tipos de esterilizao:

2.3.1. Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)

Este tipo de esterilizao realizado a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos microrganismos.

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A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, porm como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco necessrio. indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. Para ser eficiente, este processo depende de: Aquecimento da estufa at a temperatura desejada antes da colocao do material. Os materiais devem estar rigorosamente limpos, secos e adequadamente embalados. A colocao do material deve permitir a circulao do ar, portanto a estufa no pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distncia de 2 cm entre as caixas. O tempo de esterilizao deve ser contado apenas aps a colocao do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura normalizou, pois quando a estufa aberta a temperatura diminui um pouco.

2.3.2. Esterilizao por Calor mido

O calor mido pode ser utilizado para destruir microorganismos presentes em materiais atravs das formas de: vapor dgua, gua fervente e gua aquecida abaixo de seu ponto de ebulio. a) gua fervente a gua levada ao ponto de ebulio: 100C, este procedimento destri os microrganismos vegetativos presentes no meio lquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com segurana, pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100C por mais de 1 hora. b) Vapor dgua O vapor dgua sob presso a forma mais prtica e segura de aplicao do calor mido. O equipamento destinado para este fim a AUTOCLAVE. mais eficiente na destruio de microorganismos e esporos que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos microrganismos, e por este motivo mais rpido. A autoclave funciona da seguinte forma: 1- A cmara de parede dupla da autoclave lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor dgua, porque se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave usualmente operada a uma presso de 15 lb./pol , na qual a temperatura do vapor de 121C.
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A eficincia do processo de esterilizao por meio de uma auto-clave depende de alguns fatores: Os materiais devem estar limpos, secos e adequadamente embalados antes do processo. O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121C atingida. A distribuio do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. Se o material sair mido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.

2.3.3. Controle da Esterilizao

imprescindvel o controle de qualidade nos processos de esterilizao. Como se trata de um processo que inclui diversas variveis (tempo, temperatura, limpeza prvia, conhecimento da pessoa responsvel pelo processo, etc), se qualquer destas variveis for negligenciada, o processo no ser efetivo e o risco de contaminao eminente. O controle deve ser realizado atravs de mtodos qumicos e bacteriolgicos. Os mtodos qumicos utilizam uma fita especial que mostra, atravs da mudana de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os mtodos bacteriolgicos utilizam a bactria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Adicionalmente, deve ser colocada uma amostra controle, apenas o meio de cultura sem ser inoculado, este deve sofrer os mesmos procedimentos que a amostra, se ao final houver crescimento microbiano, mesmo sem haver inoculao, indica falha no processo de limpeza e/ou esterilizao.

2.3.4. Consideraes importantes importante lembrar que necessria uma limpeza perfeita dos instrumentais
antes de serem submetidos esterilizao. A presena de matria orgnica (leo, gordura, pus, sangue, e outras secrees) protege o microrganismo da ao esterilizante. adequado lavar manualmente as vidrarias com detergente e gua morna antes da esterilizao. Depois de esterilizados, os materiais devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrrio, voltam a se contaminar com microrganismos presentes no ambiente. Estudos recentes mostram que os termmetros e termostatos embutidos na estufas no so confiveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termmetros calibrados de acordo com as especificaes do INMETRO. Se no for possvel, deve-se considerar que o termmetro de mercrio tem uma incerteza na medio da faixa de 5C a 10C.

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3. MICRORGANISMOS
As clulas so consideradas as unidades bsicas estruturais e funcionais de qualquer organismo. No caso de um organismo unicelular (constitudo por uma nica clula), todos os processos vitais ocorrem dentro de uma mesma e nica clula. Com o avano da microscopia eletrnica, na dcada de 1940, a estrutura celular interna pde ser observada com mais detalhes. Aps muitos estudos foi descoberto que as clulas poderiam ser divididas em duas categorias baseandose na estrutura nuclear da clula: Procariontes apresentam material nuclear sem membrana. Por exemplo: Reino Monera (bactrias). Eles normalmente obtm nutrientes somente por absoro e no podem ingerir alimentos ou realizar fotossntese Eucariontes tm um ncleo separado do citoplasma por uma membrana nuclear. Por exemplo: Reino Protista (algas, fungos, protozorios), Reino Plantae (plantas verdes fotossintticas e algas superiores) e Reino Animlia (animais) Na figura 2 abaixo, pode-se observar o desenho esquemtico das duas categorias celulares, observe que as clulas eucariticas so mais complexas e mais organizadas, por este motivo os animais mais evoludos, possuem clulas eucariticas.

Clula Procarionte

Clula Eucarionte

Figura 2 Comparao da organizao das organelas presentes nas clulas procariontes e eucarioantes.

Na rea de saneamento, os microorganismos tm uma grande importncia. Primeiro porque boa parte dos diversos tipos de tratamento dados aos esgotos biolgico, ou seja, grupos de microorganismos que se nutrem de matria orgnica so utilizados para degradar a matria orgnica presente no esgoto. Em segundo lugar, porque os esgotos cotem uma srie de microorganismos patognicos, isto , queles que podem causar doenas aos homens e demais animais, e por isso precisam ser removidos ou inativados antes que o esgoto seja lanado no corpo receptor (rio, lagos, etc.).

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Usualmente, como parte de um monitoramento de um rio, de um reservatrio, de uma ETA (estao de tratamento de gua) ou ETE (estao de tratamento de esgoto), alguns microorganismos patognicos devem ser quantificados. No caso de um corpo de gua natural (rio, lagos, etc), a presena de microorganismos patognicos, indica que ocorreu despejo de material fecal e que aquele corpo dgua deve ter um uso restrito. O tipo de uso depender diretamente da quantidade de microorganismos presentes. J no caso de uma ETE, que recebe esgotos domsticos ricos em material fecal, j se sabe, at mesmo antes de se fazer uma anlise, que estes microorganismos estaro presentes. Contudo, importante se quantificar quanto entra e quanto sai de microorganismo numa ETE, pois s assim pode-se avaliar a eficincia de remoo de patgenos. Alm disto, a estao deve remover uma quantidade determinada de patgenos para que o esgoto tratado seja lanado no corpo receptor. Os corpos receptores so classificados pelo rgo ambiental de acordo com o uso que ser feito da sua gua. Por exemplo, um rio onde ser captada gua para abastecimento pblico deve ter uma qualidade melhor que outro apenas usado para navegao. Neste sentido, a legislao ambiental indica qual a qualidade do esgoto (comumente chamada de padro de lanamento), pode ser lanada em cada tipo de corpo receptor. A legislao pertinente, a nvel nacional a CONAMA 357. A quantificao de todos microrganismos patgenos extremamente difcil, pois cada espcie possui caractersticas particulares e nem sempre possvel simular as condies necessrias para desenvolv-las, ou diferenci-las em laboratrio. Alm disso a quantidade de patgenos presente no meio muito pequena para serem quantificadas mais grandes para causar doenas. Logo, escolhe-se uma espcie que represente todos os patgenos. Esta espcie chamada de bioindicador e segundo Von Sperling et al. (2003), precisa apresentar algumas relaes com os patgenos, tais como: Estar presentes em maiores concentraes; Possurem maior resistncia aos processos de tratamento; Ter os mecanismos de remoo iguais queles empregados para o patgeno; O ndice de decaimento deve ser menor ou igual; Podemos citar o grupo coliformes como um bioindicador. Eles so dividdos em totais, presentes em todos os ambientes, e termotolerantes, presentes em intestinos de animais de sangue quente. Ambos apresentam resistncia parecida com vrios microrganismos patgenos e indica a contaminao fecal. Outro bioindicador so os ovos de helmintos. Ao contrrio das bactrias que precisam de um grande nmero de unidades e dependem da imunidade de cada individuo para causar uma infeco, apenas um ovo de helminto causar uma doena. Outro fator que a maioria dos coliformes, e dos patgenos, no resistem muito tempo em meios aquticos limpos, mas os ovos podem permanecer por at 10 anos.

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4. MEIOS DE CULTIVO
Os meios de cultivo, tambm chamados meios de cultura, so complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos, ou seja, tentam reproduzir em laboratrio, s condies em que o microorganismo vive no ambiente. Para crescer, todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos qumicos como nutrientes. Estes elementos so necessrios tanto para a sntese como para as funes normais dos componentes celulares. Elas existem na natureza em uma grande variedade de compostos, que so inorgnicos e orgnicos. Como j dito anteriormente, quando os microrganismos so removidos do seu meio e cultivados em laboratrio, os microbiologistas utilizam meios que simulam ou at mesmo melhoram as condies naturais. Um dos fatores que devem ser observados o fornecimento de elementos qumicos essenciais. Os elementos qumicos principais para o crescimento das clulas incluem: Carbono um dos elementos qumicos mais importantes necessrio para o crescimento microbiano. Forma o esqueleto das trs maiores classes de nutrientes orgnicos: carboidratos, protenas e lipdeos. Estes compostos fornecem energia para o crescimento da clula e servem como unidade bsica do material celular. Alguns organismos obtm esses compostos absorvendo do meio, so chamados de heterotrficos. Outros organismos utilizam o dixido de carbono (CO2) do meio para produzir os compostos necessrios na obteno de energia, so chamados de autotrficos. Nitrognio Este elemento parte essencial dos aminocidos que juntos formam as protenas. O nitrognio pode ser assimilado direto da atmosfera (nitrognio gasoso), compostos inorgnicos (nitrito, nitrato ou sais de amnio), ou compostos orgnicos (aminocidos ou peptdeos). Enxofre necessrio para a sntese de aminocidos. Fsforo essencial para a sntese de cidos nuclicos e ATP (energia). Muitos outros elementos essenciais so requeridos, embora em menores quantidades do que os elementos citados acima como o sdio, ferro, zinco, cobre, mangans, molibdato e cobalto. Quatro condies principais influenciam o meio fsico de um microrganismo: Temperatura Este parmetro influencia as reaes qumicas das quais os processos de crescimento dependem. Cada grupo de bactrias tem uma faixa tima de crescimento. Em temperaturas mais favorveis para o crescimento o nmero de divises celulares por hora geralmente dobra com o aumento de 10oC. A temperatura na qual uma espcie de microrganismo cresce mais rapidamente considerada a temperatura tima de crescimento. pH Para viver em ambientes cidos ou bsicos os microrganismos deve ser capazes de manter o seu pH intracelular entorno de 7,5, no importando qual o valor de pH externo. Uma clula viva tem a habilidade, dentro dos limites prprios, de manter o pH interno constante pela expulso ou absoro de hidrognios. Cada tipo de espcie tem tolerncia uma faixa de pH. Atmosferas gasosas No habitat natural necessita de quantidades variadas de gases como oxignio, dixido de carbono, nitrognio de metano. Em

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laboratrio o ar apropriado deve estar presente de acordo com as necessidades metablicas dos microrganismos. - Microrganismos Aerbios requerem oxignio nas concentraes atmosfricas (21%). Se for limitada a concentrao de Oxignio no meio algumas culturas crescem lentamente. - Microrganismos anaerbios facultativos Tanto crescem na presena de oxignio utilizando-o em seus processos metablicos como em sua ausncia realizado processos fermentativos. - Microrganismos Anaerbios No utilizam o oxignio em seus processos metablicos e a sua presena no meio em baixas concentraes podem ser suportadas por algumas espcies, mas para os anaerbios estritos extremamente txica. - Microrganismos Microaerfios No resistem em ambientes quando a concentrao de Oxignio parecida com a atmosfrica (21%), apenas em ambientes com concentrao entorno de 1 a 15%. Presso osmticas a fora com a qual a gua se move atravs da membrana citoplasmtica de uma soluo contendo uma baixa concentrao de substncias dissolvidas (solutos) para outra contendo uma alta concentrao de solutos. Quando as clulas microbianas esto em um meio aquoso, no devem existir grandes diferenas na concentrao de solutos dentro e fora da clula, ou as clulas poderiam desidratar-se ou romper-se. CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTIVO: a) Quanto consistncia:

4.1.

Meios lquidos: so aqueles em que os nutrientes esto dissolvidos em uma

soluo aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvao. Meios semi-slidos: so aqueles que possuem na sua composio, alm dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacardeo proveniente de algas marinhas, chamado gar. So geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura possvel observar a motilidade bacteriana. Meios slidos: so aqueles que possuem uma porcentagem maior de gar (cerca de 15 g/litro de gua destilada), alm dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Atravs do meio slido em placas de Petri possvel, utilizando-se a tcnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colnias bacterianas e, portanto, o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. J a cultura em gar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obteno de uma biomassa de microrganismos. b) Quanto funo:

Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de

microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples. Meios de enriquecimento: so adicionadas ao meio simples substncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: gar sangue.

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Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados

microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adio de substncias inibidoras. Ex: gar Salmonella-Shigella. Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com caractersticas relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espcie de microrganismo. Ex: gar MacConkey. Meios de manuteno: so aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: gar Nutriente. c) Quanto natureza:

Meios animados: so constitudos de clulas vivas, como animais de

laboratrio, tecidos vivos Meios inanimados: no sintticos. Naturais so natureza, e o sinttico podemos obter meios de dos dois anteriores.

ou ovo embrionado. possuem clulas vivas. Podem ser naturais ou aqueles que possuem substncias provenientes da contm substncias obtidas em laboratrio. Ainda cultivo semi-sintticos, que so resultantes da unio

Os meios de cultivo so preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade at o momento de sua utilizao.

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4.2.

TCNICA DE SEMEADURA

A escolha da tcnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porm algumas regras devem ser seguidas nas inoculaes: A agulha e ala de nquel-cromo (tambm chamada de agulha e ala de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e aps qualquer cultivo. Tome cuidado de esfri-las antes da coleta. Os recipientes devem sempre ser abertos prximos chama do bico de Bunsen. Deve-se evitar ao mximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo. Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao mximo perfurar ou rasgar o gar, pois poder ocorrer acmulo de bactrias neste setor do meio alm de alterar as condies de crescimento bacteriano.

a) Tcnica I: Meio Lquido 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo e agite a ala.
Figura 3

b) Tcnica II: Meio semi-slido 1- Mergulhe a Agulha de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Faa uma injeo com a agulha carregada com bactrias no meio de cultivo semi-slido.
Figura 4

c) Tcnica III: Meio slido (gar inclinado) 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Encoste levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do gar.
Figura 5

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d) Tcnica IV: Meio slido (Placa de Petri tcnica do esgotamento) 1- Divida a Placa de Petri em trs partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa. 2- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 3- Faa estrias em cada diviso, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possvel toda a superfcie da placa.

Figura 6

Uma das caractersticas mais importantes de um microscpio no a sua capacidade de ampliao mas sim o poder de resoluo, isto a fineza de detalhes que o aparelho permite. O aumento por si s no permite obter uma imagem perfeita, e, conseqncia, entre outras razes, do fenmeno da difrao. O poder de resoluo de um sistema ptico a capacidade do aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos adjacentes

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5. MICROSCOPIA
Como o prprio nome sugere, microorganismos so seres microscpicos, ou seja s podem ser visualizados com o auxlio de um microscpio. A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactrias e atividades celulares como a motilidade bacteriana. A respeito da motilidade possvel observar dois movimentos: o movimento flagelar, que ativo e caracterstico de bactrias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual passivo e ocorre na direo das correntes lquidas que se formam nas preparaes.

5.1.

Unidades de medida utilizadas em microscopia

As dimenses das estruturas biolgicas podem agrupar-se em dois grupos, macroscpicas, isto , visveis ao olho humano, e microscpicas, isto , invisveis ao olho humano, tendo como fronteira o poder de resoluo do olho humano. As unidades de medida utilizadas em microscopia so o micrometro (m), para a microscopia ptica, e o nanmetro (m) e o Angstrom (), para a microscopia electronica. A sua relao com a unidade fundamental do sistema mtrico, o metro (m) e com o milmetro (mm) a seguinte: 1 m = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m 1 m = 10-3 m = 10-6 mm (0,000001 mm) = 10-9 m 1 = 10-1 m = 10-4 m = 10-7 mm (0,0000001 mm) = 10-10 m
Quadro 3 Desenho esquemtico para comparao do tamanho mdios das clulas

0,75 m 2,0 m 4,6 m bacterias esfricas Bactrias cilndricas Bactrias espirais (cocos) (bacilos) (vibries)

55 x 25 m Ovo de ascaris lumbricoides (helmintos)

50 x 25 m Ovo de Tricris (helmintos)

35 x 45 m Ovo de tenia (helmintos)

12 m Cisto de entamoeba (protozorio)

10 m Cisto de giardia (protozorio)

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Figura 7 Staphylococcus aureus

Figura 8 Bacillus

Figura 9 Vibrio cholerae

Figura 10 cisto de entamoeba coli

Figura 11 ovo de ascaris lumbricoides

5.2.

Microscopia ptica

Figura 12 Desenho esquemtico de um microscpio ptico

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O microscpio ptico constitudo por um sistema ptico e um mecnico. O sistema ptico compe-se de trs sistemas de lentes (ocular, objetivas e condensador) e uma fonte de luz. O sistema mecnico constitudo pela estrutura que suporta os elementos do sistema ptico, e inclui os elementos de focagem. A finalidade do condensador a de projetar um cone de luz uniforme sobre o objeto. Aps a passagem pelo objeto, o feixe penetra na objetiva. A objetiva projeta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que novamente a amplia. O olho v uma imagem virtual, ampliada e invertida do objeto. A ampliao total dada pela combinao de lentes do microscpio; igual ao produto das ampliaes individuais das objetivas e oculares. Assim, por exemplo, se a ampliao da objetiva 100 X e a ampliao da ocular de 10X, a ampliao total ser 1000 X. Os valores das ampliaes individuais so normalmente indicados nas lentes, pelo fabricante. Uma das caractersticas mais importantes de um microscpio no a sua capacidade de ampliao mas sim o poder de resoluo, isto a fineza de detalhe que o aparelho permite. O aumento por si s no permite obter uma imagem perfeita, em conseqncia, entre outras razes, do fenmeno da difrao. Utilizao da objetiva de imerso Esta objetiva usada com leo de imerso interposto entre a lamina de vidro e a objetiva. a objetiva que exige maiores cuidados na sua utilizao, pois foca muito prximo do material a observar.

5.3.

Cuidados a ter com o manuseamento do microscpio

Transport-lo com ambas as mos, apoiando a base numa delas e segurando

o brao com a outra. Ao coloc-lo sobre a mesa, mant-lo a alguma distncia do bordo. Evitar molh-lo ao usar preparaes temporrias. As lentes so peas muito caras. Para limp-las, deve usar a flanela que normalmente acompanha o aparelho. Aps a utilizao, encaixar a objectiva de menor ampliao alinhada com a ocular. Se durante a observao tiver utilizado leo de imerso, deve limpar a objectiva e a lamela com xilol ou eter.

5.4.

Focagem do objecto

Colocar a preparao na platina, fixando-a com o auxlio das pinas. Rodar o condensador para que fique ajustado janela da platina. Com o parafuso macromtrico, ajustar a platina para a posio mais prxima

da objectiva. Desc-la lentamente, de modo a obter a primeira imagem. Utilizando apenas o parafuso micromtrico, corrigir a focagem at obter uma imagem ntida.

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Percorrer a preparao a fim de localizar uma zona de maior interesse e

centr-la. Regular novamente a quantidade de luz com o diafragma, de modo a obter uma imagem mais perfeita.

5.5.

Colorao

As estruturas celulares apresentam um fraco contraste ptico, pelo que a sua

observao se torna muito difcil. Para ultrapassar este problema recorre-se colorao celular. Este processo vai permitir destacar algumas estruturas celulares por contraste com as restantes, na medida em que alguns componentes celulares tm a capacidade de absorver certos corantes, enquanto que outros no. Ao corante que responsvel pela colorao especfica de um organito, chama-se corante selectivo. Em citologia os corantes mais usados so orgnicos, podendo ser naturais ou artificiais. Os corantes naturais so extrados de animais ou plantas e so exemplos o carmim, a hematoxilina. Os corantes artificiais so sintetizados em laboratrio a partir de derivados da anilina e so exemplos a eosina, o azul de metileno, o vermelho neutro e o verde iodo. Os corantes artificiais podem ser cidos, bsicos ou neutros e esta caracterstica vai torn-los especficos para a colorao de determinadas estruturas celulares. A colorao das preparaes temporrias, tanto pode ser realizada antes como depois da montagem.

5.5.1. CLASSIFICAO DOS CORANTES PARA A MICROSCOPIA

PTICA a) Quanto natureza qumica:

cidos - Coram elementos bsicos da clula (acidfilos). Exemplos: Eosina,

cido smico e P-A-S- (Periodic Acid Schifft) Bsicos - Tingem as estruturas cidas da clula (basfilas). Exemplos: Hematoxilina, orcena, azul de metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana. Neutros - Efeito tintorial sobre as estruturas que no revelam acidofilia nem basofilia. Exemplo: Vermelho neutro. b) Quanto ao papel fisiolgico:

Vitais - Coram a clula sem determinar sua morte. Verde-janus B, azul de

metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III. No-Vitais Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina, cido smico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana. c) Quanto s propriedades tintoriais:

Ortocromticos - Conferem clula a mesma cor que apresentam in vtro.

Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.

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Metacromticos - Do clula colorao diferente da que apresentam in

vtro. Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

d) 4. Cromatofilia celular:

Membrana plasmtica - Tetrxido de smio (OsO4). Reticulo endoplasmtico - Tetrxido de smio. Ribossomos - Difenilamina, azul de toluidina. Matriz do hialoplasma - Reativo de Millon (reativo nitroso-mercrico). Ergastoplasma - Hematoxilina. (Ele considerado como a substncia basfila do citoplasma). Mitocndrias Verde-janus B, cido smico, hematoxilina frrica. Complexo de Golgi -Sais de prata. Centrossomo - Hematoxilina frrica. Vacolos - Vermelho neutro

e) Nuclolos:

Plasmossomos (nuclolos verdadeiros) - Verde de metil-pironina. (So

Feulgen negativo). Cariossomos (falsos nuclolos) - Hematoxilina, fucsina bsica. (So Feulgen positivo). Cromossomos - Feulgen positivo, P-A-S- negativo, hematoxilina, orcena e demais corantes bsicos.

5.5.2. TCNICAS DE COLORAO

Tcnica in vivo: Tirar com ajuda de uma pina, uma lmina limpa (desengordurada) e sem arranho, do deposito com lcool. Flambar a lmina, rapidamente, nos dois lados, cortando lentamente a chama do bico de Bunsen. Depositar na lmina, com auxlio de uma ala, pipeta ou basto, gotas de suspenso microbiana ou de amostra lquida. Recobrir com uma lamnula, evitando formao de bolhas de ar; Levar a preparao ao microscpio para focar, alterando as condies de iluminao e mudando gradativamente as objetivas a seco, para obter uma melhor observao. Tcnica in vitro: Esfregao da cultura bacteriana liquida: Flambe uma ala de platina, deixe esfriar, mantendo-a prximo a chama. Retire uma amostra da cultura com a ala e deposite no centro da gota da lmina.

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Espalhe o material com a ala em movimento circular, obtendo um esfregao

de forma oval, uniforme e fino. Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Esfregao de cultura bacteriana lquida: Flambe uma ala, deixa esfriar, mantendo-a prximo a chama. Retire uma gota da gua estril e deposite sobre a lmina. Flambe novamente a ala, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura slida. Leve a amostra at a gota de gua depositada sobre a lmina, e homogeneze com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino. Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Adio de Corantes: Cobrir o esfregao com algumas gotas de uma soluo corante. Deixar agir por 60 s. Descartar o corante e lavar em gua corrente, com o cuidado para no remover o esfregao. Secar cuidadosamente com papel absorvente. Observar no microscpio

Colorao de Gram A parede celular de bactrias Gram-positivas difere-se das bactrias Gramnegativas pela presena de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausncia de uma membrana externa. Esta diferena de constituio da parede celular a base da colorao de Gram, uma tcnica primordial no diagnstico microbiolgico, visto que atravs dela se definem caractersticas morfolgicas e tintoriais da bactria em pesquisa. A colorao de Gram consiste em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta, lugol, lcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal violeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere colorao roxa tanto pelas bactrias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adio de lcool-acetona, as bactrias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retm o complexo, permanecendo roxas. A adio de fuccina (ou safranina) no altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactrias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo lcool-acetona.

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Tcnica: Esfregao da cultura bacteriana lquida: Flambe uma ala, deixe esfriar, mantendo-a prximo a chama. Retire uma amostra da cultura com a ala e deposite no centro da lmina. Espalhe o material com a ala em movimento circular, obtendo um esfregao de forma oval, uniforme e fino. Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Esfregao de cultura bacteriana slida: Flambe uma ala, deixa esfriar, mantendo-a prximo a chama. Retire uma gota da gua estril e deposite sobre a lmina. Flambe novamente a ala, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura slida. Leve a amostra at a gota de gua depositada sobre a lmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino. Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Adio de Corantes: Coloque a lmina com o esfregao sobre um suporte. Cubra a lmina com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto. Lave a lmina em jato fraco de gua corrente, do lado contrrio ao esfregao. Cubra a lmina com lugol, deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lmina. Cubra a lmina com a soluo de lcool-acetona, verifique a descolorao que deve ocorrer em cerca de 20 segundos. Cubra a lmina com fuccina ou safranina, deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lmina. Seque inicialmente o lado da lmina oposto ao esfregao com papel toalha, e a seguir seque o restante da lmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse cortando a chama). Leve a lmina ao microscpio e observe em objetiva de imerso. (No esquea de colocar uma gota de leo para imerso sobre o esfregao)

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
TORTORA, G. J.; FUNKE B. R.;CASE C. L. Microbiologia.8 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005 PELCZAR M. J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicaes 2 ed. So Paulo: Makron Books, 1997 CHERNICHARO C. A. L. Ps-tratamento de Efluente de Reatores Anaerbios Aspectos metodolgicos 1 ed. Belo Horizonte, 2001

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