Estudio de Pretratamiento en Residuos Agrícolas

ESTUDIO DE PRETRATAMIENTO CON CIDO
DILUIDO Y LQUIDOS INICOS EN RESIDUOS

AGRCOLAS PARA LA PRODUCCIN DE
BIOETANOL DE SEGUNDA GENERACIN

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGSTER EN CIENCIAS DE LA INGENIERA
MENCIN QUMICA
Y
MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO CIVIL QUMICO

RICARDO MIGUEL PEZOA CONTE

PROFESORA GUA:
M. ELENA LIENQUEO CONTRERAS

MIEMBROS DE LA COMISIN:
ORIANA SALAZAR AGUIRRE
JUAN ASENJO DE LEUZE
ALEJANDRO GARCA MORA
CAROLINA SHENE DE VIDTS

SANTIAGO DE CHILE
MARZO 2010
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOTECNOLOGA

i

RESUMEN DE LA TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE
MAGISTER EN CIENCIAS DE LA INGENIERA, MENCIN
QUMICA E INGENIERA CIVIL QUMICA
POR: RICARDO PEZOA CONTE
FECHA EX. GRADO: 13/05/2010
PROF. GUA: SRA MARA ELENA LIENQUEO

ESTUDIO DE PRETRATAMIENTO CON CIDO DILUIDO Y LQUIDOS INICOS EN RESIDUOS
AGRCOLAS PARA LA PRODUCCIN DE BIOETANOL DE SEGUNDA GENERACIN

Los residuos agrcolas tienen un gran potencial para ser usados en la produccin de
biocombustibles. As, la presente investigacin tuvo por objetivo comparar distintos pretratamientos de
material lignocelulsico para la produccin de bioetanol. Para ello se utilizaron residuos de maz y trigo
desde cultivos locales, con tamaos de partcula entre 2,3 y 8,0 mm. Se probaron tres pretratamientos,
todos seguidos de una sacarificacin con enzimas celulolticas comerciales (Celluclast 1.5 y Novozyme
188, Novo Co.). El primero de los pretratamientos fue una hidrlisis cida diluida, llevada a cabo en
autoclave a 121 C por 30 y 60 min, y con cido sulfrico a concentraciones de 0,50, 0,75 y 1,00 % v/v,
con una carga de material de 5,0 % p/v. El segundo pretratamiento fue una hidrlisis cida, similar a la
anterior, seguida de una hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio 2,0 % p/v, llevada a cabo en autoclave a
121 C por 60 min. El ltimo pretratamiento se realiz con el lquido inico (LI) cloruro de 1-etil-3-
metilimidazolio ([EMIM
+
][Cl
-
]), a tres diferentes temperaturas de reaccin: 80, 121 y 150 C, por 30 y 60
min, con una carga de material de 5,0 % p/p.
Para los mejores resultados obtenidos con residuos de maz, se estima una produccin de 209 L de
etanol/Ton de residuo, fruto de la extraccin de un 57 % de los azcares tericamente disponibles en el
material, con un pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min a 150 C seguido de una hidrlisis
enzimtica, considerando un rendimiento de 0,42 g de etanol/g de azcar liberado. Por otra parte, para los
residuos de trigo se estima que la mayor produccin es de 242 L de etanol/Ton de residuo, fruto de la
extraccin de un 71 % de los azcares tericamente disponibles en el material, utilizando un
pretratamiento con 1,00 % v/v de H
2
SO
4
por 60 min en autoclave seguido de una hidrlisis enzimtica.
Los experimentos mostraron que a medida que se aument la concentracin de cido y el tiempo
en la hidrlisis cida, mayor fue la cantidad de azcares extrados, gracias a la hidrlisis de hemicelulosas
que determin mayor presencia de xilosa en el licor. En cambio, en el material pretratado con LI
([EMIM
+
][Cl
-
], 60 min y 150 C), un 4 y un 18 % del total de los azcares fueron liberados en el
pretratamiento, mientras que el 96 y 82% restantes fueron liberados en la sacarificacin, para residuos de
maz y trigo, respectivamente. Adicionalmente, se encontr que a medida que se aument la temperatura
en el pretratamiento la cantidad de azcares liberados en la sacarificacin aument considerablemente,
mientras que se encontraron diferencias significativas cuando se aument en 30 min el tiempo de
pretratamiento, pudiendo liberar entre 40 y 27 % ms de azcares, para residuos de maz y trigo
respectivamente.
Se realiz un modelo cintico de la sacarificacin enzimtica de tipo exponencial, donde el
trmino pre-exponencial se model con un polinomio de segundo grado para el pretratamiento cido y con
un modelo logstico para el pretratamiento con LIs. Acorde con estos modelos, se obtuvo mejoras en los
tiempos de hidrlisis enzimtica, logrando liberar en 23 y 14 h un 95 % de los azcares totales liberados
con un pretratamiento con LI y otro con cido diluido seguido de uno alcalino, respectivamente. Este nivel
de aceleracin del pretratamiento alcalino y del con LI, respecto al pretratamiento cido se explica por los
niveles de disrupcin de lignina, donde para el pretratamiento alcalino en particular se encontr una alta
solubilizacin de lignina.
Finalmente, se recomienda seguir esta investigacin con el propsito de analizar qu pasa en el
material cuando se realiza cada pretratamiento, observando cmo se ve afectada la celulosa y lignina
principalmente. La mayor tasa de liberacin de azcares por el pretratamiento alcalino podra permitir la
utilizacin de menor cantidad de carga enzimtica en la sacarificacin, mientras que la utilizacin de otros
LIs como el [EMIM+][HSO3-] podra ayudar en la mayor extraccin de lignina en el pretratamiento,
gracias al uso de aniones sulfatados.
ii

iii

AGRADECIMIENTOS

Al finalizar este largo proceso de estudios no me queda ms que agradecer a la gran cantidad de
personas que, aunque sea con un pequeo granito de arena, me han ayudado durante este todo este tiempo.

En primer lugar quisiera agradecer a mis padres, quienes me han apoyado de forma incondicional
desde el inicio de mis estudios, desde el jardn, pasando por el colegio y por los difciles momentos de los
primeros aos en la universidad. Mencin importante tambin merece mi hermana, Natalia, donde tanto su
ayuda como la de mis padres han sido fundamentales para llegar a este momento.

Tambin deseo agradecer a mi familia entera, mis abuelos, tos y primos que siempre se han
preocupado de mi formacin durante estos aos. Junto con ello agradecer a mis cuatro grandes amigos del
colegio: Gerardo, Felipe y Renn gracias por los grandes momentos vividos!!!

Como no referirme a mis amigos de 1er ao, Paula, Andrs, Carlos, Leo, Gustavo, Marcelo,
Hernn y Natalia, con quienes pasamos tantas cosas ese primer ao, y que sin duda fueron un soporte
fundamental para seguir adelante. Agradezco tambin a Sonia, quien ha sido la persona que me ha hecho
ms rer durante este tiempo, sus chistes y comentarios siempre fueron una distraccin de las
preocupaciones acadmicas. Mis otros amigos, Daniel, Catalina, Maricelle, Maurice, Nonoy, Igor y tantos
otros, quienes tambin han sido sper importantes.

Mencin importante merece Victoria, mi compaera de viaje a Finlandia. Nunca olvidar todas las
peripecias vividas, el hielo fins y los paseos por sus alrededores. sencillamente inolvidable. Tampoco
puedo dejar de agradecer a Sari, por su infinita ayuda en Turku, su total disposicin a ayudar en el pas
nrdico, y as haciendo ms placentera nuestra estada. Tambin agradezco a Pia, Victor, Pasi y a los prof
M. Reunanen, D. Murzin y JP. Mikkola y a tantos otros que seguramente olvido mencionar.

De forma muy especial tambin deseo agradecer a la prof. M.E. Lienqueo por su gran ayuda en
este trabajo y al prof. Alejandro Garca, por su colaboracin y consejos sobre Finlandia. Tambin
agradecer a Nancy del laboratorio, y junto con ella a todo el personal administrativo del DIQBT, en
especial a Gina y Erika.

Finalmente agradecer al Programa de Investigacin Domeyko de la Universidad de Chile, del
Institute for Cell Dynamics and Biotechnology (ICDB), y la Comisin Nacional de Investigacin
Cientfica y Tecnolgica del Gobierno de Chile (CONICYT), por medio de su Programa Bicentenario
CONICYT-AKA, Chile - Finlandia CCF-05.
iv

NDICE TEMTICO

CAPTULO I: INTRODUCCIN Y MARCO TERICO................................................................ 1
1. INTRODUCCIN ............................................................................................................................ 1
2. MARCO TERICO ........................................................................................................................ 5
2.1. BIOETANOL ............................................................................................................................ 5
2.1.1. Proceso de produccin de bioetanol ..................................................................................... 5
2.1.1.1. A partir de azcares simples .............................................................................................. 5
2.1.1.2. A partir de almidn ............................................................................................................ 6
2.1.1.3. A partir de la holocelulosa ................................................................................................. 6
2.1.2. Etanol como biocombustible ................................................................................................. 7
2.2. ESTRUCTURAS PRESENTES EN LOS MATERIALES LIGNOCELULSICOS ....... 7
2.2.1. Macro estructuras de la materia vegetal ............................................................................... 8
2.2.1.1. Celulosa ............................................................................................................................ 10
2.2.1.2. Hemicelulosa .................................................................................................................... 11
2.2.1.3. Lignina ............................................................................................................................. 13
2.3. PRETRATAMIENTOS DE MATERIALES LIGNOCELULSICOS ............................ 14
2.3.1. Pretratamientos fsicos ........................................................................................................ 15
2.3.1.1. Destruccin mecnica ...................................................................................................... 15
2.3.2. Pretratamientos fsico-qumicos ......................................................................................... 16
2.3.3. Pretratamientos qumicos .................................................................................................... 16
2.3.3.1. Pretratamiento cido ........................................................................................................ 16
2.3.3.1.1. cido Concentrado ....................................................................................................... 16
2.3.3.1.2. cido Diluido ............................................................................................................... 16
2.3.3.2. Pretratamiento alcalino ................................................................................................... 20
2.4. HIDRLISIS ENZIMTICA ............................................................................................... 21
2.4.1. Tipos de enzimas y mecanismos ........................................................................................ 21
2.4.1.1. Endoglucanasas ............................................................................................................... 21
2.4.1.2. Exoglucanasas .................................................................................................................. 21
2.4.1.3. Celobiasas ........................................................................................................................ 22
2.4.2. Microorganismos que producen celulasas ....................................................................... 22
2.4.3. Condiciones de sacarificacin de la celulosa .................................................................... 23
2.5. LQUIDOS INICOS (LI) .................................................................................................... 23
2.5.1. Propiedades y usos ............................................................................................................. 23
2.5.2. Disolucin de celulosa ........................................................................................................ 24
2.5.3. Lquidos inicos como pretratamiento de material lignocelulsico ............................... 26
2.5.3.1. Residuos de maz .............................................................................................................. 27
v

2.5.3.2. Residuos de trigo .............................................................................................................. 28
2.6. FERMENTACIN ................................................................................................................. 29
2.7. BIOREFINERA .................................................................................................................... 29
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 32
3.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................ 32
3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................................... 32
4. JUSTIFICACIN DEL PROYECTO ......................................................................................... 33
CAPTULO II: METODOLOGA ...................................................................................................... 34
1. SELECCIN Y PREPARACIN DEL MATERIAL ................................................................ 34
2. PRETRATAMIENTO CIDO ..................................................................................................... 35
2.1. HIDRLISIS CIDA ............................................................................................................ 35
2.2. HIDRLISIS ALCALINA .................................................................................................... 36
2.3. HIDRLISIS ENZIMTICA ............................................................................................... 36
3. PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS .................................................................. 37
3.1. LQUIDOS INICOS UTILIZADOS...................................................................................... 37
3.1.1. [EMIM
+
][Cl
-
] ........................................................................................................................... 38
3.1.2. [Aliquat
+
][OH
-
] ........................................................................................................................ 38
3.2. CONDICIONES DE PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS .......................... 39
3.2.1. [EMIM
+
][Cl
-
] ........................................................................................................................... 39
3.2.2. [Aliquat
+
][OH
-
] ........................................................................................................................ 39
3.3. HIDRLISIS ENZIMTICA ................................................................................................... 39
CAPTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................................................... 42
1. COMPOSICIN DE LOS RESIDUOS ....................................................................................... 42
2. COMPARACIN DE MTODOS DE MEDICIN DE AZCARES .................................... 42
3. EFECTO DE LA PRESENCIA DE CIDO Y TEMPERATURA EN EL
PRETRATAMIENTO EN LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL ......................................... 47
4. EFECTO DE LA CONCENTRACIN Y TIEMPO DEL PRETRATAMIENTO DE CIDO
DILUIDO ................................................................................................................................................ 48
4.1. HIDRLISIS CIDA DILUIDA DE RESIDUOS DE MAZ ........................................... 48
4.2. HIDRLISIS CIDA DILUIDA DE RESIDUOS DE TRIGO ......................................... 53
4.3. EFECTO DE LA ADICIN DE UN PRETRATAMIENTO ALCALINO SEGUIDO A
UNO CON CIDO DILUIDO EN LA SACARIFICACIN DE AMBOS RESIDUOS............. 58
4.4. CINTICA DE HIDRLISIS ENZIMTICA DE RESIDUOS PRETRATADOS CON
CIDO DILUIDO ............................................................................................................................. 61
4.4.1. Residuos de maz ................................................................................................................. 62
4.4.2. Residuos de trigo ................................................................................................................. 66
5. PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS .................................................................. 69
5.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE PRETRATAMIENTO EN LA
SACARIFICACIN DEL MATERIAL ......................................................................................... 70
vi

5.2. EFECTO DEL TIEMPO DEL PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS EN
LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL ................................................................................... 74
5.3. EFECTO DEL TIPO DE LQUIDO INICO UTILIZADO EN EL
PRETRATAMIENTO EN LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL ..................................... 75
LQUIDOS INICOS ....................................................................................................................... 78
6. ASPECTOS GENERALES DE LOS PRETRATAMIENTOS PRACTICADOS .................... 85
CAPTULO IV: CONCLUSIONES ..................................................................................................... 89
BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................................ 92
ANEXOS ................................................................................................................................................... 100
Anexo A: Pretratamientos de material lignocelulsico .......................................................................... 100
Anexo B: Metodologas de conversin de lignina en productos de valor agregado .............................. 106
Anexo C: Compuestos derivados del levoglucosano ............................................................................. 107
Anexo D: Metodologas de conversin de lignina en productos de valor agregado .............................. 109
Anexo E: Diagrama de metodologa experimental de pretratamientos cido y bsico diluidos ............ 111
Anexo F: Diagrama de metodologa experimental para pretratamiento con lquidos inicos ............... 112
Anexo G: Reactivo DNS ........................................................................................................................ 113
Anexo H: Actividad enzimtica ............................................................................................................. 114
Anexo J: Reaccin de sililacin ............................................................................................................. 121
Anexo K: Estudio estadstico ................................................................................................................. 122
Anexo L: Ejemplo de clculo rendimientos...127
Anexo M: Figuras de sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 30
y/o 60 min .............................................................................................................................................. 127
Anexo N: Valores de absorbancias DNS/kit comerciales y reas GC para clculo de azcares liberados
en cada etapa .......................................................................................................................................... 129
Anexo : Tiempos de elucin y reas de azcares en GC .................................................................... 146

vii

NDICE DE TABLAS

Tabla I-1: Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina de materiales lignocelulsicos [6] ...................... .2
Tabla I-2: Mtodos de pretratamientos de material lignocelulsico ............................................................ 13
Tabla I-3: Consumos de energa para reduccin de tamao en materiales lignocelulsicos ....................... 14
Tabla I-4: Niveles de azcares liberados para residuos de trigo con pretratamiento de cido diluido a 121
C por 1 hora, antes y despus del tratamiento enzimtico [11] .................................................................. 18
Tabla I-5: Composiciones msicas en las distintas etapas de pretratamientos de granos (BSG) para su
posterior sacarificacin enzimtica [48]....................................................................................................... 20
Tabla I-6: Conversin de residuos de maz pretratados con [BMIM
+
][Cl
-
] a distintos tiempos y
temperaturas [24] ......................................................................................................................................... 27
Tabla I-7: Niveles de azcares reductores liberados despus de 12 horas de hidrlisis enzimtica de
residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][DEtPO
4
-
] por 60 min a distintas temperaturas ........................ 28
Tabla III-1: Composicin de macroestructuras y otras sustancias de los residuos de maz y trigo ............. 41
Tabla III-2: Valores de estadstico t en cada prueba realizada con un nivel de confianza del 95 % ........ 46
Tabla III-3: Nivel de azcares reductores para pretratamientos control ...................................................... 48
Tabla III-4: Resultados del test estadstico practicado a los residuos de maz a nivel de cantidad de
azcares reductores totales, liberados en distintos tiempos y concentraciones de cido sulfrico ............. 50
Tabla III-5: Niveles de azcares reductores obtenidos para cada etapa de procesamiento de residuos de
maz con pretratamiento de cido diluido .................................................................................................... 50
Tabla III-6: Nivel de lignina solubilizada en pretratamiento de cido diluido para residuos de maz ......... 50
Tabla III-7: Niveles de xilosa y glucosa liberados en pretratamiento de cido diluido e hidrlisis
enzimtica para residuos de maz pretratados con cido sulfrico 1,00 % v/v por 30 min .......................... 51
Tabla III-8: Niveles de azcares reductores obtenidos en cada etapa de procesamiento de residuos de trigo
con pretratamiento cido .............................................................................................................................. 53
Tabla III-9: Resultados del test estadstico aplicado a los residuos de trigo para cantidad de azcares
reductores totales liberados en distintos tiempos y con diferentes concentraciones de cido sulfrico....... 54
Tabla III-10: Niveles de xilosa y glucosa liberados en pretratamiento con cido diluido e hidrlisis
enzimtica para residuos de trigo pretratados con cido sulfrico 1,00 % v/v por 60 min .......................... 57
Tabla III-11: Niveles de lignina solubilizada en pretratamiento cido para residuos de trigo ..................... 57
Tabla III-12: Niveles de lignina y azcares reductores solubilizados en pretratamiento bsico con NaOH
2,0 % p/v, a 121 C por 60 min .................................................................................................................... 58
Tabla III-13: Niveles de glucosa y xilosa liberados en las distintas etapas de la hidrlisis de material
lignocelulsico. ............................................................................................................................................ 60
viii

Tabla III-14: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido
sulfrico y base diluida ................................................................................................................................ 62
Tabla III-15: Condiciones de pretratamiento cido diluido que permiten maximizar la cantidad de azcares
reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de maz, segn modelo planteado.................. 64
Tabla III-16: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido
sulfrico y base diluida ................................................................................................................................ 67
Tabla III-17: Condiciones de pretratamiento cido diluido que permiten maximizar la cantidad de azcares
reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo, segn modelo planteado .................. 69
Tabla III-18: Resultado estudio estadstico a nivel de azcares totales liberados en la sacarificacin de
residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min ...................... 70
Tabla III-19: Niveles de glucosa y xilosa liberados en las distintas etapas del pretratamiento de residuos
agrcolas con [EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60 min ........................................................................................ 71
Tabla III-20: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz y trigo pretratados con
[EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas y por distintos tiempos ................................................................... 80
Tabla III-21: Tiempos de hidrlisis enzimtica de obtencin del 95 % de azcares reductores mximos
liberados segn modelos cinticos para los mejores pretratamientos practicados para residuos de maz y
trigo .............................................................................................................................................................. 80
Tabla III-22: Parmetros de expresin de Arrhenius para [AzRed]
mx
en la hidrlisis enzimtica de
+
][Cl
-
] por 60 min entre 80 y 150 C ............................... 82
Tabla III-23: Estimacin del etanol producido por gramo de material seco a pretratar para residuos de
maz y trigo procesados con distintos solventes en relacin a la cantidad de azcares reductores obtenidos
...................................................................................................................................................................... 84
Tabla A 1: Prdida de componentes estructurales a las cuatro semanas de tratamiento con hongos de
pudricin blanca con tallos de bamb como sustrato [84] ......................................................................... 105
Tabla H 1: Nomenclatura soluciones de ensayo ........................................................................................ 114
Tabla H 2: Soluciones de ensayo de enzimas............................................................................................. 114
Tabla H 3: Soluciones de glucosa para calibracin .................................................................................... 115
Tabla H 4: Absobancias a 540 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento cido diluido ....... 115
Tabla H 5: Absobancias a 540 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento LI ........................ 116
Tabla H 6: Nomenclatura ensayos de actividad de celobiasa..................................................................... 117
Tabla H 7: Soluciones de ensayo de actividad celobiasa ........................................................................... 118
Tabla H 8: Absorbancias a 500 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento cido diluido ..... 118
Tabla H 9: Absorbancias a 500 nm ............................................................................................................ 120
Tabla K 1: Tabla de distribucin t-student ................................................................................................. 122
ix

Tabla K 2: Estadstico t y grados de libertad f para pruebas de validacin de metodologas de medicin
de azcares ................................................................................................................................................. 123
Tabla K 3: Tabla de estadstico t y grados de libertad f para residuos de maz pretratados con cido
sulfrico...................................................................................................................................................... 123
sulfrico.................................................................................................................................................... 1254
Tabla K 5: Nomenclatura de tags en anlisis estadstico125
Tabla N 1: Valores de absorbancias medidos en los licores hidrolizados en los distintos pretratamientos de
cido diluido, para residuos de maz y trigo ............................................................................................... 130
Tabla N 2: Valores de absorbancias medidos en los licores hidrolizados en los distintos pretratamientos
alcalinos, para residuos de maz y trigo ..................................................................................................... 131
Tabla N 3: Valores de absorbancias medidos en el licor de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz y
trigo pretratados con cido diluido ............................................................................................................. 131
Tabla N 4: Valores de absorbancias medidos en el licor de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz y
trigo pretratados con cido diluido y alcalino ............................................................................................ 136
Tabla N 5: Valores de absorbancias registrados para residuos de maz y trigo pretratados con cido diluido
en autoclave a las condiciones especificadas ............................................................................................. 137
Tabla N 6: Valores de absorbancias registrados en la hidrlisis enzimtica para residuos de maz y trigo
pretratados con cido diluido en autoclave a las condiciones especificadas .............................................. 138
Tabla N 7: Valores de absorbancias registrados en la hidrlisis enzimtica para residuos de maz y trigo
pretratados con cido diluido en autoclave a las condiciones especificadas y pret alcalino ...................... 138
Tabla N 8: Valores de absorbancias registrados en el pretratamiento de residuos de maz y trigo
pretratados [EMIM][Cl] a 150 C por 60 min ............................................................................................ 138
Tabla N 9: Valores de absorbancias registrados para la medicin de lignina en el pretratamiento de
residuos de maz y trigo con cido diluido y alcalino ................................................................................ 139
Tabla N 10: Nomenclatura de ensayos R y S para pretratamiento alcalino adicional ................................ 140
Tabla N 11: Valores de reas registrados por GC para la medicin de monosacridos a las 72 h de
sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a 80 C por 60 min y para
residuos sin pretratar .................................................................................................................................. 141
+
][Cl
-
] a 121 y 150 C por 60
min..........................................................................................................................................................142
Tabla N 13: Valores de reas registrados por GC para la medicin de monosacridos a las 6 y 24 h de
+
][Cl
-
] a 150 C por 60
min..141
x

sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados con [Aliquat
+
][OH
-
] y sin solventes a 150 C por 60
min..142
Tabla N 15: Nomenclatura de tags utilizados142

xi

NDICE DE FIGURAS

Figura I-1: Diagramas de bloques de produccin de etanol a partir de distintas materias primas ................. 5
Figura I-2: Emisiones de gases de efecto invernadero de acuerdo a fuente de energa ................................. 8
Figura I-3: Componentes estructurales de las lignocelulosas ........................................................................ 9
Figura I-4: Disposicin de las macromolculas dentro de la pared celular de los vegetales [35] .................. 9
Figura I-5: Estructura hebra de celulosa con "n" molculas de glucosa ..................................................... .10
Figura I-6: Estructura de la celulosa (tipo II) ............................................................................................... 11
Figura I-7: Estructura de la celobiosa .......................................................................................................... 11
Figura I-8: Unidades estructurales presentes en hemicelulosa ..................................................................... 12
Figura I-9: Estructura de arbino-xilooligosacrido de hemicelulosa de paja de trigo .................................. 12
Figura I-10: Unidades y monmeros bsicos de la lignina .......................................................................... 13
Figura I-11: Estructura lignina-fenlica-carbohidrato en tejidos vegetales ................................................. 14
Figura I-12: Diagrama de un pretratamiento para material lignocelulsico ................................................. 15
Figura I-13: Descomposicin de glucosa y xilosa en furfural y HMF ......................................................... 17
Figura I-14: Unin directa entre arabinoxilano y matriz de lignina ............................................................. 18
Figura I-15: Niveles de azcares liberados despus de la hidrlisis enzimtica para residuos de maz
previamente tratados a 121 C con cido sulfrico a distintas concentraciones y tiempos,......................... 19
Figura I-16: Hidrlisis enzimtica de la celulosa ......................................................................................... 22
Figura I-17: Puentes de hidrgeno en estructura de [EMIM
+
][Cl
-
] .............................................................. 24
Figura I-18: Hidrlisis enzimtica de avicel pretratado con [BMIM
+
][Cl
-
] a 130 C por 10 min ............... 25
Figura I-19: Puentes de hidrgeno entre fibras de celulosa y [EMIM
+
][Cl
-
] ............................................... 26
Figura I-20: Diagrama de una biorefinera de biomasa y/o almidn............................................................ 31
Figura II-1: Liofilizador Alpha 1-4 LDplus, Christ ...................................................................................... 34
Figura II-2: Esquema del montaje experimental para hidrlisis cida ......................................................... 35
Figura II-3: Esquema del montaje experimental de la hidrlisis enzimtica ............................................... 37
Figura II-4: Montaje experimental de pretratamiento con lquidos inicos ................................................. 38
Figura II-5: Montaje experimental de hidrlisis enzimtica de material pretratado con lquidos inicos ... 38
Figura III-1: Azcares producidos por hidrlisis enzimtica de residuos de maz ...................................... 43
Figura III-2: Azcares producidos por la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo ................................... 44
Figura III-3: Composicin de hidrolizado de residuos de maz sin pretratamiento ledo en GC ................. 44
Figura III-4: Composicin de hidrolizado de residuos de trigo sin pretratamiento ledo en GC ................. 45
Figura III-5: Azcares reductores totales obtenidos para desechos de maz con pretratamiento cido,
seguido de una hidrlisis enzimtica analizados con DNS .......................................................................... 49
xii

Figura III-6: Azcares reductores totales obtenidos para desechos de trigo con pretratamiento cido,
seguido de una hidrlisis enzimtica analizados con DNS .......................................................................... 53
Figura III-7: Residuos de maz y trigo ......................................................................................................... 56
Figura III-8: Diagrama de una biorefinera de residuos agrcolas con pretratamientos cidos y alcalinos..59
Figura III-9: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 30 min a 121 C, y otro con pretratamiento alcalino, medidos con DNS .... 62
Figura III-10: Niveles de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de maz
pretratados con cido sulfrico 0,50 1,00 % v/v, para 30 y 60 min segn modelo planteado .................. 65
Figura III-11: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 60 min a 121 C, y otro con pretratamiento alcalino, medidos con DNS .... 66
Figura III-12: Niveles de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo
pretratados con cido sulfrico 0,50 1,00 % v/v, para 30 y 60 min segn modelo planteado .................. 68
Figura III-13: Azcares liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con
[EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min, medidos con GC..69
Figura III-14: Azcares liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con
[EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min, medidos con GC..70
Figura III-15: Azcares liberados para residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
+
] a 150 C
por 30 y 60 min, medidos con GC ............................................................................................................... 73
Figura III-16: Azcares liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con distintos
solventes inicos a 150 C por 60 min, medidos con GC ............................................................................ 75
Figura III-17: Azcares liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con distintos
solventes inicos a 150 C por 60 min, medidos con GC ............................................................................ 75
Figura III-18: Diagrama de posibles procesos en produccin de bioetanol a partir de residuos agrcolas con
tecnologa de pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
] .......................................................................................... 76
Figura III-19: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a
distintas temperaturas por 30 y 60 min ........................................................................................................ 77
Figura III-20: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a
distintas temperaturas por 30 y 60 min ........................................................................................................ 78
Figura III-21: Rendimiento de azcares reductores liberados en HE respecto al total de azcares mximo
hidrolizable segn modelo cintico ajustado para cada pretratamiento de residuos de maz ....................... 81
Figura III-22: Rendimiento de azcares reductores liberados en HE respecto al total de azcares mximo
hidrolizable segn modelo cintico ajustado para cada pretratamiento de residuos de trigo ....................... 81
Figura III-23: Diagrama posible para el procesamiento de residuos de maz para la produccin de
bioetanol mediante pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
] ................................................................................. 87
xiii

Figura III-24: Diagrama posible para el procesamiento de residuos de trigo para la produccin de
bioetanol mediante pretratamiento con cido diluido y base diluida ........................................................... 88
Figura A 1: Esquema de planta piloto de explosin a vapor [92] .............................................................. 101
Figura A 2: Solventes orgnicos presentes en el pretratamiento ................................................................ 104
Figura B 1: Descomposicin de levoglucosano (anhidroglucosa) en diferentes compuestos [73] ............ 106
Figura C 1: alkilbenzenosulfonato de 1-etil-3-metilimidazolio [EMIM
+
][ABS
-
] ...................................... 107
Figura C 2: Ataque del lquido inico a la matriz de lignina (adaptado de [86]) ....................................... 108
Figura D 1: Degradacin de lignina por ataque en enlace ter en guaiacol y vanilina .............................. 110
Figura E 1: Metodologa experimental de pretratamientos cidos y bsicos diluidos ............................... 111
Figura F 1: Metodologa experimental de pretratamiento con lquidos inicos ......................................... 112
Figura H 1: Calibracin glucosa - DNS para ensayo de actividad ............................................................. 115
Figura H 2: Concentracin de enzima celulasa pret cido v/s glucosa liberada......................................... 116
Figura H 3: Concentracin de enzima celulasa pret LIs v/s glucosa liberada ............................................ 117
Figura H 4: Concentracin de enzima celobiasa pret cido v/s glucosa liberada....................................... 119
Figura H 5: Concentracin de enzima celobiasa pret LIs v/s glucosa liberada .......................................... 120
Figura J 1: Reaccin de sililacin .............................................................................................................. 121
Figura M 1: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 60 min a 121 C, medidos con DNS .......................................................... 128
Figura M 2: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 30 min a 121 C, medidos con DNS .......................................................... 128
Figura N 1: Calibracin ensayo DNS en glucosa ....................................................................................... 129
Figura 1: Cromatograma de sacarificacin enzimtica .......................................................................... 146
Figura 2: Cromatograma de microextraccin en fase slida de licor de sacarificacin para determinacin
de existencia de furfural, para residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min a 150 C....... 146

xiv

NDICE DE ECUACIONES

Ecuacin 1: Estadstico t y grados de libertad f para prueba de medias Test Welch, de varianzas distintas45
Ecuacin 2: Relacin entre glucosa medida por kit y medida por GC ......................................................... 46
Ecuacin 3: Relacin entre azcares totales medida por DNS y medida por GC ........................................ 46
Ecuacin 4: Modelo exponencial de sacarificacin enzimtica ................................................................... 62
Ecuacin 5: Modelo diferencial de sacarificacin enzimtica ..................................................................... 62
Ecuacin 6: Expresin para la liberacin de azcares reductores en la hidrlisis enzimtica de residuos de
maz pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 30 min ............................................. 64
maz pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 60 min ............................................. 64
trigo pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 30 min ............................................. 67
trigo pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 60 min ............................................. 68
Ecuacin 10: Expresin de modelo logstico para la cantidad de azcares mxima hidrolizable en la
hidrlisis enzimtica de material pretratado con [EMIM][Cl] por 60 min .................................................. 83
trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] entre 80 y 150 C por 60 min .............................................................. 84
maz pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] entre 80 y 150 C por 60 min .............................................................. 84
Ecuacin L 1: Clculo de rendimientos..126
Ecuacin N 1: Calibracin absorbancia DNS v/s glucosa ......................................................................... 129
Ecuacin N 2: Clculo cantidad de azcares reductores en pretratamiento cido en funcin de absorbancia
medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa ................................................................... 129
Ecuacin N 3: Clculo cantidad de azcares reductores en pretratamiento alcalino en funcin de
absorbancia medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa ............................................... 131
Ecuacin N 4: Clculo cantidad de azcares reductores en sacarificacin en funcin de absorbancia
medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa ................................................................... 131
Ecuacin N 5: Cantidad msica de xilosa en la muestra ............................................................................ 137
Ecuacin N 6: Cantidad msica de glucosa en la muestra ......................................................................... 137
Ecuacin N 7: Cantidad de lignina solubilizada en pretratamientos cido y alcalino...138

Ecuacin N 8: Expresin para el clculo de msico de monosacridos a travs de mediciones
GC...141

1

CAPTULO I: INTRODUCCIN Y MARCO TERICO

1. INTRODUCCIN

Segn estimaciones de la CNE
1
en Chile la demanda por combustibles en 2010 ser de 3,33
millones de m
3
, con un crecimiento anual del 2,5 % [1]. Esta informacin refleja el alto aumento de
consumo de gasolinas si se coteja con los casi 2 millones de m
3
que se demandaron en 1990 [2]. Otro
antecedente es la gran emisin de gases de efecto invernadero que hoy en da se generan por la utilizacin
de combustibles fsiles. As, ambos antecedentes dejan en evidencia la imperiosa necesidad del pas de
buscar nuevas fuentes de energa, que en principio sean renovables y que sus precios puedan ser
competitivos en el mercado de las gasolinas convencionales.

Bajo esta premisa ha nacido la idea de los biocombustibles (bioetanol, biodiesel y biogs), los
cuales se basan en ser producidos a partir de materias primas renovables, tales como maz, trigo, caa de
azcar, material proveniente de residuos de la industria forestal y agrcola, micro y macro algas, etc. [3].
Estos biocombustibles contribuiran a la expansin de la matriz energtica del pas hacia el uso de fuentes
de energa renovables, y a la vez disminuiran la emisin de gases de efecto invernadero debido al cierre
del ciclo de liberacin de CO
2
en su uso con plantaciones vegetales que absorben va fotosntesis este
compuesto [4].

As, fruto de la fermentacin de los azcares presentes en estas materias primas es posible obtener
etanol como biocombustible, el cual ya es utilizado en mezclas con gasolinas convencionales por distintos
pases, tales como Brasil, EE.UU y la Unin Europea [3]. Sin embargo, la obtencin de etanol de primera
generacin usando maz (Zea mays) y trigo (Triticum aestivum) podra sufrir ciertas dificultades, debido a
la poca cantidad de tierras disponibles para su cultivo y a la competencia con el mercado alimenticio
[5],[6].

De esta forma, es necesario visualizar otras materias primas que permitan producir bioetanol, sin
generar un tan alto impacto en mercados sensibles como el de los alimentos. La utilizacin de residuos de
la industria agrcola y material de origen forestal, llamados materiales lignocelulsicos, subsanara este
hecho. Los residuos agrcolas en particular, tales como los de trigo, hoy en da son simplemente quemados

1
CNE: Comisin Nacional de Energa
2

en los campos o utilizados como afrecho para animales [7]. En la misma lnea, los residuos de maz en
parte son utilizados como abono para futuras plantaciones de maz y tambin utilizados como alimento en
diferentes tipo de ganado [7].

A nivel mundial, la produccin de maz alcanza los 318 millones de toneladas por ao, tenindose
as una amplia fuente de residuos de maz para la produccin de bioetanol, mientras que 529 millones de
toneladas de residuos de trigo son producidas por ao [8]. En Chile, la produccin de trigo y maz en el
perodo 2007/08 alcanz las 1,2 y 1,4 millones de toneladas, respectivamente [9]. Considerando que para
maz y trigo se tienen rendimientos de residuos de 1,0 1,5 [kg/kg de maz] [10] y 1,3 1,4 [kg/ kg de
trigo] [11], se deduce la existencia de una fuente de gran abundancia para la produccin de
biocombustibles de segunda generacin a nivel nacional. Otra ventaja es la gran disminucin en la
emisin de gases de efecto invernadero, donde el uso de etanol proveniente de biomasa agrcola
(biocombustible de segunda generacin) en forma pura (E100, sin mezclas con gasolinas convencionales)
reducira en un 106 % la emisin de estos gases, y en mezclas de un 10 % (E10) se reduciran en un 7 %
[4],[12].

No obstante, estas fuentes lignocelulsicas, tal como su nombre lo dice, poseen lignina, el cual es
un polmero de difcil degradacin [6],[13]. As, para la conversin de estos materiales en azcares
fermentables, es necesario realizar pretratamientos que rompan la lignina para tener acceso a la celulosa y
a la hemicelulosa, para su posterior depolimerizacin en azcares con enzimas que hidrolizan estos
componentes estructurales [3],[6]. A continuacin se muestra una tabla con los distintos porcentajes de
polmeros que tienen ciertos materiales lignocelulsicos.

Tabla I-1: Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina de materiales lignocelulsicos [6]
Materiales Lignocelulsicos Celulosa ( %) Hemicelulosa ( %) Lignina ( %)
Maderas duras 40-55 24-40 18-25
Maderas blandas 45-50 25-35 25-35
Cscaras de nuez 25-30 25-30 30-40
Mazorcas de maz 45 35 15
Pastos 25-40 35-50 10-30
Papel 85-99 0 0-15
Paja de trigo 30 50 15
Hojas 15-20 80-85 0
Semillas de algodn 80-95 5-20 0
Papel de diario 40-55 25-40 18-30

3

Los pretratamientos para estos materiales se clasifican principalmente en fsicos, qumicos, fsico-
qumicos y biolgicos [6]. Todos ellos tienen por objetivo liberar las dos fuentes de azcares antes
sealadas, dado que se encuentran encapsuladas por la lignina. Los ms ampliamente investigados se han
realizado utilizando explosin con vapor y los tratamientos con cidos, debido a que con ellos se obtienen
altos ndices de recuperacin de celulosa y hemicelulosa, y un alto porcentaje de hidrlisis de este ltimo
en xilosa principalmente [3],[6]. En cambio, para la degradacin de celulosa, se hace necesario suministrar
enzimas que hidrolicen el polmero, para la obtencin de glucosa [6],[13].

Glucosa y xilosa son monosacridos que pueden ser fermentados a etanol por distintos
microorganismos, no obstante, an no existen microorganismos capaces de fermentar eficientemente
ambos compuestos a la vez [6]. La glucosa es una molcula compuesta por seis carbonos, la cual es
fermentada por una cantidad considerable de especies, dentro de las cuales destaca Saccharomyces
cerevisiae, la cual tiene altos rendimientos de produccin de etanol [15]. Sin embargo, S. cerevisiae es
incapaz de fermentar xilosas, la cual es una molcula compuesta por cinco carbonos [6]. De esta forma,
con el desarrollo de ingeniera gentica se han hecho mltiples investigaciones en bsqueda de
microorganismos que co-fermenten ambos azcares, desarrollndose especies recombinantes tales como
Zymomonas mobilis [15] o Saccharomyces spp. con genes de S. cerevisiae y Pichia stipitis [16], este
ltimo capaz de aadir una va metablica para la degradacin de xilosa .

Una alternativa de pretratamiento de material lignocelulsico que se est estudiando es el uso de
lquidos inicos. Estos lquidos son sales orgnicas, compuestos de un anin, generalmente halgeno, y un
catin orgnico. Ambas iones dan una alta especificidad a la molcula, teniendo la propiedad de
solubilizar una gran cantidad de sustancias y catalizar una gran variedad de reacciones [17],[18]. Los
lquidos inicos tienen temperaturas de fusin inferiores a los 100 C y presiones de vapor prcticamente
despreciables [19]. Algunas investigaciones han reportado altos ndices de solubilizacin de celulosa en
lquidos inicos [20],[21], con su consiguiente disminucin de cristalinidad y mejoras en los tiempos de
hidrlisis enzimtica [22],[23]. Otras investigaciones en tanto, ya han tratado material lignocelulsico
como pretratamiento para la hidrlisis enzimtica [24], y otras investigaciones preliminares han probado
slo utilizar este tratamiento para la obtencin de azcares con catalizadores cidos, con el objetivo de
fermentarlos para obtener etanol como biocombustible, tarea que est an pendiente [26],[27].

El trabajo de esta tesis se enmarcar en el estudio de los pretratamientos de material
lignocelulsico, para su posterior sacarificacin con enzimas celulolticas, y as observar las mejoras en
los rendimientos de liberacin de azcares y junto con ello estimar la produccin de bioetanol a partir de
residuos de maz y trigo.
4

5

2. MARCO TERICO

2.1. BIOETANOL

El etanol es una cadena de 2 carbonos unidos por un enlace simple, donde uno de estos tiene
enlazado un grupo hidroxilo. El etanol es un producto de la fermentacin anaerbica de azcares como la
glucosa, por medio de microorganismos tales como S. cerevisiae, Z. mobilis y P. stipitis [3].

2.1.1. Proceso de produccin de bioetanol

El etanol, con fines energticos, puede ser producido utilizando azcares, cereales (almidn) o
biomasa (holocelulosa), donde cada una de estas fuentes de carbono contiene glucosa como molcula
fundamental [3],[28].

Figura I-1: Diagramas de bloques de produccin de etanol a partir de distintas materias primas [28]

2.1.1.1. A partir de azcares simples

Entre los primeros destaca la caa de azcar, fuente de azcares por medio de la cual se produce
etanol en Brasil, convirtindose en uno de los principales productores a nivel mundial de este
biocombustible. Los azcares presentes en la caa de azcar poseen frmula qumica C
12
H
22
O
11
, llamada
sacarosa, que es un disacrido de glucosa y fructosa, ambas unidas por un enlace glucosdico [3].

El proceso consta de una etapa de triturado y filtrado, donde se reduce la cristalinidad del
material, para luego ser fermentados directamente para la obtencin de etanol y su posterior destilacin
[28], como se muestra en la Figura I-1.

6

2.1.1.2. A partir de almidn

Otra materia prima posible es el uso de almidn, una cadena lineal de glucosas unidas por medio
de enlaces -1,4-glucosdicos. El almidn est presente en distintas fuentes vegetales, entre las que
predominan los cereales como el maz y el trigo. Los pretratamientos de estos materiales se dividen en
dos: molido en seco y molido hmedo [28].

En el primero de ellos el grano es remojado en agua a 50 C con pequeas cantidades de dixido
de azufre y cido lctico, lo cual ablanda el grano y libera el almidn. Luego el germen es separado debido
a que flota por su alto contenido de aceite, y posteriormente la fibra es separada. Finalmente, por un
proceso de centrifugacin, el gluten, de alto contenido proteico, es separado del almidn, para que ste
ltimo pueda ser fermentado por levaduras en etanol [28].

El proceso de molienda hmeda se inicia con una reduccin del tamao del grano por medio de un
sistema mecnico. La harina resultante es sometida a distintos tratamientos trmicos levemente cidos con
el objetivo de solubilizar el almidn, para luego ser sacarificados por enzimas -amilasas [3]. Los azcares
son fermentados por levaduras y el etanol es destilado. Los granos resultantes del proceso de destilacin
son llamados DDGS (Dried Destiller Grains of Solubles) y son vendidos en forma de pellets como
suplemento alimenticio de ganado [28].

2.1.1.3. A partir de la holocelulosa

La tercera forma de obtencin de bioetanol es a partir de biomasa, o lo que son llamados
materiales lignocelulsicos. En ellos, la fuente fundamental de azcares son celulosa y hemicelulosa (en
conjunto, holocelulosa), compuestas por glucanos y arabinoxilanos, respectivamente [28]. Para obtener
azcares es necesario pretratar el material de forma de romper la matriz de lignina que cubre a los
polisacridos. Con el material pretratado, se aaden enzimas celulolticas capaces de romper los enlaces -
1,4-glucosdicos de la celulosa de forma de obtener glucosa. Adems, los ccteles enzimticos
comerciales, por lo general, contienen enzimas capaces de hidrolizar compuestos xilanos en xilosa [11],
no obstante, gran parte de estos compuestos son hidrolizados en los pretratamientos, como se ver en la
Seccin 2.3.

Una vez hidrolizado el material, los azcares pueden ser fermentados por distintos
microorganismos, dependiendo de su estructura y convertidos en etanol, para luego ser destilado tal como
se aprecia en la Figura I-1. La lignina sobrante del proceso como material slido puede ser sometida a
7

combustin para la generacin de electricidad, o bien, puede ser procesada para la sntesis de distintos
biomateriales (ver Seccin 2.7) [29],[30].

La produccin de bioetanol de segunda generacin, como es llamado el etanol de origen
celulsico, an no se realiza a gran escala debido a los bajos niveles de rendimiento que tiene la etapa de
pretratamiento y sacarificacin enzimtica, haciendo muy costosa su produccin. No obstante, avances en
este campo existen, ya que la empresa canadiense IOGEN Co. tiene una planta piloto que produce etanol
celulsico a partir de residuos agrcolas, con el uso de un pretratamiento cido de la biomasa entre 200 y
250 C, seguido de una hidrlisis enzimtica con enzimas celulolticas, y finalmente una fermentacin
continua de los azcares (pentosas y hexosas) con cepas modificadas de Zymmomonas spp. [31]. La
lignina remanente es utilizada para la generacin de energa y reduccin de costos del proceso global [32].

Otra empresa que produce hoy en da etanol celulsico es Raven Biofuel International, Co. la cual
lo produce a partir de residuos agrcolas. El proceso consiste en dos etapas de hidrlisis cida, donde en la
primera de ellas la hemicelulosa es depolimerizada en xilosas, y a travs de un proceso de hidrogenizacin
es transformada en furfural, el cual es comercializado. La segunda etapa de hidrlisis tiene por objetivo
depolimerizar la celulosa en glucosa, para que luego sta pueda ser fermentada y destilada para la
obtencin del etanol. La lignina remanente del proceso es utilizada, al igual que en el proceso de Iogen,
Co., para generar electricidad y disminuir los costos en energa [33].

2.1.2. Etanol como biocombustible

El etanol en Brasil es masivamente producido a partir de caa de azcar desde los aos 70, donde
la utilizacin del mismo se ha hecho con fines oxigenantes, permitiendo una disminucin en la generacin
de compuestos carbonados contaminantes como el monxido de carbono (CO) y compuestos
hidrocarbonados [3]. En EE.UU. la produccin de bioetanol se genera a partir de granos de maz [3],[28].
Para el ao 2009 se proyectaban segn Renewable Fuels Association de EE.UU. una demanda de 2,3
millones [m
3
] [34].

Las razones volumtricas en las que se utiliza el etanol en Brasil han llegado a ndices de entre 20
y 25 %, aunque en motores convencionales existe una reduccin de potencia, debido a que el etanol tiene
un menor poder calorfico que las gasolinas convencionales [28]. Otra desventaja es la corrosin de
componentes metlicos del motor. Para subsanar estas desventajas es necesario realizar ajustes en el
motor, los que si se realizan pueden aumentar la potencia que entrega el motor, mejorando los
rendimientos trmicos y de consumo de combustible [28].
8

Respecto a la emisin de gases de efecto invernadero, la utilizacin de mezclas de etanol, ya sea
de origen de almidn o celulsico, disminuyen en parte la emisin de dichos contaminantes. El uso de
etanol de grano de maz, con diferentes tipos de energa involucradas en el proceso, reduce en alrededor de
un 19 % en promedio las emisiones de gases de efecto invernadero, mientras que la utilizacin de etanol
celulsico reduce en un 86 % las emisiones de estos gases, respecto a lo que se liberara con el uso de
gasolina tal como muestra la Figura I-2 [34]. Todo esto es considerando el ciclo total de energa, desde la
cosecha (o extraccin de petrleo para combustibles fsiles), pasando por el proceso de produccin del
combustible, hasta su uso en automviles y absorcin de CO
2
por los vegetales.

Figura I-2: Emisiones de gases de efecto invernadero por combustibles de uso vehicular de acuerdo
a la fuente de energa

2.2. ESTRUCTURAS PRESENTES EN LOS MATERIALES
LIGNOCELULSICOS

2.2.1. Macro estructuras de la materia vegetal

En los residuos agrcolas coexisten sustancias de bajo y alto peso molecular [8],[11]. Los
primeros son tanto materia orgnica como inorgnica, y representan un porcentaje de alrededor un 10 %.
Por otro lado, existentes molculas de alto peso molecular, llamadas macromolculas, dentro de las cuales
existen dos grandes grupos: los polisacridos, compuestos por celulosa y hemicelulosa, y la lignina, tal
como muestra el siguiente diagrama:

reduccin
19%
reduccin
28%
reduccin
52%
reduccin
78%
reduccin
86%
petrleo promedio
actual
gas natural biomasa biomasa biomasa
Gasolina Etanol de maz caa de
azcar
celulsico
Emisin de gases
de efecto
invernadero
Energa utilizada en la produccin del combustible

Figura I-3:

La lignina es la estructura que protege a la celulosa en la planta, enlazndose con la hemicelulosa.
La celulosa, como se dijo, est en la parte interior y los distintos enlaces que existen entre los
polisacridos ayudan a dar un gran ndice de crista
As, celulosa, hemicelulosa y lignina forman estructuras llamadas microfibras, las cuales organizadas en
macrofibras, como muestra la Figura
planta [35].
Figura I-4: Disposicin de las macromolculas dentro de la pared celular de los vegetales

Desecho
agrcola
9
: Componentes estructurales de las lignocelulosas
es la estructura que protege a la celulosa en la planta, enlazndose con la hemicelulosa.
polisacridos ayudan a dar un gran ndice de cristalinidad a la estructura, la cual es difcil de hidrolizar.
Figura I-4, determinan la estructura fundamental de la pared celular de la
: Disposicin de las macromolculas dentro de la pared celular de los vegetales
Sustancias de
bajo peso
molecular
Materia
Orgnica
Materia
Inorgnica
Macromolculas
Lignina
Polisacridos
Celulosa
Hemicelulosa

Componentes estructurales de las lignocelulosas
es la estructura que protege a la celulosa en la planta, enlazndose con la hemicelulosa.
ructura, la cual es difcil de hidrolizar.
la estructura fundamental de la pared celular de la

: Disposicin de las macromolculas dentro de la pared celular de los vegetales [35]
Celulosa
Hemicelulosa
10

2.2.1.1. Celulosa

La celulosa es el polmero ms abundante en las plantas y en la naturaleza, y es utilizada en
mltiples procesos industriales, tales como la fabricacin de papel y otros. Junto con ello, se constituye en
la mayor fuente de azcares de la mayora de los residuos agrcolas y forestales [8].

Desde el punto de vista qumico, la celulosa es un polmero cristalino formado por cadenas
lineales de D-glucosa (molculas de 6 carbonos) unidas a travs de sus enlaces -1,4-glucosdicos (ver
Figura I-5). Cada molcula de glucosa posee tres grupos hidroxilos, en los carbonos 2, 3 y 6 (C2, C3 y
C6), los cuales estn accesibles a glicosilaciones [36]. Aparte, una molcula lineal de glucosa, llamada
celodextrina, posee extremos reductores y no reductores, zonas donde molculas especficas inician los
ataques de hidrlisis (depolimerizacin), llamadas enzimas celulolticas [13].

Figura I-5: Estructura hebra de celulosa con "n" molculas de glucosa (adaptado de [13])

Desde un punto de vista macro, cada una de las hebras de celulosa est enlazada a otras mediante
puentes de hidrgeno, formando una estructura supra-molecular semi-cristalina, dndole caractersticas de
insolubilidad (ver Figura I-6). Esta caracterstica de insolubilidad es la que ha llamado la atencin de los
cientficos, en bsqueda de encontrar solventes apropiados que sean capaces de romper los puentes de
hidrgeno que se forman entre los grupos hidroxilos de la molcula, para as disolver la celulosa y hacer
ms fcil su procesamiento [36].

Al menos, existen dos tipos de configuraciones de celulosa a nivel de los tipos de organizacin
que los puentes de hidrgeno tienen dentro de la molcula. En el primero de ellos, denominado tipo I, el
oxgeno asociado al C6 acta como donante de protones junto al oxgeno del anillo en la misma unidad,
siendo el oxgeno asociado al C3 en la unidad adyacente el aceptor de protones. En la configuracin tipo
II, todos los puentes de hidrgeno que se establecen entre los tomos anteriormente sealados se
conforman entre unidades distintas (ver Figura I-6) [13].

11

Figura I-6: Estructura de la celulosa (tipo II) (adaptado de [37])

Las configuraciones tipo I y II son tpicas de las estructuras amorfas de los materiales vegetales,
no obstante, la tipo I es ms comn en la naturaleza. La configuracin tipo II es ms parecida a la celulosa
que ha sido tratada con compuestos alcalinos [13].

En el proceso de sacarificacin de la celulosa con enzimas celulolticas, una de las ltimas
unidades antes de poder obtener la glucosa como monmero final, es una molcula que est conformada
por dos molculas de glucosa (dmero) llamada celobiosa. Esta molcula tiene un enlace -glucosdico
entre los carbonos 1 y 4 de cada molcula, como se aprecia en la Figura I-7.

Figura I-7: Estructura de la celobiosa

2.2.1.2. Hemicelulosa

Como se sealaba anteriormente, la celulosa es la entidad que est en mayor cantidad presente en
la vida vegetal, dado que forma parte importante de la pared celular. Junto con ella, coexiste la

hemicelulosa, un polmero que en base es similar a la celulosa, con una serie de s
presentes, tal como se muestra en la

Figura I-8:

Adems, las hemicelulosas p
la pared celular: xilanos, mananos,

Los xilanos son el principal polisacrido de las hemicelulosas, y representan alrededor de un 20
30 % del residuo agrcola. Los xilanos son heteropolmeros formado por una cadena de xilosas unidas por
medio de un enlace -1,4-glucosdico, unindose a pequeas cadenas de carbohidratos.

Un componente importante de los xilanos encontrados en
(ver Figura I-9), representando uno de los componentes ms importantes de la hemicelulosa en estas
especies, cuya cadena puede ser apreciad

Figura I-9: Estructura de arbino
Hemicelulosa
12
hemicelulosa, un polmero que en base es similar a la celulosa, con una serie de subgrupos de monmeros
presentes, tal como se muestra en la Figura I-8:
: Unidades estructurales presentes en hemicelulosa
Adems, las hemicelulosas pueden ser clasificadas por su estructura de diferentes polisacridos en
la pared celular: xilanos, mananos, -glucanos y xiloglucanos.
agrcola. Los xilanos son heteropolmeros formado por una cadena de xilosas unidas por
glucosdico, unindose a pequeas cadenas de carbohidratos.
Un componente importante de los xilanos encontrados en residuos agrcolas es el ar
, representando uno de los componentes ms importantes de la hemicelulosa en estas
especies, cuya cadena puede ser apreciada en la siguiente figura:

: Estructura de arbino-xilooligosacrido de hemicelulosa de paja de trigo
Hemicelulosa
Pentosas
Xilosa
Arabinosa
Hexosas
Glucosa
Manosa
Galactosa
cidos
Hexurnicos
Deoxi-Hexosas
ubgrupos de monmeros

presentes en hemicelulosa
ueden ser clasificadas por su estructura de diferentes polisacridos en
agrcola. Los xilanos son heteropolmeros formado por una cadena de xilosas unidas por
glucosdico, unindose a pequeas cadenas de carbohidratos.
agrcolas es el arabinoxilano
, representando uno de los componentes ms importantes de la hemicelulosa en estas
xilooligosacrido de hemicelulosa de paja de trigo
13

2.2.1.3. Lignina

La lignina es uno de los materiales orgnicos mayormente presentes en las plantas, slo superada
por la celulosa y la hemicelulosa [8]. Tal como se aprecia en la Tabla I-1, el porcentaje en masa de lignina
presente en los desechos agroindustriales vara desde un 15 a un 35 %, y su principal funcin en la vida
vegetal es proteger a la planta y darle resistencia mecnica [8],[35].

La lignina es un polmero tridimensional amorfo que est altamente ramificado, con una gran
cantidad de grupos funcionales presentes, tales como hidroxilos fenlicos y alifticos [35]. Estas unidades
estn presentes en tres estructuras de tipo alcoholes aromticos, alcohol p-cumrico, alcohol coniferlico y
alcohol sinaplico, los cuales constituyen a la matriz de lignina como precursores fundamentales (ver
Figura I-4 y Figura I-10). Estos alcoholes conforman los tres monmeros fundamentales de la lignina
llamados: fraccin p-hidroxifenil (H), fraccin guaicil (G) y fraccin siringil (S), tal como se aprecia en la
Figura I-4 [8],[35].

La lignina presente en especies herbceas es distinta de la que se puede encontrar en maderas
duras o blandas, debido a que estas ltimas presentan solo dos de los tres unidades fundamentales
anteriormente citadas: guaiacil y siringil [38].

Figura I-10: Unidades y monmeros bsicos de la lignina

En la pared celular la lignina siempre est asociada a carbohidratos, particularmente a
hemicelulosas (ver Figura I-4), mediante intermediarios como el cido p-cumrico o el ferlico (cidos
hidroxicinmicos). Estos, a travs de enlaces de tipo ster y ter, forman estructuras llamadas
carbohidratos-lignino-fenlicos [39], tal como muestra la Figura I-11. Este tipo de enlaces es el que
dificulta la posibilidad de extraer los azcares desde el material vegetal [8].
14

Figura I-11: Estructura lignina-fenlica-carbohidrato en tejidos vegetales [8]

Otras estructuras presentes en la lignina son los llamados lignanos, los cuales en materiales
herbceos comprenden hasta un 5 %, donde los principales presentes en residuos agrcolas son el 7-
hidroximatairesinol y el siringaresinol. Ambos establecen enlaces covalentes con carbohidratos,
principalmente de tipo glucosdico, los cuales pueden ser extrados utilizando cidos o bases diluidas [8].
Tambin es posible encontrar estructuras acetiladas, principalmente en la zona (ver Figura I-11) que une
a la lignina con la zona fenlica (cido ferlico o p-cumrico); al igual que los lignanos, estos pueden ser
extrados por bases diluidas.

2.3. PRETRATAMIENTOS DE MATERIALES LIGNOCELULSICOS

Los distintos pretratamientos que se realizan al material lignocelulsico se clasifican en fsicos,
qumicos, fsico-qumicos y biolgicos, tal como muestra la Tabla I-2.

Tabla I-2: Mtodos de pretratamientos de material lignocelulsico
Clasificacin Pretratamiento Clasificacin Pretratamiento
Fsicos
Destruccin mecnica
Qumicos
Ozonlisis
Pirlisis Hidrlisis cida diluida
Fsico-qumicos
Explosin a vapor (SO
2
) Hidrlisis cida concentrada
AFEX (explosin con NH
3
) Hidrlisis alcalina
Explosin con CO
2
Deslignificacin oxidativa
Biolgicos Hongos de pudricin blanca Proceso Organosolv

Los pretratamientos tienen por objetivo romper la matriz de lignina presente en el material, de
forma de dejar expuestos los distintos polisacridos para que sean reducidos a azcares fermentables a
15

travs de hidrlisis enzimtica, tal como muestra la Figura I-12. En la misma lnea, los pretratamientos
deben ser tales que minimicen la generacin de compuestos inhibidores de las etapas posteriores del
proceso de obtencin de bioetanol.

Figura I-12: Diagrama de un pretratamiento para material lignocelulsico

2.3.1. Pretratamientos fsicos

2.3.1.1. Destruccin mecnica

El material lignocelulsico se reduce de tamao con el objetivo de exponerlo para tratamientos
posteriores. En general, se busca dejar el material ms expuesto para el ataque por soluciones cidas o por
el tratamiento enzimtico, para poder reducir el tamao de las fibras de celulosa presentes.

Tabla I-3: Consumo de energa en la reduccin de tamao de materiales lignocelulsicos
Material
Lignocelulsico
Tamao Final
[mm]
Energa [kWh/Ton]
Cuchillos Martillo
Residuo de
Trigo
1,60 7,50 42,0
2,54 6,40 29,0
Residuo de
Maz
1,60 S/I
2
14,0
3,20 20,0 9,60
6,35 15,0 S/I
9,50 3,20 S/I

2
S/I: Informacin no disponible
16

Los tamaos que se utilizan generalmente son de 10-30 mm, y de 0,2-2,0 mm despus de
tratamientos con molinos de bola o de cuchillos. Los requerimientos de energa para llevar al material a
estos tamaos son elevados, y se resumen en la Tabla I-3 [6].

2.3.2. Pretratamientos fsico-qumicos

Los pretratamientos fsico-qumicos son aquellos que utilizan vapor con catalizadores cidos o
bsicos (dixido de azufre, dixido de carbono o amoniaco), a temperaturas entre 160 260 C y
presiones entre 0,69 4,83 MPa, produciendo un gran fraccionamiento del material y conversiones por
sobre el 50 % en compuestos arabinoxilanos. Para ms detalle ver Anexo A.

2.3.3. Pretratamientos qumicos

Los pretratamientos qumicos utilizan solventes qumicos para la ruptura de la matriz de lignina,
con temperaturas no superiores a los 200 C y presiones inferiores a los 0,2 MPa.

2.3.3.1. Pretratamiento cido

2.3.3.1.1. cido Concentrado

Se tienen altos niveles de hidrlisis de celulosa con altas concentraciones de cido sulfrico o
clorhdrico, sin embargo, estos son txicos, corrosivos y peligrosos [6]. Adicionalmente, los cidos deben
ser recuperados para hacer el proceso econmicamente viable [40].

2.3.3.1.2. cido Diluido

La aplicacin de soluciones diluidas de cido sulfrico a temperaturas elevadas lleva a altos
niveles de hidrlisis de celulosa, posterior a la hidrlisis enzimtica. De la misma forma, se obtienen altas
conversiones de compuestos xilanos en xilosas.

Por lo general, se utilizan temperaturas cercanas a los 160 C, con porcentajes en peso de material
lignocelulsico variables entre 5 y 40 % [6]. Sin embargo, otros estudios muestran que es posible llevar a
cabo el proceso en autoclave a 121 C por 1 h y obtener niveles elevados de hidrlisis de celulosa en el
17

tratamiento enzimtico [11],[41]. A temperaturas mayores es posible reducir el tiempo de residencia del
tratamiento cido [6].
La cantidad de cido sulfrico a suministrar no supera el 2 % v/v, y se debe tener cuidado en que
no sea demasiado elevado, dado que se pueden obtener componentes furfurales, fruto de la
descomposicin de los azcares [6]. Posterior al pretratamiento se debe neutralizar la solucin, de forma
de poder llevar a cabo la etapa enzimtica.

Furfural e hidroximetilfurfural son productos de la descomposicin de los azcares liberados en el
pretratamiento cido, debido a las condiciones de acidez y de altas temperaturas a las cuales se opera la
reaccin de hidrlisis, tal como se aprecia en la Figura I-13. Estos compuestos son inhibidores de la etapa
de fermentacin, bajando los ndices de rendimiento en la produccin de etanol. La generacin de cido
actico y acetona tambin han sido probadas como productos de descomposicin de levoglucosano (ver
Anexo B). Este ltimo compuesto (anhidroglucosa) es producto de la pirlisis de la celulosa, y a
descomposicin de la glucosa [42]-[44].

Respecto a la lignina, el pretratamiento cido es capaz de romper el enlace tipo ter que existe
entre los cidos hidroxicinmicos (ferlicos o p-cumricos) y la matriz de lignina (ver Figura I-11) [8].
As, este pretratamiento permite hasta un 100 % de remocin de la hemicelulosa (arabinoxilanos) sin
disolucin de lignina [45].

Figura I-13: Descomposicin de glucosa y xilosa en furfural y HMF [33],[43],[46]

18

En el caso de residuos de trigo se ha encontrado que es necesaria la adicin de un pretratamiento
cido, debido a que gran parte de los arabinoxilanos estn unidos directamente a la matriz de lignina por
enlaces tipo ter (sin cidos hidroxicinmicos como intermediarios, ver Figura I-14), los que, como se
seala en la Figura I-11, deben ser atacados en ambientes cidos. As, los azcares liberados pueden ser
directamente fermentados [11].

Figura I-14: Unin directa entre arabinoxilano y matriz de lignina [47]

Saha y colaboradores, [11], desarrollaron un pretratamiento de hidrlisis cida diluida para
residuos de trigo y maz. Para el primero de ellos se utiliz residuos de trigo, pasado por una malla de 1,27
[mm], al 7,83 [ % p/v], encontrando como mejores condiciones 0,75 [ % v/v] de cido sulfrico a 121 C
por 1 [h], con un rendimiento de azcares del 74 % despus de la hidrlisis enzimtica.

Tabla I-4: Niveles de azcares liberados para residuos de trigo con pretratamiento de cido diluido
a 121 C por 1 hora, antes y despus del tratamiento enzimtico [11]
cido [
% v/v]
Hidrlisis
Enzimtica
Azcares liberados [mg/g de material seco]
Glucosa
Xilosa y
galactosa
Arabinosa Total
0,00 Antes 15 1 0 0 0 0 15 1
Despus 109 1 60 0 0 0 169 1
0,25 Antes 5 0 46 2 8 1 59 1
Despus 186 4 179 13 31 1 396 13
0,50 Antes 5 0 133 1 17 0 155 1
Despus 226 4 214 2 32 5 472 11
0,75 Antes 15 1 152 4 20 0 187 5
Despus 230 9 222 8 33 5 485 22
1,00 Antes 20 0 158 0 20 0 198 1
Despus 214 4 208 4 30 1 452 1
19

Para la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo se utiliz Celluclast 1.5L (glucanasas) y
Novozyme 188 (celobiasa), con dosis de 72,6 [IU/g de celulosa]
3
y 13,6 [U/g]
4
de celulosa,
respectivamente
5
[11].

Para residuos de maz (pasado por malla 1,27 [mm]), Saha y colaboradores, [41], encontraron
como mejores condiciones para material al 15 % p/v en base seca 0,50 % p/v de cido sulfrico a 121 C y
1 h, con rendimientos entre 85-100 % de los azcares tericos.

Figura I-15: Niveles de azcares liberados despus de la hidrlisis enzimtica para residuos de maz
previamente tratados a 121 C con cido sulfrico a distintas concentraciones y tiempos, [41]
6

Para la hidrlisis enzimtica de residuos de maz se utiliz Celluclast 1.5L (glucanasas) y
Novozyme 188 (celobiasa), con dosis de 90,8 [IU/g de celulosa] y 26,9 [U/g] de celulosa, respectivamente
[41]. Las definiciones de actividad para cada enzima son iguales a las reportadas para desechos de trigo.

3
: 1 [IU] se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 [mol] de glucosa como azcar reductor por
minuto, bajo un medio con las siguientes condiciones: volumen 0,5 [mL], carboximetilcelulosa 1,0 [ % p/v] en buffer
acetato 50 [mM] a pH 5,0, a 50 C por 30 minutos.
4
: 1 [U] se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 [mol] de p-nitrofenol por minuto, bajo un medio
con las siguientes condiciones: volumen 1,0[mL], 4,0 [mM] de p-nitrofenol -D-glucosidasa en buffer acetato 50
[mM] a pH 5,0, a 50 C por 30 minutos.
5
: Para ms detalles respecto a la hidrlisis enzimtica revisar Seccin 2.4
6
: En la Figura I-15: A: Glucosa, B: Xilosa, C: Arabinosa y D: Azcares totales.
20

2.3.3.2. Pretratamiento alcalino

La hidrlisis alcalina se lleva a cabo con soluciones diluidas de NaOH, produciendo una reaccin
de saponificacin rompiendo los enlaces de tipo ster (ver Figura I-11) que unen la hemicelulosa con la
lignina [8]. La porosidad del material lignocelulsico aumenta, gracias a la hinchazn que provoca el
tratamiento de NaOH diluido. Algunas investigaciones postulan que el tratamiento es efectivo para
materiales con contenido relativamente bajo de lignina, del orden de 10-18 % [6], aunque se han
encontrado importantes ndices de solubilizacin de lignina para aserrn de lamo con contenido de lignina
de 22 % [45].

Tambin, otras investigaciones han utilizado la adicin de un tratamiento alcalino posterior a uno
con cido diluido realizado a granos previamente utilizados para la produccin de cerveza (brewers spent
grain BSG). En l se logran altos niveles de solubilizacin de lignina, sin mayores prdidas de azcares
como fruto de hidrlisis en esta etapa. En la subsiguiente etapa de sacarificacin enzimtica se logran
ndices ms elevados de obtencin de azcares, del orden de un 15 % superior comprados a la utilizacin
de pretratamiento cido solamente [48].

Tabla I-5: Composiciones msicas en las distintas etapas de pretratamientos de granos (BSG) para
su posterior sacarificacin enzimtica [48]
Componente
Composicin de
BSG sin tratar [
% p/p]
Masa recuperada
despus del pret
cido [g]
Prdidas despus del
tratamiento cido
[ % p/p]
Composicin
de celulignina
[g/100 g]
Celulosa 16,8 16,5 0,36 1,8 34
Hemicelulosa 28,4 3,83 0,02 86,5 7,9
Lignina 27,8 23,9 0,78 14 49,2
Otros 27 4,32 0,17 84 8,9
Masa total 100 48,55 51,45 100
Componente
Masa
recuperada
despus del
pretratamiento
alcalino
[g/100 g BSG]
Prdidas despus
del
pretratamiento
alcalino [ % p/p]
Prdidas totales
despus de la
secuencia de
pretratamientos [g]
Composicin
de pulpa de
celulosa
[g/100 g]
Celulosa 16,2 0,22 1,8 3,6 90,4
Hemicelulosa 0,2 0,01 94,8 99,3 1,1
Lignina 1,46 0,02 93,9 94,7 8,2
Otros 0,05 0,00 98,8 99,8 0,3
Masa total 17,91 63,11 82,09 100

21

2.4. HIDRLISIS ENZIMTICA

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica capaces de catalizar reacciones. Por lo general,
la degradacin de compuestos o la transformacin de los mismos tienen velocidades de reaccin muy
bajas [13]. Las enzimas, como todo catalizador qumico, slo pueden ayudar en la velocidad de una
reaccin siempre que sta sea termodinmicamente posible [49],[50].

La hidrlisis enzimtica de lignocelulosa se lleva a cabo una vez que el material ha sido
previamente tratado por alguno de los mtodos anteriormente sealados. Sin ellos, por lo general los
ndices de obtencin de azcares fermentables son relativamente bajos, dado que la adsorcin de las
enzimas hacia sitios de la lignina produce inactivacin de la misma [3],[6],[8],[11],[13].

2.4.1. Tipos de enzimas y mecanismos

Las enzimas utilizadas se denominan celulasas, las cuales son muy especficas. stas se
subdividen en 3 grupos dependiendo de su actividad enzimtica [13],[51],[52]:

2.4.1.1. Endoglucanasas

Las enzimas endoglucanasas tienen accin sobre las regiones amorfas de la celulosa y sobre las
fibras que a nivel microscpico pueden ser observadas en la estructura del polmero. La accin de estas
enzimas es sobre el enlace -1,4-glucosdico presentes entre las unidades monomricas de glucosa que
conforman la celulosa. El resultado de esta accin enzimtica es la disminucin de la longitud de la
cadena de celulosa, generando nuevos sitios de degradacin para otras enzimas para degradar el polmero
finalmente a monmeros de glucosa [51],[52].

2.4.1.2. Exoglucanasas

Las enzimas exoglucanasas actan sobre la cadena -1,4-D-glucano a travs de los extremos no
reductores de la celulosa, generando como productos molculas de celobiosa (dmeros de glucosa) y
monmeros de glucosa [51],[52].

22

2.4.1.3. Celobiasas

Las celobiasas (-1,4-glucosidasa) son las encargadas de romper los dmeros de glucosa liberando
molculas de glucosa [51],[52].

Cuando las zonas amorfas de la celulosa ya han sido degradadas, la accin sinrgica de las
glucanasas permite la hidrlisis de la regin cristalina de la celulosa. En esta etapa la generacin de
molculas de celobiosa redunda en una baja en la eficiencia de la hidrlisis de celulosa en glucosa, debido
a que la celobiosa produce una reaccin inhibitoria sobre las enzimas glucanasas, inactivndolas [51]-[53].

Un mecanismo resumido de la hidrlisis de celulosa por parte de las enzimas celulolticas se
puede apreciar en la Figura I-16, donde las lneas rojas representan los puentes de hidrgeno que se
establecen entre los oxgenos de los carbonos 3 y 6 y el oxgeno que conforma el anillo. Las lneas azules
representan la inhibicin de las enzimas glucanasas por parte de la celobiosa.

Figura I-16: Hidrlisis enzimtica de la celulosa (adaptado de [54])

2.4.2. Microorganismos que producen celulasas

Las enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos (m.o.), tales como
bacterias u hongos. La batera enzimtica proveniente del hongo Tricoderma reesei es una de las ms
utilizadas, presentando actividad para las tres enzimas anteriormente descritas [13],[52]. No obstante, esta
actividad es relativamente baja para -1-4-glucosidasa, por lo que la sola adicin de la batera enzimtica
23

producida por T. reesei no garantiza niveles ptimos de hidrlisis en glucosa, debido a la inhibicin de las
enzimas glucanasas por la accin de la celobiosa, anteriormente explicada. Para subsanar este aspecto, se
debe agregar al preparado enzimtico actividad de -1-4-glucosidasa, la cual es producida por el hongo
Aspergillus niger [52].

2.4.3. Condiciones de sacarificacin de la celulosa

Los procesos de hidrlisis enzimtica se llevan a cabo a pH cercanos a 5, a temperaturas variantes
en el rango 45-50 C, entre 150-250 rpm y con tiempos de operacin que rondan las 70 a 100 h por lo
general [13]. La cantidad de enzima a suministrar por gramo de material lignocelulsico a es de 60 FPU,
segn el ensayo de papel filtro [55]. En otras publicaciones, se utiliza una carga enzimtica similar, la cual
es igual a 20 [FPU/g de material] [13],[51],[52]. No obstante, debido a la baja actividad enzimtica de los
preparativos de celulasas en -glucosidasa (celobiasa), se recomienda suministrar entre 0,8 2,7 CBU de
-glucosidasa por cada FPU de celulasa suministrada [56].

2.5. LQUIDOS INICOS (LI)

2.5.1. Propiedades y usos

Los lquidos inicos son sales orgnicas, y que tienen puntos de fusin que varan entre los -96 C
a los 100 C, hacindolos solventes ampliamente tiles para un sinfn de propsitos a temperaturas
moderadas [19]. Por ejemplo, el cloruro de sodio tambin podra ser considerado como un lquido inico,
claro que estas caractersticas de lquido se alcanzan a una temperatura de 801 C (punto de fusin del
cloruro de sodio) [57], la cual es muy elevada. Existen alrededor de 10
18
combinaciones posibles de
lquidos inicos a ser sintetizados [19],[58],[59].

Los lquidos inicos se caracterizan, aparte de ser lquidos a temperaturas moderadas, por tener
presiones de vapor prcticamente despreciables, pudiendo ser fcilmente separados de otros compuestos
por destilacin, lo que permite su recuperacin en forma pura y su reutilizacin [60]. Esta misma
caracterstica los hace llamar compuestos verdes, por su nula vaporizacin y as nula contaminacin del
ambiente con sustancias txicas. Otras caractersticas que lo hacen verdes son la de no tener riesgos de
inflamabilidad, lo que los hace compuestos seguros de operar; la alta especificidad que tienen lo que hace
disminuir las etapas intermediarias para obtener productos determinados; y la utilizacin de compuestos
de naturaleza renovable [17],[19],[58].

24

La caracterstica lquida de estas sales viene dada porque sus energas libres de Gibbs de
solvatacin son negativas, lo que quiere decir que el estado lquido es termodinmicamente favorable,
debido al gran tamao y flexibilidad de los iones [17]. As, desde un punto de vista qumico, los lquidos
inicos son sales orgnicas, donde principalmente el catin es de naturaleza orgnica y por lo general es
una estructura mucho ms grande que el anin, el cual es tambin por lo general slo un tomo, por
ejemplo, un halgeno [17].

Actualmente, los lquidos inicos son utilizados en una amplia variedad de campos en la industria
qumica, operando como solventes de algunos compuestos, catalizando reacciones y hasta en campos tan
atpicos como la astronoma [59]-[61]. Una de las aplicaciones industriales utilizadas hoy en da a escala
piloto es un proceso de catlisis bifsica, conocida como Proceso Difasol, desarrollado por el Instituto
Francs de Petrleo. En l, el lquido inico [BMIM
+
][Al
2
Et
2
Cl
5
-
] ([BMIM
+
] = 1-butil-metilimidazolio)
acta como solvente y base de Lewis para la reaccin de dimerizacin de butanos en una mezcla de
octanos, utilizando nquel(II) como catalizador [58].

2.5.2. Disolucin de celulosa por LI

Las investigaciones recientes han mostrado la capacidad de disolucin de celulosa por parte de
algunos lquidos inicos, principalmente de base catinica, de la familia de los imidazolio [20]. Los
lquidos inicos del tipo [RMIM
+
][Cl
-
] han sido de los ms investigados en la disolucin de celulosa
[20],[23], debido a que en su estructura es posible la formacin de puentes de hidrgeno (ver Figura I-17,
lneas rojas: puentes de hidrgeno), que en teora, seran capaces de solubilizar a la celulosa reemplazando
los mismos puentes de hidrgeno que se establecen entre sus fibras.

Figura I-17: Puentes de hidrgeno en estructura de [EMIM
+
][Cl
-
], (adaptado de [17])

Esta disolucin de celulosa ha sido probada bajo sonicacin [20],[62]. Se han encontrado niveles
de solubilizacin de celulosa en [BMIM
+
][Cl
-
] (cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio) del orden de un 8 a
25

un 10 % en tiempos variantes entre 15 a 20 min, utilizando condiciones de sonicacin de 10 W de
potencia mxima, a 10 % de potencia nominal [62].

Para disolver celulosa en [BMIM
+
][Cl
-
] se ha utilizado tambin temperaturas elevadas, que varan
entre 130 y 150 C. Las cargas de celulosa en lquido inico (sal inica a temperatura ambiente) son del
orden de un 5,0 % p/p e incubados por tiempos que varan desde los 10 a 180 min. Dadi y colaboradores,
[21], encontraron condiciones ptimas de disolucin de celulosa avicel a 130 C por 10 minutos, liberando
en la posterior hidrlisis enzimtica (60 FPU/g de celulosa) alrededor de 16 [mg/mL] de azcares
reductores a las 24 horas respecto de una carga inicial de 17 [mg/mL]. Esto supone rendimientos del orden
de un 95 %. A las 6 horas de hidrlisis se encontraron rendimientos del orden de un 80 % en azcares
reductores, lo que redunda en una clara mejora respecto a avicel sin tratar, la cual a las 24 horas alcanza
rendimientos del orden de un 40 %. Los ndices de disminucin de cristalinidad de la celulosa son los que
explican los menores tiempos de hidrlisis para la celulosa.

Otros trabajos muestran la disolucin de celulosa con distintos lquidos inicos, demostrando que
para [BMIM
+
][Cl
-
] se tienen los ndices de hidrlisis enzimtica (con 50 FPU/g de celulosa) ms veloces,
pero con [EMIM
+
][OAc
-
] (acetato de 1-etil-3-metilimidazolio) los ms altos ndices de obtencin de
azcares, tal como muestra la Figura I-18. La carga de celulosa fue de 20 [mg/mL], por lo que para todos
los tratamientos se alcanzaron rendimientos cercanos al 100 % a las 48 horas en relacin a los azcares
reductores registrados (medidos por DNS, [63]). Los pretratamientos con LI fueron realizados a 110 C
por 15 min, seguido de la adicin de agua desionizada por 30 min bajo agitacin, y lavados con agua
desionizada y acetona [23].

Figura I-18: Hidrlisis enzimtica de avicel pretratado con [BMIM
+
][Cl
-
] a 130 C por 10 min [22]
26

La regeneracin del material lignocelulsico es necesaria debido a que la celulosa tiende a formar
una solucin viscosa con el LI, debido a los puentes de hidrgeno que se establecen entre las hebras de
celulosa y el lquido inico (ver Figura I-19) [21]. As, la regeneracin de la celulosa debe ser realizada
con agua u otro solvente, de forma que la celulosa vuelva a conformar su estructura, esta vez con menor
cristalinidad.

La razn de lavar sucesivamente la celulosa viene dada por la comprobada inactivacin de las
celulasas provenientes de T. reseei al estar en presencia de algunos lquidos inicos. Turner y
colaboradores [64], demostraron que para los lquidos inicos 5,0 % LiCl 95 % DMAc, [BMIM
+
][BF
4
-
]
y [BMIM
+
][Cl
-
] la actividad de las enzimas celulolticas se ve substancialmente reducida. Las razones que
explican la desactivacin de las enzimas no han sido del todo comprobadas, y de hecho, despus del
contacto de las enzimas con lquidos inicos no pudieron ser reactivadas.

Figura I-19: Puentes de hidrgeno entre fibras de celulosa y [EMIM
+
][Cl
-
], (adaptado de [23])

2.5.3. Lquidos inicos como pretratamiento de material lignocelulsico

El uso de lquidos inicos como pretratamiento de material lignocelulsico tiene por objetivo el
fraccionamiento del material, y su consiguiente mejora de rendimiento en las tasas de hidrlisis
enzimticas, realizadas con enzimas celulolticas comerciales, versus pretratamientos tales como
explosin a vapor o la hidrlisis cida [24],[65]. No obstante, su uso a escala industrial an representa
algunos desafos, debido a que la recuperacin del LI a nivel de laboratorio se realiza por intercambio
inico, lo cual es impracticable a gran escala. Otro desafo es la utilizacin de las hemicelulosas y lignina
para hacer el proceso costo-efectivo, despus de que la celulosa ha sido extrada [65].

27

2.5.3.1. Residuos de maz

Para residuos de maz se ha utilizado [BMIM
+
][Cl
-
] y [EMIM
+
][OAc
-
] como pretratamiento de
una hidrlisis enzimtica, a temperaturas que varan entre 75 y 150 C, por tiempos de 0,5 a 3 horas.

Para [BMIM
+
][Cl
-
] las mejores condiciones, dentro de las estudiadas, fueron con una carga de
material de 5,0 % p/p, 60 minutos y 150 C, alcanzndose rendimientos de 100 % de conversin de
celulosa y 61 % de xilanos, despus de 36 horas de hidrlisis enzimtica (ver Tabla I-6). El tamao de
material utilizado fue entre las mallas -20 +80 (tamao de partcula entre 0,180 y 0,850 mm), mientras que
la sacarificacin fue llevada a cabo en buffer Na citrato 50 [mM] a pH 4,8. 50 C, con una carga de
material del 1,0 % p/p, 20 [FPU/g de desecho de maz] de celulasa (Spezyme CP, de Genencor, EE.UU.) y
40 [CBU/g de desecho de maz] de celobiasa (-glucosidasa, Novozyme 188, de Novo Co, Dinamarca)
[24].

Tabla I-6: Conversin de residuos de maz pretratados con [BMIM
+
][Cl
-
] a distintos tiempos y
temperaturas [24]
Tiempo
H.Enz
[h]
Conversin ( %), temperatura y tiempo pretratamiento con [BMIM
+
][Cl
-
]
sin tratar 130 C, 1 [h] 130 C, 3 [h] 150 C, 1 [h] 150 C, 3 [h]
xilan glucan xilan glucan xilan glucan xilan glucan xilan glucan
6 s/i 14 s/i 31 s/i 44 s/i 61 s/i 75
14 1 s/i 18 s/i 29 s/i 39 s/i 12 s/i
28 s/i 48 s/i 58 s/i 65 s/i 85 s/i 91
36 3 s/i 36 68 40 70 61 100 22 100

Para [EMIM
+
][OAc
-
] las mejores condiciones, dentro de las estudiadas, fueron con una carga de
material de 5,0 % p/p, 60 minutos y 120 C, aunque a esta temperatura la conversin de xilanos es menor,
del orden de un 25 % [24]. Si bien los autores del experimento no lo sealan, la merma en rendimiento de
conversin de grupos xilanos puede deberse a la hidrlisis de ellos en la etapa de pretratamiento con el
lquido inico. Las condiciones de la hidrlisis enzimtica son iguales al pretratamiento con [BMIM
+
][Cl
-
], salvo la carga enzimtica, la cual fue de 5,0 [FPU/g de residuo de maz] de celulasa (Spezyme CP, de
Genencor, EE.UU.) y 20 [CBU/g de desecho de maz] de celobiasa (-glucosidasa, Novozyme 188, de
Novo Co, Dinamarca) [24].

Las diferencias entre ambos lquidos inicos son atribuidas a que [EMIM
+
][OAc
-
] tiene una mayor
capacidad de romper los puentes de hidrgeno existentes en la estructura cristalina de la celulosa, junto
28

con tener un punto de fusin menor que [BMIM
+
][Cl
-
], lo que ayuda a que el proceso sea ms conveniente
del punto de vista energtico [24].

Otro aspecto importante de la investigacin radica en la presencia de humedad en el material. Es
sabido que la presencia de agua en el lquido inico afecta la solubilizacin de la celulosa, no permitiendo
romper los puentes de hidrgeno intermoleculares en el polmero. No obstante, los ndices de obtencin de
azcares terminadas 24 horas de hidrlisis enzimtica muestran que son prcticamente invariantes al
contenido de humedad entre 0 y 10 %, respecto a la conversin de glucanos y xilanos. Esto se debe, a que
si bien el agua afecta el rompimiento de puentes de hidrgeno en la celulosa, el pretratamiento con
lquidos inicos en materiales lignocelulsicos busca la disrupcin de la matriz de lignina, para hacer la
celulosa ms accesible al ataque enzimtico. No obstante, el contenido de humedad afecta los tiempos de
hidrlisis enzimtica, no permitiendo disminuir de forma tan drstica los tiempos de sacarificacin [24].

2.5.3.2. Residuos de trigo

Como pretratamiento de material lignocelulsico se han tratado residuos de trigo con
[EMIM
+
][DEtPO
4
-
] (dietilfosfato de 1-etil-3-metilimidazolio), a temperaturas entre 25 y 150 C por 10 a
120 minutos. La carga de material fue de 4,0 % p/p y los desechos de trigo fueron molidos hasta que
quedara un polvo de material (no se especifica la granulometra) [25].

Los mejores resultados se encontraron para un pretratamiento con 130 C y 30 minutos,
alcanzando rendimientos del orden de 55 % en azcares reductores. A medida que se aument la
temperatura se obtuvieron mayores ndices de azcares posterior a la sacarificacin enzimtica, no
obstante, entre 130 y 150 C (ambos 60 min) las diferencias son mnimas y no permiten identificar a un
pretratamiento como mejor que el otro (ver Tabla I-7). Manteniendo la temperatura en 130 C, no existen
diferencias significativas entre 30, 60, 90 y 120 minutos de pretratamiento.

Tabla I-7: Niveles de azcares reductores liberados despus de 12 horas de hidrlisis enzimtica de
+
][DEtPO
4
-
] por 60 min a distintas temperaturas
Temperatura pretratamiento [ C]
25 70 100 120 130 150
Azcares reductores
[mg/mL]
2,9 2,8 4,8 5,1 5,5 5,6
Rendimiento [ %] 29 28 48 51 55 56

29

La hidrlisis enzimtica se llev a cabo bajo una carga de material de 1,0 % p/p en buffer Na
acetato 50 [mM] a pH 4,8, a 50 C bajo agitacin. La carga enzimtica fue 30 FPU/g de residuo de trigo
de celulasa (Genencor, EE.UU.). Los azcares liberados fueron medidos bajo la tcnica de DNS, [63].

Respecto a la cintica de la hidrlisis enzimtica, se aprecia una ostensible mejora respecto a los
controles, tanto en nivel de azcares liberados como en tiempos en que se alcanzan estos valores
mximos. Por ejemplo, para material pretratado con [EMIM
+
][DEtPO
4
-
] a 130 C por 30 min, a las 6
horas de hidrlisis se alcanz un 50 % de azcares reductores liberados, de un total de 55 % alcanzado a
las 24 horas, aproximadamente. Respecto a material pretratado con agua se observa que a las 6 horas de
hidrlisis se liberaron alrededor de un 5,0 % de azcares reductores, mientras que a las 24 horas se
liberaron alrededor de un 10 % de azcares reductores. As, con el tratamiento con [EMIM
+
][DEtPO
4
-
] se
obtiene que los mximos de azcares reductores liberados se alcanzan en periodos ms cortos, respecto a
material pretratado con agua [25].

Otras investigaciones han estudiado la delignificacin de desechos de caa de azcar con
[EMIM
+
][ABS
-
] (naturaleza aninica tipo alquilbenceno-sulfonato), donde se han obtenido rendimientos
de extraccin de lignina cercanos al 75 % (ver Anexo C)

2.6. FERMENTACIN

La fermentacin de los azcares obtenidos despus de la sacarificacin enzimtica (SHF,
separated hydrolysis fermentation) se lleva a cabo por medio de microorganismos. Cuando la fuente de
carbono es almidn, la fermentacin de los azcares obtenidos se lleva a cabo normalmente con S.
cerevisiae, sin embargo, a la hora de fermentar los azcares provenientes de material lignocelulsico, la S.
cerevisiae no puede fermentar las pentosas provenientes de la hidrlisis de la hemicelulosa. As, se ha
tenido que investigar en la adicin de rutas metablicas a estos microorganismos de forma que sean
capaces de procesar las pentosas, mediante ingeniera gentica [29]. Otra complejidad que est presente en
la fermentacin de pentosas y hexosas es la generacin de compuestos inhibidores en las etapas previas,
tales como cido actico y furanos [6].

Debido a que los principales monmeros que se obtienen de la hidrlisis de material
lignocelulsico son glucosa y xilosa, las investigaciones se han enfocado en tener organismos que tengan
las dos rutas metablicas para su sntesis. Genes de sntesis de xilosa han sido incorporados a levadura y
Zymomonas mobilis. Otro microorganismo recombinante que tiene la ruta metablica de sntesis de
pentosas es la Escherichia coli FBR5, utilizada para fermentar azcares provenientes de la hidrlisis
30

enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido sulfrico diluido a 121 C por 60 minutos. En dicha
investigacin, el rendimiento etanol/sustrato fue de 0,413 [g de etanol/g de sustrato (azcar)], a 35 C y
pH 6,0 [11].

La otra forma de fermentar azcares es hacerlo de forma simultnea con la sacarificacin
enzimtica (SSF, simultaneous saccharification and fermentation). Este proceso tiene la ventaja de generar
menos compuestos inhibitorios, los cuales reducen los rendimientos de la fermentacin. Otras ventajas son
la rpida conversin de azcares en etanol, lo que reduce la inhibicin de las enzimas; menores
requerimientos de enzimas; menores requerimientos de esterilizacin debido a la rpida conversin de
glucosa en etanol; y tiempos de reaccin ms cortos junto con una minimizacin del volumen de reaccin.
Las desventajas que tiene el proceso es que el crecimiento de los microorganismos no es el ptimo para la
hidrlisis de la celulosa y la tolerancia de etanol de los microorganismos [6],[31].

Los microorganismo ms utilizados en el proceso SSF son T. reesei y S. cerevisiae a una
temperatura ptima de 38 C, sin embargo, debido a que sta no es la temperatura ptima para la hidrlisis
de celulosa, tal como se mencionaba anteriormente, se est investigando en la utilizacin de
microorganismos que puedan crecer a temperaturas ms elevadas [6].

2.7. BIOREFINERA

La adicin de co-procesos para el proceso de produccin de etanol a partir de materiales
lignocelulsicos es fundamental para hacerlos costo-efectivos y competitivos en el mercado de las
gasolinas convencionales [6],[29],[66]. El alto gasto en energa que requiere la etapa del pretratamiento
demanda la utilizacin eficiente de las fuentes energticas disponibles, como por ejemplo, la generacin
de energa elctrica a partir de la lignina residual mediante su quema (proceso patentado por Iogen, Co
[32]), o bien, la produccin de productos secundarios a partir de la lignina o los compuestos xilanos
solubilizados en el proceso, tal como lo hace Raven Biofuels Internationa, Co., produciendo furfural a
partir de una hidrlisis cida primaria que genera xilosas [33].

31

Figura I-20: Diagrama de una biorefinera de biomasa y/o almidn (adaptado de [29],[67])

La lignina residual del proceso de pretratamiento puede ser utilizada para la sntesis de una gran
variedad de productos adicionales, tales como: vanilina, cido ferlico, cido cumrico, guaiacol,
catechol, entre otros (ver Figura I-20). Por ej., la vanilina, es utilizada como saborizante o fragancias [66].
Por otro lado, en la pirolisis los gases de sntesis pueden ser utilizados para la produccin de propileno,
mientras que los aceites de la misma son ricos en distintos alcoholes steres, aldehdos, etc. [67].

Las distintas metodologas en una biorefinera se pueden clasificar en tres grandes grupos:
hidrotrmica, qumica y enzimtica (para ms detalles, revisar Anexo D).

32

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Comparar produccin especfica de etanol por gramo de materia prima tratada que sera posible
producir al procesar residuos agrcolas (maz y trigo) con un proceso que incluya un pretratamiento con
cido diluido, uno de cido diluido seguido de otro alcalino y uno con lquidos inicos, todos seguidos de
una hidrlisis con celulasas comerciales.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Estudiar el efecto de un pretratamiento cido sobre la efectividad de la hidrlisis enzimtica de
celulosa presente en residuos lignocelulsicos de maz y trigo

Determinar las condiciones de operacin que liberan las mximas cantidades de azcares y
monosacridos despus de la sacarificacin para cada pretratamiento.

Estudiar el efecto de un pretratamiento alcalino diluido aplicado a residuos de maz y trigo,
previamente tratados con cido diluido, sobre la remocin de lignina, y sobre la liberacin de
azcares en la sacarificacin.

Identificar las condiciones de operacin en un pretratamiento de residuos de maz y trigo con
lquidos inicos, que liberen la mayor concentracin de azcares simples, glucosa y xilosa.

Evaluar ventajas y desventajas de utilizar del pretratamiento con lquidos inicos, y pretratamiento
cido y/o alcalino diluidos.

33

4. JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

La justificacin de la realizacin del proyecto radica en la necesidad de generar valores
experimentales referenciales respecto a los niveles de liberacin de azcares desde materiales
lignocelulsicos locales (en particular, desechos de maz y trigo), con pretratamientos qumicos
convencionales (cido diluido y alcalino) y de qumica verde (ambientalmente amigables), como son los
lquidos inicos. Todo ello con el objetivo de tener un patrn de comparacin para el pretratamiento de
estos desechos con hongos de pudricin blanca y su posterior sacarificacin con enzimas celulolticas
comerciales, enmarcado en el proyecto de produccin de bioetanol a partir de materiales lignocelulsicos.

Si bien existe un acervo de literatura respecto a este tipo de pretratamientos para este tipo de
materiales, es imprescindible tener datos experimentales propios en base a este tipo de desechos, debido a
que las composiciones qumicas a nivel de macroestructuras es diferente en cada regin en que las
plantaciones son cultivadas, y por ello, el comportamiento de los materiales ante distintos tratamientos
puede ser diferente.

Respecto a la investigacin con lquidos inicos, a nivel nacional no existe experiencia en la
utilizacin de este tipo de solventes en materiales lignocelulsicos con vas a la obtencin de bioetanol.
Debido a lo revolucionario de este tipo de compuestos qumicos por sus caractersticas ambientales
referentes al mnimo impacto del entorno, la investigacin en este campo sugiere un avance importante en
pro de la utilizacin de procesos amigables con el medio ambiente, y junto con ello, coloca al pas en la
rbita cientfica de investigacin en este campo.

34

CAPTULO II: METODOLOGA

La metodologa seguida para la realizacin de esta investigacin se basa principalmente en tres
etapas: una primera de fraccionamiento, seleccin de tamao y secado del material a tratar; una segunda
referente a la realizacin del pretratamiento qumico seleccionado; y una tercera, de sacarificacin del
material pretratado, tal como se aprecia en el diagrama en Anexo E y F.

1. SELECCIN Y PREPARACIN DEL MATERIAL

Los residuos de maz y trigo fueron obtenidos desde cosechas locales de los meses de Marzo 2008
y Diciembre 2007, respectivamente. Las partculas de residuos fueron disminuidas de tamao mediante un
Molino de martillos Condux Werk, LHM 20116 con una malla de 8 [mm], seleccionndose el material de
un tamao de 2,30 [mm].

Para los materiales pretratados con cido sulfrico diluido y/o hidrxido de sodio diluido, la
metodologa de secado fue disponer los residuos en un liofilizador MicroModulyo, ThermoSavant por 20
horas, y luego almacenados a -20 C antes de ser utilizados.

Para los materiales pretratados con lquidos inicos, la metodologa de secado consisti en
dejarlos toda una noche en un congelador, y luego ser dispuestos en un liofilizador Alpha 1-4 LDplus,
Christ, como el de la Figura II-1, a -50 C y 20 [mbar] por 20 horas. Finalmente los residuos fueron
almacenados en un congelador a -20 C antes de ser utilizados.

Figura II-1: Liofilizador Alpha 1-4 LDplus, Christ

35

2. PRETRATAMIENTO CIDO

2.1. HIDRLISIS CIDA

El pretratamiento cido fue realizado a tres distintas concentraciones: 0,50, 0,75 y 1,00 % v/v, y a
dos tiempos: 30 y 60 minutos. Los ensayos fueron realizados en una autoclave con 1.750 [mL] de agua a
18 C, y el tiempo de calentamiento hasta alcanzar el hervor fue de 35 minutos (ver Figura II-2). La
temperatura de operacin fue asumida como 121 C (punto de ebullicin del agua a 2 atm). El material fue
cargado a 5,0 % p/v y los ensayos se hicieron en triplicado. Una vez alcanzado el tiempo de hidrlisis la
autoclave fue rpidamente dispuesta en hielo, para enfriarse. Luego los tubos fueron puestos en hielo y
almacenados a -20 C.

Figura II-2: Esquema del montaje experimental para hidrlisis cida

Posteriormente el material fue filtrado al vaco con filtros de Millipore Co. de fibra de vidrio, de
2,0 [m] de tamao de poro. Se adicion agua destilada para retirar los azcares remanentes del material
hasta completar 50 [mL] de solucin, de los cuales 1,0 [mL] fue guardado a -20 C para futuros anlisis.
Una vez recolectado el licor el material fue lavado dos veces con 100 [mL] de buffer acetato 50 [mM] a
pH 4,8, con el objetivo de neutralizar el material al pH con el que se llev a cabo la hidrlisis enzimtica.

Los azcares del licor recolectado fueron analizados con la tcnica de DNS con calibracin en
glucosa [63], y para ello se tomaron 30 [L] de muestra y se adicionaron 30 [L] de agua destilada. A la
solucin de 60 [L] se agregaron 120 [L] de DNS-fenol (ver Anexo G) y fue dispuesta a 100 C por 5
minutos, y luego enfriados con hielo. A la solucin resultante se le midi la absorbancia a 550 [nm]. Para
medir la lignina soluble del lquido filtrado las muestras se diluyeron entre 50 y 25 veces con agua
desionizada, y se midi su absorbancia a 205 nm, [68]. La cantidad de glucosa fue analizada con el kit
comercial de Randox Laboratories Ltda, mientras que la cantidad de xilosa fue analizada con el kit
comercial de Megazyme International Ireland Ltda.

36

El material filtrado fue secado por 72 horas a 50 C, para registrar la prdida de peso y luego ser
hidrolizados con enzimas celulolticas comerciales.

2.2. HIDRLISIS ALCALINA

El pretratamiento alcalino del material previamente tratado con cido sulfrico diluido fue
realizado con hidrxido de sodio (NaOH) al 2,0 % p/v por un tiempo de 60 minutos al. Los ensayos se
realizaron en la misma autoclave, utilizndose las mismas condiciones de operacin.

Terminada la hidrlisis se tom una alcuota de 1,0 [mL], la cual fue analizada con la tcnica de
DNS con calibracin en glucosa. En el ensayo, 60 [L] de la muestra fueron mezclados con 120 [L] de
reactivo DNS y fueron dispuestos en un calefactor a 100 C por 5 minutos y luego enfriados con hielo.
Finalmente 60 [L] de la mezcla fueron dispuestos en una placa para leer la absorbancia en un
espectrofotmetro a 550 [nm]. La cantidad de glucosa y xilosa fue analizada con los mismos kit
comerciales mencionado anteriormente. Al igual que los licores de la hidrlisis cida, la lignina soluble
fue medida a 205 [nm].

El material fue filtrado al vaco siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente para cido
sulfrico diluido, para despus registrar su prdida de peso.


La hidrlisis enzimtica fue realizada con enzimas celulolticas comerciales Sigma Aldrich. Se
utiliz una celulasa proveniente de T. resei Celluclast 1.5 (Novo, Co., Dinamarca) con actividad segn
Ensayo de Papel Filtro igual a 85,0 [FPU/mL], donde FPU representa la cantidad de mol de glucosa
liberados por minuto (ver Anexo H), y actividad de -glucosidasa igual a 6,2 [CBU/mL]. Tambin se
aadi celobiasa debido a que la preparacin de celulasa contiene baja actividad de -glucosidasa. Para
ello se suministr una celobiasa comercial, Novozyme 188 (Novo, Co., Dinamarca) con actividad de -
glucosidasa de 916 [CBU/mL], donde CBU representa la cantidad en mol de celobiosa convertida por
minuto.

Las hidrlisis fueron realizadas a 5,0 % p/v en relacin a la masa inicial de material a pretratar (es
decir, masa antes de pretratamiento cido), con buffer acetato 50 [mM] neutralizado con HCl concentrado
a pH 4,8, a 50 C y 230 rpm por un tiempo de 96 horas, [55] (ver Figura II-3). La actividad enzimtica
suministrada para los residuos de maz fue de 65 [FPU/g de celulosa] para celulasa y 97 [CBU/g de
37

celulosa] (1,5 [CBU/FPU suministrada) para celobiasa. Para los residuos de trigo la actividad enzimtica
suministrada fue de 75 [FPU/g de celulosa] y 111 [CBU/g de celulosa] (1,5 [CBU/FPU suministrada),
respectivamente. La carga enzimtica se adicion de acuerdo a lo recomendado para material
lignocelulsico, 60 [FPU/g de celulosa] y 0,8 2,7 [CBU/FPU suministrada], [56].

Alcuotas de 40 [L] fueron tomadas a las 6, 24, 48 y 72 horas de hidrlisis, siendo diluidas con
210 [L] (muestras 6 y 24 h) y 460 [L] (muestras 48 y 72 h) de buffer acetato pH 4,8. Luego las muestras
fueron dispuestas a 100 C por 5 minutos, con el objetivo de desactivar la enzima y guardadas a -20 C
para posteriores anlisis.

Los azcares reductores fueron analizados mediante la tcnica de DNS con calibracin en glucosa,
[63], para lo cual se tomaron 60 [L] de la alcuota diluida. Una vez mezclados, se aadieron 120 [L] de
DNS-fenol y se pusieron en un bao en seco a 100 C por 5 minutos. Luego la mezcla se puso en hielo por
5 minutos para detener la reaccin y se midi la absorbancia a 550 [nm]. La cantidad de glucosa y xilosa
fue determinada con los mismos kit comerciales mencionados anteriormente.

Figura II-3: Esquema del montaje experimental de la hidrlisis enzimtica

Finalmente, para analizar la cintica de sacarificacin enzimtica los niveles de azcares
registrados se ajustaron a distintas curvas con el programa computacional CurveExpert 1.3,
seleccionndose as los modelos que mejor se ajusten a los datos medidos.

3. PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS

3.1. LQUIDOS INICOS UTILIZADOS

Como pretratamiento, dos lquidos inicos fueron probados: cloruro de 1-etil-3-metilimidazolio
[EMIM
+
][Cl
-
] e hidrxido de tricaprilmetilamonio [Aliquat
+
][OH
-
].
38

3.1.1. [EMIM
+
][Cl
-
]

Este lquido inico fue sintetizado por Merck & Co.,Inc. Consiste en una sal orgnica slida a
temperatura ambiente, y con punto de fusin entre 77 y 79 C, [69]. Es un compuesto altamente
higroscpico, por lo que su manipulacin preferentemente debe realizarse bajo atmsfera de argn o
nitrgeno, [62].

3.1.2. [Aliquat
+
][OH
-
]

Este lquido inico fue sintetizado a partir de Aliquat 336, Sigma Aldrich Corporation. Aliquat
336 es una mezcla 2:1 de dos compuestos; cloruro de trioctilmetilamonio y cloruro de
tricaprilmetilamonio, y es utilizado en la industria minera en la extraccin de distintos metales.

Para reemplazar el anin cloruro por uno hidroxilo se aadieron 6,26 [g] de hidrxido de potasio
(KOH) a 50 [mL] de Aliquat 336 previamente diluidos en 500 mL de cloroformo. La razn de KOH
suministrada fue un 10 % molar superior de aquella necesitada para reemplazar los aniones cloruro. El
peso molecular de Aliquat 336 utilizado no fue el entregado por el fabricante, sino que se utiliz aquel
que fue reportado por Mikkola y colaboradores [70].

La reaccin fue llevada a cabo a 60 C por toda una noche, con un sistema de enfriamiento en la
parte superior para recircular el cloroformo evaporado. Una vez que termin la reaccin el lquido fue
filtrado con filtros de nylon, Millipore, Co, de 47 [mm] de dimetro y tamao de poro de 0,2 [m], para
retirar los cristales de cloruro de potasio (KCl) formados. El cloroformo fue retirado en un evaporador
rotatorio a 60 C y 15 [mbar]. Posteriormente, el lquido inico fue nuevamente diluido, esta vez en
acetona anhdrida, con la cantidad suficiente como para ver al lquido inico totalmente diluido en la
acetona. Fue guardado por toda una noche a -20 C, y luego fue filtrado nuevamente con filtros de nylon
7
.

Para observar si existan an cristales de KCl remanentes, a una muestra de lquido inico se le
aadi unas pocas gotas de nitrato de plata (AgNO
3
), previamente disuelto en etanol (Etax Aa 99,5 % de
pureza), sin observarse la formacin de ningn precipitado blanco. Esto ltimo ratifica la ausencia de
cristales de KCl en el lquido preparado, sin embargo, la conversin de la reaccin (reemplazo de aniones
OH
-
por aniones Cl
-
) no fue medida.

7
Las condiciones de la reaccin fueron otorgadas por el profesor Jyri-Pekka Mikkola, Laboratory of Industrial
Chemistry and Reaction Engineering, bo Akademi University, Turku, Finland; Technical Chemistry, Department of
Chemistry, Chemical-Biological Center, Ume University, Sweden.
39

3.2. CONDICIONES DE PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS

3.2.1. [EMIM
+
][Cl
-
]

Se pes 0,1 [g] de material, y se agreg 1,9 [g] de [EMIM
+
][Cl
-
] a temperatura ambiente, es decir,
sin atmsfera de argn, por lo que hubo una hidratacin parcial de esta sal orgnica (observacin
cualitativa). De esta forma, el material estuvo en una relacin 5,0 % p/p en [EMIM
+
][Cl
-
]. Los ensayos
fueron realizados en triplicado y dispuestos en un bao de silicona para mantener la temperatura deseada
(ver Figura II-4).

Una vez que la reaccin finaliz (80, 121 y 150 C por 30 y 60 min a 300 rpm), los frascos fueron
dispuestos bajo agua fra, para bajar la temperatura, y se aadieron 5 [mL] de agua desionizada para
solubilizar al [EMIM
+
][Cl
-
] y regenerar la posible celulosa solubilizada. Luego, los residuos fueron
filtrados (filtro de nylon Millipore, Co., tamao de poro 0,2 [m]) y el licor fue aforado a 50 [mL] desde
donde una muestra de 3 [mL] fue guardada a -20 C. El material hidrolizado fue lavado dos veces con 50
[mL] de agua desionizada para eliminar el [EMIM
+
][Cl
-
] remanente, y luego secado en un liofilizador
(previo almacenamiento a -20 C por una noche) a -50 C y 20 [mbar].

Finalmente, al lquido inico se le midi la cantidad de azcares reductores presentes con la
tcnica de DNS, siguiendo el mismo procedimiento citado anteriormente. A los mejores casos se realiz
una medicin de glucosa y xilosa con kit comerciales.

3.2.2. [Aliquat
+
][OH
-
]

Se pes 0,1 [g] de material, y se agregaron 1,9 [g] de [Aliquat
+
][OH
-
] a temperatura ambiente. De
esta forma, el material estuvo en una relacin 5,0 % p/p en [Aliquat
+
][OH
-
], siendo realizados en
triplicado. El montaje experimental utilizado fue el mismo que se utiliz para las experiencias realizadas
con [EMIM
+
][Cl
-
] (ver Figura II-4).

Una vez que la reaccin finaliz (150 C por 60 min a 300 rpm), se procedi al filtrado y lavado
del material con acetona anhdrida, siguiendo el mismo protocolo realizado para los pretratamientos con
[EMIM
+
][Cl
-
].

40

Figura II-4: Montaje experimental de pretratamiento con lquidos inicos


Para la sacarificacin del material pretratado con lquidos inicos, se utilizaron las mismas
enzimas celulolticas comerciales utilizadas para la sacarificacin del material pretratado con cido
diluido, salvo que la actividad de cada una de las enzimas fue distinta, y son las siguientes: Celluclast
1.5L (celulasa) 63,4 [FPU/mL ],(-glucosidasa) 6,5 [CBU/mL]; y Novozyme 188 (-glucosidasa) 650
[CBU/mL], ambas de Novo, Co. (ver Anexo H).

Figura II-5: Montaje experimental de hidrlisis enzimtica de material pretratado con lquidos inicos

Las hidrlisis fueron realizadas a 5,0 % p/v en relacin a la masa inicial de material a pretratar (es
decir, masa antes de pretratamiento cido), con buffer acetato 50 [mM] neutralizado con HCl concentrado
a pH 4,8, a 47,5 C y 220 rpm por un tiempo de 72 horas (ver Figura II-5). La carga enzimtica
suministrada para los residuos de maz fue la misma que para los residuos pretratados con cido sulfrico
diluido.

41

Alcuotas de 20 [L] fueron tomadas a las 6, 24, 48 y 72 horas de hidrlisis, siendo diluidas con
480 [L] de buffer acetato pH 4,8. Luego las muestras fueron dispuestas a 100 C por 5 minutos, con el
objetivo de desactivar la enzima y guardadas a -20 C para posteriores anlisis.

Los monosacridos fueron medidos a travs de cromatografa de gases (GC), realizando un
proceso de derivatizacin de las muestras previo anlisis, con el objetivo de bajar la temperatura de
vaporizacin de los azcares. Para realizar la derivatizacin (sililacin) de las muestras 250 [L] fueron
dispuestos en un frasco de vidrio, agregando 1,0 [mL] de xilitol 0,1 [mg/mL], disuelto en una mezcla 9:1
metanol agua, como estndar. Adems, se hizo una calibracin con todos los monmeros a medir,
agregando 1,0 [mL] de una solucin que contena 0,1 [mg/mL] de cada compuesto a medir (arabinosa,
ramnosa, xilosa, manosa, fructosa, glucosa, galactosa y sucrosa) y 1,0 [mL] de solucin estndar xilitol.
Todos los frascos fueron dispuestos en un calefactor a 50 C para ser evaporadas, bajo ambiente de
nitrgeno y bajo campana. Luego las muestras fueron llevadas a un horno a 40 C al vaco para eliminar
toda la humedad presente en ellas. Posteriormente se inici la reaccin de sililacin bajo campana,
aadiendo 120 [L] de piridina a cada muestra seguido de agitacin en vortex. Luego se aadieron 150
[L] de hexametildisilazano (HMDS) y 70 [L] de trimetilclorosilano (TMCS), seguido de agitacin en
vortex (ver Anexo J). Se dejaron reposar las muestras por toda una noche, con objeto de que el precipitado
formado decantara. Finalmente se tomaron alrededor de 50 [L] de la parte lquida para ser analizados en
el cromatgrafo. El protocolo seguido responde a la metodologa de muestras sin metanlisis de
Laboratory of Wood and Paper Chemistry, bo Akademi, [71].

El equipo utilizado para la medicin de azcares fue un Cromatgrafo de gas PerkinElmer
Autosystem XL. La columna utilizada fue J&W HP-1 25 m (L) x 0.199 mm (ID), ancho de film 0,110 [m]
y lmites de temperatura desde -60 C a 350 C (350 C Pgm). El mtodo seguido utiliz hidrgeno
gaseoso como gas carrier a 14 [psi], y un volumen de inyeccin de muestra de 1,0 [L] a 250 C. El
detector fue del tipo FID (Flame Ionization Detector, Detector de Ionizacin de Llama en espaol) a 310
C. El horno interior del cromatgrafo oper a 100 C por 8 minutos, luego calent hasta los 170 C a
razn de 2 C/min, y luego hasta 300 C a razn de 12 C/min, mantenindose en esta ltima temperatura
por 10 minutos. Compuestos furanos, as como acetona y cido actico fueron medidos por espectroscopia
de masa.

Las cinticas de sacarificacin enzimtica fueron modeladas utilizando el mismo software que
para el material pretratado con cido diluido.

42

CAPTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIONES

1. COMPOSICIN DE LOS RESIDUOS

La composicin de los residuos de maz y trigo fue determinada por Pablo Santibez, del
Departamento de Ingeniera de la Madera de la Universidad de Chile. Las tcnicas utilizadas para la
medicin de los mismos fueron las normas TAPPI T-204 cm-97, T-203 cm-99 y T-222 om-98,
respectivamente. A continuacin se presentan los resultados:

Tabla III-1: Composicin de macroestructuras y otras sustancias de los residuos de maz y trigo
Componente
%, p/p
Residuos de maz Residuos de trigo
Lignina klason 11,7 0,2 12,5 0,3
Celulosa 35,5 0,4 30,5 0,8
Hemicelulosa 35,9 7,3 34,3 6,5
Sustancias extrables 15,8 1,5 15,7 1,1
Cenizas 5,4 0,1 7,2 0,3

As, se puede decir que los residuos de maz tienen una fuente de carbohidratos potencial igual a
714 7,7 [mg de azcares/g de material seco] ([mg AzRed/g MS]), mientras que los residuos de trigo
contienen 648 8,5 [mg AzRed/g MS].

2. COMPARACIN DE MTODOS DE MEDICIN DE AZCARES

Se realizaron dos experiencias para observar si existen diferencias significativas entre las
metodologas de medicin de azcares: para la primera, los azcares reductores fueron medidos con DNS,
en tanto que glucosa y xilosa con kit comerciales (Randox y Megazyme, respectivamente); mientras que
para la segunda, se midieron los azcares mediante cromatografa de gases. Para validar el modelo, se
realiz una hidrlisis enzimtica a residuos de maz y trigo, por separado, y sin tratamientos preliminares.
La carga enzimtica suministrada fue la misma, tanto para DNS kit comerciales (1er experimento) como
para cromatgrafo de gases (GC) (2do experimento) (ver CAPTULO II: secciones 2.3 y 3.3,
respectivamente), a 47 C por 72 horas y 220 rpm. En la Figura III-1 se pueden observar los resultados en
obtencin de azcares para los monmeros de glucosa y xilosa, as como los azcares totales obtenidos de
la hidrlisis.

43

En cuanto a la validez de las metodologas utilizadas, para maz se observa que todos los valores
son similares, independiente de la metodologa, pero presentan errores poco significativos (entre un 10 y
un 13 %). Para residuos de trigo los valores de azcares determinados por el GC son del orden de un 16 %
inferior a los obtenidos con DNS, de la misma forma que en la medicin de glucosa se encontr que los kit
comerciales entregaron un 14 % ms de azcares que el GC. Se debe considerar que la metodologa de
DNS representa una aproximacin de la cantidad de azcares reductores presentes en la muestra a
analizar, dado que su calibracin se hace en glucosa, y el resto de monosacridos podra ser supra o
subvalorado respecto a la absorbancia medida con esta tcnica. Otro punto importante a considerar es que
las experiencias realizadas por el GC corresponden a una experiencia distinta de las muestras analizadas
con los kit comerciales y con DNS, debido a que las primeras fueron realizadas en el Laboratorio de
Qumica Industrial e Ingeniera de Reacciones, bo Akademi y las segundas en el Centro de Ingeniera
Bioqumica y Biotecnologa de la Universidad de Chile. Si bien las experiencias fueron llevadas a cabo
bajo las mismas condiciones, el hecho de que las muestras no sean las mismas puede haber influido de
forma importante en que la cantidad de azcares medidos no sean ms parecidas.

Figura III-1: Azcares producidos por la hidrlisis enzimtica de residuos de maz (Az totales en
GC es la suma de todos los monmeros analizados)

Comparando los resultados obtenidos por los kit comerciales y los obtenidos con el DNS, se
aprecia que los azcares totales medidos por esta ltima metodologa son superiores a los medidos con los
kit, lo cual se justifica debido a que con el mtodo DNS se estn midiendo extremos reductores, sean estos
monomricos o no, mientras que en los kit se est midiendo la cantidad especfica de glucosa y xilosa por
separado.
23 25
126
109
149
133
166 164
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
kits GC DNS
A
z
c
a
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Metodologa de medicin
Xilosa Glucosa Xil + Glu Az totales
44

Figura III-2: Azcares producidos por la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo (Az totales en
GC es la suma de todos los monmeros analizados)

Figura III-3: Composicin de hidrolizado de residuos de maz sin pretratamiento, analizado
mediante GC

Las Figuras III-3 y III-4 muestran las composiciones del hidrolizado (licor) en cuanto a los
monmeros (con la salvedad de sucrosa que es un dmero). Es claro que no importando el residuo, los
mayores monmeros que se obtienen son glucosa y xilosa, correspondiendo a un 86 y un 89 % de los
azcares totales analizados por el GC, en residuos de maz y trigo, respectivamente. La glucosa proviene
principalmente de la hidrlisis de la celulosa, aunque se debe considerar que la hemicelulosa en su
estructura tambin tiene monmeros de glucosa, mientras que la xilosa proviene exclusivamente de la
hemicelulosa. Los restantes monmeros debiesen provenir de la hidrlisis de hemicelulosa o azcares
libres presentes en el material.
30 32
77
92
107
124
143
118
0
50
100
150
200
kits GC DNS
A
z
c
a
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Metodologa de medicin
Xilosa Glucosa Xil + Glu Az totales
3,2%
7,7%
1,4%
70,0%
1,6%
0,2%
15,8%
Arabinosa
Fructosa
Galactosa
Glucosa
Manosa
Sucrosa
Xilosa
45

Figura III-4: Composicin de hidrolizado de residuos de trigo sin pretratamiento, analizado
mediante GC

De las Figuras III-1 y III-2 se aprecia que si bien los valores determinados por cada metodologa
son parecidos, fue necesario realizar un estudio estadstico para poder verificar si los resultados podran
ser comparables. As, para cada comparacin se plante la hiptesis nula: los resultados obtenidos por las
metodologas permiten afirmar que los niveles de azcares son iguales, y por medio de una prueba
conocida como Test Welch (para varianzas desiguales), se vio si el estadstico t sigui una distribucin t
student de f grados de libertad, validando o rechazando as la hiptesis. sta se rechaz cuando el valor
absoluto del estadstico t tom valores mayores que el valor de t de la t-student para /2 = 0,025
(nivel de confianza de un 95 %) a ciertos grados de libertad dependiendo de las varianzas.

2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
1
2
2
2
1
1
1
1
1
;
|
|
\
|
+
+
|
|
\
|
+
|
|
\
|
+
=
+
=
m m n n
m n
f
m n
Y X
t

Ecuacin 1: Estadstico t y grados de libertad f para prueba de medias Test Welch, de varianzas
distintas

En la Ecuacin 1 n y m representan las cantidades de mediciones de la variable (nmero de
repeticiones) en la experiencia 1 y 2,
1
y
2
representan las varianzas de las experiencias, y Y e X

representan las medias de las variables medidas.

3,2%
7,7%
1,4%
70,1%
1,6%
15,9%
Arabinosa
Fructosa
Galactosa
Glucosa
Manosa
Xilosa
46

Tabla III-2: Valores de estadstico t en cada prueba realizada con un nivel de confianza del 95 %
| t | f t
0,975
f
Hiptesis nula
Maz
glucosa GC - kit 1,669 6,47 2,406 Aceptada
xilosa GC - kit 0,721 6,43 2,406 Aceptada
azcares totales GC - DNS 1,116 6,00 2,447 Aceptada
Trigo
glucosa GC - kit 3,186 6,04 2,447 Rechazada
xilosa GC - kit 0,806 4,43 2,673 Aceptada
azcares totales GC - DNS 4,260 7,10 2,365 Rechazada

Como se aprecia en la Tabla III-2, slo dos pruebas fueron rechazadas: los valores de glucosa
medidos por el kit y por el GC y los azcares totales medidos por DNS y el GC, ambas para trigo. Los
rechazos vienen dados claramente por una menor varianza existente en las mediciones de este material, lo
cual puede ser explicado por una mayor homogeneidad del material. El maz, por el contrario posee
partculas de diferente densidad, lo que puede haber afectado la medicin, dispersando los datos y para
esta clase de anlisis hacerlos ms similares. En todo caso, se debe hacer hincapi que los experimentos
realizados con kit DNS y los realizados con cromatgrafo de gases fueron distintos, por lo que gran parte
de las diferencias se pueden explicar por esta va. As, para trabajos futuros se recomienda probar todas
las tcnicas de medicin en un mismo experimento, de forma de poder analizar in situ la validez de cada
metodologa.

Con el objetivo de comparar para residuos de trigo los monosacridos en los test en los que se
encontraron diferencias significativas, se procedi a realizar una normalizacin de la cantidad de azcares
en base a los resultados obtenidos por el cromatgrafo de gases mediante las siguientes expresiones:

Residuos de trigo (glucosa kit GC):
[ ] [ ]
kit GC
Glu Glu = 194 , 1
Ecuacin 2: Relacin entre glucosa medida por kit y medida por GC

Residuos de trigo (DNS GC):
[ ] [ ]
DNS GC
red Az red Az = 204 , 1
Ecuacin 3: Relacin entre azcares totales medida por DNS y medida por GC (sumatoria
monosacridos)

47

3. EFECTO DE LA PRESENCIA DE CIDO Y TEMPERATURA EN EL
PRETRATAMIENTO EN LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL

En esta seccin se analizar el efecto del cido y de la temperatura en el pretratamiento comparado
con pretratamientos control. As, pretratamiento control temperatura se referir a un pretratamiento
realizado con cido pero a temperatura ambiente, mientras que pretratamiento control cido se referir a
un pretratamiento realizado a 121 C pero sin cido sulfrico, pudiendo as determinar el real efecto de
ambos parmetros en la hidrlisis del material.

La Tabla III-3 muestra que la adicin de un pretratamiento con temperatura aumenta
considerablemente los niveles de azcares reductores liberados en el proceso total, debido a que el
pretratamiento convencional (cido 1,00 % v/v, 121 C) libera 317 21 y 407 44 [mg AzRed/g MS],
mientras que los pretratamientos control temperatura liberan slo 179 18 y 134 14 [mg AzRed/g MS],
para residuos de maz y trigo en el proceso total, respectivamente. Los pretratamientos control cido
liberan 215 16 y 198 20 [mg AzRed/g MS], lo que representa un aumento de un 47 % y un 106 %
ms de azcares liberados en el proceso total, para residuos de maz y trigo respectivamente. En
comparacin con los azcares liberados sin pretratamientos, se aprecia que tanto cido como temperatura
juegan roles importantes, toda vez que ambos pretratamientos control logran liberar ms azcares que
sacarificando el material sin pretratatamientos previos, para ambos materiales.

As, se aprecia que la temperatura juega un rol importante en la disrupcin del material,
posibilitando la catlisis de la ruptura de los enlaces de la matriz de lignina y de hemicelulosa. El cido
por s slo a temperatura ambiente, si bien logra hidrolizar parcialmente la hemicelulosa para obtener
azcares reductores, no logra ser superior al efecto de la temperatura, pues esta ltima posibilita la
liberacin de una mayor cantidad de azcares para ambos materiales, como muestra la Tabla III-3. No
obstante, la accin del cido y la temperatura muestra ser de un comportamiento sinrgico a la hora de
atacar el material, toda vez que es el cido el que produce la disrupcin del material y la temperatura
puede generar efectos catalticos en esta reaccin, permitiendo as tener a la celulosa ms expuesta al
ataque enzimtico.

48

Tabla III-3: Nivel de azcares reductores para pretratamientos control
8
(ejemplo de clculo Anexo
L)
Material
cido %
v/v
Temp
[ C]
Tiempo
[min]
Azcares reductores [mg/g material seco]
Rendimiento
total de
azcares,
%
9

Pretratamiento
Hidrlisis
enzimtica
Total
liberado
Maz
s/p s/p s/p 0 0 166 7 166 7 23
0,00 121 60 84 8 131 13 215 16 30
1,00 21 60 60 2 119 16 179 18 25
1,00 121 60 173 24 144 13 317 21 44
Trigo
s/p s/p s/p 0 0 118 6 118 6 18
0,00 121 60 68 4 130 15 198 20 31
1,00 21 60 30 2 104 16 134 14 21
1,00 121 60 224 19 183 28 407 44 63

4. EFECTO DE LA CONCENTRACIN Y TIEMPO DEL PRETRATAMIENTO DE
CIDO DILUIDO

Para cotejar el efecto de la concentracin de cido sulfrico en el pretratamiento, as como el
tiempo de hidrlisis, se realizaron pretratamientos a tres diferentes concentraciones: 0,50, 0,75 y 1,00 %
de cido, por 30 y 60 min, tanto para residuos de maz como de trigo.

4.1. HIDRLISIS CIDA DILUIDA DE RESIDUOS DE MAZ

En la Figura III-5 se pueden apreciar los azcares reductores totales hidrolizados para los residuos
de maz, tanto en el pretratamiento cido como en la hidrlisis enzimtica. Se observa que el mejor
resultado de azcares liberados se alcanza cuando se aplica una concentracin de cido sulfrico de 1,00
% v/v, liberando 317 21 [mg AzRed/g MS], los cuales representan un 44 % del total de azcares tericos
presentes en el material (ver Tabla III-1). Como era de esperar, la cantidad de azcares liberados es
creciente respecto a la cantidad de cido suministrado, no obstante, entre 0,75 y 1,00 % de cido, sin
importar el tiempo de hidrlisis, el incremento es marginal respecto al que se tiene cuando se trata con 0,5
% de cido sulfrico.

8
Pretratamiento control cido: pretratamiento realizado en ausencia de cido sulfrico, a 121 C por 60 min.
Pretratamiento control temperatura: pretratamiento realizado con cido sulfrico al 1,00 % v/v, a temperatura
ambiente por 60 min.
s/p: sin pretratamiento.
9
Calculado respecto a la totalidad de azcares disponibles (celulosa y hemicelulosa) presentes en el material (ver
Tabla III-1)
49

Figura III-5: Azcares reductores totales obtenidos para desechos de maz con pretratamiento
cido, seguido de una hidrlisis enzimtica analizados con DNS

La Tabla III-4 muestra las diferencias significativas
10
, con un 90 % de confianza, existentes entre
los azcares reductores totales medidos en el proceso total de hidrlisis de desechos de maz, es decir,
pretratamiento cido ms hidrlisis enzimtica. De ella, se puede inferir que el pretratamiento que queda
totalmente descartado es el de cido con 0,5 % v/v - 30 min de hidrlisis, debido a que se obtienen menos
azcares, 226 16 [mg/ g de material seco] (ver Figura III-5), presenta diferencias significativas con todo
el resto de los pretratamientos. Del resto, slo existen diferencias significativas entre 1,00 % cido 30
min y 0,50 % cido 60 min, y entre 1,00 % cido 60 min y 0,50 % cido 60 min. As, como en todo
el resto de los pretratamientos cotejados no existen diferencias significativas, se tiene que el
pretratamiento cido 1,00 % por 30 min (311 43 [mg AzRed/g MS], ver Figura III-5) es el ms efectivo,
debido a que no existen diferencias significativas entre ste y el de 60 min, alcanzando as el mismo nivel
de azcares reductores hidrolizados utilizando menos energa debido al menor tiempo de tratamiento. Por
otro lado, si bien entre 0,75 % cido 60 min y 0,75 % cido - 30 min no existen diferencias significativas
con los pretratamientos cidos 1,00 % a ambos tiempos, los primeros (0,75 % cido a ambos tiempos)
tampoco marcaron diferencias respecto del tratamiento con cido 0,50 % 60 min, mientras que los de
1,00 % a ambos tiempos s lo hicieron, mostrndose as el pretratamiento 1,00 % cido 30 min como el
ms efectivo en la liberacin de azcares reductores (ver Tabla III-4).

10
Evaluadas con Test Welch, al igual que en la seccin de validacin de metodologas de medicin de azcares
liberados.
226
295
311
262
301
317
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0,50 0,75 1,00
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Concentracin cido sulfrico en pretratamiento [% v/v]
30 min
60 min
50

Tabla III-4: Resultados del test estadstico practicado a los residuos de maz a nivel de cantidad de
azcares reductores totales, liberados en distintos tiempos y concentraciones de cido sulfrico
11

Tiempo [min]
30 60
Tiempo
[min]
cido sulfrico
[ %, v/v]
[ %, v/v] cido sulfrico
0,50 0,75 1,00 0,50 0,75 1,00
30
0,50

0,75
dif sig
1,00
dif sig no dif sig
60
0,50
dif sig no dif sig dif sig
0,75
dif sig no dif sig no dif sig no dif sig
1,00
dif sig no dif sig no dif sig dif sig no dif sig

Tabla III-5: Niveles de azcares reductores obtenidos para cada etapa de procesamiento de residuos
de maz con pretratamiento de cido diluido
cido
[ %, v/v]
Tiempo
[min]
Azcares reductores [mg/g de material seco]
Rendimiento azcares
totales, %
Pretratamiento
cido (H.A.)
Hidrlisis
enzimtica
Total
liberado
H.A. H.E. Total
0,50
30 94 24 132 11 226 16 14 18 32
60 144 23 119 13 262 29 20 17 37
0,75
30 139 24 156 30 295 52 19 22 41
60 159 33 142 10 301 44 22 20 42
1,00
30 164 40 146 8 311 43 24 20 44
60 173 24 144 13 317 21 24 20 44

Observando ms en detalle el objetivo del pretratamiento en cuanto a la exposicin de celulosa,
por ruptura de la matriz de lignina y hemicelulosa que la encapsulan, no se observan diferencias
importantes entre los pretratamientos con cido al 0,75 y 1,00 % a ambos tiempos. Estos cuatro
pretratamientos son capaces de liberar entre 144 13 y 156 30 [mg AzRed/g MS] en la hidrlisis
enzimtica (HE), lo cual claramente est dentro del rango de error de la muestra. La diferencia es algo ms
significativa a nivel de pretratamiento (ver Tabla III-5), es decir, qu tantos azcares son capaces de ser
liberados en la hidrlisis cida, donde la concentracin de cido juega un rol ms preponderante. El cido
es capaz de romper el enlace ter que une a la lignina con el lignano, permitiendo la ruptura del mismo
liberando hebras de hemicelulosa asociadas por un enlace ster al lignano (Captulo I seccin 2.2.1.3).

11
dif sig: existen diferencias significativas entre los experimentos
no dif sig: no existen diferencias significativas entre los experimentos
51

Estas condiciones de acidez y temperatura tambin permiten depolimerizar la hemicelulosa [6], y as
obtener compuestos como la xilosa, galactosa o arabinosa. De esta forma a una mayor concentracin de
cido en el pretratamiento se liberan ms azcares.

Tabla III-6: Nivel de lignina solubilizada en pretratamiento de cido diluido para residuos de maz
cido,
% v/v
Tiempo
[min]
Lignina cida soluble
[mg/g de material seco]
Rendimiento lignina, %
(respecto al terico)
0,50
30 5,2 4,0 4,4
60 12,7 1,2 10,9
0,75
30 10,1 3,1 8,6
60 11,6 4,3 9,9
1,00
30 8,6 2,9 7,4
60 11,2 0,4 9,6

La Tabla III-6 muestra los niveles de lignina solubilizada, los cuales no superan los 15 [mg/g MS],
representando alrededor de un 10 % del total de la lignina existente. Esto sugiere que lo que ha sufrido el
material en el pretratamiento es un fraccionamiento parcial, que permite disminuir la cristalinidad del
material y dejar la celulosa ms expuesta al ataque enzimtico, pero no una solubilizacin de lignina. Este
resultado es consistente con el de Mussato y colaboradores, [48], donde las prdidas de lignina por
solubilizacin en el pretratamiento cido no superaron el 14 % (ver Tabla I-5).

Respecto al tiempo de pretratamiento, no se pueden apreciar diferencias significativas
importantes. Slo para la concentracin de cido de 0,50 % v/v se observan diferencias entre los 30 y 60
min. Los dems no muestran diferencias significativas (con un 90 % de confianza), debido a que el
material si bien se sigue hidrolizando, probablemente un mayor tiempo podra favorecer la generacin de
compuestos furanos (ver Captulo I seccin 2.3.3.1.2), en particular furfural debido a la descomposicin
de xilosa, el cual es el mayor monmero presente en los licores cidos del pretratamiento (ver Tabla III-7).
Este resultado es acorde con la literatura, tal como se mostr en la seccin anteriormente referenciada (ver
Figura I-15, Saha y colaboradores [41]), donde el incremento de azcares entre 30 y 60 min es marginal
en cuanto a la hidrlisis de xilanos.

Midiendo la cantidad de xilosa y glucosa con kit comerciales, para el pretratamiento cido 1,00 %
v/v, 30 min, 121 C, se liberaron 322 5 [mg de azcares/g MS] en total (ver Tabla III-7), de los cuales
136 21 [mg/g MS] corresponden a xilosa y 186 16 [mg/g de material seco] corresponden a glucosa.
Este resultado es acorde con la cantidad de azcares reductores totales liberados (311 43 [mg AzRed/g
MS], ver Tabla III-5), y si bien es un 3 % inferior, est dentro del rango admisible.
52

enzimtica para residuos de maz pretratados con cido sulfrico 1,00 % v/v por 30 min
Etapas
Azcar [mg/g material seco]
Rendimiento por
etapa Xil + Glu, %
xilosa glucosa Xil + Glu
Azcares
reductores
Pretratamiento cido 104 16 42 23 147 18 164 40
21
Hidrlisis enzimtica 32 13 143 10 175 23 146 8
24
Total hidrolizado 136 21 186 16 322 5 311 43
45

Como se puede observar en la Tabla III-7, la mayor cantidad de xilosa se libera en el
pretratamiento de cido diluido, lo cual est acorde con lo que dice la literatura [3],[6],[11],[48]. Esto se
debe a que la matriz de lignina est unida a la hemicelulosa mediante enlaces tipo ter y ster, donde los
primeros son susceptibles al ataque cido, tal como se mencion anteriormente. La celulosa, en cambio,
est encapsulada por la hemicelulosa y la lignina, por lo que su hidrlisis en glucosa no es esperable en
esta etapa. La glucosa encontrada en el licor cido puede venir directamente de los arabinoxilanos (ver
Figura I-8) que componen qumicamente a los desechos de maz, y no responder a una hidrlisis de
celulosa. Esta ltima reaccin se ve verificada slo con la adicin de enzimas celulolticas, que es donde
se encuentran cantidades ms elevadas de glucosa. Una hidrlisis parcial de hemicelulosas sigue
ocurriendo debido a la capacidad de estas enzimas de hidrolizar en parte este biopolmero, y romper
tambin los enlaces tipo ster que enlazan a los lignanos, [8].

En general, los azcares liberados en el pretratamiento cido estn acorde con lo sealado por
otros autores, [41], sobre todo considerando que los menores niveles de azcares alcanzados responden,
casi de forma indesmentible, a la granulometra del material. En este estudio se utiliz una granulometra
de -5/16 in + 8 mallas (2,38 8,0 mm), ostensiblemente superior a la utilizada en la literatura, que es del
tipo -16 mallas (menor a 1,45 mm), [11],[41]. Esto influye en el pretratamiento cido, debido a la menor
superficie existente para el ataque cido, lo que redunda en menores ndices de eficiencia en ruptura de la
matriz de lignina y de hemicelulosa, [6]. Respecto a la temperatura, en la literatura se observa que si sta
es mayor a 160 C, los ndices de azcares liberados seran superiores; no obstante, la degradacin de los
azcares en compuestos inhibidores de la fermentacin tambin aumenta.

Los resultados de esta hidrlisis cida para residuos de maz, comparados con un pretratamiento
de explosin a vapor del mismo material [76], muestran que en este trabajo la cantidad de azcares
liberados (xilosa y glucosa) son inferiores. Para un pretratamiento realizado a 190 C con 1,6 % v/v de
53

cido por 5 min, previa impregnacin del material (molidos a 0,2 mm) con cido sulfrico al 1,6 % p/p
por toda un noche, los rendimientos de glucosa alcanzaron un 83,5 % mientras que los de xilosa un 49,5
%, alcanzndose as un rendimiento total de azcares igual al 70,6 % (glucosa ms xilosa). Este valor es
mayor que el 44 % de rendimiento alcanzado con un pretratamiento cido para este mismo material,
debido al mayor nivel de fraccionamiento que sufre el material en el pretratamiento de explosin a vapor;
ste permite una mayor digestibilidad de la celulosa en el pretratamiento enzimtico, donde justamente se
registran las mayores diferencias entre ambos pretratamientos. De todas maneras tambin se debe
considerar la mayor concentracin de cido utilizada en esta experiencia

4.2. HIDRLISIS CIDA DILUIDA DE RESIDUOS DE TRIGO

Los mejores resultados obtenidos para este material se alcanzaron con un pretratamiento cido al
1,00 % v/v y tiempo de 60 min (temperatura 121 C), registrndose en total 407 44 [mg AzRed/g MS],
tal como se aprecia en la Figura III-6. Este nmero representa un rendimiento de un 63 % en comparacin
con la cantidad de celulosa y hemicelulosa tericos que componen los residuos de trigo (ver Tabla III-1).
Al ir aumentando tanto el tiempo como la concentracin de cido en el pretratamiento son mayores los
ndices de azcares reductores liberados por el proceso completo, tal como se puede apreciar en la Figura
III-6.

Figura III-6: Azcares reductores totales obtenidos para desechos de trigo con pretratamiento
cido, seguido de una hidrlisis enzimtica analizados con DNS
Analizando las cantidades de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica, entre los
pretratamientos con 0,75 y 1,00 % de cido a ambos tiempos (30 y 60 min), no existen diferencias
importantes (ver Tabla III-8). Esto refleja que, a nivel de exposicin de celulosa al tratamiento enzimtico,
266
321
361
333
382
407
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0,50 0,75 1,00
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Concentracin cido sulfrico en pretratamiento [% v/v]
30 min
60 min
54

no hay grandes diferencias, por lo que el pretratamiento cido a estas condiciones es invariante a nivel de
las cantidades de azcares que en esta etapa es posible liberar. No obstante, a nivel del proceso total s
existen diferencias significativas (ver Tabla III-9), las cuales son del todo atribuidas a los azcares
liberados en la etapa del pretratamiento, que vienen de la hidrlisis de los componentes arabinoxilanos.
Esto quiere decir que las condiciones de cido 0,75 y 1,00 %, a ambos tiempos, si bien eran invariables a
nivel de sacarificacin del material pretratado, no lo son a nivel de la hidrlisis de componentes xilanos en
el pretratamiento. Los resultados muestran que a mayor concentracin de cido, mayores son las
cantidades de azcares liberados en el pretratamiento, aumentando entre un 22 y un 36 %, debido a la
ruptura de los enlaces tipo ter que unen la lignina con los lignanos, y a su vez estos con los azcares.

Tabla III-8: Niveles de azcares reductores obtenidos en cada etapa de procesamiento de residuos
de trigo con pretratamiento cido

La Tabla III-9 muestra la existencia de diferencias significativas, a nivel de azcares reductores
totales medidos en el proceso, que fueron observadas entre cada uno de los pretratamientos cidos
realizados a residuos de trigo. Como se puede apreciar, entre casi todos los pretratamientos existen
diferencias significativas, con un nivel de confianza del 90 %, con la salvedad de los pretratamientos 0,50
% - 60 min y 0,75 % - 60 min, y entre 1,00 % - 60 min y 0,75 % - 60 min, pudiendo afirmar as que
tiempo y temperatura son variables que afectan el rendimiento de azcares liberados.

cido
%, v/v
Tiempo
[min]
Azcares reductores [mg/g de material seco]
Rendimiento azcares
totales, %
Pretratamiento
cido (H.A.)
Hidrlisis
enzimtica
Total
liberado
H.A. H.E. Total
0,50
30 119 8 147 12 266 16 18 23 41
60 170 6 163 19 333 16 26 25 51
0,75
30 158 11 163 14 321 8 24 25 49
60 197 6 185 16 382 21 31 28 59
1,00
30 184 8 177 12 361 7 28 27 55
60 224 19 183 28 407 44 35 28 63
55

Tabla III-9: Resultados del test estadstico aplicado a los residuos de trigo para cantidad de
azcares reductores totales liberados en distintos tiempos y con diferentes concentraciones de cido
sulfrico
Tiempo [min]
30 60
Tiempo
[min]
cido sulfrico
[ %, v/v]
cido sulfrico [ %, v/v]
0,50 0,75 1,00 0,50 0,75 1,00
30
0,50
0,75 dif sig
1,00 dif sig dif sig
60
0,50 dif sig dif sig dif sig
0,75 dif sig dif sig dif sig no dif sig
1,00 dif sig dif sig dif sig dif sig no dif sig

Los pretratamientos que alcanzaron los mejores rendimientos de acuerdo a la Figura III-6 son los
pretratados con cido al 0,75 y 1,00 %, ambos por 60 min. Sin embargo, el pretratamiento 0,75 % - 60 min
no mostr diferencias significativas con el pretratamiento 0,50 % - 60 min, por lo que se puede decir que
el mejor pretratamiento fue logrado con cido al 1,00 % y 60 min, debido a que este ltimo s registr
diferencias significativas con el pretratamiento 0,50 % - 60 min (ver Tabla III-9).

Se debe apreciar que para residuos de trigo existe una mayor cantidad de azcares liberados en la
etapa de pretratamiento cido que en los de maz, lo cual puede ser justificado por la estructura especial
que tienen los residuos de trigo respecto a las conexiones existentes entre lignina y arabinoxilanos
(hemicelulosas). Se debe recordar que en el Captulo I seccin 2.2.1.3 se mencion que los residuos de
trigo pueden presentar niveles de hasta un 50 % de arabinoxilanos unidos directamente por un enlace tipo
ter, de susceptibilidad cida, a la matriz de lignina sin intermediarios lignanos (enlaces tipo ster de
susceptibilidad bsica, [8]). Este aspecto es importantsimo para explicar los mayores niveles de azcares
registrados para residuos de trigo en la etapa de hidrlisis cida, debido a que este tipo de enlace de
susceptibilidad cida permitira la liberacin inmediata de los azcares en estas condiciones.

Otro aspecto que podra explicar las diferencias registradas entre maz y trigo es la cristalinidad
del material. Si bien este parmetro no fue medido, como observacin cualitativa se debe decir que los
residuos de maz estn compuestos por partculas ms densas que las de trigo, a la vez que las primeras
tienen forma ms homognea, tal como se aprecia en la Figura III-7. As, la superficie de ataque del cido
56

en los residuos de maz es menor que para los de trigo, lo que puede influir en los ndices de azcares
liberados en esta etapa.

En relacin al tiempo de pretratamiento, se observa un aumento continuo en los niveles de
azcares reductores liberados entre 0,50 y 1,00 % de cido, tanto para 30 como para 60 min (ver Tabla
III-8). En contraste con los residuos de maz, los residuos de trigo parecen hidrolizar ms material con el
transcurso del tiempo y no llegar a un nivel de estancamiento en la liberacin de azcares que pudiera
hacer pensar en la generacin de furanos por descomposicin de azcares, aunque ni HMF ni furfural
fueron analizados para confirmar esta teora. As, sera recomendable realizar la medicin de estos
compuestos posterior al pretratamiento mediante cromatografa HPLC.

Al igual que para los residuos de maz, para un pretratamiento en especfico se midi la cantidad
de xilosa y glucosa liberados tanto en el pretratamiento de cido diluido como en la hidrlisis enzimtica.
Para el material pretratado con cido a concentracin 1,00 % v/v, 121 C y 60 minutos se obtuvo en total
212 16 [mg AzRed/g MS] de xilosa, mientras que de glucosa se obtuvo 251 6 [mg AzRed/g MS], tal
como se aprecia en la Tabla III-10. Esto es coherente con la literatura, y similar a lo ocurrido con los
residuos de maz, donde la mayor cantidad de xilosa (78 % del total de xilosa liberada) se obtiene en el
pretratamiento de cido diluido, debido a la hidrlisis de arabinoxilanos, mientras que la mayor cantidad
de glucosa (80 % del total de glucosa liberada) se obtiene en la sacarificacin enzimtica.

En total se liberaron 463 10 [mg Az/g MS] entre glucosa y xilosa, mientras que con DNS se
midieron 407 44 [mg/g MS] de azcares reductores totales. Este valor es inferior en un 8 % al registrado
con los kit, sin contar la presencia de otros monosacridos. Esta diferencia es ms grande que para los
residuos de maz, y se escapa de los rangos de dispersin (varianza) obtenidos. No obstante, esto es
concordante con las diferencias observadas en los azcares medidos por las distintas metodologas en el
experimento de validacin. Una justificacin a la diferencia de valores es que la tcnica de DNS mide
Maz Trigo
Figura III-7: Residuos de maz y trigo
57

extremos reductores, sean estos o no azcares monomricos. As, el kit est midiendo la cantidad total de
glucosa y xilosa, pero no otros extremos reductores presentes que la tcnica de DNS si cuantifica.

enzimtica para residuos de trigo pretratados con cido sulfrico 1,00 % v/v por 60 min
Etapa
Azcar [mg/g de material seco]
Rendimiento por
etapa Xil + Glu, %
xilosa glucosa Xil + Glu
Azcares
reductores
Pretratamiento cido 166 5 49 27 215 22 224 19
33
Hidrlisis enzimtica 46 13 201 21 247 29 183 28
38
Total hidrolizado 212 16 251 6 463 10 407 44
71

Tabla III-11: Niveles de lignina solubilizada en pretratamiento cido para residuos de trigo

La lignina solubilizada en este pretratamiento alcanza su mayor concentracin con cido al 1,00 %
por 60 min, alcanzando los 27,6 0,6 [mg/g de material seco], los cuales representan un 22 % de la
lignina presente en el material (ver Tabla III-11). Este valor es mayor respecto al obtenido en residuos de
maz, lo que reflejara un mejor nivel de hidrlisis de los residuos de trigo en estas condiciones, toda vez
que se logra solubilizar ms lignina y se obtienen mayores niveles de azcares. Tambin es clara la
diferencia existente entre el tiempo de hidrlisis, donde para 60 min existe en promedio una liberacin de
lignina un 50 % que respecto a 30 min.

La literatura existente muestra azcares liberados del orden de 485 22 [mg AzRed/g MS], para
un pretratamiento con cido diluido al 0,75 % v/v por 60 min a 121 C de residuos de trigo, [11]. Este
valor, es acorde con los 463 10 [mg AzRed/g MS] de azcares (xilosa y glucosa) obtenidos en este
experimento. No obstante, se debe considerar la granulometra utilizada en el experimento de Saha [11], la
cual fue de -16 mallas (menor a 1,45 mm), inferior a los -5/16 in + 8 mallas (2,38 8,0 mm) utilizados en
este experimento. Una menor granulometra implica una mayor superficie especfica, y con ello mayores
ndices de hidrlisis del material en el pretratamiento y su posterior sacarificacin. La cantidad de
cido,
% v/v
Tiempo
[min]
Lignina cida soluble
[mg/g de material seco]
Rendimiento de lignina %,
(respecto al terico)
0,50
30 15,2 1,7 12,2
60 22,6 0,8 18,1
0,75
30 16,9 1,9 13,5
60 25,4 0,6 12,3
1,00
30 19,3 0,6 15,4
60 27,6 0,6 22,1
58

azcares disponibles en ambos materiales son distintas, debido a que en el experimento de Saha [11]
existen 762 0,42, mientras que para este trabajo de tienen 648 8,5 [mg AzRed/g MS]), lo que refleja
diferencias estructurales internas en el material, por lo que no se puede inferir que la granulometra no
afecta en la hidrlisis de este tipo de material.

Comparando con un pretratamiento de explosin a vapor [77], el rendimiento de azcares fue de
prcticamente 100 %, con 527 [mg AzRed/g MS] para residuos de trigo pretratados con 190 C y 10 min,
y granulometra similar a la utilizada en este trabajo. As, para este pretratamiento existe un mayor nivel
de hidrlisis de hemicelulosas y un mayor acceso de la celulosa al ataque enzimtico, debido al gran
fraccionamiento que sufre el material por la exposicin a elevadas temperaturas y presiones.

4.3. EFECTO DE LA ADICIN DE UN PRETRATAMIENTO ALCALINO SEGUIDO A
UNO CON CIDO DILUIDO EN LA SACARIFICACIN DE AMBOS RESIDUOS

Se estudi el efecto de la adicin de un pretratamiento bsico seguido a uno con cido diluido, con
el objetivo de observar si la supuesta remocin de lignina y de hemicelulosas del material afecta la
digestibilidad enzimtica del material pretratado. Previamente, Mussato y colaboradores [48] investigaron
la remocin de lignina y hemicelulosa con un pretratamiento bsico adicional, obteniendo finalmente un
material slido con un contenido de celulosa del orden de un 93 %. Como ya anteriormente se seal, la
presencia de lignina en la sacarificacin induce la inactivacin de las enzimas celulolticas, por adicin de
las mismas a la matriz de lignina, perdiendo actividad y obteniendo un menor ndice de azcares
liberados. En la Tabla III-12 se muestran los ndices de lignina y hemicelulosa hidrolizados para un
pretratamiento bsico con hidrxido de sodio (NaOH) a 2,0 % p/v, a 121 C por 60 minutos.

Tabla III-12: Niveles de lignina y azcares reductores solubilizados en pretratamiento bsico con
NaOH 2,0 % p/v, a 121 C por 60 min
Residuos
Pretratamiento cido Pretratamiento bsico
cido,
% v/v
Tiempo
[min]
Temp [
C]
NaOH
% p/v
Tiempo
[min]
Temp
[ C]
Lignina
[mg/g
MS]
Azcares
reductores
[mg/g MS]
Maz
1,00 60 121 2,00 60 121 219 15 4,7 2,8
Trigo
1,00 30 121 2,00 60 121 185 8 4,6 0,6

Los resultados de la Tabla III-12 muestran un alto ndice de solubilizacin de lignina, sin una
prdida importante de azcares reductores, los cuales en masa no superan el 0,5 % del total de azcares
presentes en el material. La lignina solubilizada muestra valores marcadamente superiores respecto a los
59

obtenidos con la hidrlisis cida, lo que sugiere que la digestibilidad del material podra ser superior
posterior a este segundo pretratamiento. La cantidad de lignina solubilizada corresponde a un 185 % y 148
% de la lignina presente para residuos de maz y trigo, respectivamente. Estos valores superiores al 100 %
no son inesperados entendiendo la naturaleza de la metodologa utilizada, debido a que la lignina soluble
fue medida en la relacin a la absorbancia registrada a 205 nm, longitud de onda a la cual otros
componentes del hidrolizado (azcares o furfurales) tambin absorben, por lo que interfieren en la
medicin global [68]. As, para obtener resultados ms confiables es conveniente realizar la medicin de
lignina soluble mediante cromatografa HPLC, de forma de poder cuantificar cada uno de los compuestos
presentes en el hidrolizado.

Esta extraccin casi total de lignina est acorde con los resultados obtenidos por Mussato y
colaboradores, [48], donde la cantidad de lignina solubilizada en esta etapa alcanza el 93,9 %, y del 94,7
% sumadas hidrlisis cida y alcalina (ver Tabla I-5). Como resultado cualitativo se debe decir que el
color del material hidrolizado posterior a la hidrlisis alcalina es blanco, lo que manifiesta la mayor
presencia msica de celulosa en el material frente a la lignina remanente en el mismo. Con el objetivo de
confirmar estos resultados es necesario realizar experimentos de espectroscopia de masa, para as
determinar la composicin qumica estructural de celulosa, hemicelulosa y lignina en el material
transcurridos los pretratamientos practicados.

Respecto a los azcares liberados, se puede decir que estos no superan el 0,5 % como
anteriormente se seal, resultados acorde con los de Mussato y colaboradores [48], donde se obtuvieron
prdidas no superiores al 2,0 % en masa.

Para los residuos de trigo, se aprecia que el pretratamiento adicional no favorece la obtencin de
mayor cantidad de xilosa en el proceso global. Comparando la cantidad de xilosa obtenida en la hidrlisis
enzimtica, es claro el menor nivel de xilosa hidrolizada cuando se adiciona un pretratamiento bsico, (ver
Tabla III-13). Una explicacin a ello es que en la etapa de pretratamiento bsico la xilosa pudo ser
hidrolizada, pero las condiciones de temperatura llevaron rpidamente a la formacin de compuestos
furanos. Esto podra ser apoyado por la mayor cantidad de lignina encontrada en el hidrolizado, lo que
podra ser explicado por la absorcin a 205 nm de compuestos furfurales, [68].

60

Tabla III-13: Niveles de glucosa y xilosa liberados en las distintas etapas de la hidrlisis de material
lignocelulsico.
Etapas
Residuos de trigo Residuos de maz
Xilosa Glucosa Xil + Glu Xilosa Glucosa Xil + Glu
Pretratamiento cido 166 5 49 27 215 22 104 16 42 23 147 18
Hidrlisis enzimtica 46 13 201 21 247 29 32 13 143 10 175 23
Total hidrolizado 212 16 251 6 463 10 136 21 186 16 322 5
Etapas
Pretratamiento bsico adicional
Pretratamiento cido 166 5 49 27 215 22 104 16 42 23 147 18
Hidrlisis enzimtica 8 1 211 13 219 12 11 2 206 10 217 7
Total hidrolizado 174 6 260 25 434 13 115 14 248 20 354 10

Para los residuos de maz, en cambio, se aprecia una mejora importante en los niveles de glucosa
liberados, siendo un 44 % superior respecto a material solamente tratado con cido (ver Tabla III-13). Esto
sustenta el argumento de que con este pretratamiento existe una mejor depolimerizacin de la celulosa en
la etapa enzimtica, debido a la menor presencia de lignina en el material. Respecto a la hidrlisis de
xilosa, se aprecia que la cantidad liberada tambin manifiesta un retroceso, al igual como se obtuvo para
los residuos de trigo, sin embargo, esta diferencia est dentro de los rangos de error calculados en ambos
anlisis.

La cantidad de glucosa y xilosa liberada en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo y maz,
previamente tratados con cido sulfrico y luego con hidrxido de sodio, son muy similares, pudindose
decir que son estadsticamente iguales pues estn dentro de los rangos de error (ver Tabla III-13). As,
ambos pretratamientos modifican de tal forma el material, retirando gran cantidad de las hemicelulosas y
la lignina presentes, que lo nico que debiera quedar es una masa de celulosa, justificado por el color
blanco de la masa resultante como se seal anteriormente. De su hidrlisis por lo tanto, es perfectamente
posible esperar que para residuos agrcolas con similares cantidades de celulosa despus de esta clase de
pretratamiento las cantidades de glucosa y xilosa sean relativamente iguales en su sacarificacin.

Volviendo a la cantidad de lignina solubilizada, se aprecia que en el licor del pretratamiento cido
existira una gran cantidad de lignina solulibilizada (cido ferlico, cido p-cumrico, vanilina) y la
posible existencia de compuestos furfurales, tales como hidroximetilfurfural o furfural debido a la
descomposicin de azcares [8],[33]. Si bien el gasto energtico para la obtencin de azcares es superior
al del pretratamiento cido, debido a la adicin de una etapa de pretratamiento a condiciones de energa
similares, la solubilizacin de lignina en esta etapa sugiere que este licor podra seguir siendo procesado,
en bsqueda de separar estos cidos y obtenerlos como subproductos del proceso, siendo as este mayor
61

requerimiento energtico subsanado por este hecho, por lo que sera recomendable realizar estudios de
factibilidad tcnico econmica para evaluar esta posibilidad. Tal como se seal en el Captulo I seccin
2.7, referente a biorefineras, la solubilizacin de lignina es posible realizarla mediante tratamiento
qumicos, como el que se practic en este estudio. No obstante, consideraciones de tipo ambiental llevan a
que este tipo de pretratamiento no sea del todo practicado, debido a que requieren neutralizacin de aguas
para que puedan ser descartadas en el proceso. Un diagrama de las distintas potencialidades de los
pretratamientos practicados es el que se muestra a continuacin:

Figura III-8: Diagrama de una biorefinera de residuos agrcolas con pretratamiento cido y
alcalino (azul: corrientes lquidas, rojo: material slido, negro: mezcla de material slido y lquido)

CIDO DILUIDO

Se estudi la cintica de sacarificacin enzimtica de residuos agrcolas pretratados tanto con
cido sulfrico diluido, as como de material pretratado con una hidrlisis alcalina de forma adicional, con
el objetivo de analizar la liberacin de azcares reductores en el tiempo y as observar si tanto la
concentracin, como el tiempo de pretratamientos influyen en la reaccin enzimtica.
62

As, se evaluaron distintas curvas que se ajustaron a los datos experimentales, utilizando el
software CurveExpert 1.3, obtenindose que la Ecuacin 4 fue la que mejor se ajust a los datos
experimentales para todas las experiencias realizadas.

[ ] [ ] { } ( ) t k red Az red Az
mx
= exp 1
Ecuacin 4: Modelo exponencial de sacarificacin enzimtica

La Ecuacin 4 viene de integrar la Ecuacin 5, utilizando como condicin inicial que en t = 0 no
existen azcares liberados. En ella, [Az red] representa la cantidad de azcares reductores liberados ([mg
Az red/g MS]), donde [Az red]
mx
representa la cantidad de azcares reductores mximos posibles a
liberar, y que es caracterstico de cada pretratamiento realizado. La constante k ([h
-1
]) es un parmetro
cintico, y que explica la velocidad o tasa a la que se van liberando azcares en la reaccin.

[ ]
[ ] [ ] ( ) red Az red Az k
dt
red Az d
mx
=
Ecuacin 5: Modelo diferencial de sacarificacin enzimtica

4.4.1. Residuos de maz

La Figura III-9 muestra los azcares reductores, medidos con DNS, de la hidrlisis enzimtica de
residuos pretratados con cido sulfrico a distintas concentraciones, por 30 min a 121 C. De forma
adicional, se muestra la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido al 1,00 % v/v, 121
C por 30 min, y posteriormente tratados con hidrxido de sodio 2,00 % p/p. Las curvas fueron ajustadas
al modelo exponencial de la Ecuacin 4, obtenindose correlaciones superiores a 0,97 (ver Tabla III-14).

Figura III-9: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 30 min a 121 C, y otro con pretratamiento alcalino
0
50
100
150
200
250
0 12 24 36 48 60 72 84 96
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Tiempo hidrlisis enzimtica [h]
0,50 %
0,75 %
1,00 %
cido 1,00 % v/v +
NaOH 2,0 % p/v
63

La Figura III-9 muestra que, tal como se seal anteriormente, no existen grandes diferencias
entre los pretratamientos con cido a 0,75 y 1,00 % v/v. La cintica de reaccin es lenta, y recin a las 72
horas los azcares liberados comienzan a estabilizarse. No obstante, el pretratamiento adicional con
hidrxido de sodio al 2,0 % p/v acelera, de forma importante, la liberacin de azcares reductores,
alcanzando su mayor valor a las 12 horas de hidrlisis. Esto induce una reduccin del tiempo en 60 horas
en la hidrlisis enzimtica, junto con una mayor cantidad de azcares liberados, del orden de un 30 %
superior.

Tabla III-14: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con
cido sulfrico y base diluida
Pretratamiento cido
Pretrat
alcalino
Parmetros cinticos
Coeficiente
r
2

cido
[ %, v/v]
Tiempo
[min]
[Az red]
mx

[mg/g DS]
k
[1/h]
0,50 30

129 0,040 0,973
0,75 30

163 0,034 0,984
1,00 30

158 0,031 0,983
0,50 60

154 0,029 0,997
0,75 60

171 0,032 0,995
1,00 60

163 0,031 0,992
1,00 30 X 202 0,301 0,996

A nivel de aceleracin de la reaccin, no existe una mejora atribuible a la concentracin de cido o
bien al tiempo de pretratamiento (ver Anexo M). Para 60 min existe una mejora en la hidrlisis de
azcares con 0,75 % v/v de cido, sin embargo, este mayor valor se puede deber a la mayor disposicin de
azcares en este material, debido a que en el pretratamiento, por ejemplo, para 1,00 % v/v se extrajo una
mayor cantidad de azcares.

La aceleracin de la hidrlisis enzimtica con un pretratamiento bsico adicional se explica por la
lignina solubilizada en este ltimo pretratamiento. As, la cantidad de enzimas por unidad de masa es
superior para este pretratamiento, pudiendo stas atacar directamente a la celulosa y hemicelulosa
remanente, sin perder actividad por blindaje de las enzimas celulolticas a la lignina, cosa que debe ocurrir
con el material pretratado slo con cido sulfrico diluido, repercutiendo en un bajo rendimiento y en
alcanzar los mayores niveles de azcares en tiempos ms prolongados.

El coeficiente k representa la tasa de liberacin de azcares reductores en la hidrlisis enzimtica,
siendo claramente dependiente de la actividad enzimtica suministrada (mantenida invariante para todos
los pretratamiento aplicados igual a 65 [FPU/g de celulosa] de celulasa y 97 [CBU/g de celulosa] de
64

celobiasa), y del pretratamiento aplicado al material. Sin importar la concentracin del cido en el
pretratamiento, ni del tiempo del mismo, la tasa de rendimiento k se mantiene relativamente constante, no
as la cantidad de azcares mxima liberada ([Az red]
mx
), la cual tiene algunas diferencias, que se deben
al efecto del pretratamiento. Analizando la adicin de pretratamiento bsico, k cambia notablemente (un
orden de magnitud), mostrando una clara aceleracin de la sacarificacin del material pretratado, debido a
la mayor disponibilidad de celulosa para el ataque enzimtico.

Respecto al coeficiente [Az red]
mx
se calcul su dependencia en relacin a la concentracin de
cido sulfrico en el pretratamiento, debido a las diferencias manifiestas que se aprecian en la Tabla
III-14. As, se ajustaron distintos modelos con el software CurveExpert 1.3, donde el mejor modelo que se
ajust a este coeficiente uno del tipo polinmico de segundo grado. De esta forma, la expresin cintica
que modela la sacarificacin enzimtica de residuos de maz pretratados con cido diluido por 30 o 60 min
son las siguientes:

Hidrlisis cida, 30 min, rango de cido 0,50 1,00 % v/v:

[ ] [ ] [ ] ( ) { } ( ) t SO H SO H red Az + = 033 , 0 exp 1 312 526 56
2
4 2 4 2

Ecuacin 6: Expresin para la liberacin de azcares reductores en la hidrlisis enzimtica de
residuos de maz pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 30 min (carga
enzimtica celulasa: 65 FPU/g de celulosa y celobiasa: 97 CBU/g de celulosa)

Hidrlisis cida, 60 min, rango de cido 0,50 1,00 % v/v:

2
4 2 4 2

residuos de maz pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 60 min (carga

Donde t representa el tiempo en horas transcurrido de la hidrlisis enzimtica y [H
2
SO
4
] es la
concentracin del cido sulfrico suministrada en el pretratamiento, en % v/v.

En las expresiones cinticas antes mencionadas el parmetro k se mantuvo constante, igual a
0,033 0,004 [h
-1
]. En la siguiente figura se muestran la superficie que alcanzan los niveles de azcares
reductores hidrolizados en la hidrlisis enzimtica de estos residuos pretratados, graficados con la
herramienta Maple 7.
65

Figura III-10: Niveles de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de
maz pretratados con cido sulfrico 0,50 1,00 % v/v, para 30 y 60 min segn modelo planteado

De la Figura III-10 se aprecia que en la superficie de trabajo existen mximos locales, que bajo el
modelo ajustado, representan valores mximos de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica
de residuos de maz pretratados con cido diluido en las condiciones llevadas a cabo experimentalmente
(cido sulfrico 0,50 1,00 % v/v, 121 C, por 30 y 60 min). As, con la herramienta Solver de Microsoft
Office Excel 2007 de las Ecuacin 6 y Ecuacin 7 es posible encontrar dichos mximos, los cuales se
muestran en la Tabla III-15. Las diferencias entre ambos tiempos se observan a concentraciones cercanas a
0,5 % v/v de cido, siendo similares en el resto del campo estudiado (ver Figura III-10).

El modelo muestra diferencias mnimas a nivel de azcares reductores liberados en la hidrlisis
enzimtica (3 %) de residuos de maz pretratado con cido diluido por 30 60 min a 121 C, siendo esta
cantidad de cido similar para ambos tiempos (0,80 y 0,84 % v/v, ver Tabla III-15).

Tabla III-15: Condiciones de pretratamiento cido diluido que permiten maximizar la cantidad de
azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de maz, segn modelo
planteado
Condiciones pretratamiento cido diluido Hidrlisis enzimtica
Tiempo [min]
cido
sulfrico,
% v/v
Temperatura
[ C]
Tiempo
[h]
Azcares reductores
liberados [mg/g MS]
30 0,84 121 72 150
60 0,80 121 72 155

66

4.4.2. Residuos de trigo

La Figura III-11 muestra los azcares reductores, medidos con DNS, de la hidrlisis enzimtica de
residuos pretratados con cido sulfrico a distintas concentraciones, por 60 min a 121 C. De forma
adicional, se muestra la hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido al 1,00 % v/v, 121
C por 60 min, y posteriormente tratados con hidrxido de sodio 2,00 % p/p. Las curvas fueron ajustadas
al modelo exponencial de la Ecuacin 4, obtenindose correlaciones superiores a 0,99 (ver Tabla III-16).

Figura III-11: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido sulfrico
a distintas concentraciones, por 60 min a 121 C, y otro con pretratamiento alcalino

Observando la figura anterior se aprecia que, al igual que para los residuos de maz, no existen
grandes diferencias entre los pretratamientos con cido a 0,75 y 1,00 % v/v. La cintica de reaccin es
lenta, y recin a las 72 horas los azcares liberados comienzan a estabilizarse. As, de forma similar, el
pretratamiento adicional con hidrxido de sodio al 2,0 % p/v acelera, de forma importante, la cantidad de
azcares reductores liberados, alcanzando su mayor valor a las 12 horas de hidrlisis (60 horas antes que
slo con pretratamiento cido), no obstante, no mejora la cantidad total de azcares a liberar.

0
50
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100
A
z
c
a
r
e
s

r
e
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
0,50 %
0,75 %
1,00 %
cido 1,00 % v/v +
NaOH 2,0 % p/v
67

Tabla III-16: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con
cido sulfrico y base diluida
Pretratamiento cido
Pretrat
alcalino
Parmetros cinticos
Coeficiente
r
2

cido %, v/v Tiempo[min] [Az red]
mx
[mg/g MS] k [1/h]
0,50 30

167 0,031 0,992
0,75 30

182 0,030 0,990
1,00 30

216 0,027 0,993
0,50 60

189 0,032 0,995
0,75 60

212 0,032 0,988
1,00 60

214 0,032 0,996
1,00 60 X 204 0,308 0,991

En anexo (ver Anexo M) se puede apreciar la cintica de sacarificacin de residuos de trigo
pretratados con cido diluido por 30 min, los cuales si bien tienen un comportamiento similar que los
residuos pretratados por 60 min, se aprecia que para este menor tiempo existen diferencias ms grandes
entre 0,75 y 1,00 % v/v de cido (del orden de un 20 %).

Respecto a los parmetros cinticos, el comportamiento es similar a los residuos de trigo. La
constante cintica k se mantiene constante para todos los pretratamientos cidos, y cambia en un orden de
magnitud cuando se agrega un pretratamiento bsico. Todo esto justificado por la gran solubilizacin de
lignina en el pretratamiento bsico, lo que permite que las enzimas ataquen a una celulosa ms libre. El
parmetro [Az red]
mx
tiene diferencias atribuibles a la concentracin de cido, cuya dependencia es
calculada de la misma forma que para los residuos de maz, teniendo como ajuste un polinomio cuadrtico
como el de mejor comportamiento.

En dichas expresiones cinticas (Ecuacin 8 y Ecuacin 9) el parmetro k se mantuvo constante,
igual a 0,031 0,002 [h
-1
], lo que representa un error del 6 %. En la Figura III-12 se muestra el grfico de
niveles de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de estos residuos pretratados, en
funcin de la concentracin de cido en el pretratamiento y el tiempo de hidrlisis enzimtica, gracias al
software Maple 7.

Hidrlisis cida, 30 min, 0,50 1,00 % v/v:

[ ] [ ] [ ] ( ) { } ( ) t SO H SO H red Az + + = 031 , 0 exp 1 152 130 194
2
4 2 4 2

residuos de trigo pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 30 min (carga
68

Hidrlisis cida, 60 min, 0,50 1,00 % v/v:

2
4 2 4 2

residuos de trigo pretratados con cido diluido (0,50 1,00 % v/v) a 121 C por 60 min (carga

Figura III-12: Niveles de azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de
trigo pretratados con cido sulfrico 0,50 1,00 % v/v, para 30 y 60 min segn modelo planteado

La Figura III-12 muestra la superficie que dibujan los niveles de azcares reductores liberados en
la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido diluido, en funcin de la concentracin
de cido en el pretratamiento y del tiempo de la hidrlisis enzimtica. Se debe destacar que para un
pretratamiento cido de 30 min, en el rango de las 70 horas de hidrlisis enzimtica, se observa que la
superficie es convexa, a diferencia de todas las otras que son cncavas, encontrando un mximo dentro del
campo estudiado, y no en los bordes del mismo. Esto puede deberse a que si se hubiese investigado alguna
concentracin de cido ms elevada (por ejemplo 1,25 % v/v), probablemente se hubiese encontrado una
merma en la cantidad de azcares liberados, fruto de la mayor hidrlisis de hemicelulosas en el
pretratamiento (menor disposicin de azcares para sacarificar).

De la misma forma que para residuos de maz, se determin la existencia de valores mximos en
la liberacin de azcares reductores en la sacarificacin, los cuales se aprecian en la Tabla III-17. As, se
observa que nuevamente, al igual que para residuos de maz, la diferencia entre ambos pretratamientos es
69

mnima a nivel de la mxima cantidad de azcares reductores hidrolizables, sin embargo, para 60 min se
puede utilizar un 10 % menos de cido sulfrico, aunque el gasto en energa es ms importante. Es
importante repetir que el que ambos pretratamientos permitan liberar la misma cantidad de azcares
reductores en la sacarificacin, no indica que en el proceso global esto tenga el mismo comportamiento.
La liberacin de azcares en el pretratamiento permite establecer diferencias significativas entre ambas
alternativas (ver Tabla III-9), siempre y cuando el objetivo sea liberar ms azcares en el proceso global,
con vas a fermentarlos a etanol. Por el contrario, si el objetivo del pretratamiento es liberar la celulosa del
encapsulamiento de la lignina y los azcares liberados son utilizados para la generacin de furfural, como
se aprecia en el diagrama de la Figura III-8, con la sola utilizacin de los azcares provenientes de la
sacarificacin para fermentar etanol, la eleccin de cul pretratamiento elegir con el objetivo de la
produccin de este biocombustible, de acuerdo a este resultado podra ser distinta.

Tabla III-17: Condiciones de pretratamiento cido diluido que permiten maximizar la cantidad de
azcares reductores liberados en la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo, segn modelo
planteado
Condiciones pretratamiento cido diluido Hidrlisis enzimtica
Tiempo [min]
cido
sulfrico,
% v/v
Temperatura
[ C]
Tiempo
[h]
Azcares reductores
liberados [mg/g MS]
30 1,00 121 72 192
60 0,90 121 72 191

5. PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS

Tanto los residuos de maz como los de trigo fueron dispuestos en un pretratamiento con lquidos
inicos, a objeto de investigar la capacidad de estos solventes de romper la matriz de lignina y dejar a la
celulosa ms accesible al ataque enzimtico. Para ello se estudi fundamentalmente el solvente cloruro de
etilmetilimidazolio [EMIM
+
][Cl
-
], a distintos tiempos (30 y 60 min) y con distintas temperaturas (80, 121
y 150 C). Tambin se estudi el efecto de hidrxido de tricaprilmetilamonio [Aliquat
+
][OH
-
].

70

5.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DEL PRETRATAMIENTO EN LA
SACARIFICACIN DEL MATERIAL

Para residuos de maz y trigo se realizaron tratamientos con lquidos inicos a distintas
temperaturas. Las Figuras III-13 y III-14 muestran las cantidades de azcares liberados en la
sacarificacin enzimtica de material pretratado con [EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min. En
ellas se aprecia que, tanto para residuos de maz como para residuos de trigo, la temperatura tiene un
efecto importante, siendo posible liberar ms azcares en la H.E. que para material sin pretratar. Para 80
C la diferencia respecto al control (sin pretratamiento, s/p) no existen diferencias significativas para
ambos materiales (ver Tabla III-18), debido a que recin a esta temperatura el [EMIM
+
][Cl
-
] est en
estado lquido. Para 121 C se observa un leve aumento en los niveles de accesibilidad del material al
ataque enzimtico, sin embargo, existen diferencias significativas respecto a material s/p y a 80 C. A 150
C se observa que el aumento en el nivel de azcares liberados en la hidrlisis enzimtica es importante,
liberndose para maz 395 7 [mg AzRed/g MS], mientras que para trigo se liberaron 351 5 [mg
AzRed/g MS], representando los primeros un 55 % del total de azcares disponibles y un 54 % los
segundos.

[EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min, determinados con GC (s/p: sin pretratamiento,
total: suma de todos los monosacridos analizados)

0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
A
r
a
b
i
n
o
s
a
F
r
u
c
t
o
s
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G
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u
c
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G
l
u
c
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s
a
X
i
l
o
s
a
T
o
t
a
l
s/p 80C 121C 150C
A
z
c
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r
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b
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r
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o
s

[
m
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/
g

d
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t
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r
i
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l

s
e
c
o
]
Azcar y temperatura de pretratamiento
71

[EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min, determinados con GC (s/p: sin pretratamiento,
total: suma de todos los monosacridos analizados)

Este resultado es consistente con la literatura [25], donde el pretratamiento de residuos trigo con
[EMIM
+
][DEtPO
4
-
] muestra rendimientos por encima del 50 % (ver Tabla I-7), sin embargo, la
granulometra utilizada es menor que las de este trabajo (grado polvo v/s 2,30 8,00 [mm]). Para residuos
de maz la situacin es distinta, y los niveles de hidrlisis de azcares en la sacarificacin enzimtica
alcanzan valores superiores al 80 % con [BMIM
+
][Cl
-
] como solvente (ver Tabla I-6), utilizando
granulometras diferentes a las de este trabajo (0,25 0,82[mm] v/s 2,30 8,00 [mm]).

Tabla III-18: Resultado estudio estadstico de azcares totales liberados en la sacarificacin de
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas por 60 min
Temperatura [ C]
Temperatura
[ C]
s/p 80 121 150
s/p
80 no dif signif
121 dif signif dif signif
150 dif signif dif signif dif signif
0
50
100
150
200
250
300
350
400
A
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X
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G
l
u
c
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X
i
l
o
s
a
T
o
t
a
l
s/p 80C 121C 150C
A
z
c
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r
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l
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b
e
r
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d
o
s

[
m
g
/
g

d
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m
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t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Azcar y temperatura de pretratamiento
72

Los rendimientos de azcares obtenidos para ambos materiales son similares (55 y 54 % de
eficiencia para residuos de maz y trigo), lo que sugiere que la disposicin interna de los
macrocomponentes dentro de los residuos no induce a un comportamiento distinto del pretratamiento a
nivel de eficiencia de la hidrlisis enzimtica del material. Esto marca una diferencia importante respecto
al pretratamiento cido practicado, donde se encontraron diferencias importantes (44 y 63 % de eficiencia
para residuos de maz y trigo) en las cantidades de azcares liberados en la etapa enzimtica, que como ya
se ha dicho anteriormente podra deberse a los enlaces de unin entre lignina y hemicelulosa.

Tabla III-19: Niveles de glucosa y xilosa liberados en las distintas etapas del pretratamiento de
residuos agrcolas con [EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60 min
Etapas
Xilosa Glucosa Xil + Glu
Ren,
%
Xilosa Glucosa Xil + glu
Ren,
%
Pretrat
LI
12

10 4 66 24
13
76 20 11 11 2 7 5 18 5 3
H.E. 104 1 239 2 343 2 53 114 2 272 3 386 4 54
Total
liberado
114 3 305 8 419 10 64 125 2 279 6 404 5 57

La Tabla III-19 muestra las cantidades de azcares liberados en las distintas etapas del
pretratamiento del material. Como se puede apreciar, en la etapa de lquidos inicos se logra liberar cierta
cantidad de azcares, siendo ms importante la liberacin de glucosa en residuos de trigo 66 24 [mg/g
MS]. Este resultado sugiere que la matriz de lignina puede haber sufrido un nivel de disrupcin
importante, debido a que se obtuvo glucosa fruto de la hidrlisis del material. No obstante, no es posible
inferir que esta glucosa provenga de la hidrlisis de celulosa, porque perfectamente puede ser de
compuestos glucanos presentes en la hemicelulosa de los residuos de trigo. De todas maneras, estos
ltimos tienen un mayor nivel de hidrlisis que los residuos de maz en esta etapa, lo que demuestra que
este material es ms fcilmente hidrolizable que los residuos de maz debido probablemente a la
disposicin interna de los macrocomponentes en la pared celular. As, para residuos de trigo en la
hidrlisis enzimtica de material pretratado por 60 min a 150 C fue posible encontrar cido glucornico
(5,1 0,6 [mg/g MS], ver Anexo N), el cual es un componente que est asociado a la lignina mediante
enlaces de tipo ster [8].

12
Los azcares para los lquidos inicos fueron medidos con kit comerciales de glucosa y xilosa, mientras que para
los obtenidos en la hidrlisis enzimtica fueron medidos en un cromatgrafo de gases. Para los lquidos inicos hubo
un perodo de 7 das en que las muestras no estuvieron bajo refrigeracin.
13
El valor fue transformado desde su valor determinado por el kit a unidades de medicin de GC mediante la
relacin de la (Ecuacin 2). Medicin con kit: 55 20 mg de glucosa/por gramo de material seco.
73

Se debe recordar que el resultado anterior fue similar al obtenido para el pretratamiento cido,
donde una mayor cantidad de azcares pudo ser hidrolizada en los residuos de trigo (considerando que
maz tiene una mayor disponibilidad de azcares), siendo esto explicado por el enlace ter de
susceptibilidad cida, que une la matriz de lignina con la hemicelulosa, pudiendo ser atacado por el anin
cloruro. La no existencia de esta configuracin en los residuos de maz, debido a la presencia de cido
ferlico como intermediario en la conexin entre lignina y azcar, explicara el bajo nivel de azcares
obtenidos en esta etapa.

Sumados ambos pretratamientos se observa que el rendimiento global de glucosa y xilosa, de
acuerdo a los azcares totales disponibles en cada uno de los materiales es de 64 % para residuos de trigo
y de 57 % para residuos de maz. As, a nivel global, se puede decir que este pretratamiento no muestra
diferencias importantes entre ambos materiales.

Comparados con el pretratamiento cido, este pretratamiento tiene menores ndices de azcares
(xilosa y glucosa) para trigo, debido a que con este ltimo el pretratamiento cido logra niveles de
rendimiento del orden de 71 %
14
. Para residuos de maz en cambio, el rendimiento con pretratamiento
cido es de un 44 %, menor que el 57 % que se alcanza con lquidos inicos. As, las diferencias en trigo
radican principalmente en la capacidad del cido de hidrolizar la hemicelulosa para la liberacin de
xilosas, cosa que el pretratamiento con lquidos inicos no es capaz de lograr. No obstante, se debe haber
producido con el pretratamiento con lquidos inicos un considerable nivel de disrupcin de lignina, para
que las enzimas sean capaces de liberar tal cantidad de azcares slo en esta etapa. Esta explicacin es la
que justificara los mejores niveles de azcares obtenidos para residuos de maz, con un pretratamiento de
lquidos inicos. El material sera altamente susceptible a este lquido inico, permitiendo liberar una gran
cantidad de azcares en la etapa de sacarificacin, que en su conjunto, es superior a la obtenida en el
proceso global de pretratamiento con cido diluido.

Otro resultado importante es la ausencia de compuestos furfurales en el licor de sacarificacin,
tanto para residuos de trigo como para residuos de maz pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60
min. El anlisis fue realizado por la tcnica MEFS (MicroExtraccin en Fase Slida, SPME por sus siglas
en ingls) para compuestos voltiles, encontrndose cido actico y acetona en los licores, provenientes
probablemente de la descomposicin de hemicelulosas (ver Anexo ).

14
Segn transformacin mediante Ecuacin 2. Segn kit comerciales el rendimiento es de un 61 %.
74

5.2. EFECTO DEL TIEMPO DE PRETRATAMIENTO CON LQUIDOS INICOS
EN LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL

Para los 150 C con [EMIM
+
][Cl
-
] como solvente, se decidi realizar una prueba a 30 min de
hidrlisis, para analizar si los resultados obtenidos con 60 min pueden ser alcanzados de igual manera con
un pretratamiento a menor tiempo. Como se aprecia en la Figura III-15, tanto para los residuos de trigo
como para los de maz, con un tiempo de 60 min es posible liberar 100 y 84 [mg AzRed/g MS] ms de
azcares respecto a 30 min, representando un aumento de un 40 y 27 % del total de los azcares liberados
en la sacarificacin, respectivamente.

Figura III-15: Azcares liberados para residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
+
] a
150 C por 30 y 60 min, medidos con GC

Este mejor comportamiento del material pretratado por 60 min refleja que, la posible disrupcin
de lignina efectuada a los 30 min no es suficiente para lograr exponer tanto celulosa y hemicelulosa al
tratamiento enzimtico, haciendo al material ms accesible al ataque de las enzimas. En la Figura III-15 se
puede observar que el aumento en los ndices de xilosa es marginal para ambos materiales, si se comparan
con los obtenidos para glucosa, atribuible este ltimo a la hidrlisis de celulosa. Esto es consistente con la
disposicin estructural dentro de la pared celular, como se estudi en el Captulo I seccin 2.2, donde en la
Figura I-4 se puede apreciar que la hemicelulosa est enlazada con la lignina en la zona externa,
encapsulando a la celulosa. As, para la ruptura de enlaces tipo ter entre hemicelulosa y lignina el
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
A
r
a
b
i
n
o
s
a
G
l
u
c
o
s
a
X
i
l
o
s
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T
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t
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l
A
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b
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o
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c
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X
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X
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o
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a
G
l
u
c
o
s
a
X
i
l
o
s
a
T
o
t
a
l
30 min 60 min 30 min 60 min
maz trigo
A
z
c
a
r
e
s

l
i
b
e
r
a
d
o
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Material utilizado, azcar obtenido y tiempo de pretratamiento
75

tratamiento no requerira mucho tiempo, mientras que para dejar expuesta la celulosa al ataque enzimtico
debiera requerirse un mayor tiempo, debido a la diferencia registrada en los niveles de glucosa obtenidos.

5.3. EFECTO DEL TIPO DE LQUIDO INICO UTILIZADO EN EL
PRETRATAMIENTO EN LA SACARIFICACIN DEL MATERIAL

Para comparar el efecto del solvente inico en el pretratamiento de material lignocelulsico a 150
C, se realiz una hidrlisis de ambos materiales con hidrxido de tricaprilmetilamonio [Aliquat
+
][OH
+
],
con [EMIM
+
][Cl
-
] y otro slo con temperatura y sin solvente.

Las Figuras III-16 y III-17 muestran que la cantidad de azcares obtenidos para residuos
pretratados con [Aliquat
+
][OH
-
] son muy inferiores a los obtenidos para [EMIM
+
][Cl
-
], siendo incluso
menores a los obtenidos para residuos sin pretratar o slo con temperatura. La utilizacin de este solvente
fue hecha sobre la sospecha de que el anin [OH
-
] permitira solubilizar y/o romper la matriz de lignina de
mejor forma, debido a que la utilizacin de NaOH permite la solubilizacin de una gran cantidad de
lignina [48]. No obstante, los resultados aqu presentados no muestran buenos ndices de hidrlisis de
azcares, debido muy probablemente a que a estas condiciones la lignina no se vio afectada. Como
resultado cualitativo, se pudo observar que el material no sufri ningn cambio a nivel macroscpico,
mientras que para [EMIM
+
][Cl
+
] se observ cierta fragmentacin del material en pequeas fibras.

Una explicacin a esta situacin podra venir dada por la configuracin molecular del lquido
inico. El catin [Aliquat
+
] es muy grande, lo que podra producir un efecto estrico entre los cationes y la
matriz de lignina, no permitiendo el ataque del in hidroxilo a los enlaces tipo ter dentro de dicha matriz,
impidiendo la disrupcin esperada y liberando una menor cantidad de azcares (ver Figura III-16 y Figura
III-17).

Para el sobrenadante de [Aliquat
+
][OH
-
] y acetona no se pudo analizar su contenido de azcares,
debido a que la acetona se evapor en el traslado de las muestras, perdindose as el volumen real de
muestra para medir azcares. En dicho hidrolizado puede haber existido alguna cantidad de azcares
liberados no menor, que es lo que pudo haber marcado la diferencia existente entre este lquido inico y el
tratamiento realizado sin solventes.

Mencin importante merece el caso del tratamiento de material slo a 150 C sin presencia de
solvente. Como anteriormente se dijo, la hidrlisis de este material pretratado registr valores algo
inferiores a los obtenidos sin pretratamiento para residuos de trigo. Las diferencias obtenidas podran
76

deberse a la descomposicin del material a estas temperaturas, en ausencia de solvente, formando
compuestos como el levoglucosano (compuesto formado durante pirolisis [79],[46]), el cual se degrada en
una gran cantidad de compuestos (ver Anexo B), como report Katdstrom en su investigacin [73].

distintos solventes inicos a 150 C por 60 min, analizados con GC

distintos solventes inicos a 150 C por 60 min, analizados con GC
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
A
r
a
b
i
n
o
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F
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t
o
s
a
G
l
u
c
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X
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X
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a
G
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X
i
l
o
s
a
T
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t
a
l
s/solv [EMIM+][Cl-] [Aliquat+][OH-]
a
z
c
a
r
e
s

l
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a
d
o
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Azcar obtenidos y solvente utilizado en pretratamiento
0
50
100
150
200
250
300
350
400
A
r
a
b
i
n
o
s
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F
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u
c
t
o
s
a
G
l
u
c
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X
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X
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A
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F
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G
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u
c
o
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X
i
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o
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T
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a
l
s/solv [EMIM+][Cl-] [Aliquat+][OH-]
a
z
c
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o
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
Azcar obtenidos y solvente utilizado en pretratamiento
77

Con el objetivo de disear un proceso de obtencin de bioetanol desde residuos de trigo por la va
de lquidos inicos, es fundamental poder utilizar los azcares que son hidrolizados en la etapa de
pretratamiento. Como se observ, los residuos de maz prcticamente no liberan azcares en el
pretratamiento (ver Tabla III-19), mientras que para residuos de trigo estos alcanzan a 76 20 [mg
AzRed/g MS], representando un 18 % del total liberado para este material. As, una opcin podra ser la
directa fermentacin de estos azcares para la obtencin de etanol, sin embargo, la tolerancia de los
microorganismos al lquido inico debe ser investigada. Otra posibilidad sera producir furfural y HMF
sometiendo a la mezcla LI azcar a altas temperaturas, con lo cual, las condiciones de acidez podran
generar estos compuestos. Todo ello debe ser investigado para verificar su factibilidad. Una ltima opcin
podra ser la investigacin en la utilizacin de un LI que fuera compatible con la sacarificacin
enzimtica, de forma de obtener azcares directamente despus del pretratamiento, sin etapas de lavado
intermedias, realizando una fermentacin posteriormente.

Un diagrama de lo anterior se puede observar en la Figura III-18, donde los bloques naranjos
representan procesos por los cuales debieran pasar los residuos de trigo dada la presencia de azcares,
mientras que de los residuos de maz slo debiera existir una recuperacin del lquido inico directamente.

Figura III-18: Diagrama de posibles procesos en produccin de bioetanol a partir de residuos
agrcolas con tecnologa de pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
]

78

LQUIDOS INICOS

La Figura III-19 muestra las cinticas de sacarificacin de residuos de maz a distintas
temperaturas y tiempos de pretratamiento, con [EMIM
+
][Cl
-
] como solvente.

Figura III-19: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a
distintas temperaturas por 30 y 60 min (puntos: datos experimentales y lneas: modelo ajustado)

En esta ltima figura, se aprecia que para la temperatura de 150 C, sin importar el tiempo de
hidrlisis, existe una mejora ostensible a nivel de los azcares liberados en esta etapa. Entre 30 y 60 min
tambin existen diferencias considerables, obtenindose los mejores resultados para este ltimo tiempo, lo
que podra ser explicado por un mayor ndice de disrupcin de la lignina presente en el material, en la cual
el tiempo de pretratamiento influye de manera importante. La Figura III-20 muestra un comportamiento
similar para residuos de trigo, aunque las diferencias entre 80 y 121 C no son importantes. As, la
temperatura tendra un efecto importante a la hora de romper la matriz de lignina y permitir exponer la
celulosa al ataque enzimtico.

0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 12 24 36 48 60 72 84 96
A
z
c
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r
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c
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o
r
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[
m
g
/
g

d
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m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
80C, 60 min
121C, 60 min
150C, 60 min
150C, 30 min
79

Figura III-20: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a
distintas temperaturas, por 30 y 60 min (puntos: datos experimentales y lneas: modelo ajustado)

Se observa de las Figuras III-19 y III-20 una hidrlisis ms rpida del material, comparando con el
pretratamiento cido (ver Figuras III-9 y III-11). ste es un resultado importante, pues evidenciara que
aparte de una mayor disrupcin de lignina tambin podra producirse una disminucin en la cristalinidad
de la celulosa, debido al menor tiempo que se observa para alcanzar los mayores ndices de liberacin de
azcares.

El modelo cintico aplicado para la sacarificacin de estos materiales pretratados fue el mismo
que para los pretratados con cido. Observando la Tabla III-20, se aprecia que las tasas de hidrlisis k son
mayores que para los materiales pretratados con cido, lo cual sustenta la mayor velocidad en liberacin
de azcares en la sacarificacin. Si bien la solubilizacin de lignina no pudo ser medida, como
observacin cualitativa de debe decir que el material no registr una decoloracin como la registrada con
el material pretratado con base, lo que lleva a pensar que la prdida de lignina por solubilizacin no debe
haber sido muy sustancial.

Una disminucin en la cristalinidad de la celulosa puede haberse logrado por la formacin de
puentes de hidrgeno entre los aniones cloruro y los grupos hidroxilos de la cadena de celulosa (ver Figura
I-19) debido a esta mayor velocidad en la obtencin de azcares reductores liberados. As, en la
regeneracin del material debido a los lavados del mismo con agua desionizada debe haber resultado en
una disminucin de esta cristanilidad en la celulosa, permitiendo a la celulosa ser ms digerible por las
enzimas celulolticas.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 12 24 36 48 60 72 84 96
A
z
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[
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g

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m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
80C, 60 min
121C, 60 min
150C, 60 min
150C, 30 min
80

Tabla III-20: Coeficientes cinticos de la hidrlisis enzimtica de residuos de maz y trigo
pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a distintas temperaturas y por distintos tiempos
Material
Pretratamiento Parmetros cinticos
Coeficiente
r
2

Temperatura
[ C]
Tiempo
[min]
[Az red]
mx

[mg/g DS]
k
[1/h]
Maz 150 60 366 0,166 0,995
Maz 121 60 222 0,159 0,993
Maz 80 60 142 0,159 0,993
Maz 150 30 270 0,291 0,975
Trigo 150 60 319 0,152 0,992
Trigo 121 60 138 0,181 0,992
Trigo 80 60 124 0,136 0,989
Trigo 150 30 248 0,519 0,999

La Tabla III-21 muestra el tiempo de H.E. en que se alcanzan a liberar el 95 % de los azcares
liberados en la H.E. para los residuos pretratados mediante distintas tcnicas. Mediante extrapolacin de
los modelos ajustados se observa la ostensible mejora en tiempos para los pretratamientos de LI versus el
de cido diluido, lo que marca una aceleracin de la HE. Dicha aceleracin tambin se observa para el
pretratamiento cido alcalino. En las Figura III-21 y Figura III-22, se puede observar que los
rendimientos de cada hidrlisis enzimtica para ciertos pretratamientos son cotejados, comprobndose en
la figura de la esquina inferior derecha la cantidad de azcares liberados en la sacarificacin.

Tabla III-21: Tiempos de hidrlisis enzimtica de obtencin del 95 % de azcares reductores
mximos liberados segn modelos cinticos para los mejores pretratamientos practicados para
residuos de maz y trigo
Material
Pretratamiento(s)
Tiempo y azcares en alcanzar 95 % del
mximo de azcares hidrolizado en
respectiva HE [h]
Solvente
Temp
[ C]
Tiempo
[min]
Tiempo [h] Azcares [mg/g MS]
Maz H
2
SO
4
1,00 % v/v 121 60 94 150
Maz
H
2
SO
4
1,00 % v/v,
NaOH 2,00 % p/p
121 30 y 60 10 192
Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60 18 348
Trigo H
2
SO
4
1,00 % v/v 121 60 90 203
Trigo
H
2
SO
4
1,00 % v/v,
NaOH 2,00 % p/p
121 30 y 60 10 193
Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60 20 304

81

Figura III-21: Rendimiento de azcares reductores liberados en HE respecto al total de azcares
mximo hidrolizable segn modelo cintico ajustado para cada pretratamiento de residuos de maz
(puntos: datos experimentales y lneas: modelo ajustado)

Figura III-22: Rendimiento de azcares reductores liberados en HE respecto al total de azcares
mximo hidrolizable segn modelo cintico ajustado para cada pretratamiento de residuos de trigo
(puntos: datos experimentales y lneas: modelo ajustado)
82

As, para residuos de maz y trigo con la aplicacin de un pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
], se
obtiene una reduccin en los tiempos para alcanzar el 95 % de rendimiento de 76 y 70 horas,
respectivamente, en comparacin con cido diluido. Con la adicin de un pretratamiento bsico al de
cido diluido, las reducciones en los tiempos para alcanzar el 95 % de rendimiento son an mejores, y
corresponden a 84 y 80 horas, para residuos de maz y trigo respectivamente. Entre 10 y 20 horas de
hidrlisis enzimtica son necesarias para liberar el 95 % de los azcares mximos obtenidos segn el
modelo cintico, tanto para residuos de maz y trigo pretratados con cido sulfrico hidrxido de sodio a
121 C y con materiales pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60 min. Esta mayor velocidad en la
hidrlisis enzimtica es explicada en cada modelo por el valor de k, que expresa la velocidad en la
liberacin de azcares. A mayor k los tiempos en alcanzar los mximos rendimientos son cada vez
menores, fruto de esta mayor velocidad en la sacarificacin que viene dado por el ms fcil acceso de
ataque de las enzimas a la celulosa presente en los residuos.

Habiendo suministrado la misma carga enzimtica para cada sacarificacin de material pretratado,
las diferencias en la velocidad de hidrlisis de azcares viene dada directamente por el pretratamiento
aplicado. Como se seal anteriormente, la mejora en la sacarificacin con un pretratamiento bsico
adicional a uno cido viene dada por la menor presencia de lignina en el material hidrolizado
(solubilizacin de lignina en este pretratamiento), permitiendo a las enzimas atacar directamente a la
celulosa. Para el pretratamiento con lquidos inicos la mejora en tiempos es algo menor que con el
pretratamiento bsico, sin embargo, es ostensiblemente mejor que con el pretratamiento cido. Como
tambin ya se ha sealado, esta mejora se explica por la posible disrupcin de lignina por parte del ion
cloruro presente en el lquido inico, atacando los enlaces ter dentro de la matriz. Esto debe ser acelerado
fuertemente por la temperatura aplicada en el pretratamiento, debido a las notables diferencias registradas
entre 80, 121 y 150 C. As, se debiera tener un menor ndice de cristalinidad del material y una
exposicin de la celulosa y hemicelulosa lo que permite el ataque enzimtico y su hidrlisis. No obstante,
la presencia de lignina en el material influye en que las enzimas se adsorban en sta y no permitan una
hidrlisis tan eficiente, comparado con el pretratamiento bsico. As, al igual que para los estudios de
pretratamiento cido se hace necesario hacer estudios microscpicos al material para medir la cristalinidad
del material, la cual puede ser medida utilizando tcnicas de calorimetra diferencial de barrido (DSC).

La Tabla III-20 muestra que la tasa de hidrlisis enzimtica (k) de material pretratado con
[EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min no registra cambios importantes con el aumento de la temperatura. Parece ser
que esta tasa tiene ms que ver con la carga enzimtica suministrada en la sacarificacin y la cantidad de
azcares potencialmente disponibles en el material pretratado. No obstante, el trmino [Az red]
mx
(de la
Ecuacin 4) tiene cambios ms importantes en funcin de la temperatura, por lo que se model su
83

comportamiento con el programa CurveExpert 1.3, obtenindose el siguiente modelo como el de mejor
comportamiento.

[ ]
{ } T c b
a
red Az
mx
+
=
exp 1

Ecuacin 10: Expresin de modelo logstico para la cantidad de azcares mxima a liberar en la
hidrlisis enzimtica de material pretratado con [EMIM][Cl] por 60 min

La Tabla III-22 muestra los parmetros del modelo logstico calculados para la hidrlisis
enzimtica de residuos de maz y trigos pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min entre 80 y 150 C. El
coeficiente r
2
para esta interpolacin realizada para los residuos de trigo es igual a 0,861, mientras que
para los residuos de maz se obtuvo un r
2
igual a 0,985 (ver Tabla III-22). El valor de azcares liberados
de la hidrlisis enzimtica de residuos de trigo con [EMIM
+
][Cl
-
] a 121 C es particularmente bajo, y no
tiene una diferencia tan importante con el pretratamiento realizado a 80 C (slo de un 11 %), en contraste
a lo que se obtuvo con residuos de maz, donde la diferencia en los azcares liberados es ms importante
(56 %) entre ambas temperaturas. Esto se puede explicar por algn en error en el anlisis de azcares
liberados en la sacarificacin de residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a 121 C, lo que no
permite ver la tendencia exponencial de tipo logstico que s se observa ms claramente para los residuos
de maz.

Tabla III-22: Parmetros de expresin de modelo logstico para [AzRed]
mx
en la hidrlisis
enzimtica de residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min entre 80 y 150 C
Residuos
Pretratamiento Modelo Logstico
Temperatura
C
[AzRed]
mx

[mg/g MS]
a
[mg/g MS]
b
[ ]
c
[1/ C]
Coeficiente
r
2
Maz
150 366
2,1610
4
5,2810
2
0,015 0,985 Maz
121 222
Maz
80 142
Trigo
150 320
1,9710
9
8,0510
7
0,018 0,861 Trigo
121 138
Trigo
80 124

La obtencin de un modelo cintico para la sacarificacin enzimtica de residuos agrcolas
pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] es importante, porque permite conocer la tasa de liberacin de azcares toda
vez que se modifica la temperatura del pretratamiento, pudiendo tener una estimacin de la cantidad de
azcares a liberar en el proceso. La investigacin de otras temperaturas con este lquido inico para estos
84

residuos es importante para perfeccionar el modelo aqu presentado, y ms an, para saber qu podra
pasar con el material a temperaturas por sobre los 150 C, donde hasta una mayor cantidad de azcares
podran ser hidrolizados en el pretratamiento o la cantidad de azcares a liberar en la sacarificacin
pudieran ser ms elevadas.

Al igual que para el pretratamiento cido, se puede plantear una expresin cintica general para
los residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min a temperaturas entre 80 y 150 C,
considerando el coeficiente k como una constante para este tiempo. As, en funcin de la temperatura de
pretratamiento (T) y tiempo de hidrlisis enzimtica (t), las expresiones son:

[ ]
{ }
{ } ( ) t
T
red Az
+
= 161 , 0 exp 1
018 , 0 exp 10 05 , 8 1
10 97 , 1
7
9

+
][Cl
-
] entre 80 y 150 C por 60 min (carga enzimtica
celulasa: 75 FPU/g de celulosa y celobiasa: 111 CBU/g de celulosa)

[ ]
{ }
{ } ( ) t
T
red Az
+
= 156 , 0 exp 1
015 , 0 exp 10 28 , 5 1
10 16 , 2
2
4

residuos de maz pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] entre 80 y 150 C por 60 min(carga enzimtica
celulasa: 65 FPU/g de celulosa y celobiasa: 97 CBU/g de celulosa)

85

6. ASPECTOS GENERALES DE LOS PRETRATAMIENTOS PRACTICADOS

De los pretratamiento realizados y las respectivas hidrlisis enzimticas realizadas a dichos
materiales, es posible hacer una proyeccin del etanol que puede ser producido con cada tcnica. Saha y
colaboradores [11] realizaron la fermentacin de azcares obtenidos de la hidrlisis enzimtica de
residuos de trigo pretratado con cido sulfrico a 121 C (hidrolizado de pretratamiento cido e
hidrolizado de la sacarificacin juntos), encontrando un rendimiento de 0,413 [g de etanol/g de azcar
reductor]. Utilizando este rendimiento, una estimacin de la cantidad de etanol que podra obtenerse por
fermentacin de manera conjunta de los azcares obtenidos tanto en la etapa de pretratamiento como en la
de sacarificacin se presenta en la siguiente tabla:

Tabla III-23: Estimacin del etanol producido por gramo de material seco a pretratar para residuos
de maz y trigo procesados con distintos solventes en relacin a la cantidad de azcares reductores
obtenidos
15

Pretratamiento
Produccin de etanol
[g etanol/g material
seco]
Produccin de etanol
[L etanol/Ton
material seco]
Solvente en
pretratamiento
Tiempo
[min]
Temp
[ C]
Residuos
de maz
Residuos
de trigo
Residuos
de maz
Residuos
de trigo
[EMIM
+
][Cl
-
] 60 150 0,164 0,142 209 180
[H
2
SO
4
] 1,00 % v/v 60 121 0,133 0,191 169 242
[H
2
SO
4
] 1,00 % v/v -
[NaOH] 2,00 % p/v
30 y 60 121 0,146 0,179 185 227

Los resultados de la Tabla III-23 muestran que entre un 13 y un 19 % de la masa de residuos
podra ser convertida en etanol como biocombustible, donde claramente los residuos de trigo, sin ser el
material que dispone ms azcares por unidad de masa, es del cual se podra obtener una mayor cantidad
de producto. Los resultados de Saha y colaboradores [11] para residuos de trigo pretratados con cido
diluido, muestran que alrededor de un 24 % de la masa inicial puede ser convertida en etanol, siendo as
las de este trabajo proyecciones inferiores a las obtenidas por Saha [11] debido a la menor cantidad de
azcares obtenidos despus de la sacarificacin. Si se fermentara slo la glucosa presente los niveles de
etanol por unidad de masa de material seran an inferiores, por lo que la produccin de este
biocombustible sin la fermentacin de pentosas parece ser inviable.

Iogen Co. hoy en da es capaz de producir en promedio 220 L de etanol por Ton de material seco
de desechos de trigo [32], mientras que National Renewable Energy Laboratory de EE.UU. proyect una

15
Estos valores no consideran la presencia de compuestos inhibidores que podran hacer los valores ms bajos, y
asumen la misma tasa de produccin tanto para pentosas como para hexosas.
86

produccin de 300 L de etanol por Ton de material seco de desechos de maz [96]. Ambas producciones
utilizan un pretratamiento con explosin a vapor antes de sacarificar el material. Las proyecciones para
maz en este trabajo son ligeramente inferiores a las de la literatura, dado que con el pretratamiento con
[EMIM
+
][Cl
-
] se logra superar ligeramente los 200 L de etanol por Ton de material seco (ver Tabla III-
23), mientras que para residuos trigo la produccin proyectada en este trabajo con un pretratamiento cido
diluido (242 L de etanol por Ton de material) es similar a los que Iogen Co. produce hoy en da.

De no fermentar las pentosas es imperiosamente necesario darle algn uso dentro del proceso
productivo global, de forma de hacerlo costo-efectivo. Su descomposicin en furfural podra ser una
buena alternativa para la generacin de un subproducto y darle valor agregado al proceso, tal como lo hace
Raven Biofuels International [33].

As, para los residuos de maz sera recomendable un pretratamiento con lquidos inicos, dada la
mayor cantidad de azcares reductores hidrolizados mediante esta metodologa y consideraciones de tipo
ambiental, ya que los lquidos inicos no requieren tratamientos de aguas tan exhaustivos como los de
hidrlisis cida alcalina diluidas y no liberan gases txicos. De esta forma, luego del pretratamiento con
[EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60 min, que permite la disrupcin de lignina y dejar la celulosa ms expuesta
al ataque enzimtico, vendra una etapa de lavado, donde se permitira recuperar el material y limpiarlo del
solvente, para posteriormente sacarificar el material. Tambin es necesario recuperar el lquido inico para
poder reutilizarlo, lo cual puede ser realizado mediante tcnicas de destilacin. Una vez sacarificado el
material, se puede proceder a la fermentacin para producir el etanol. Un esquema del proceso se puede
visualizar en la Figura III-23.

No obstante, la utilizacin de esta metodologa tiene algunos bemoles, como son las caractersticas
higroscpicas del [EMIM
+
][Cl
-
], lo que obliga a trabajar bajo ambientes en ausencia de humedad, o como
mximo reducidas, para no afectar los rendimientos del pretratamiento. En la misma lnea, la recuperacin
del lquido inico a nivel de eficiencia de extraccin de agua tambin debe ser importante [24]. De esta
forma sera auspicioso investigar otros lquidos inicos, que pudieran generar disrupcin en el material,
pero que a su vez solubilizaran la lignina. La utilizacin de aniones sulfatados podra ser atractivo para la
consecucin de estos objetivos (un [EMIM
+
][SO
3
-
] por ejemplo) [86].

En la etapa de fermentacin tambin existen algunas dificultades en orden a fermentar pentosas y
hexosas de forma conjunta, dado que se deben utilizar microorganismos que co-fermenten ambos
sustratos. As, posterior a la fermentacin y destilacin de etanol, sera posible una hipottica sntesis de
furfural con las pentosas no fermentadas en el proceso.
87

Figura III-23: Diagrama posible para el procesamiento de residuos de maz para la produccin de
bioetanol mediante pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
]

Para los residuos de trigo, en cambio, parece ms recomendable realizar un pretratamiento cido
diluido debido a que se puede obtener una mayor cantidad de azcares. As, esta metodologa dara la
opcin de fermentar hexosas de manera exclusiva, y evaluar la fermentacin de pentosas de forma
separada o su descomposicin en furfural como co-producto del proceso. La lignina remanente podra ser
utilizada para la generacin de electricidad, ya que la transformacin de la misma en cidos ferlicos y
otros son tcnicas de investigacin muy recientes que requieren estudios ms profundos. De todas
maneras, la utilizacin de una hidrlisis alcalina es atractiva toda vez que permite una aceleracin de la
hidrlisis enzimtica, permitiendo inclusive la posible utilizacin de cargas enzimticas reducidas. Junto
con ello, la solubilizacin de lignina permitira la purificacin de los distintos productos presentes para su
comercializacin. Un diagrama del proceso puede apreciarse en la Figura III-24.

Las desventajas de este proceso radican en la utilizacin de compuestos txicos que deben ser
extrados, anterior al descarte de las aguas del proceso. Por otro lado, la presurizacin del reactor de
hidrlisis requiere costos adicionales respecto a procesos que se llevan a cabo a presin atmosfrica.
Tambin la generacin de compuestos inhibidores podran disminuir los rendimientos en la fermentacin
88

de los azcares. Sin embargo, los requerimientos energticos seran menores que el tratamiento con
lquidos inicos, toda vez que la temperatura utilizada es menor (121 v/s 150 C)

Figura III-24: Diagrama posible para el procesamiento de residuos de trigo para la produccin de
bioetanol mediante pretratamiento con cido diluido y base diluida

Cabe destacar que para la realizacin de todos estos procesos es necesario realizar una
investigacin a fondo, en orden a evaluar tanto de forma experimental como de forma tcnico-econmica
la real posibilidad de practicar estos procesos.

89

CAPTULO IV: CONCLUSIONES

En el presente trabajo se compararon tres diferentes metodologas de pretratamiento de material
lignocelulsico: hidrlisis cida diluida, hidrlisis alcalina diluida seguida a una cida diluida y un
pretratamiento con lquidos inicos para residuos de maz y trigo. En conjunto todas ellas demuestran
liberar una mayor cantidad de azcares que la sacarificacin de material sin pretratar, logrando
rendimientos que varan entre 44 y 71 % despus de la sacarificacin enzimtica.

Para los residuos de maz (2,30 8,00 mm) el pretratamiento con cido diluido logr liberar un 44
% de los azcares tericos presentes en el material, con una concentracin de cido sulfrico de 1,00 %
v/v y 30 min en autoclave. Con el pretratamiento alcalino adicional se aument la liberacin de azcares a
un 50 %, con hidrxido de sodio 2,0 % p/v y 60 min en autoclave. Con el pretratamiento con lquidos
inicos se consigui un rendimiento del 57 %, utilizando cloruro de 1-etil-3-metilimidazolio a 150 C por
60 min, siendo este ltimo el mejor pretratamiento para este material.

Para los residuos de trigo (2,30 8,00 mm) el pretratamiento con cido diluido logr liberar un 71
% de los azcares tericos presentes en el material, con una concentracin de cido sulfrico de 1,00 %
v/v y 60 min en autoclave, siendo ste el mejor pretratamiento. Con el pretratamiento alcalino adicional no
existi un aumento en el rendimiento, utilizando hidrxido de sodio 2,0 % p/v y 60 min en autoclave. Con
el pretratamiento con lquidos inicos se consigui un rendimiento del 64 %, utilizando cloruro de 1-etil-
3-metilimidazolio a 150 C por 60 min.

Estimando la cantidad de etanol a producir a partir de los rendimientos de azcares liberados, para
residuos de maz pretratados con cloruro de 1-etil-3-metilimidazolio a 150 C por 60 min se produciran
209 L de etanol por Ton de material seco procesado. En cambio, para residuos de trigo pretratados con
cido sulfrico al 1,00 % v/v por 60 min en autoclave se produciran 242 L de etanol por Ton de material
seco procesado.

Para el pretratamiento con cido diluido se investigaron tres concentraciones: 0,50, 0,75 y 1,00 %
v/v, encontrndose que a medida que se aumenta la concentracin de cido tambin aumenta la cantidad
de azcares liberados en el pretratamiento. No obstante, cuando este material pretratado es sacarificado
con enzimas celulolticas comerciales dicha relacin no es creciente, sino que tiene un mximo, para
ambos materiales. De acuerdo al modelo cintico ajustado de base exponencial para la hidrlisis
enzimtica, se encontr que las concentraciones de cido para el pretratamiento eran de 0,84 % v/v y 60
min para residuos de trigo y 1,00 % v/v y 30 min para residuos de maz.
90

La cintica de reaccin de los residuos agrcolas pretratados con cido diluido es lenta,
alcanzndose valores estables a nivel de azcares liberados a las 72 horas de sacarificacin. Cuando se
adiciona un pretratamiento alcalino la hidrlisis enzimtica se ve acelerada considerablemente,
alcanzndose estabilidad en el nivel de azcares reductores liberados a las 14 horas de sacarificacin. Este
resultado sugiere la utilizacin de una carga enzimtica inferior para este ltimo pretratamiento, dado que
la adicin de l influye fundamentalmente en la velocidad de dicha reaccin, factor tambin dependiente
de las enzimas.

Para la sacarificacin enzimtica de residuos agrcolas fue posible determinar expresiones
cinticas en funcin de la acidez del pretratamiento [H
2
SO
4
]. As, para los mejores pretratamientos cidos
los modelos ajustados son los siguientes, en funcin del tiempo de hidrlisis enzimtica y la acidez:

Para residuos de maz, hidrlisis cida, 30 min a 121 C, 0,50 1,00 % v/v:

2
4 2 4 2

Para residuos de trigo, hidrlisis cida, 60 min a 121 C, 0,50 1,00 % v/v:

2
4 2 4 2

Para el pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
] se aprecia un aumento notable en el nivel de azcares
liberados en la sacarificacin con el aumento de la temperatura. Este pretratamiento tambin produjo una
aceleracin importante en la sacarificacin de ambos residuos, estabilizndose los niveles de azcares
liberados a las 23 horas de reaccin de acuerdo al modelo ajustado. La cintica de esta sacarificacin
tambin es exponencial, dependiendo de la temperatura T del pretratamiento:

Para residuos de maz, [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min:

[ ]
{ }
{ } ( ) t
T
red Az
+
= 156 , 0 exp 1
015 , 0 exp 10 28 , 5 1
10 16 , 2
2
4

Para residuos de trigo, [EMIM
+
][Cl
-
] por 60 min:

[ ]
{ }
{ } ( ) t
T
red Az
+
= 161 , 0 exp 1
018 , 0 exp 10 05 , 8 1
10 97 , 1
7
9

91

Para el pretratamiento con [EMIM
+
][Cl
-
] se encontraron diferencias entre un tratamiento por 30 y
60 min, lo que sugiere que el tiempo es importante para alcanzar mayores niveles de disrupcin de lignina
y conseguir que la celulosa est ms accesible al ataque enzimtico. De la misma forma, la sustitucin de
este solvente por [Aliquat
+
][OH
-
] no mostr buenos resultados en la sacarificacin, lo que sugiere que
existe algn impedimento atribuible a catin y/o anin para el ataque de los residuos, o probablemente la
sntesis del lquido inico no fue la adecuada.

Finalmente, se recomienda seguir investigando en el campo de lquidos inicos, en la bsqueda de
solventes ms adecuados para el pretratamiento del material, y su consiguiente sacarificacin, para hacer
el proceso ms simple. De la misma forma, se pueden buscar lquidos inicos de anin sulfatado con el
objetivo de remover lignina y poder modificarla para hacer procesos que sean costo-efectivos, y permitan
realizar una gran biorefinera de los residuos, obteniendo una gran cantidad de productos aparte del
bioetanol.

92

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100

ANEXOS

Anexo A: Pretratamientos de material lignocelulsico

El presente anexo muestra pretratamientos alternativos a los mostrados en el cuerpo del presente
trabajo, los cuales han sido introducidos en la Tabla I-2: Mtodos de pretratamientos de material
lignocelulsico.

Pirlisis

El material es sometido a altas temperaturas, cercanas a 300 C, donde la celulosa se descompone
rpidamente en compuestos gaseosos. Si es tratado a temperaturas ms bajas se puede lograr
modificaciones estructurales, los cuales si son tratados con cido diluido dan la posibilidad de obtener
azcares que pueden ser fermentados para la obtencin de etanol [6].

Explosin a vapor (autohidrlisis)

Este proceso opera en un reactor donde se dispone el material lignocelulsico en forma de chips.
Constantemente se hace ingresar vapor saturado a altas presiones, de forma que ste cope todos los
intersticios del material. Posteriormente, transcurridos unos pocos minutos, una vlvula es sbitamente
abierta de forma que el material se rompe totalmente dada la liberacin de presin, liberndose la celulosa
[92]. En este proceso, la hemicelulosa en casi su totalidad es degradada [6], debido a que los enlaces tanto
de tipo ter como ster se rompen durante el proceso [8]. Un diagrama del mismo se puede observar en la
Figura A 1.

101

Figura A 1: Esquema de planta piloto de explosin a vapor [92]

El reactor de explosin a vapor opera a temperaturas variables entre 160 y 260 C, a presiones que
varan entre 0,69 y 4,83 MPa [6]. La adicin de dixido de azufre mejora la hidrlisis enzimtica posterior
[3].

En general, los tratamientos mecnicos antes mencionados requieren un 70 % ms de energa que
la explosin con vapor, convirtindola a sta en una de los ms efectivos pretratamientos de residuos
agrcolas [6].

En investigaciones realizadas con residuos de maz [76], con un pretratamiento de explosin a
vapor con cido al 3,0 % p/p y 190 C por 5 min, previa impregnacin del material con cido, se
alcanzaron rendimientos de glucosa de 83,5 % y de xilosa de 49,5 %, registrndose un rendimiento global
igual al 70,9 %. Slo una pequea parte de glucosa es hidrolizada en el pretratamiento de explosin a
vapor, mientras que alrededor de un 10 % de los arabinoxilanos son hidrolizados. En la subsiguiente etapa
de sacarificacin (15 FPU de Celluclast 1.5 L y 19,6 CBU de Novozyme 188 por gramo de material
pretratado) el 63,9 % de la hemicelulosa y el 93,5 % de la celulosa presente en el material pretratado son
hidrolizados en xilosa y glucosa, respectivamente.

Para residuos de trigo los resultados son an mejores [77], alcanzndose prcticamente un 100 %
de azcares respecto al total hidrolizable (celulosa ms hemicelulosa), despus de la hidrlisis enzimtica
(15 FPU de Celluclast 1.5 L y 18 CBU de Novozyme 188 por gramo de material pretratado) de material
previamente tratado con una explosin a vapor con cido sulfrico al 0,2 % p/p (anterior a la explosin el
material fue impregnado con este cido por toda una noche a condicin ambiente), a 190 C por 10 min.
102

En el pretratamiento, respecto a los residuos de maz, los resultados son similares en cuanto a la celulosa,
hidrolizndose menos de un 5,0 % en glucosa, no obstante, los arabinoxilanos logran solubilizarse en un
75,9 % en xilosa.

Explosin con amoniaco (AFEX)

El mecanismo de operacin del reactor de explosin con amoniaco es relativamente similar al de
vapor, sin embargo la temperatura de operacin se realiza a 90 C por 30 minutos. La cantidad de
amoniaco a utilizar es de 1 kg por kg de material lignocelulsico en base seca. Por lo general, AFEX no
solubiliza la hemicelulosa en grandes cantidades, y no es muy efectivo para materiales con alto contenido
de lignina [3], [6], [8].

Para hacer el proceso ms costo efectivo es necesario recuperar el amoniaco residual, y las
pequeas trazas que puedan quedar aguas abajo no producen inhibicin para las etapas posteriores [6].

En otro proceso que involucra amoniaco, denominado ARP (ammonia recycle percolation: reciclo
de amoniaco percolado), a altas temperaturas el material se hincha obtenindose altos ndices de
depolimerizacin de la lignina (alrededor de 70 % en 10 min a 170 C, 23, MPa con 15 % p/p de
amoniaco) sin mayor degradacin de xilanos y glucanos, y con ndices de digestibilidad enzimtica del
material del orden de un 90 % [74].

Explosin con dixido de carbono

Es un proceso muy similar a los dos anteriores, sin embargo, los rendimientos de obtencin de
azcares posterior a la hidrlisis enzimtica son relativamente bajos comparados con los mismos. No
genera compuestos inhibidores [6].

Ozonlisis

En el proceso de ozonlisis se agrega ozono al proceso para degradar la hemicelulosa y la lignina.
Para desechos de trigo se encontr que posterior a la hidrlisis enzimtica se tienen rendimientos del
orden de un 70 y un 90 % para glucanos [75]. Para aserrn de lamo se encontr que pretratndolos con
ozono se pudo retirar alrededor de un 80 % de la lignina con un 50 % de rendimiento en la hidrlisis
enzimtica [78].
103

Entre las ventajas del proceso se tiene que no produce compuestos inhibidores y puede ser llevada
a condiciones normales de presin y temperatura. Entre sus desventajas se tienen los altos costos de
operacin del proceso [6].

Deslignificacin oxidativa

Se han probado pretratamientos con perxido de hidrgeno a bajas concentraciones (2 %) a 30 C
por 8 h, encontrndose una subilizacin casi total de la hemicelulosa y un 95 % de eficiencia de
conversin de celulosa en glucosa despus de la etapa de sacarificacin [6].

Otros estudios desarrollados por Saha y colaboradores, [81], encontraron rendimientos de azcares
para desechos de trigo (pasado por malla 1,27 [mm]), posterior al tratamiento enzimtico, de 80 % con
concentraciones de perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) de 2,15 % v/v, pH 11,5 a 35 C por 24 h, y un
tratamiento enzimtico por 120 h a 45 C y pH 5, sin encontrar compuestos furfurales en el medio.

En otra investigacin de Sun y colaboradores, [82], para desechos de trigo (pasados por una malla
de 1,0 [mm]) se encontr una solubilizacin del 18,63 % p/p de lignina a las 16 horas de hidrlisis, con
H
2
O
2
2,0 % v/v, 50 C a pH 11,5.

Proceso Organosolv

El proceso organosolv es realizado con solventes orgnicos con cidos inorgnicos como
catalizadores para romper los enlaces de unin de la lignina con la hemicelulosa. Por lo general se
encuentran elevados niveles de rendimiento, sin embargo, muchos de los solventes utilizados (ver Figura
A 2) son compuestos inhibidores en las etapas posteriores, razn por la cual deben ser drenados para no
perjudicar los procesos que siguen y para hacer el proceso econmicamente rentable [6].

Figura A 2:

Estudios realizados por Feng Xu
cido actico agua (20/60/20 v/v/v) 20 [mL] por gramo de rastrojo de trigo, se obtienen rendimientos
de delignificacin del orden de 94,1
solventes orgnicos (etanol y metanol) tuvieron muy bajos rendimientos. La temperatura de operacin fue
de 85 C por 4 h y se utiliz 0,1 %

Pretratamiento biolgico

En los pretratamientos biolgicos se utilizan hongos de pudricin blanca para degradar la lignina y
la hemicelulosa del material. Se les denomina de pudricin blanca debido al color que empieza a tomar
el material lignocelulsico cuando hemicelulosa y li
porcentaje en masa de celulosa, dando ese color albino

Zhang y colaboradores, [84]
taxodii 2538 obteniendo altos ndices de reduccin de lignina a los 120 das de pretratamiento, e ndices
de azcares fermentables del orden de 350 [mg/g de material], a las 120 horas de hidrlisis con carga de
celulasa de 20 [FPU/g de material]
mnimo consumo de celulosa y el mximo de lignina

104
: Solventes orgnicos presentes en el pretratamiento
Estudios realizados por Feng Xu y colaboradores, [83], muestran que con el
agua (20/60/20 v/v/v) 20 [mL] por gramo de rastrojo de trigo, se obtienen rendimientos
de delignificacin del orden de 94,1 % y solubilizacin del 76,4 % de la hemicelulosa presente. Los
% de HCl como catalizador.
Pretratamiento biolgico
el material lignocelulsico cuando hemicelulosa y lignina empiezan a ser degradados, aumentando el
porcentaje en masa de celulosa, dando ese color albino [6], [91].
[84], estudiaron el pretratamiento de tallos de bamb con
2538 obteniendo altos ndices de reduccin de lignina a los 120 das de pretratamiento, e ndices
e material] (ver Tabla A 1). La seleccin del hongo se realiz seleccionando el
mnimo consumo de celulosa y el mximo de lignina (objetivo principal del pretratamiento).
pentosas y hexosas
HCl
H
2
SO
4
(tri)etilen
glicol
ac.actico
metanol
acetona
etanol

Solventes orgnicos presentes en el pretratamiento
muestran que con el uso de cido frmico
agua (20/60/20 v/v/v) 20 [mL] por gramo de rastrojo de trigo, se obtienen rendimientos
de la hemicelulosa presente. Los
gnina empiezan a ser degradados, aumentando el
mb con Echinodontium
2538 obteniendo altos ndices de reduccin de lignina a los 120 das de pretratamiento, e ndices
La seleccin del hongo se realiz seleccionando el
(objetivo principal del pretratamiento).
105

Tabla A 1: Prdida de componentes estructurales a las cuatro semanas de tratamiento con hongos
de pudricin blanca con tallos de bamb como sustrato [84]
Prdida de componente [ %]
Especie y cepa Peso Lignina Celulosa Hemicelulosa
Echinodontium taxodii 2538 10,58 24,28 1,64 28,46
Ganoderma lipsisense 245 10,78 16,25 5,92 19,31
Ganoderma lucidum En4 12,10 10,56 12,83 15,16
Grifola umbellata P64 8,26 10,01 9,00 13,85
Polyporus mongolius 2410 9,01 13,07 3,37 16,13
Tramates gibbosa 5955 11,72 13,40 9,22 24,77

Hatakka, [85], estudi el pretratamiento de residuos de trigo con una gran variedad de hongos de
pudricin blanca, dentro de los cuales encontr que para un tratamiento con Ischnoderma benzoinum 108
por 35 das obtuvo rendimientos de azcares despus de 72 horas de hidrlisis enzimtica igual a 359
[mg/g de material], con una carga enzimtica de 20 [FPU/g de material].

En la actualidad se han encontrado una vasta cantidad de hongos capaces de generar hidrlisis, sin
embargo, se tienen altos tiempos de operacin, los cuales se cuentan por semanas. Otro aspecto negativo
son los altos consumos de hemicelulosa por parte de los hongos, lo que reduce la cantidad de azcares
disponibles para la fermentacin. No obstante, como aspectos positivos se deben destacar los bajos
requerimientos energticos del proceso y la no generacin de compuestos inicuos que contaminen las
etapas posteriores y el medio ambiente [6].

106

Anexo B: Compuestos derivados del levoglucosano

Figura B 1: Descomposicin de levoglucosano (anhidroglucosa) en diferentes compuestos [73]

107

Anexo C: Liberacin de lignina con lquidos inicos

Se ha investigado tambin la solubilizacin de lignina en lquidos inicos, con el objetivo de tener
una masa de celulosa libre de contenido de lignina, o al menos un porcentaje menor del mismo. El
tratamiento de residuos de caa de azcar con alquilbenceno-sulfonato de 1-etil-3-metilimidazolio
([EMIM
+
][ABS
-
]) ha sido bastante eficiente en la remocin de lignina, dejando un contenido de lignina en
la masa de celulosa inferior al 4 %, con tiempos de pretratamiento de 2 horas y temperaturas entre 170 y
190 C. Este lquido inico es una mezcla de ismeros de xilenosulfonatos (74 %), con pequeas cantidad
de etilbencenosulfonato (13 %), cumenosulfonato (9 %) y toluenosulfonato (4 %). [86].

En la industria del papel son conocidas el uso de sales sulfonatadas para remover lignina. Por
ejemplo, el uso de xilenosulfonato de sodio (30-40 %) en soluciones acuosas a temperaturas entre 150
180 C y presiones entre 0,4 1,4 MPa, patentado por McKee en 1943, tiene altos ndices de
fragmentacin de lignina, las cuales son luego solubilizados por la adicin de agentes hidrotrpicos, los
cuales establecen fuertes enlaces ion-dipolo entre la lignina y dichos agentes, solubilizando as el material
[89].

Figura C 1: alquilbenceno-sulfonato de 1-etil-3-metilimidazolio [EMIM
+
][ABS
-
]

Altos ndices de remocin de hemicelulosa tambin han sido reportados, mientras que las prdidas
de celulosa por degradacin del mismo en monmeros de glucosa o compuestos furanos fueron inferiores
al 8 %. La solubilizacin de la lignina se debe a que, con la ayuda de xilenosulfonato de sodio, permite el
quiebre de los enlaces tipo ter de la lignina gracias al ataque nucleoflico de los grupos alquilbenceno-
sulfonatos del lquido inico, debido a la coordinacin de los iones sodio con el oxgeno del enlace ter
(ver Figura C 2, [86]). Recordar que la reactividad del enlace ter ante compuestos cidos fue analizada en
la seccin 2.2.1.3.

108

Figura C 2: Ataque del lquido inico a la matriz de lignina (adaptado de [86])

109

Anexo D: Metodologas de conversin de lignina en productos de valor agregado

Con el objetivo de dar valor de utilizar la lignina remanente en los procesos de biorefinera de
material lignocelulsico, el procesamiento de este material se clasifica en tres grandes metodologas:
hidrotrmica, qumica y enzimtica.

1. METODOLOGA HIDROTRMICA

Los tratamientos hidrotrmicos consisten en el uso de material lignocelulsico con agua en
condiciones subcrticas o spercriticas (presiones y temperatura extremas). Cuando la temperatura
utilizada ronda los 170 190 C, el pretratamiento es capaz de solubilizar hasta un 50 % de la lignina
inicial, por lo que mayores etapas deben ser adicionadas en orden de retirar un mayor nivel de lignina
[87].

A altas temperaturas y altas presiones (380 C y 100 MPa) por 8 segundos, se logra degradar el
polmero de lignina en distintos productos debido a la ruptura de los enlaces de ter en la matriz de lignina
[8]. Los principales compuestos que son obtenidos de tratamientos hidrotrmicos de residuos de trigo son
cidos ferlicos, sirngico, valinlico y vanilina [87].

2. METODOLOGA QUMICA

Las metodologas qumicas tienen el objetivo de quebrar los enlaces ter al interior de la lignina,
con el objetivo de fraccionarla y/o solubilizar la lignina. Los mtodos ms tradicionales son las
oxidaciones con permanganatos o alcalino-bencenos y las hidrlisis cidas, no obstante, ellas son
desventajosas debido a las fuertes condiciones utilizadas y bajos rendimientos. El uso de haluros tambin
ha sido utilizado, obtenindose altos ndices de solubilizacin de lignina, pero no pueden ser utilizados
debido a razones ambientales. As, uno de los pocos mtodos actualmente utilizados es la hidrlisis
alcalina, donde generalmente se ocupa hidrxido de sodio (NaOH) para el procesamiento de maderas [8].
Tambin se ha utilizado el NaOH (90 min, 120 C) como una etapa subsiguiente a una hidrlisis cida en
granos utilizados para la produccin de cerveza, donde alrededor de un 79 % de la lignina es solubilizada
en este tratamiento, permitiendo obtener una gran cantidad de cidos los cuales pueden ser separados y
comercializados [48].

Debido a las complicaciones existentes en la utilizacin de compuestos qumicos peligrosos, la
utilizacin de lquidos inicos como compuestos no voltiles y estables, as como reutilizables, los
110

posicionan como un rea de investigacin promisoria. Tal como se analizaba en el anexo anterior (Anexo
C), la solubilizacin de lignina a partir del lquido inico [EMIM
+
][ABS
-
] con compuestos sulfonatos
permite atacar fuertemente los enlaces tipo ter dentro de la matriz de lignina y solubilizar el material
[86].

3. METODOLOGA ENZIMTICA

La metodologa enzimtica se basa en la utilizacin de microorganismos secretores de enzimas
capaces de degradar la lignina en sus cidos monomricos. Algo de esto fue hablado en la seccin 2.3.3,
donde el pretratamiento biolgico de material lignocelulsico degrada la lignina a travs de hongos de
pudricin blanca.

Los microorganismos son capaces de romper el enlace arilglicerol--aril ter, el cual est presente
dentro de la lignina entre un 30-50 % de todos los enlaces existentes en ella. El rompimiento de estos
enlaces de una forma ambientalmente sustentable es lo que hace al proceso tener buenas perspectivas
respecto a los anteriormente sealados. Se ha observado que bacterias del tipo Pseudomonas son bastante
eficientes en el rompimiento de este tipo de enlaces (ver Figura D 1) [8].

Figura D 1: Degradacin de lignina por ataque en enlace ter en guaiacol y vanilina
(adaptado de [8])

El compuesto ms importante de la degradacin de lignina es la vanilina, por lo usos que sta
tiene y anteriormente fueron sealados. En la degradacin de lignina por hongos de pudricin blanca,
mnimas cantidades de vanilina han sido encontradas, en contraste con las de cido ferlico. As, para la
produccin de vanilina a partir de este cido se ha utilizado Aspergillus niger, para obtener cido
vanilnico y Pycnoporus cinnabarinus para reducir ste ltimo compuesto en vanilina [88].
111

Anexo E: Diagrama de metodologa experimental de pretratamientos cido y
bsico diluidos

Molienda Tamizado
Secado en fro
(liofilizacin)
Hidrlisis
cida diluida
Filtrado y
neutralizacin
de pH
Medicin DNS/
kits y lignina
soluble
Secado en fro
(liofilizacin)
Hidrlisis
alcalina
diluida
Filtrado y
neutralizacin
de pH
Medicin DNS/
kits y lignina
soluble
Secado en fro
(liofilizacin)
Hidrlisis
enzimtica
Medicin
DNS/kits

Figura E 1: Metodologa experimental de pretratamientos cidos y bsicos diluidos

Nota: Los cuadros rojos son tratamientos que se realizan a la material lignocelulsico (fase slida), los
cuadros azules son tratamientos que se realizan al hidrolizado (fase lquida) y los cuadros morados
representan tratamientos donde existe material lignocelulsico y un hidrolizado en conjunto. Las flechas
discontinuas representan tratamientos que no se realizan a todos los materiales lignocelulsicos
procesados (pretratamiento alcalino).
112

Anexo F: Diagrama de metodologa experimental para pretratamiento con
lquidos inicos

Figura F 1: Metodologa experimental de pretratamiento con lquidos inicos

Nota: Los cuadros rojos son tratamientos que se realizan a la material lignocelulsico (fase slida), los
cuadros azules son tratamientos que se realizan al hidrolizado (fase lquida) y los cuadros morados
representan tratamientos donde existe material lignocelulsico y un hidrolizado en conjunto.
113

Anexo G: Reactivo DNS

El reactivo DNS fue preparado una vez y fue utilizado tanto para la medicin de actividad de las
enzimas, as como la cantidad de azcares reductores totales de los pretratamientos de cido y base diluida
e hidrlisis enzimtica, y pretratamiento con lquidos inicos.

Se disolvieron bajo agitacin magntica segn [63]:

3,53 [g] de 3,5-cido dinitrosaliclico

6,60 [g] de hidrxido de sodio en pellets

472 [mL] de agua destilada.

Luego, se agregaron:

102 [g] de Na-K Tartarato

2,53 [mL] de Fenol (previamente fundido a 50 C)

2,77 [g] de Metabisulfito de sodio

Finalmente, el DNS preparado fue guardado en un lugar oscuro y en un frasco forrado con papel
aluminio para evitar la degradacin del mismo y prdida de capacidad de desarrollo de color en la
reaccin con azcares reductores.
114

Anexo H: Actividad enzimtica

La actividad de las enzimas utilizadas fue medida a travs de las tcnicas aprobadas por la IUPAC
en el ao 1984 (Ghose et al, 1987, [63]).

Celulasa en Celluclast 1.5L, Novo, Co.

Para la medicin de actividad de celulasas se utiliz como sustrato papel filtro de dimensiones 1
cm X 6 cm (50 mg), en una solucin de 1,0 [mL] de buffer citrato 50 [mM] neutralizado a pH 4,8 con
NaOH y con 0,5 mL de una solucin de enzimas. El ensayo fue realizado a 50 C, sin agitacin y por
transcurso de 60 minutos.

Las muestras analizadas fueron cuatro concentraciones de enzimas con sustrato, otras cuatro sin
sustrato (blancos de enzimas), cuatro distintas concentraciones de glucosa (curva de calibracin) y un
blanco de buffer, tal como se aprecia en la siguiente tabla:

Tabla H 1: Nomenclatura soluciones de ensayo

E1 Concentracin de enzima 1 B1 Blanco de enzima 1 G1 Solucin glucosa 1
BG1 Solucin buffer

Se prepar una solucin 1:100 de Celluclast 1.5L (20 [L]) diluidos en 1.800 [L] de buffer
citrato, as como otra solucin de 10 mL de glucosa de 10,1 [mg/mL] en buffer citrato, ambos como
soluciones de stock para distintas diluciones a preparar.
Tabla H 2: Soluciones de ensayo de enzimas
Para actividad Soluciones de enzima
Solucin Buffer
[uL]
Enzima
[uL]
Concentracin
estndar
enzima
Concentracin Estndar
enzima [uL]
Agua
destilada
[uL]
E1 y B1 1000 500 0,0100 0,0100 500 0
E2 y B2 1000 500 0,0100 0,0080 400 100
E3 y B3 1000 500 0,0100 0,0060 300 200
E4 y B4 1000 500 0,0100 0,0040 200 300

115

Tabla H 3: Soluciones de glucosa para calibracin
Solucin
Buffer
[uL]
Estndar
Glucosa
[uL]
Estndar
glucosa
[mg/mL]
Concentracin
[mg/mL]]
Concentracin
[mg/0,5 mL]
G1 500 1000 10,1 6,73 3,37
G2 750 750 10,1 5,05 2,53
G3 1000 500 10,1 3,37 1,69
G4 1200 300 10,1 2,02 1,01

Una vez terminada la reaccin a 50 C, a las muestras se les aadieron 3,0 mL de solucin de
DNS y se dispusieron en un recipiente con agua hirviendo por 5 min, para posteriormente ser enfriadas en
hielo por otros 5 min. Seguido a lo anterior, se aadieron 20 mL de agua destilada, y pasados 25 minutos
se procedi a medir la absorbancia a 540 nm.

o Ensayo de actividad para enzimas utilizadas para materiales pretratados con cido sulfrico

Las absorbancias registradas para la curva de calibracin y del ensayo de actividad enzimtica son
las siguientes:
Tabla H 4: Absorbancias a 540 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento cido diluido

E1 1,023 B1 0,016 G1 1,056
E2 0,930 B2 0,002 G2 0,883
E3 0,810 B3 0,000 G3 0,663
E4 0,697 B4 0,008 G4 0,471
BG1 0,020

Figura H 1: Calibracin glucosa - DNS para ensayo de actividad

0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
G
l
u
c
o
s
a

[
m
g
/
0
,
5

m
L
]
Absorbancia 540 nm
116

La regresin lineal realizada es la siguiente:

[Glucosa] [mg/mL] = 3,99 [A
540
] 0,387

Luego, se graficaron las concentraciones de enzimas ensayadas versus las cantidades de glucosa
liberadas en el ensayo, de acuerdo a la curva de calibracin realizada, tal como muestra el siguiente
grfico:

Figura H 2: Concentracin de enzima celulasa pret cido v/s glucosa liberada

La regresin exponencial realizada dio como resultado:

[enzima] = 0,00105*2,037
[glucosa]
r
2
= 0,995

Por lo que la concentracin de enzima capaz de liberar 2 mg de glucosa es de 0,00435.

Definiendo la unidad enzimtica (FPU = mol de glucosa liberados por minuto = mol/min) como
aquella que es capaz de liberar 2 mg de glucosa (11,1 mol) por un volumen de enzima de 0,5 mL en 60
minutos, se tiene:

11,1
0,5 60
0,37

Actividad celulasa = 85 [FPU/mL]

117

o Ensayo de actividad para enzimas utilizadas para materiales pretratados con lquido inico

Las absorbancias registradas para la curva de calibracin y del ensayo de actividad enzimtica son
las siguientes:
Tabla H 5: Absorbancias a 540 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento LI

E1 0,923 B1 0,012 G1 1,056
E2 0,846 B2 0,004 G2 0,883
E3 0,727 B3 0,007 G3 0,663
E4 0,567 B4 0,003 G4 0,471
BG1 0,020

Luego, se graficaron las concentraciones de enzimas ensayadas versus las cantidades de glucosa
liberadas en el ensayo, de acuerdo a la curva de calibracin realizada, tal como muestra el siguiente
grfico:

Figura H 3: Concentracin de enzima celulasa pret LIs v/s glucosa liberada


[enzima] = 0,00159*2,916
[glucosa]
r
2
= 0,998


Definiendo la unidad enzimtica igual que para el ensayo anterior se tiene que la actividad medida
es:
Actividad celulasa = 63,4 [FPU/mL]
118

Celobiasa (Novozyme 388), Novo, Co.

Para la medicin de la actividad se utiliz una solucin de 1 [mL] de celobiasa 15 [mM] en buffer
citrato 50 [mM] neutralizado con NaOH a pH 4,8. Se aadi 1 [mL] de solucin de buffer con enzimas a
distintas concentraciones, y se llevaron a 50 C por transcurso de 30 minutos. Luego fueron dispuestos en
un frasco con agua hirviendo por 5 minutos, para posteriormente ser enfriados en hielo y medir la cantidad
de glucosa liberada gracias a un kit comercial, midiendo la absorbancia a 500 nm.

Las muestras analizadas fueron cuatro concentraciones de enzimas con sustrato, cuatro muestras
con enzimas solamente y un blanco de buffer con sustrato, tal como se aprecia en la siguiente tabla:

Tabla H 6: Nomenclatura ensayos de actividad de celobiasa

E1 Concentracin de enzima 1 B1 Blanco de enzima 1
BS Blanco de sustrato y buffer

Se prepar una solucin 1:400 de Novozyme 388 (4 [L]) diluidos en 1.000 [L] de buffer citrato
como solucin de stock para distintas diluciones a preparar.

Tabla H 7: Soluciones de ensayo de actividad celobiasa
Soluciones
Enzimas
[ ]
Conc
[ ]
Total
[L]
Enzima
1/400 [L]
Buffer citrato
[L]
E1 y B1 1/4.000 0,000250 1.000 100 900
E2 y B2 1/5.000 0,000200 1.000 80 920
E3 y B3 1/8.000 0,000125 1.000 50 950
E4 y B4 1/10.000 0,000100 1.000 40 960

o Ensayo de actividad para enzimas utilizadas para materiales pretratados con cido sulfrico

Las absorbancias registradas para el ensayo de actividad enzimtica son las siguientes:

Tabla H 8: Absorbancias a 500 nm para ensayos enzimas utilizadas en pretratamiento cido diluido
Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs
E1 0,464 E3 0,282 B1 0,093 B3 0,076 Std 0,358
E2 0,393 E4 0,235 B2 0,085 B4 0,073 BS 0,037
119

Luego se calcularon las concentraciones de glucosa liberada por cada una de las muestras en
relacin al estndar de glucosa de concentracin 10 mg/mL, de acuerdo con la siguiente expresin:

As, en grfico semilogartmico, la cantidad de glucosa liberada (concentracin*2 [mL]) versus la
cantidad de enzima se observa en la siguiente figura:

Figura H 4: Concentracin de enzima celobiasa pret cido v/s glucosa liberada

La regresin exponencial realizada dio como resultado: [enzima] = 4,98E-5*2,03
[glucosa]
; r
2
= 0,996


Definiendo la unidad enzimtica (CB = mol de glucosa liberados por minuto = mol/min) como
aquella que es capaz de liberar 1 mg de glucosa, es decir, convertir 0,5 mg de celobiosa (2,78 mol de
celobiosa) por un volumen de enzima de 1,0 [mL] en 30 minutos, se tiene:

2,78
1,0 30
0,0926

Actividad celobiasa = 916 [CB/mL]
o Ensayo de actividad para enzimas utilizadas para materiales pretratados con lquidos inicos

Las absorbancias registradas para el ensayo de actividad enzimtica son las siguientes:
120

Tabla H 9: Absorbancias a 500 nm
Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs Dilucin Abs
E1 0,362 E3 0,197 B1 0,081 B3 0,069 Std 0,358
E2 0,303 E4 0,141 B2 0,072 B4 0,051 BS 0,037

Luego se calcularon las concentraciones de glucosa liberada por cada una de las muestras en
relacin al estndar de glucosa de concentracin 10 mg/mL, de acuerdo con la siguiente expresin:

As, en grfico semilogartmico, la cantidad de glucosa liberada (concentracin*2 [mL]) versus la
cantidad de enzima se observa en la siguiente figura:

Figura H 5: Concentracin de enzima celobiasa pret LIs v/s glucosa liberada


[enzima] = 6,66E-5*2,14
[glucosa]
r
2
= 0,998

Por lo que la concentracin de enzima capaz de liberar 1 mg de glucosa es de 0,000142. As, la
actividad enzimtica es:

Actividad celobiasa = 650 [CB/mL]

121

Anexo J: Reaccin de sililacin

La reaccin de sililacin es uno de los procedimientos ms ampliamente usados para la
derivatizacin de muestras para anlisis en un cromatgrafo de gases (GC). En ella, los tomos de
hidrgeno de los grupo hidroxilo de una muestra (para este caso un azcar reductor) son reemplazados por
grupos alquil-silil, obteniendo compuestos ms voltiles, menos polares y ms estables trmicamente
[93].

En esta reaccin se produce una sustitucin nucleoflica del tomo de hidrgeno por el complejo
alquil-silil, liberndose el protn para formar el compuesto HX. El anin X depende de la naturaleza del
reactivo en cuestin, ya sea hexametildisilazano (HMDS), trimetilclorosilano (TMCS) o Piridina [93]. El
segundo de ellos tambin acta como catalizador en la reaccin de derivatizacin [94].

Figura J 1: Reaccin de sililacin (adaptado de [95])

Se debe tener especial cuidado en la presencia de agua en la muestra a someter a la reaccin,
debido a que los grupos OH del agua tambin reaccionan con los reactantes antes mencionados, razn por
la cual las muestras deben cuidadosamente secadas al vaco o en ambientes en ausencia de humedad [94].
122

Anexo K: Estudio estadstico

Tabla K 1: Tabla de distribucin t-student

123

Tabla K 2: Estadstico t y grados de libertad f para pruebas de validacin de metodologas de
medicin de azcares
Prueba
Azcares
datos GC
Azcares
datos kit -
DNS
Var
1
2
Var
2
2

est
| t |
Gl
f
t
0,975
f
Dif
signif?
16

maz
glucosa
GC -
kit
116 133 86 248 1,67 6,47 2,406 N
112 137

98 108

xilosa
GC -
kit
29 25 13 4 0,72 6,43 2,406 N
22 21

23 23

total
GC -
DNS
169 160 137 37 1,12 6,00 2,447 N
151 161

147 171

trigo
glucosa
GC -
kit
87 71 14 51 3,19 6,04 2,447 S
94 85

94 74

xilosa
GC -
kit
33 28 1 16 0,81 4,43 2,673 N
33 35

31 28

total
GC -
DNS
134 113 23 48 4,26 7,10 2,365 S
143 126

140 116

sulfrico
Grupo
datos 1
Grupo
datos 2
Azcares
datos 1
Azcares
datos 2
Var
1
2
Var
2
2

est |
t |
Gl
f
t
0,95
f
Dif
signif?
17

A1 B1 208 246 259 2747 2,16 4,75 1,490 S
A2 B2 236 288
A3 B3 236 350
A1 C1 208 263 259 1820 3,20 5,12 1,472 S
A2 C2 236 324
A3 C3 236 345
A1 G1 208 230 259 859 1,85 6,21 1,438 S

16
Diferencias significativas?: Se determinan calculando el estadstico t para cada par de grupos y calculando el
valor de t
0,975
f
, dependiendo de los grados de libertad (Gl) f calculados. Si | t | > t
0,975
f
se rechaza la hiptesis nula
(hip nula: las muestras provienen de experimentos con medias iguales), es decir, existen diferencias significativas
(S). En caso contrario, no hay evidencia para rechazar la hiptesis nula, es decir, no existen pruebas suficientes para
decir con un 95 % de confianza que las muestras tienen medias distintas, (N).
17
Diferencias significativas?: Se determinan calculando el estadstico t para cada par de grupos y calculando el
valor de t
0,950
f
, dependiendo de los grados de libertad (Gl) f calculados. Si | t | > t
0,950
f
se rechaza la hiptesis nula
(hip nula: las muestras provienen de experimentos con medias iguales), es decir, existen diferencias significativas
(S). En caso contrario, no hay evidencia para rechazar la hiptesis nula, es decir, no existen pruebas suficientes para
decir con un 90 % de confianza que las muestras tienen medias distintas, (N).
124

A2 G2 236 269
A3 G3 236 287
A1 H1 208 317 259 1903 2,76 5,07 1,476 S
A2 H2 236 334
A3 H3 236 251
A1 I1 208 294 259 455 5,89 7,44 1,407 S
A2 I2 236 335
A3 I3 236 323
B1 C1 246 263 2747 1820 0,41 7,68 1,401 N
B2 C2 288 324
B3 C3 350 345
B1 G1 246 230 2747 859 0,94 6,28 1,433 N
B2 G2 288 269
B3 G3 350 287
B1 H1 246 317 2747 1903 0,15 7,74 1,401 N
B2 H2 288 334
B3 H3 350 251
B1 I1 246 294 2747 455 0,69 5,29 1,460 N
B2 I2 288 335
B3 I3 350 323
C1 G1 263 230 1820 859 1,62 7,09 1,414 S
C2 G2 324 269
C3 G3 345 287
C1 H1 263 317 1820 1903 0,28 8,00 1,397 N
C2 H2 324 334
C3 H3 345 251
C1 I1 263 294 1820 455 0,24 5,88 1,444 N
C2 I2 324 335
C3 I3 345 323
G1 H1 230 317 859 1903 1,27 7,00 1,415 N
G2 H2 269 334
G3 H3 287 251
G1 I1 230 294 859 455 2,63 7,31 1,409 S
G2 I2 269 335
G3 I3 287 323
H1 I1 317 294 1903 455 0,59 5,81 1,433 N
H2 I2 334 335
H3 I3 251 323

125

sulfrico
Grupo
datos 1
Grupo
datos 2
Azcares
datos 1
Azcares
datos 2
Var
1
2
Var
2
2

est |
t |
Gl
f
t
0,95
f
Dif
signif?
18

D1 E1 321 283 66 247 5,36 6,00 1,440 S
D2 E2 329 253
D3 E3 313 262
D1 F1 362 283 49 247 9,54 5,54 1,458 S
D2 F2 368 253
D3 F3 354 262
D1 J1 327 283 271 247 5,08 7,98 1,397 S
D2 J2 320 253
D3 J3 352 262
D1 K1 397 283 458 247 7,58 7,34 1,409 S
D2 K2 392 253
D3 K3 358 262
D1 L1 364 283 1947 247 5,22 5,00 1,476 S
D2 L2 405 253
D3 L3 453 262
E1 F1 362 321 49 66 6,45 7,83 1,403 S
E2 F2 368 329
E3 F3 354 313
E1 J1 327 321 271 66 1,13 5,85 1,446 N
E2 J2 320 329
E3 J3 352 313
E1 K1 397 321 458 66 4,64 5,13 1,480 S
E2 K2 392 329
E3 K3 358 313
E1 L1 364 321 1947 66 3,33 4,27 1,517 S
E2 L2 405 329
E3 L3 453 313
F1 J1 327 362 271 49 2,72 5,41 1,469 S
F2 J2 320 368
F3 J3 352 354
F1 K1 397 362 458 49 1,64 4,85 1,508 S
F2 K2 392 368
F3 K3 358 354
F1 L1 364 362 1947 49 1,79 4,20 1,522 S
F2 L2 405 368
F3 L3 453 354
J1 K1 397 327 458 271 3,17 7,51 1,406 S

18
Las diferencias significativas fueron determinadas de la misma forma que lo hechas para los residuos de maz
pretratados con cido sulfrico.
126

J2 K2 392 320
J3 K3 358 352
J1 L1 364 327 1947 271 2,73 5,09 1,473 S
J2 L2 405 320
J3 L3 453 352
K1 L1 364 397 1947 458 0,88 5,78 1,447 S
K2 L2 405 392
K3 L3 453 358

Tabla K 5: Nomenclatura de tags en anlisis estadsticos
Tag Residuos Muestra
cido
% v/v
Tiempo
[min]
cido
%
v/v
Tiempo
[min]
A1 Maz 1 0,50 30 G1 Maz 1 0,50 60
A2 Maz 2 0,50 30 G2 Maz 2 0,50 60
A3 Maz 3 0,50 30 G3 Maz 3 0,50 60
B1 Maz 1 0,75 30 H1 Maz 1 0,75 60
B2 Maz 2 0,75 30 H2 Maz 2 0,75 60
B3 Maz 3 0,75 30 H3 Maz 3 0,75 60
C1 Maz 1 1,00 30 I1 Maz 1 1,00 60
C2 Maz 2 1,00 30 I2 Maz 2 1,00 60
C3 Maz 3 1,00 30 I3 Maz 3 1,00 60
D1 Trigo 1 0,50 30 J1 Trigo 1 0,50 60
D2 Trigo 2 0,50 30 J2 Trigo 2 0,50 60
D3 Trigo 3 0,50 30 J3 Trigo 3 0,50 60
E1 Trigo 1 0,75 30 K1 Trigo 1 0,75 60
E2 Trigo 2 0,75 30 K2 Trigo 2 0,75 60
E3 Trigo 3 0,75 30 K3 Trigo 3 0,75 60
F1 Trigo 1 1,00 30 L1 Trigo 1 1,00 60
F2 Trigo 2 1,00 30 L2 Trigo 2 1,00 60
F3 Trigo 3 1,00 30 L3 Trigo 3 1,00 60

127

Anexo L: Ejemplo de clculo rendimientos

Rendimientos

Para calcular los rendimientos de la cantidad de azcares liberados en cada etapa, o en el proceso
total, sobre la cantidad total de azcares disponibles, se utiliz la siguiente expresin:

%

Ecuacin L 1: Clculo de rendimiento

Por ejemplo, el rendimiento de azcares en la primera fila de la Tabla III-3, en la sacarificacin
enzimtica de residuos de maz sin pretratar, se obtuvo una cantidad de azcares liberados igual a 166
[mg/g de MS], mientras que la cantidad total de azcares disponibles segn la Tabla III-1 es igual a 714
[mg/g de MS]. As, reemplazando valores en la expresin:

%

, %
, %

Este mismo ejemplo es vlido para el clculo de todos los rendimientos de cada pretratamiento
realizado, tanto a nivel de azcares liberados en el pretratamiento, como en la sacarificacin o en el
proceso total, as como en las cantidades de lignina solubilizada.

128

Anexo M: Figuras de sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados
con [EMIM
+
][Cl
-
] por 30 y/o 60 min

Figura M 1: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de maz pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 60 min a 121 C, medidos con DNS

Figura M 2: Cintica de hidrlisis enzimtica de residuos de trigo pretratados con cido sulfrico a
distintas concentraciones, por 30 min a 121 C, medidos con DNS

0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 12 24 36 48 60 72 84 96
A
z
c
a
r
e
s

r
e
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
0,50 %
0,75 %
1,00 %
0
50
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100
A
z
c
a
r
e
s

r
e
u
c
t
o
r
e
s

[
m
g
/
g

d
e

m
a
t
e
r
i
a
l

s
e
c
o
]
0,50 %
0,75 %
1,00 %
129

Anexo N: Valores de absorbancias DNS/kit comerciales y reas GC para
clculo de azcares liberados en cada etapa

1. Absorbancias registradas en pretratamiento cido, alcalino e hidrlisis enzimtica con DNS

La calibracin de la absorbancia a 550 nm del ensayo de DNS se realiz en glucosa, realizando
distintas soluciones de glucosa tal como se aprecia en la siguiente figura:

Figura N 1: Calibracin ensayo DNS en glucosa

La recta interpolada es la siguiente:

[ ] [ ] 994 , 0 187 , 1 005 , 0
2
= + = r Glu Abs
Ecuacin N 1: Calibracin absorbancia DNS v/s glucosa

Para el clculo de las concentraciones de azcares liberados en el pretratamiento cido a partir de
las absorbancias medidas se utiliz la siguiente expresin:

[ ] [ ] [ ] ( ) { }
[ ]
[ ] g M
mL Vol
blanco Abs X Abs
mL
mg
d Az =
(
002 , 0 837 , 0 * Re
Ecuacin N 2: Clculo cantidad de azcares reductores en pretratamiento cido en funcin de
absorbancia medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa

Donde [AzRed] es la cantidad de azcares reductores por gramo de residuo, [Abs X] es el
promedio de las cuatro absorbancias registradas por muestra, Vol es el volumen de aforo del licor
hidrolizado del ensayo y M es la masa en gramos pesada para cada muestra.

0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[

]
Glucosa [mg/mL]
130

Tabla N 1: Valores de absorbancias medidos en los licores hidrolizados en los distintos
pretratamientos de cido diluido, para residuos de maz y trigo
Residuo
cido
%v/v
Tiempo
[min]
Muestra Abs X
Abs
(absol)
Az red
[mg/mL]
Vol
[mL]
Peso
[g]
Az
red
[mg/g]
Maz 0,50 30 1 0,500 0,337 0,280 50 0,2026 69
Maz 0,50 30 2 0,629 0,467 0,389 50 0,1994 98
Maz 0,50 30 3 0,718 0,555 0,463 50 0,1993 116
Maz 0,75 30 1 0,747 0,584 0,487 50 0,1996 122
Maz 0,75 30 2 0,778 0,615 0,513 50 0,2005 128
Maz 0,75 30 3 0,971 0,808 0,675 50 0,2022 167
Maz 1,00 30 1 0,751 0,589 0,491 50 0,2001 123
Maz 1,00 30 2 0,972 0,809 0,676 50 0,2012 168
Maz 1,00 30 3 1,128 0,965 0,806 50 0,1995 202
Trigo 0,50 30 1 0,755 0,593 0,494 50 0,2010 123
Trigo 0,50 30 2 0,641 0,479 0,399 55 0,2007 109
Trigo 0,50 30 3 0,759 0,596 0,497 50 0,1994 125
Trigo 0,75 30 1 0,979 0,816 0,682 50 0,2001 170
Trigo 0,75 30 2 0,886 0,724 0,604 50 0,2005 151
Trigo 0,75 30 3 0,898 0,735 0,614 50 0,1993 154
Trigo 1,00 30 1 1,001 0,839 0,700 50 0,1995 175
Trigo 1,00 30 2 1,020 0,857 0,716 52 0,1999 186
Trigo 1,00 30 3 1,082 0,919 0,768 50 0,2010 191
Maz 0,50 60 1 0,725 0,563 0,469 50 0,2012 117
Maz 0,50 60 2 0,928 0,765 0,639 50 0,2002 160
Maz 0,50 60 3 0,900 0,738 0,616 50 0,1994 154
Maz 0,75 60 1 0,987 0,824 0,688 50 0,1999 172
Maz 0,75 60 2 0,997 0,834 0,696 52,5 0,1993 183
Maz 0,75 60 3 0,746 0,583 0,486 50 0,2015 121
Maz 1,00 60 1 0,865 0,702 0,586 50 0,2001 146
Maz 1,00 60 2 1,015 0,853 0,712 50 0,1992 179
Maz 1,00 60 3 1,093 0,931 0,777 50 0,2010 193
Trigo 0,50 60 1 1,008 0,846 0,706 50 0,2004 176
Trigo 0,50 60 2 0,958 0,796 0,664 50 0,2002 166
Trigo 0,50 60 3 0,961 0,799 0,667 50 0,1999 167
Trigo 0,75 60 1 1,115 0,953 0,796 50 0,1998 199
Trigo 0,75 60 2 1,135 0,972 0,812 50 0,2008 202
Trigo 0,75 60 3 1,079 0,917 0,766 50 0,2009 191
Trigo 1,00 60 1 1,184 1,022 0,854 50 0,2006 213
Trigo 1,00 60 2 1,189 1,027 0,858 50 0,2005 214
Trigo 1,00 60 3 1,345 1,183 0,988 50 0,2004 247
blanco 0,174

131

Para el clculo de las concentraciones de azcares liberados en la sacarificacin de residuos
pretratados con cido diluido a partir de las absorbancias medidas se utiliz la siguiente expresin:

[ ] [ ] [ ] ( ) { }
[ ]
[ ] g M
mL
blanco Abs X Abs
mL
mg
d Az
4
002 , 0 837 , 0 * Re =
(

Ecuacin N 3: Clculo cantidad de azcares reductores en pretratamiento alcalino en funcin de
absorbancia medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa

Tabla N 2: Valores de absorbancias medidos en los licores hidrolizados en los distintos
pretratamientos alcalinos, para residuos de maz y trigo
Residuo
Pretratamiento cido Pretratamiento alcalino
cido
%v/v
Tiempo
[min]
Muestra
Abs
X
Abs
(abs)
AzRed
[mg/mL]
Peso [g]
Az
[mg/g]
Maz 1,00 30 1 0,394 0,158 0,258 0,2007 5,15
Maz 1,00 30 2 0,344 0,108 0,196 0,2013 3,89
Maz 1,00 30 3 0,377 0,141 0,238 0,2000 4,75
Trigo 1,00 60 1 0,291 0,055 0,129 0,1999 2,59
Trigo 1,00 60 2 0,505 0,269 0,398 0,1999 7,96
Trigo 1,00 60 3 0,334 0,098 0,183 0,2007 3,65
Blanco 0,236

Para el clculo de las concentraciones de azcares liberados en el pretratamiento cido a partir de
las absorbancias medidas se utiliz la siguiente expresin:

[ ] [ ] [ ] ( ) { }
[ ]
[ ] g M
mL
f blanco Abs X Abs
mL
mg
d Az
4
002 , 0 837 , 0 * Re =
(

Ecuacin N 4: Clculo cantidad de azcares reductores en sacarificacin en funcin de absorbancia
medida por ensayo DNS con curva de calibracin en glucosa

Donde f representa el factor de dilucin: 12,5 para muestras de 48, 72 y 96 h, 25 para muestras de
6 y 24 h.
Tabla N 3: Valores de absorbancias medidos en el licor de la hidrlisis enzimtica de residuos de
maz y trigo pretratados con cido diluido
Residuo
Pretratamiento cido Hidrlisis enzimtica
cido
% v/v
Tiempo
[min]
Muestras
Tiempo
HE [h]
Abs X
Abs
(absol)
Az red
[mg/mL]
peso
[g]
Az red
[mg/g]
maz
0,50 30 1 6 0,182 -0,095 1,88 0,2026 37
maz
0,50 30 2 6 0,203 -0,074 2,10 0,1994 42
maz
0,50 30 3 6 0,211 -0,066 2,18 0,1993 44
132

maz
0,75 30 1 6 0,184 -0,093 1,90 0,1996 38
maz
0,75 30 2 6 0,189 -0,088 1,95 0,2005 39
maz
0,75 30 3 6 0,214 -0,064 2,21 0,2022 44
maz
1,00 30 1 6 0,189 -0,088 1,95 0,2001 39
maz
1,00 30 2 6 0,164 -0,113 1,70 0,2012 34
maz
1,00 30 3 6 0,182 -0,095 1,88 0,1995 38
trigo
0,50 30 1 6 0,181 -0,097 1,87 0,2010 37
trigo
0,50 30 2 6 0,174 -0,104 1,79 0,2007 36
trigo
0,50 30 3 6 0,164 -0,113 1,69 0,1994 34
trigo 0,75 30 1 6 0,137 -0,140 1,41 0,2001 28
trigo 0,75 30 2 6 0,182 -0,095 1,88 0,2005 38
trigo 0,75 30 3 6 0,147 -0,131 1,51 0,1993 30
trigo 1,00 30 1 6 0,156 -0,121 1,61 0,1995 32
trigo 1,00 30 2 6 0,205 -0,072 2,13 0,1999 43
trigo 1,00 30 3 6 0,184 -0,094 1,90 0,2010 38
maz 0,50 60 1 6 0,135 -0,143 1,39 0,2012 28
maz 0,50 60 2 6 0,144 -0,134 1,48 0,2002 30
maz 0,50 60 3 6 0,121 -0,156 1,25 0,1994 25
maz 0,75 60 1 6 0,132 -0,145 1,36 0,1999 27
maz 0,75 60 2 6 0,209 -0,068 2,17 0,1993 43
maz 0,75 60 3 6 0,169 -0,109 1,74 0,2015 35
maz 1,00 60 1 6 0,153 -0,124 1,58 0,2001 32
maz 1,00 60 2 6 0,141 -0,136 1,45 0,1992 29
maz 1,00 60 3 6 0,138 -0,140 1,42 0,2010 28
trigo 0,50 60 1 6 0,129 -0,148 1,33 0,2004 27
trigo 0,50 60 2 6 0,127 -0,151 1,30 0,2002 26
trigo 0,50 60 3 6 0,150 -0,128 1,54 0,1999 31
trigo 0,75 60 1 6 0,183 -0,095 1,89 0,1998 38
trigo 0,75 60 2 6 0,222 -0,056 2,30 0,2008 46
trigo 0,75 60 3 6 0,150 -0,127 1,55 0,2009 31
trigo 1,00 60 1 6 0,177 -0,100 1,83 0,2006 36
trigo 1,00 60 2 6 0,156 -0,121 1,61 0,2005 32
trigo 1,00 60 3 6 0,174 -0,104 1,79 0,2004 36
maz 0,50 30 1 24 0,254 -0,023 2,63 0,2026 52
maz 0,50 30 2 24 0,277 0,000 2,88 0,1994 58
maz 0,50 30 3 24 0,366 0,088 3,80 0,1993 76
maz 0,75 30 1 24 0,286 0,008 2,97 0,1996 59
maz 0,75 30 2 24 0,355 0,078 3,69 0,2005 74
maz 0,75 30 3 24 0,392 0,115 4,08 0,2022 81
maz 1,00 30 1 24 0,284 0,007 2,95 0,2001 59
maz 1,00 30 2 24 0,302 0,025 3,14 0,2012 62
maz 1,00 30 3 24 0,329 0,052 3,42 0,1995 69
trigo 0,50 30 1 24 0,375 0,097 3,90 0,2010 78
133

trigo 0,50 30 2 24 0,325 0,048 3,38 0,2007 67
trigo 0,50 30 3 24 0,341 0,064 3,55 0,1994 71
trigo 0,75 30 1 24 0,370 0,093 3,85 0,2001 77
trigo 0,75 30 2 24 0,357 0,080 3,71 0,2005 74
trigo 0,75 30 3 24 0,358 0,081 3,73 0,1993 75
trigo 1,00 30 1 24 0,413 0,136 4,30 0,1995 86
trigo 1,00 30 2 24 0,448 0,171 4,67 0,1999 93
trigo 1,00 30 3 24 0,371 0,093 3,86 0,2010 77
maz 0,50 60 1 24 0,336 0,059 3,49 0,2012 69
maz 0,50 60 2 24 0,316 0,039 3,28 0,2002 66
maz 0,50 60 3 24 0,353 0,076 3,67 0,1994 74
maz 0,75 60 1 24 0,374 0,097 3,89 0,1999 78
maz 0,75 60 2 24 0,395 0,117 4,11 0,1993 82
maz 0,75 60 3 24 0,376 0,099 3,91 0,2015 78
maz 1,00 60 1 24 0,324 0,046 3,36 0,2001 67
maz 1,00 60 2 24 0,399 0,122 4,16 0,1992 83
maz 1,00 60 3 24 0,304 0,027 3,16 0,2010 63
trigo 0,50 60 1 24 0,434 0,157 4,52 0,2004 90
trigo 0,50 60 2 24 0,409 0,132 4,26 0,2002 85
trigo 0,50 60 3 24 0,454 0,176 4,72 0,1999 95
trigo 0,75 60 1 24 0,444 0,166 4,62 0,1998 92
trigo 0,75 60 2 24 0,461 0,184 4,80 0,2008 96
trigo 0,75 60 3 24 0,417 0,139 4,34 0,2009 86
trigo 1,00 60 1 24 0,408 0,131 4,25 0,2006 85
trigo 1,00 60 2 24 0,532 0,254 5,54 0,2005 111
trigo 1,00 60 3 24 0,553 0,276 5,76 0,2004 115
maz 0,50 30 1 48 0,665 0,387 6,93 0,2026 137
maz 0,50 30 2 48 0,662 0,385 6,91 0,1994 139
maz 0,50 30 3 48 0,574 0,296 5,98 0,1993 120
maz 0,75 30 1 48 0,594 0,317 6,20 0,1996 124
maz 0,75 30 2 48 0,767 0,489 8,00 0,2005 160
maz 0,75 30 3 48 0,878 0,600 9,16 0,2022 181
maz 1,00 30 1 48 0,672 0,395 7,01 0,2001 140
maz 1,00 30 2 48 0,746 0,468 7,78 0,2012 155
maz 1,00 30 3 48 0,687 0,409 7,16 0,1995 144
trigo 0,50 30 1 48 0,769 0,492 8,03 0,2010 160
trigo 0,50 30 2 48 0,688 0,410 7,17 0,2007 143
trigo 0,50 30 3 48 0,660 0,383 6,89 0,1994 138
trigo 0,75 30 1 48 0,724 0,447 7,56 0,2001 151
trigo 0,75 30 2 48 0,854 0,577 8,91 0,2005 178
trigo 0,75 30 3 48 0,761 0,483 7,94 0,1993 159
trigo 1,00 30 1 48 0,892 0,615 9,31 0,1995 187
trigo 1,00 30 2 48 0,870 0,592 9,08 0,1999 182
134

trigo 1,00 30 3 48 0,780 0,502 8,14 0,2010 162
maz 0,50 60 1 48 0,544 0,267 5,67 0,2012 113
maz 0,50 60 2 48 0,526 0,249 5,48 0,2002 110
maz 0,50 60 3 48 0,638 0,360 6,65 0,1994 133
maz 0,75 60 1 48 0,692 0,415 7,22 0,1999 145
maz 0,75 60 2 48 0,722 0,444 7,53 0,1993 151
maz 0,75 60 3 48 0,626 0,349 6,53 0,2015 130
maz 1,00 60 1 48 0,705 0,428 7,36 0,2001 147
maz 1,00 60 2 48 0,748 0,471 7,81 0,1992 157
maz 1,00 60 3 48 0,624 0,346 6,50 0,2010 129
trigo 0,50 60 1 48 0,723 0,445 7,54 0,2004 151
trigo 0,50 60 2 48 0,740 0,463 7,72 0,2002 154
trigo 0,50 60 3 48 0,885 0,608 9,24 0,1999 185
trigo 0,75 60 1 48 0,949 0,672 9,91 0,1998 198
trigo 0,75 60 2 48 0,908 0,631 9,48 0,2008 189
trigo 0,75 60 3 48 0,801 0,524 8,36 0,2009 167
trigo 1,00 60 1 48 0,727 0,449 7,58 0,2006 151
trigo 1,00 60 2 48 0,915 0,638 9,55 0,2005 191
trigo 1,00 60 3 48 0,986 0,709 10,30 0,2004 206
maz 0,50 30 1 72 0,465 0,188 4,84 0,2026 96
maz 0,50 30 2 72 0,486 0,209 5,07 0,1994 102
maz 0,50 30 3 72 0,520 0,243 5,42 0,1993 109
maz 0,75 30 1 72 0,558 0,281 5,82 0,1996 117
maz 0,75 30 2 72 0,653 0,376 6,81 0,2005 136
maz 0,75 30 3 72 0,773 0,496 8,07 0,2022 160
maz 1,00 30 1 72 0,612 0,334 6,38 0,2001 128
maz 1,00 30 2 72 0,628 0,350 6,55 0,2012 130
maz 1,00 30 3 72 0,645 0,368 6,73 0,1995 135
trigo 0,50 30 1 72 0,713 0,436 7,44 0,2010 148
trigo 0,50 30 2 72 0,734 0,456 7,66 0,2007 153
trigo 0,50 30 3 72 0,689 0,412 7,19 0,1994 144
trigo 0,75 30 1 72 0,747 0,470 7,79 0,2001 156
trigo 0,75 30 2 72 0,798 0,520 8,33 0,2005 166
trigo 0,75 30 3 72 0,760 0,483 7,93 0,1993 159
trigo 1,00 30 1 72 0,884 0,607 9,23 0,1995 185
trigo 1,00 30 2 72 0,916 0,638 9,56 0,1999 191
trigo 1,00 30 3 72 0,817 0,540 8,53 0,2010 170
maz 0,50 60 1 72 0,725 0,447 7,56 0,2012 150
maz 0,50 60 2 72 0,608 0,331 6,34 0,2002 127
maz 0,50 60 3 72 0,743 0,466 7,75 0,1994 156
maz 0,75 60 1 72 0,749 0,471 7,81 0,1999 156
maz 0,75 60 2 72 0,831 0,554 8,67 0,1993 174
maz 0,75 60 3 72 0,785 0,507 8,19 0,2015 163
135

maz 1,00 60 1 72 0,653 0,375 6,81 0,2001 136
maz 1,00 60 2 72 0,718 0,440 7,49 0,1992 150
maz 1,00 60 3 72 0,626 0,348 6,52 0,2010 130
trigo 0,50 60 1 72 0,798 0,521 8,33 0,2004 166
trigo 0,50 60 2 72 0,816 0,538 8,51 0,2002 170
trigo 0,50 60 3 72 0,907 0,629 9,47 0,1999 189
trigo 0,75 60 1 72 1,019 0,742 10,64 0,1998 213
trigo 0,75 60 2 72 1,023 0,746 10,69 0,2008 213
trigo 0,75 60 3 72 0,953 0,676 9,95 0,2009 198
trigo 1,00 60 1 72 0,789 0,512 8,24 0,2006 164
trigo 1,00 60 2 72 1,083 0,805 11,31 0,2005 226
trigo 1,00 60 3 72 1,038 0,761 10,84 0,2004 216
maz 0,50 30 1 96 0,589 0,312 6,14 0,2026 121
maz 0,50 30 2 96 0,599 0,321 6,24 0,1994 125
maz 0,50 30 3 96 0,723 0,446 7,54 0,1993 151
maz 0,75 30 1 96 0,621 0,344 6,48 0,1996 130
maz 0,75 30 2 96 0,752 0,474 7,84 0,2005 156
maz 0,75 30 3 96 0,878 0,601 9,17 0,2022 181
maz 1,00 30 1 96 0,688 0,411 7,18 0,2001 143
maz 1,00 30 2 96 0,731 0,454 7,63 0,2012 152
maz 1,00 30 3 96 0,730 0,453 7,62 0,1995 153
trigo 0,50 30 1 96 0,790 0,513 8,25 0,2010 164
trigo 0,50 30 2 96 0,723 0,446 7,54 0,2007 150
trigo 0,50 30 3 96 0,704 0,427 7,34 0,1994 147
trigo 0,75 30 1 96 0,782 0,505 8,16 0,2001 163
trigo 0,75 30 2 96 0,824 0,546 8,60 0,2005 172
trigo 0,75 30 3 96 0,766 0,489 7,99 0,1993 160
trigo 1,00 30 1 96 0,853 0,576 8,90 0,1995 179
trigo 1,00 30 2 96 1,086 0,809 11,35 0,1999 227
trigo 1,00 30 3 96 0,879 0,602 9,18 0,2010 183
maz 0,50 60 1 96 0,648 0,370 6,76 0,2012 134
maz 0,50 60 2 96 0,597 0,320 6,23 0,2002 124
maz 0,50 60 3 96 0,727 0,449 7,58 0,1994 152
maz 0,75 60 1 96 0,732 0,455 7,64 0,1999 153
maz 0,75 60 2 96 0,786 0,509 8,20 0,1993 165
maz 0,75 60 3 96 0,679 0,402 7,08 0,2015 141
maz 1,00 60 1 96 0,604 0,327 6,30 0,2001 126
maz 1,00 60 2 96 0,865 0,588 9,03 0,1992 181
maz 1,00 60 3 96 0,723 0,446 7,54 0,2010 150
trigo 0,50 60 1 96 0,806 0,529 8,41 0,2004 168
trigo 0,50 60 2 96 0,789 0,511 8,23 0,2002 164
trigo 0,50 60 3 96 0,857 0,579 8,94 0,1999 179
trigo 0,75 60 1 96 0,834 0,556 8,70 0,1998 174
136

trigo 0,75 60 2 96 0,928 0,651 9,69 0,2008 193
trigo 0,75 60 3 96 0,851 0,574 8,89 0,2009 177
trigo 1,00 60 1 96 0,805 0,527 8,40 0,2006 167
trigo 1,00 60 2 96 0,950 0,673 9,92 0,2005 198
trigo 1,00 60 3 96 1,004 0,727 10,49 0,2004 209
blanco 0,163

Para los residuos pretratados con hidrxido de sodio, la expresin para calcular los azcares
reductores liberados en la hidrlisis enzimtica es igual a la utilizada para los pretratados solamente con
cido.

Tabla N 4: Valores de absorbancias medidos en el licor de la hidrlisis enzimtica de residuos de
maz y trigo pretratados con cido diluido y alcalino
Residuos
Pretratamiento cido Hidrlisis enzimtica de pretrat alcalino
cido
%
v/v
Tiempo
[min]
Muest
Tiempo
HE [h]
Abs X
Abs
(abso)
Az red
[mg/mL]
peso
[g]
Az red
[mg/g]
maz
1,00 30 1 6 0,789 0,707 8,23 0,2007 164
maz
1,00 30 2 6 0,832 0,751 8,68 0,2013 173
maz
1,00 30 3 6 0,864 0,782 9,01 0,2000 180
trigo
1,00 60 1 6 0,800 0,718 8,34 0,1999 167
trigo
1,00 60 2 6 0,801 0,719 8,36 0,1999 167
trigo
1,00 60 3 6 0,842 0,761 8,79 0,2007 175
maz
1,00 30 1 24 0,900 0,818 9,39 0,2007 187
maz
1,00 30 2 24 0,835 0,753 8,71 0,2013 173
maz
1,00 30 3 24 0,796 0,714 8,30 0,2000 166
trigo
1,00 60 1 24 0,849 0,768 8,86 0,1999 177
trigo
1,00 60 2 24 0,846 0,765 8,83 0,1999 177
trigo
1,00 60 3 24 0,872 0,791 9,11 0,2007 181
maz
1,00 30 1 48 1,071 0,909 11,19 0,2007 223
maz
1,00 30 2 48 0,930 0,767 9,71 0,2013 193
maz
1,00 30 3 48 0,935 0,772 9,76 0,2000 195
trigo
1,00 60 1 48 0,992 0,829 10,36 0,1999 207
trigo
1,00 60 2 48 0,967 0,805 10,10 0,1999 202
trigo
1,00 60 3 48 1,024 0,861 10,69 0,2007 213
maz
1,00 30 1 72 0,977 0,814 10,20 0,2007 203
maz
1,00 30 2 72 0,986 0,823 10,30 0,2013 205
maz
1,00 30 3 72 1,013 0,850 10,58 0,2000 212
trigo
1,00 60 1 72 1,006 0,844 10,51 0,1999 210
trigo
1,00 60 2 72 0,953 0,790 9,95 0,1999 199
trigo
1,00 60 3 72 1,046 0,883 10,92 0,2007 218
maz
1,00 30 1 96 1,005 0,842 10,49 0,2007 209
137

maz
1,00 30 2 96 1,097 0,934 11,46 0,2013 228
maz
1,00 30 3 96 1,214 1,051 12,68 0,2000 254
trigo
1,00 60 1 96 0,917 0,754 9,57 0,1999 192
trigo
1,00 60 2 96 1,100 0,938 11,49 0,1999 230
trigo
1,00 60 3 96 1,053 0,890 11,00 0,2007 219

2. Absorbancias registradas para kit comerciales

Para calcular las cantidades msicas de cada monmero liberadas se utilizaron las siguientes
expresiones en la hidrlisis cida:

[ ] ( ) ( ) { }
[ ]
[ ] g M
mL
A A A A
mL
mg
g
mg
d Az
blanco blanco
50
1 2 1 2 7005 , 0 Re
(
=
(

Ecuacin N 5: Cantidad msica de xilosa en la muestra

[ ]
[ ]
[ ] g M
mL
A
A
mL
mg
g
mg
d Az
std
50
00 , 1 Re
(
=
(

Ecuacin N 6: Cantidad msica de glucosa en la muestra

Las absorbancias registradas a 500 nm (glucosa) y 320 nm (xilosa) para las muestras pretratadas
con cido sulfrico en el pretratamiento y sacarificacin fueron las siguientes:

Tabla N 5: Valores de absorbancias registrados para residuos de maz y trigo pretratados con cido
diluido en autoclave a las condiciones especificadas
Residuo
Pretratamiento

Xilosa Glucosa
cido
%
v/v
Tiempo
[min]
M [g]
A1
(abs)
A2
(abs)
Xilosa
[mg/g
MS]
A
Glucosa
mg/mL
Glucosa
[mg/g
MS]
Maz 1,00 30 0,2001 0,221 0,828 104 0,042 0,087 22
Maz 1,00 30 0,2012 0,233 0,753 89 0,129 0,267 67
Maz 1,00 30 0,1995 0,259 0,953 120 0,075 0,155 39
Trigo 1,00 60 0,2006 0,223 1,150 160 0,155 0,321 80
Trigo 1,00 60 0,2005 0,245 1,223 169 0,059 0,122 31
Trigo 1,00 60 0,2004 0,259 1,234 169 0,072 0,149 37
Std xilosa

0,195 0,721

blanco

0,237 0,247

Std glucosa

0,482

138

Tabla N 6: Valores de absorbancias registrados en la hidrlisis enzimtica para residuos de maz y
trigo pretratados con cido diluido en autoclave a las condiciones especificadas (std y blanco iguales
a Tabla N-5)
Residuo
Pretratamiento

Xilosa Glucosa
cido
%
v/v
Tiempo
[min]
M [g]
A1
(abs)
A2
(abs)
Xilosa
[mg/g
MS]
A
Glucosa
[mg/mL]
Glucos
[mg/g
MS]
Maz
1,00 30 0,2001 0,214 0,490 47 0,298 0,618 154
Maz
1,00 30 0,2012 0,278 0,423 24 0,267 0,554 138
Maz
1,00 30 0,1995 0,248 0,403 25 0,264 0,548 137
Trigo
1,00 60 0,2006 0,218 0,456 40 0,342 0,710 177
Trigo
1,00 60 0,2005 0,223 0,581 61 0,414 0,859 214
Trigo
1,00 60 0,2004 0,249 0,471 37 0,412 0,855 213
Tabla N 7: Valores de absorbancias registrados en la hidrlisis enzimtica para residuos de maz y
trigo pretratados con cido diluido en autoclave a las condiciones especificadas y pret alcalino
Residuo
Pretratamiento Xilosa Glucosa
cido
% v/v
Tiempo
[min]
M [g]
A1
(abs)
A2
(abs)
mg/g
MS
A mg/mL mg/g MS
Maz 1,00 30 0,2007 0,209 0,289 9 0,380 0,788 196
Maz 1,00 30 0,2013 0,218 0,283 7 0,420 0,871 216
Maz 1,00 30 0,2000 0,211 0,282 8 0,425 0,882 220
Trigo 1,00 60 0,1999 0,210 0,287 9 0,415 0,861 215
Trigo 1,00 60 0,1999 0,198 0,302 13 0,378 0,784 196
Trigo 1,00 60 0,2007 0,206 0,295 11 0,397 0,824 205
Blanco xilosa
0,206 0,233

Glucosa

0,482

Tabla N 8: Valores de absorbancias registrados en el pretratamiento de residuos de maz y trigo
pretratados [EMIM][Cl] a 150 C por 60 min
Residuo M [g]
Xilosa Glucosa
A1
(abs)
A2
(abs)
Xilosa
[mg/g MS]
A
Glucosa
[mg/mL]
Glucosa
[mg/g MS]
Trigo 0,1000 0,509 0,576 12 0,054 0,141 71
Trigo 0,1000 0,497 0,545 6 0,046 0,120 60
Trigo 0,1000 0,443 0,506 11 0,025 0,065 33
Maz 0,1000 0,213 0,271 9 0,01 0,026 13
Maz 0,1000 0,209 0,279 13 0,005 0,013 7
Maz 0,1000 0,217 0,278 10 0,002 0,005 3
Blanco xil 0,202 0,234

Std glucosa

0,382

139

3. Absorbancias registradas para mediciones de lignina soluble

Para las mediciones de lignina soluble, a partir de las absorbancias registradas, se utiliz la
siguiente expresin:

[ ]
( ) [ ]
[ ] g M
mL V
f
b
A A
g
mg
Lignina
blanco

=
(

Ecuacin N 7: Cantidad de lignina solubilizada en pretratamientos cido y alcalino

Donde es el coeficiente de absorbancia a 205 nm para lignina, igual a 110 [mL/mgcm] y b es el
ancho de la cubeta, igual a 1 cm. El volumen de la muestra es V, mientras que f es el factor de dilucin.

Tabla N 9: Valores de absorbancias registrados para la medicin de lignina en el pretratamiento de
residuos de maz y trigo con cido diluido y alcalino
Tag
Abs 205
nm
Dilucin
Volumen
[mL]
Masa [g]
Lignina soluble
[mg/g de MS]
A1 0,282 25 50 0,2026 1,3
A2 0,348 25 50 0,1994 5,1
A3 0,422 25 50 0,1993 9,3
B1 0,405 25 50 0,1996 8,3
B2 0,404 25 50 0,2005 8,2
B3 0,503 25 50 0,2022 13,7
C1 0,358 25 50 0,2001 5,6
C2 0,415 25 50 0,2012 8,8
C3 0,461 25 50 0,1995 11,5
D1 0,557 25 50 0,2010 16,8
D2 0,497 25 50 0,2007 13,5
D3 0,528 25 50 0,1994 15,3
E1 0,562 25 50 0,2001 17,2
E2 0,522 25 50 0,2005 14,9
E3 0,587 25 50 0,1993 18,7
F1 0,591 25 50 0,1995 18,9
F2 0,611 25 50 0,1999 20,0
F3 0,597 25 50 0,2010 19,1
G1 0,281 50 50 0,2012 11,5
G2 0,291 50 50 0,2002 12,7
G3 0,301 50 50 0,1994 13,9
H1 0,312 50 50 0,1999 15,1
H2 0,292 50 50 0,1993 12,9
140

H3 0,239 50 50 0,2015 6,8
I1 0,274 50 50 0,2001 10,8
I2 0,280 50 50 0,1992 11,5
I3 0,280 50 50 0,2010 11,4
J1 0,375 50 50 0,2004 22,2
J2 0,374 50 50 0,2002 22,1
J3 0,386 50 50 0,1999 23,5
K1 0,398 50 50 0,1998 24,9
K2 0,401 50 50 0,2008 25,1
K3 0,409 50 50 0,2009 26,0
L1 0,428 50 50 0,2006 28,2
L2 0,418 50 50 0,2005 27,1
L3 0,422 50 50 0,2004 27,6
R1 0,459 3333 4 0,2007 178
R2 0,47 3333 4 0,2013 184
R3 0,484 3333 4 0,2000 193
S1 0,53 3333 4 0,1999 221
S2 0,549 3333 4 0,1999 233
S3 0,501 3333 4 0,2007 203

Los tags A L siguen la misma nomenclatura citada en la Tabla K-5, mientras que los tags R y S
van acorde lo siguiente:

Tabla N 10: Nomenclatura de ensayos R y S para pretratamiento alcalino adicional
Pretratamiento
cido
Pretratamiento
alcalino
cido
% v/v
Tiempo
[min]
Base
% p/v
Tiempo
[min]
R1 Trigo 1 1,00 60 2,00 60
R2 Trigo 2 1,00 60 2,00 60
R3 Trigo 3 1,00 60 2,00 60
S1 Maz 1 1,00 30 2,00 60
S2 Maz 2 1,00 30 2,00 60
S3 Maz 3 1,00 30 2,00 60

4. reas de mediciones en cromatgrafo de gases para cada monmero en ensayo con lquidos
inicos

La frmula para el clculo de las cantidades de azcares liberados a partir de los valores de reas
es la siguiente:

141

[ ]
( )
( )
( )
( )
( )
( )
( )
( )
( ) muestra M
enzimat V
muestra V
calib en azcar c
calib en std A
calib en muestra A
calib V
std A
azcar A
g
mg
do Monosacri =
(

Ecuacin N 8: Expresin para el clculo de msico de monosacridos a travs de mediciones GC

Donde:

A (azcar): es el rea del monosacrido en investigacin en la muestra
A (std): es el rea del estndar (xilitol) suministrado junto a la muestra
A (muestra en calib): es el rea del monosacrido en el ensayo de calibracin
A (std en calib): es el rea del estndar (xilitol) en el ensayo de calibracin
C (azcar en calib): es la concentracin de los monosacridos en la calibracin, igual a 0,1 [mg/mL]
V (calib): volumen de calibracin, igual a 1 [mL]
V (muestra): volumen de la muestra, igual a 20 [L]
V (enzimat): volumen del lquido en la sacarificacin, asumido constante e igual a 2 [mL]
M (muestra): masa pesada para cada ensayo, igual a 0,1 [g]

+
][Cl
-
] a 80 C por 60 min y para
residuos sin pretratar
Tag
rea monmeros [Vs]
Arabin Fructosa Galactosa Glucosa Manosa Sucrosa Xilosa Std
Std 1.3 378195 666839 380702 401406 113139 376601 373261 535139
Std 2.3 408103 698869 413483 434378 123365 418049 401171 561680
prom std 393149 682854 397093 417892 118252 397325 387216 548410
rp a4 72 14964 1324 1521 288245 809 334 74807 592161
rp a5 72 8996 7574 2725 190194 0 235 49357 486432
rp a6 72 11795 0 3008 192117 0 205 57452 470892
rp h1 72 13458 112 2750 185843 0 387 70796 519122
rp h2 72 8608 0 1688 139124 0 367 52588 455144
rp h3 72 15673 0 2810 200197 0 380 73619 518625
rp maiz 1 72 9891 47170 5570 228770 1521 1180 52402 516417
rp maiz 2 72 7746 102806 2684 214465 1120 336 39177 503967
rp maiz 3 72 10391 71034 4320 198798 1435 435 43347 529985
rp trigo 1 72 13945 9446 3418 172708 908 0 59880 519951
rp trigo 2 72 11744 21484 6597 172699 1723 0 55964 484288
rp trigo 3 72 17510 36986 4297 220353 1515 0 67600 616669

142

+
][Cl
-
] a 121 y 150 C por 60 min
Tag
rea monmeros [Vs]
Arabinos Fructosa Galactosa Glucosa Manosa Sucrosa Xilosa Std
STD 1.4 387039 650809 379326 396534 108030 344789 376122 501573
STD 2.4 417118 711107 408327 423618 119558 369197 404650 534145
prom std 402079 680958 393827 410076 113794 356993 390386 517859
RP B1 72 18454 2050 3474 354362 0 723 146985 522678
RP B2 72 17178 2700 3203 378250 709 130331 503496
RP B3 72 11599 1423 2456 291522 0 711 119864 550419
RP C1 72 12892 0 1450 513473 0 1004 546444
RP C2 72 11454 1557 1371 501572 759 206731 526590
RP C3 72 16105 1428 2390 0 996 200440 516635
RP D1 72 13450 0 1612 0 681 562572
RP D2 72 15596 2151 3300 563552 0 946 225128 518617
RP D3 72 17610 2069 3129 626314 0 1133 248685 585796
RP E1 72 14265 327 2583 244976 0 655 53002 529733
RP E2 72 16167 1421 2251 252747 0 702 114292 555798
RP E3 72 14576 1387 1174 239339 0 793 112369 515105

Tabla N 13: Valores de reas registrados por GC para la medicin de monosacridos a las 6 y 24 h
de sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] a 150 C por 60 min
Tag
rea monmeros [Vs]
Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manosa Sucrosa Xilosa Std
Std 1.3 378195 666839 380702 401406 113139 376601 373261 535139
Std 2.3 408103 698869 413483 434378 123365 418049 401171 561680
prom std 393149 682854 397093 417892 118252 397325 387216 548410
rp c1 6 6217 520 0 354459 0 0 129864 630517
rp c2 6 6564 0 0 432427 0 243 146233 678132
rp c3 6 7802 0 631 267711 0 767 110884 634028
rp c1 24 11909 1305 2518 531710 0 460 220579 729218
rp c2 24 8573 1198 843 476740 0 971 188945 609073
rp c3 24 13709 1532 1068 379566 0 251 177188 630478
rp d1 6 7875 999 0 339659 0 556 110719 566080
rp d2 6 3718 1974 569 309943 0 417 99631 548579
rp d3 6 6704 1795 0 444705 0 140 138391 540367
rp d1 24 15019 2160 3172 490510 641 577 188317 598468
rp d2 24 11291 2004 2061 574523 706 589 217780 700868
rp d3 24 13819 1753 1062 572460 0 207 211445 607683

143

sacarificacin de residuos de maz y trigo pretratados con [Aliquat
+
][OH
-
] y sin solventes a 150 C
por 60 min
Tag
rea monmeros [Vs]
Arabinos Fructosa Galactosa Glucosa Manosa Sucrosa Xilosa Std
STD 1.5 333511 577027 326734 343026 111265 321597 323971 432560
STD 2.5 369436 644738 360613 379473 122560 369937 357306 485606
prom std 351474 610883 343674 361250 116913 345767 340639 459083
RP J1 72 581 4856 1286 61146 0 4347 46097 534303
RP J2 72 1573 5320 2021 104257 0 668 23528 529462
RP J3 72 2431 9240 1449 88790 0 555 16231 531398
RP N1 72 2613 7101 1137 83799 0 299 24990 497559
RP N2 72 3480 5787 1683 107455 0 625 13899 544008
RP N3 72 4166 11712 2780 108650 0 596 26706 530599
RP O1 72 8861 17522 2953 159931 1184 571 22929 517288
RP O2 72 10041 17138 2922 184624 806 573 46871 496505
RP O3 72 12418 12251 3320 190832 807 749 50141 503656
RP P1 72 10316 8051 2707 143101 826 624 52402 558799
RP P2 72 9914 4169 2832 154562 1004 544 29534 550459
RP P3 72 15410 14199 4095 302278 0 398 70038 670036

Tabla N 15: Nomenclatura de tags utilizados
Pretratamiento
Residuo Lquido inico Temperatura C Tiempo [min]
RP A4 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP A5 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP A6 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP B1 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 121 60
RP B2 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 121 60
RP B3 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 121 60
RP C1 24 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP C1 6 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP C2 6 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP C3 6 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
+
][Cl
-
] 150 60
+
][Cl
-
] 150 60
+
][Cl
-
] 150 60
+
][Cl
-
] 150 60
+
][Cl
-
] 150 60
144

+
][Cl
-
] 150 60
RP D1 6 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D2 6 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D3 6 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D1 24 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D2 24 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D3 24 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D1 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D2 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP D3 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 60
RP E1 72 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 121 60
+
][Cl
-
] 121 60
+
][Cl
-
] 121 60
RP H1 72 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 80 60
+
][Cl
-
] 80 60
+
][Cl
-
] 80 60
RP I1 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 30
RP I2 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 30
RP I3 72 Maz [EMIM
+
][Cl
-
] 150 30
RP J1 72 Maz [Aliquat
+
][OH
-
] 150 60
+
][OH
-
] 150 60
+
][OH
-
] 150 60
RP L1 72 Trigo [EMIM
+
][Cl
-
] 150 30
+
][Cl
-
] 150 30
+
][Cl
-
] 150 30
RP N1 72 Trigo [Aliquat
+
][OH
-
] 150 60
+
][OH
-
] 150 60
+
][OH
-
] 150 60
RP O1 72 Maz sin solventes 150 60
RP P1 72 Trigo sin solventes 150 60
RP MAIZ 1 72 Maz sin pretratamiento
145

RP TRIGO 1 72 Trigo sin pretratamiento

146

Anexo : Tiempos de elucin y reas de azcares en GC

Figura 1: Cromatograma de sacarificacin enzimtica

Figura 2: Cromatograma de MicroExtraccin en fase slida de licor de sacarificacin para
determinacin de existencia de furfural, para residuos de trigo pretratados con [EMIM
+
][Cl
-
] por 60
min a 150 C (similar resultado para residuos de maz)

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DILUIDO Y LQUIDOS INICOS EN RESIDUOS

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