INDICE

1. ANTECEDENTES 2. PROBLEMTICA 3. JUSTIFICACIN 4. ALCANCE 5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GENERAL 5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 6. HIPTESIS 6.1 HIPTESIS NULA 6.2 HIPTESIS ALTERNA 7. MARCO TERICO 7.1 CARACTERSTICAS DEL TOMATE RIN 7.2 CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO ANTAGONISTA 8. MARCO METODOLGICO 8.1 METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIN Y PRESERVACION DE LAS CEPAS DE TRICHODERMA 8.2 DISEO DEL MEDIO

1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4

5 6 7

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 10. ANEXOS

TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIN Y PRESERVACIN DEL TRICHODERMA COMO AGENTE DE BIOCONTROL DE MICROORGANISMOS QUE ATACAN A CULTIVOS DE TOMATE RION. 1. ANTECEDENTES La mayora de las enfermedades de plantas generalmente se controlan con fungicidas qumicos, los cuales se aplican al suelo, semillas, follaje y fruto. El control biolgico utiliza organismos vivos, involucra tambin microorganismos cuya actividad biolgica disminuye el dao causado por los patgenos de las plantas. El tomate rin se cultiva en casi todo el mundo, convirtindose en una de las hortalizas de mayor importancia comercial tanto por su nivel de consumo, que es alrededor del 48.43%, y sus caractersticas nutricionales como fuente valiosa de vitaminas y sales minerales. La produccin en el Ecuador de tomate rin en el 2005 fue de 58778 has, las plagas destruyen anualmente cerca del 35% de las cosechas. Los cultivos de tomate son atacadas por microorganismos fngicos: Phytophthora Infestans, Alternaria solani, Ascochyta lycopersici, Oidium sp., Fusarium oxysporum f.sp., Verticillium alboatrum, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Colletotrichum, Macrophomina phaseolina, y bacterias: Corynebacterium michiganense, Erwinia carotovora, Pseudomonas solanacearum, que se controlan con una amplia variedad de fertilizantes. El gnero Trichoderma es un hongo anaerbico facultativo, habitante natural del suelo de pH 6-7, que contiene materia orgnica mayor al 2%; tiene la capacidad de sobrevivir en el habitad donde es cultivado el tomate, en climas clidos, templados a 24C - 25C y 50% - 60% de humedad. Algunas de sus especies tienen la habilidad de producir metabolitos secundarios, que se originan a partir de intermediarios del metabolismo primario y son clasificados segn su precursor. El acetil es el compuesto intermediario del metabolismo secundario de los hongos filamentosos productores de terpenos (carotenoides, ergosterol, acido giberlico), derivados de cidos grasos (poliacetileno), de derivados de aminocidos (alcaloides, penicilina, cefalosporina) y por ltimo de polictido. La combinacin de pequeas cantidades de antibiticos y enzimas lticas de Trichoderma inhiben la germinacin de esporas y elongacin del tubo germinal del hongo husped. Cuando Trichoderma se pone en contacto con hifas de otro organismo susceptible, tiende a segregar sustancias supresoras de crecimiento, que hacen que el otro organismo detenga su crecimiento, como enzimas que atacan o inhiben a los hongos fitopatgenos y que lo hacen un excelente agente de biocontrol. 2. PROBLEMTICA La necesidad de reducir el uso de fungicidas en el control fitosanitario hace necesario desarrollar tecnologas que permitan de forma fcil, econmica y efectiva obtener productos a partir de microorganismos, con la calidad y cantidad suficiente para su aplicacin masiva en reas de cultivo. En el Ecuador el rendimiento del pas es apenas de 88.933 kilogramos/ hectrea frente 252.688 kilogramos/ hectrea que constituye la media del Continente

Americano, lo que hace necesario innovar nuevas tecnologas para mejorar la produccin. En Cuba a partir de 1990 se iniciaron estudios para el biocontrol de hongos en los suelos de hortalizas, obteniendo as aislamientos del Trichoderma que fueron seleccionados por su capacidad hiperparsita. 3. JUSTIFICACIN En el Ecuador se cultiva tomate bajo condiciones ambientales adversas, con incidencias de plagas, organismos patgenos y poblaciones de malas hierbas, siendo el costo de produccin USD 900 por tonelada mtrica, con una prdida econmica de USD 315, adems, un alto porcentaje de los costos de produccin est relacionado con la compra y aplicacin de insumos, entre ellos los agroqumicos, productos que los tomateros usan de una manera excesiva y que, adems de encarecer los costos de produccin, causan serios disturbios al medio ambiente y a la salud de los consumidores y de los mismos productores, lo que se puede contrarrestar con sistemas de agricultura orgnica, como el uso de biofertilizantes, minimizando el uso de agroqumicos a corto y mediano plazo. Con el biocontrol se busca la regulacin de la abundancia de organismos indeseables a travs de la autodefensa y la competencia de la planta con organismos patgenos y su tasa de produccin sana. 4. ALCANCE Aislamiento, seleccin y preservacin del Trichoderma comportamiento con microorganismos antagonistas. 5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar el antagonismo entre el Trichoderma y los microorganismos causantes de enfermedades en el tomate rin. para evaluar su

5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Aislar los microorganismos fngicos a partir del suelo donde se cultiva el tomate. Identificar y seleccionar la mejor cepa del gnero Trichoderma. Determinar el antagonismo mediante enfrentamiento dual de Trichoderma vs. Microorganismos patgenos. Preservar las cepas de mejor efecto antagnico aplicando la tcnica de crioconservacin.

6. HIPOTESIS 6.1 HIPOTESIS ALTERNATIVA Los metabolitos producidos por las cepas obtenidas del Trichoderma, inhiben el crecimiento de microorganismos que atacan al tomate rin.

6.2 HIPOTESIS NULA Los metabolitos producidos por las cepas obtenidas del Trichoderma, no inhiben el crecimiento de microorganismos que atacan al tomate rin. 7. MARCO TEORICO 7.1 CARACTERSTICAS DEL TOMATE RIN Las enfermedades del tomate se producen por varios microorganismos, para este problema se utilizan organismos biocontroladores de enfermedades como ELEMENTO CANTIDAD Agua 93.5 % Protena 0.9 g Grasa 0.1 g Carbohidratos 3.3 g Fibra 0.8 g Fsforo 19 mg Calcio 7 mg Hierro 0.7 mg Vitaminas A, B1, B2 1.2 mg Vitamina C 20 mg Niacina 0.6mg Trichoderma. El tomate tiene nutrientes que ayudan a que estos hongos crezcan; su composicin qumica promedio es la siguiente: Tabla 1. Composicin Qumica del Tomate por cada 100g de Tomate Fresco

Fuente: California Tomato Board, U.S. Departament of Agriculture, 2000

7.2 CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO ANTAGONISTA

Tabla 2. Metabolitos y Necesidades Mnimas del Trichoderma para Produccin de Biomasa

Grupo Trfico Fuente de Carbono Fuente de Energa Donador de electrones Aceptor de electrones Fuente de Nitrgeno Estos hongos antagonistas actan mediante FUENTE Fuente de C Fuente de N Fuente de Energa Agar-Agar Agua

Quimiohetertrofa Peptona Dextrosa Dextrosa Oxgeno Peptona la ruptura de paredes hifales del hongo CANTIDAD 500 ml 10 g 17.0 1000 ml

COMPUESTO Extracto de cscaras de tomate (Peptonas) Dextrosa Agente solidificante Agua destilada

pH 7.2 fitoparsito, penetrando sus hifas y aprovechando sus nutrientes. Produce toxinas como tricodermin y harzianopeiridona causando antagonismo por fungistasis y tambin produciendo enzimas lticas que destruyen las paredes celulares de los esclerocios o estructuras de resistencia del hongo. El Trichoderma ha desarrollado mecanismos para atacar y parasitar a otros hongos y as, aprovechar una fuente nutricional adicional. Las formas de accin de trichoderma como biocontrolador son: 1. Micoparasitismo y Antibiosis 2. Competicin por nutrientes y espacio 3. Desactivacin de las enzimas de los patgenos 4. Tolerancia al estrs por parte de la planta, al ayudar al desarrollo del sistema radicular. 5. Solubilizacin y absorcin de nutrientes inorgnicos 6. Resistencia inducida 8 DISEO DEL MEDIO

Tabla 3. Caractersticas del medio diseado AGAR DEXTROSA

Todos los medios de cultivo utilizados han de contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc). El Agar Dextrosa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. Este medio es utilizado para el cultivo de hongos patgenos, la alta concentracin de dextrosa y el pH ligeramente cido facilita el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Con la adicin de antibiticos antibacterianos (cloranfenicol o gentamicina), se logra la inhibicin de bacterias saprofitas, se obtiene un excelente medio para el aislamiento. Se prepara con cscara de tomate como base; en este medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrgeno para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa acta como fuente de energa y el agar es agregado como agente solidificante. PEPTONAS Es un producto soluble en agua que se obtiene por hidrlisis particularmente de una protena o varias protenas. Este material contiene una mezcla de aminocidos libres, pptidos y proteosas que se mantienen en la solucin despus de calentarlas a 100 C. La presencia de metales alcalinos o fosfatos puede causar la precipitacin de la peptona a un pH neutral. Por sta razn las peptonas producidas a un pH neutro se deben de utilizar para las frmulas de los medios. En general las protenas empleadas en la produccin de peptonas son de dos tipos, protenas animales (casena, gelatina, carne) y protenas vegetales (cascaras de tomate). Las peptonas se obtienen a travs de varios tipos de procesos de digestin como cido, alcalino y enzimtico.

DEXTROSA Los seres hetertrofos, como los animales, son incapaces de realizar este proceso y toman la glucosa de otros seres vivos o la sintetizan a partir de otros compuestos orgnicos. Otra posibilidad es la sntesis de glucosa a partir de molculas no glucdicas, proceso conocido como gluconeognesis. Este azcar simple es derivable de la conversin de almidn. METODOLOGIA 1. TOMA REPRESENTATIVA DEL SUELO Las muestras se toman aleatoriamente del perfil del suelo aledao a la base de las plantas de tomate, de 0 a 40 cm de profundidad. 2. CONTROL BIOLGICO (CULTIVOS DUALES) En un extremo de la placa de petri con Agar Dextrosa de pH 5,5, se coloca un disco de agar de 4 mm de dimetro con micelio del patgeno y en el extremo opuesto otro disco de 4 mm con micelio del antagonista a 5 cm aproximadamente entre ellos; el cultivo se incuba a 251 C durante 5 das, hacindose mediciones cada 24 h del crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos.

El antagonismo se comprueba por la competencia de nutrientes y espacio, se valora comparando las variables en la velocidad del crecimiento, por medio de: Radio de Crecimiento Antagonista (RCA) y Radio de Crecimiento Patgeno (RCP): midiendo los radios con un calibrador o pie de rey. Porcentaje de Inhibicin del Crecimiento Radial (PICR): se medir empleando la frmula PICR = (R1 R2)/R1 x 100 donde R1 es el radio del patgeno testigo y R2 es el radio del patgeno en enfrentamiento. Micoparasitismo (MICMO): se realizan observaciones macroscpicas de los cultivos duales, tomndose como ndice de micoparasitismo, la invasin del antagonista sobre la superficie del micelio patgeno, tenindose en cuenta la escala siguiente: Esporulacin de antagonista sobre patgeno1 Grado 0 1 2 3 4 Capacidad antagnica Ninguna invasin de la superficie de la colonia del hongo patgeno Invasin de de la superficie de la colonia del hongo patgeno Invasin de de la superficie de la colonia hongo patgeno Invasin total de la superficie de la colonia del hongo patgeno. Invasin total de la superficie de la colonia del hongo patgeno esporulacin sobre ella.

Se comprueba micoparasitismo, por medio un microscopio binocular, con aumento de 100x, donde se analizan las interacciones de las hifas antagonistas con las del patgeno, ya sea por enrollamiento o por penetracin. 3. MTODO ECOMTRICO Este mtodo utiliza un procedimiento normalizado de siembra en estras para obtener una dilucin progresiva de una suspensin de prueba de un microorganismo en una placa del medio que se est colocando a prueba. Se evala la recuperabilidad, selectividad y reproducibilidad del medio. Tambin se puede utiliza para determinar la accin inhibitoria del medio selectivo contra el organismo determinando la proporcin del ICA en el medio selectivo y el ICA en un medio no selectiva ptimo de crecimiento (a esto lo denomin Mossel como el ndice de crecimiento relativo, o ICR). Es importante en el caso de los medios selectivos demostrar un ICA alto para un organismo deseado frente a un ICA bajo de los organismos no deseados. Procedimiento. 1. Se dividen las placas en cuatro cuadrantes marcados sobre la base de la caja de petri. 2. Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deber ser de unos 4 mm. 3. A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en crecimiento toda la noche o 18 horas de incubacin), tome con una asa calibrada de 1 microlitro y trace sobre la superficie del medio 5 estras paralelas a las lneas
1

Elas y Arcos (1984) citada en Ezziyyani et al. (2004)

4. 5. 6.

7.

dibujadas en cada cuadrante y una estra central, de forma progresiva y sin recargar, retorcer, repisar o esterilizar el asa. Hacer lo mismo con el medio de referencia. Incubar las placas en posicin invertida por el tiempo necesario y a la temperatura apropiada. Transcurrido el tiempo, efectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que cada estra tiene un valor de 0.2 y la estra central de 1.0. Multiplicar por el nmero de estras en las cuales se observa crecimiento, y determinar el ndice de crecimiento absoluto (ICA). Si hay crecimiento en las cinco estras de los cuatro cuadrantes y la estra central (1), el ICA es igual a 5. El ICA es igual al nmero del cuadrante cuando todas las estras de este y de los cuadrantes anteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se observe crecimiento en ninguna estra del cuadrante siguiente. Efectuar la misma operacin con el medio de referencia. Una vez obtenida las lecturas en cada medio (ICA), sacar el ndice de Crecimiento Relativo ( ICR), comparando el ICA del medio en evaluacin y el medio de referencia.
ICR ICA medio evaluado ICA medio referencia

4. ESTRIADO El objetivo es esta tcnica es extender lo ms posible el inoculo con el fin de obtener colonias aislada. 1 Paso: tomar y descargar el Inoculo 0.1 ml en el primer plano de nuestro estriado, a continuacin con una pipeta. 2 Paso: Sin levantar luego estriar el segundo plano perpendicular a nuestro primer estriado, y repetir lo mismo con el ltimo estriado logrando completar todo el espacio de la placa. 3 Paso: Incubar: 7 das a 27 C.

5. Metodologa para el aislamiento de bacterias patgenas que atacan al tomate rin Se debe tomar las partes afectadas del tallo, hojas y fruto; almacenar en las fundas plsticas. Tomar las muestras y cortar alrededor de treinta pedazos, poner en vasos de precipitacin y dejar reposar por treinta minutos con una solucin de agua-cloro (2:1). Lavar con agua destilada tres veces. Sembrar los pedazos en cajas petri con medio PDA. Incubar por 5 das a 37 C. Observar el crecimiento en las cajas petri de todas las cajas y seleccionar los hongos de importancia, observar su morfologa en el microscopio. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Improvement of Trichoderma strains for biocontrol (Mejora de cepas de trichoderma para su empleo como biofungicidas), M Rey, J Delgado-Jarana, AM Rincn, MC Limn & T Bentez http://www.reviberoammicol.com/search/index.php

2. Study of the effect of volatile metabolites of Trichoderma hamatum on the growth of

phytopathogenic soilborne fungi (Efecto de los metabolitos voltiles de Trichoderma sobre el crecimiento de hongos fitopatgenos procedentes del suelo), GM Dal Bello GM, CI Mnaco & AR Chves http://www.reviberoammicol.com/search/index.ph

3. Trichoderma Controls Fusarium Wilt Disease in Tomato Plants in Soilless Culture

Through Competition (Trichoderma control de Fusarium en enfermedades de la planta del tomate), Guillem Segarra, Eva Casanova, Manuel Avils and Isabel Trillas, http://www.springerlink.com/content/d5581727x37h2202/? p=727eb9c105a341afa7fa8adb210b30c8&pi=5

4. http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/ad/ad_457.pdf
5. http://www.agro.unalmed.edu.co/publicaciones/revista/docs/Art.AntagonismoInVitro deTrichoderma.pdf 6. ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/a1374s/a1374s02.pdf 7. http://www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio%20MAG %20IICA/productos/tomate_mag.pdf 8. STANIER, R., y otros, Microbiologa, Editorial Reverte, cuarta edicin, Espaa, 1985.