FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA

LABORATORIO CLNICO Y ANATOMIA PATOLGICA

INMUNOLOGA II- Producto N1

ASIGNATURA SECCIN

: :

INMUNOLOGA II LC7N1 SEMESTRE: 2013-I

Grupo ALUMNO

:
:

B
BJAR VILELA ROSARIO

Cdigo Matrcula: 2010100161

DOCENTE : CARLOS BALTODANO.

LIMA- PER

2012

PRUEBA DE R.P.R (REAGINA PLAMTICA RPIDA) PARA DIAGNSTICO DE SFILIS SIGNIFICACION CLINICA La sfilis es una enfermedad venrea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en reas de abrasiones. El contacto sexual es la forma ms comn de transmisin. La deteccin y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sfilis cardiovascular, neurosfilis y sfilis congnita. El diagnstico de esta enfermedad sufre la carencia de un mtodo para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidrmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infeccin aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antgenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clnicos son por lo tanto los procedimientos ms rpidos y tiles disponibles para diagnstico de sfilis. FUNDAMENTOS DEL METODO En la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), las "reaginas" presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por accin de las mismas con antgeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partculas de carbn. La reaccin produce una aglutinacin visible macroscpicamente, favorecida por las partculas de carbn. Las reacciones inespecficas se evitan con el empleo de antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: Presencia de grumos negros sobre el fondo claro que indica presencia de "reaginas"en la muestra. No reactivo: Aspecto gris homogneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra.

PRACTICA DEL RPR Para el diagnstico de la sfilis se pueden usar exmenes directos en el cual se busca el antgeno causal o etiolgico (microscopa de campo oscuro inoculacin en animales en los testculos, PCR) y los exmenes indirectos que detectan anticuerpos reagnicos o no treponmicos (RPR, VDRL, TRUST, USR, ELISA) y treponmicos o especficos que detectan anticuerpos antitreponmicos (FTA-ABS, ELISA, MHA). En la prctica realizamos la prueba del RPR el antgeno de esta prueba no treponmica est compuesta de cardiolipina, colesterol y lecitina. La reagina plasmtica rpida es una prueba de deteccin para sfilis que busca anticuerpos presentes en la sangre en personas que tengan sntomas de infecciones de transmisin sexual, sirve tambin como control y de manera rutinaria para mujeres embarazadas en bsqueda de la enfermedad.

La imagen muestra en el pocillo 1 el control negativo, en el pocillo 2 el control positivo y en los otros pocillos muestras.

El reporte de los resultados es de REACTIVO (50%grumos), NO REACTIVO (Ausencia de grumos) y DBIL REACTIVO (Menos del 50% de grumos) en este caso es mejor hacerlo semicuantitativo ya que el menos de 50% es muy subjetivo y puede variar de operador en operador.

Para realizar diluciones se proceden hacer ttulos de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, etc. hasta donde se evidencie la aglutinacin favorecida por el carbn y se reporta como REACTIVO seguido de la inversa del ttulo donde se observ la ltima aglutinacin por ejemplo si el ltimo ttulo observable macroscpicamente fue en 1/8 se reporta como REACTIVO 8 DILS.
100uL 100uL 100uL 100uL 100uL

Mx Problem:100uL

Suero Fisiogico: Dilucin:

100uL 1/2

100uL 1/4

100uL 1/8

100uL 1/16

100uL 1/32

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS En las pruebas no treponmicas como el RPR un resultado REACTIVO no quiere decir que tenga la enfermedad ya que no busca directamente al antgeno y podra tratarse ms bien de una reaccin cruzada.

En gestante es usual realizar pruebas treponmicas para hallar el agente causal porque con una prueba no treponmica podra ocurrir una reaccin cruzada.

Algunos casos para la interpretacin: Gestante con primer resultado de RPR 2DILS y en el segundo mes con 2DILS se podra deducir que la paciente no tiene enfermedad porque lo ms lgico es que si tiene la enfermedad en el segundo resultado debera salir ms alto ya que para hacer la enfermedad debera aumentar hasta cuatro veces ms el ttulo. Paciente que clnicamente tiene la herida en genital y tiene como resultado NO REACTIVO a pesar de ello el mdico da tratamiento y en 3 meses le pide un control teniendo como resultado REACTIVO 4 DILS esto quiere decir que el agente etiolgico ha sido destruido por el tratamiento pero esto no quiere decir que el sistema inmune se haya detenido en la produccin de anticuerpos. La sintomatologa est ausente y el resultado obtenido es memoria porque la respuesta inmune no se detiene es por ello que da un resultado REACTIVO sin que el paciente tenga la enfermedad. Una vez que el paciente tiene en su vida un resultado REACTIVO se convierte como una cicatriz inmunolgica pero los ttulos ya no sern altos y podran variar con ttulos como 1DILS, 2 DIL y NO REACTIVO.

Sfilis primaria

Sfilis secundaria

Sfilis terciaria

PRUEBA DE LTEX DETERMINACIN DE PROTENA C- REACTIVA SIGNIFICANCIA CLNICA La Protena C Reactiva (PCR) es una protena termolbil que no atraviesa la barrera placentaria y cuya movilidad electrofortica se encuentra entre las zonas de la y el globulinas. Su nombre se debe a la capacidad para precipitar los polisacridos C de los pneumococos. Es una de las llamadas protenas de fase aguda y se incrementa en suero en una gran variedad de enfermedades inflamatorias o como respuesta a necrosis tisular. Su determinacin es importante debido a que aumenta rpidamente al comienzo de la enfermedad 14 a 26 horas luego de la inflamacin o injuria tisular y desaparece en la etapa de recuperacin apareciendo slo durante la fase activa del proceso inflamatorio. La PCR se encuentra comnmente aumentada en: artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre reumtica activa, infarto agudo de miocardio, etc. Tambin se la puede hallar luego de una operacin quirrgica y en gran porcentaje luego de transfusiones sanguneas. La determinacin de PCR no slo indica la intensidad de la enfermedad sino tambin la respuesta del paciente a un tratamiento dado.

En conclusin el PCR es una protena de fase aguda que se eleva cuando hay proceso inflamatorio agudo, infeccin bacteriana, enfermedades autoinmunes, neoplasia, infarto de miocardio, traumas quirrgicos. FUNDAMENTOS DEL METODO El PCR se detecta en suero por reaccin con un anticuerpo especfico adsorbido (Anti PCR) sobre un soporte inerte de ltex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinacin de las partculas de ltex.

Tambin existe PCR por el mtodo de turbidimetra, entre el ltex y turbidimetra es mejor la turbidimetra ya que la prueba de ltex del PCR es subjetiva porque la interpretacin se hace bajo el ojo humano a diferencia de la turbidimetra los resultados son dados por medidas de lecturas de un haz de luz.

Resultado:

Positivo

Negativo

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: Suspensin homognea. Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos. Cuando se observa un resultado positivo se procede a realizar la prueba semicuantitativa haciendo titulaciones. Primer paso: hacer la dilucin seriada

Suero: 100uL MP: 100uL Segundo paso: hacer la reaccin con el reactivo de latex 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

Si

Si

Si

Si

No

No

No

No

El resultado es la inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. La concentracin aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada por la frmula siguiente: PCR (mg/L) = Ttulo x Sensibilidad de la reaccin (6 mg/L) Ejemplo: la muestra presenta un ttulo de 1:16. Su concentracin de PCR es de 16 x 6 = 96 mg/L. Tener en cuenta que se debe procesar simultneamente el Control Negativo y el Control Positivo provistos. VALORES DE REFERENCIA Hasta 6 mg/L Algunos casos para la interpretacin de los resultados: Nio llega a emergencia se le toma una muestra y su resultado de PCR es 12mg/L como esta prueba es inespecfica se presume que podra tener algn cuadro infeccioso o inflamatorio ya que es la primera que se eleva. A las 12

horas se le vuelve hacer PCR teniendo como resultado 48mg/L cuando se observa un resultado as se deduce que el mdico no ha encontrado an el problema ya que el resultado de esta prueba no disminuye. Esta prueba el mdico la usa tambin para monitorizar el tratamiento en los prximos controles con una buena teraputica los resultados del PCR deben bajar. Cuando a una persona con infarto al miocardio se le toma la muestra el PCR se eleva mucho antes que las transaminasas y troponina (18-24h), siendo an entre estas dos ltimas la mioglobina la primera enzima cardiaca en elevarse. Tambin sirve el PCR para monitorizar al paciente con infarto al miocardio.

DETERMINACIN DEL FACTOR REUMATOIDEO (FR) La artritis reumatoidea es un sndrome crnico de etiologa desconocida, caracterizado por una inflamacin inespecfica y generalmente simtrica de las articulaciones, que a veces evoluciona hacia la destruccin de las estructuras articulares y periarticulares. En la articulacin enferma se observa un engrosamiento de la membrana sinovial con formacin de pliegues y proliferacin de linfocitos. Estas clulas, que forman folculos linfoides, son las responsables de la sntesis de factores reumatoideos (FR) y otras inmunoglobulinas. Los FR son generalmente de tipo IgM anti-IgG, es decir que reaccionan con las fracciones Fc de las IgG. Tambin se han encontrado FR de tipo IgG, aunque en mucho menor proporcin de casos. Los FR de tipo IgM estn presentes en el 85-90% de los adultos con artritis reumatoidea aunque no es especfico de la enfermedad puesto que tambin se han encontrado en individuos sanos (en un 3 a 5% de los casos). Por tal motivo, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad distinta de la artritis reumatoidea, frente a una reaccin de aglutinacin positiva es aconsejable

realizar la precipitacin de las globulinas con sulfato de amonio. De tal forma, se asegura la precipitacin completa de los FR y se mantiene en solucin cualquier aglutinina responsable de una falsa reaccin positiva, como as tambin algn posible inhibidor. Cabe resaltar que el FR es una Ac contra la fraccin FC de las Inmunoglobulinas que se depositan en las articulaciones. Si hay reaccin antgeno- anticuerpo el complemento inactivo disminuye y esto se aprecia en la enfermedad autoinmune. La pruebas de ltex pueden buscar antgeno o anticuerpo. La reaccin que ocurra debe ser complementaria. FUNDAMENTOS DEL METODO El factor reumatoideo de tipo IgM se detecta en presencia de gammainmunoglobulina o fraccin II de Cohn (que en este caso es el antgeno) adsorbida sobre un soporte inerte de ltex-poliestireno. Este antgeno se une a los FR (antiIgG) produciendo una aglutinacin de las partculas de ltex poliestireno, visible macroscpicamente. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Tcnica cualitativa Negativo: Suspensin homognea. Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos. Proceder a la tcnica semicuantitativa. Tcnica semicuantitativa (titulacin)

Suero

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

Si

Si

Si

No

No

No

No

No

Ttulo: Inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. La concentracin aproximada del factor reumatoideo en la muestra puede ser calculada por la frmula siguiente: FR (UI/ml) = Ttulo x Sensibilidad de la reaccin (1 UI/ml) Ejemplo: La muestra presenta un ttulo de 1:40. Su concentracin en FR es de 40 x 1 = 40 UI/ml. VALORES DE REFERENCIA No estn claramente establecidos. Se consideran patolgicos valores superiores a 20 UI/ml. Algunos ejemplos para la interpretacin de resultados: Resultados de FR de 250UI/mL, 30UI/mL indican que la enfermedad est tratndose por lo tanto hay disminucin del dolor, inflamacin. Esta prueba no es de diagnstico, ante sospecha de la enfermedad despus de obtener un resultado elevado el mdico indicar despus la prueba del ANA. El FR sirve tambin para monitorizar el tratamiento.

DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINA (ASO) El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin embargo un ttulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infeccin reciente producida por un estreptococo beta hemoltico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela. FUNDAMENTOS DEL METODO Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reaccin con la estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de ltex. Los anticuerpos

antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinacin visible macroscpicamente. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: Suspensin homognea. Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos.

Positivo

Negativo

Cuando un resultado sale positivo se procede hacer diluciones con la finalidad de obtener un resultado numrico y conocer la cantidad de anticuerpos antiestreptolisina O en el suero. 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

Si

No

No

No

No

No

No

No

Ttulo: inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. En el ejemplo anterior grfico el nivel aproximado de antiestreptolisina O en la

muestra ser calcula por la frmula siguiente: ASO (UI/ml) = Ttulo x Sensibilidad de la reaccin (200 UI/ml) Ejemplo: la muestra presenta un ttulo de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400 UI/ml.

VALORES DE REFERENCIA Hasta 200 UI/ml Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Las pruebas de ASO son significativas cuando son mayor de 200 UI/mL ya que quiere decir que existen anticuerpos contra la estreptolisina.

El estreptococo puede causar:

La fiebre reumtica ocasiona daos en las arterias del corazn.

DETERMINACIN DEL HCG- BETA La hormona gonadotropina corinica humana es una hormona glucoproteca secretada por el desarrollo de la placenta poco despus de la fecundacin. En el momento de la primera falta menstrual, las concentraciones de HCG en suero y orina son alrededor de 100 mUI/mL y dobla en concentracin de 1 a 2 das. Los niveles mximos de ms de 1000 mIU/mL de HCG son vistos al final de la primera trimestre de gestacin. La aparicin temprana de HCG en orina despus de la concepcin se ha convertido en el marcador de eleccin para la deteccin temprana.

FUNDAMENTO El test directo de embarazo est basado en la reaccin de aglutinacin por ltex entre partculas de ltex recubiertas con anticuerpos Anti HCG y el HCG presentes en la muestra. La presencia de HCG en la muestra de orina resulta sin aglutinacin que es visualmente diferenciada por la aglutinacin. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Negativo: Se observa aglutinacin. Positivo: No se observa aglutinacin. La prueba negativa se procede a la parte semicuantitativa por medio de diluciones para obtener un valor numrico. VALORES NORMALES 0- 5 mIU/mL Esta prueba solo se eleva en caso de embarazos, mola y policarcinoma. Es importante la cuantificacin en una prueba positiva porque indica las semanas de gestacin. Ejemplo para la interpretacin de resultados: Un resultado de 3250mIU/mL con un atraso menstrual indica un embarazo, este resultado ayuda al mdico indicar las semanas de embarazo (ejemplo 46 semanas). Si esta misma mujer a la 10 ma semana siente malestar y se vuelve a tomar una muestra para HCG- y obtiene como resultado 4000 mIU/mL es muy probable que tenga problemas con su embarazo.

Deteccin con la prueba HCG beta

PRUEBA DE ANTGENOS FEBRILES PARA DIAGNSTICO DE FIEBRE TIFOIDEA SIGNIFICACIN CLNICA Las Salmonellas se consideran patgenos entricos obligados. Los alimentos y el agua contaminados son el mecanismo de transmisin. La enfermedad puede presentarse como gastroenteritis, septicemia con lesiones en diversos rganos o fiebre tifoidea.

A pesar que el mtodo definitivo para establecer la etiologa de estas enfermedades es a travs del aislamiento del agente patgeno esto resulta difcil debido a que la investigacin se realiza frecuentemente en periodos tardos de la enfermedad y luego de una terapia antibitica. Por este motivo es de gran importancia diagnstica la deteccin de los anticuerpos especficos producidos en el curso de cada una de estas patologas. Una prueba aislada es de escaso valor siendo necesarias 2 o ms pruebas seriadas a fin de poner en evidencia cambios en el ttulo de anticuerpos. FUNDAMENTO DEL MTODO El suero del paciente se pone en contacto con antgenos especficos. En este caso se utilizan suspensiones de Salmonellas muertas. Si la muestra contiene los anticuerpos correspondientes se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. PROCEDIMIENTO 1. Atemperar los reactivos. 2. Agregar 40uL de muestra problema y sobre ello 1 gota del reactivo (Ag O, AgH, Ag A, AgB respectivamente ). 3. Mezclar y leer en aglutinoscopio.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Negativo: No se evidencia aglutinacin. Positivo: Se evidencia aglutinacin. NEGATIVO POSITIVO

Si hay aglutinacin se procede a diluir y se considerar la ltima dilucin que da aglutinacin. Se consideran las diluciones de la siguiente manera: Suero: 80uL 40uL 20uL 10uL 5uL Dilucin 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320

Las aglutinaciones tambin son llamadas como el test de Vidal. En los reactivos provistos en los kit estn los antgenos O, H de la S almonella tiphy, el antgeno Vi no se busca porque los anticuerpo formados para este antgeno se elevan mucho y desaparece rpido; en el kit tambin se encuentran los antgenos A, B de la Salmonella paratiphyca. Por tanto, en el suero buscamos los anticuerpos cuyos resultados de las diluciones sern proporcionales a la cantidad de anticuerpos formados por el individuo. Ejemplo de algunos casos: Paciente que consume alimento contaminado que a los 14 das hace la enfermedad va a consulta mdica y sus resultados de laboratorio(Aglutinaciones) salen negativas. A los 3 meses previo tratamiento y sin sintomatologa se vuelve a realizar la prueba teniendo como resultados O:1/80, H: 1/80 quiere decir que ya san y que estuvo expuesto al agente causal. A los 2 anos se vuelve a realizar la prueba y obtiene como resultado 0:1/40, H:Negativo quiere decir que el ttulo 1/40 es solo memoria. A los 4 anos se toma una nueva muestra y sus resultados salen O: 1/60, H: 1/32 quiere decir que se ha reinfectado.

La primera aglutinina en aparecer y desaparecer es la O y la aglutinina H tarda un poco ms en aparecer y es quien da picos ms altos. Los ttulos bajos como 1/20 no son significativos porque la poblacin est muy expuesta en nuestro pas. Cuando un paciente es crnico no hay ttulos altos oscilan entre 1/40 y 1/80. El gols standart para esta enfermedad es el cultivo.

PRUEBA DE SET DE BRUCELLAS PARA EL DIAGNSTICO DE FIEBRE MALTA SIGNIFICANCIA CLNICA Se conoce con el trmino brucelosis al conjunto de enfermedades ocasionadas, tanto en el hombre como en los animales (zoonosis) por microorganismos del gnero Brucella. Incluye, por consiguiente, tanto las diferentes formas clnicas de la infeccin humana como los diversos cuadros que se presentan en el ganado, sobre todo en forma de abortos epizoticos. La expresin "brucelosis humana", es ms correcta que las denominaciones "fiebre ondulante" o "fiebre de Malta". El gnero Brucella est formado por bacilos gramnegativos pequeos, inmviles y aerobios, de crecimiento lento. Genticamente, el gnero Brucella parece monoespecfico. Sin embargo, se reconocen tres especies clsicas responsables de la brucelosis humana, con especificidad de especie animal, distribucin geogrfica y peculiaridades patgenas. Brucella melitensis afecta fundamentalmente a cabras y ovejas, pero puede afectar a bvidos y cerdos. Brucella abortus es el microorganismo implicado con mayor frecuencia en la brucelosis bovina. Brucella suis afecta primariamente al ganado porcino. Las tres especies menores ( Brucella neotomae, Brucella ovis y Brucella canis ), no revisten importancia en patologa humana. La Brucelosis se presenta en la mayora de los casos con anorexia, fiebre, decaimiento y escalofros, pudiendo aparecer luego complicaciones importantes como son las seas y neuropsquicas. A pesar de que el mtodo definitivo para establecer la etiologa de estas enfermedades es a travs del aislamiento del agente patgeno, esto resulta difcil debido a que la investigacin se realiza frecuentemente en perodos tardos de la enfermedad y luego de una terapia antibitica. Por este motivo es de gran importancia diagnstica la deteccin de los anticuerpos especficos producidos en el curso de cada una de estas patologas. Una prueba aislada es de escaso valor siendo necesarias 2 o ms pruebas seriadas a fin de poner en evidencia cambios en el ttulo de anticuerpos.

FUNDAMENTO DEL MTODO El suero del paciente se pone en contacto con antgenos especficos. En este caso se utilizan suspensiones de Brucellas muertas. Si la muestra contiene los anticuerpos correspondientes se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. AGLUTINACIN EN PLACA (HUDDLESON) ANTGENO DE 10-12% Detecta tanto Ig G como Ig M. Atemperar los reactivos antes de usar. Colocar la muestra de suero en la placa por 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 ml. Agitar y homogenizar el antgeno y colocar una gota sobre cada una de las porciones de la muestra Mezclar con un palillo la muestra con el antgeno. Rotar la placa con suaves movimientos rotatorios. Colocar la placa en el aglutinoscopio y controlar por 4 min. Despus de 4 min, rotar nuevamente por 4 veces y hacer la lectura.

Reaccin positiva de Brucella

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Reaccin Completa: La mayora de las clulas han sido aglutinadas y el lquido que las rodea es transparente. Reaccin Incompleta: Incluye todos los grados intermedios de reaccin. Reaccin Negativa: Mezcla homognea de antgeno-suero sin aglutinacin. Realizar la lectura a los 4 min ya que es cuando se alcanza la aglutinacin mxima. Si la aglutinacin es mayor y se quiere conocer el ttulo final del suero por el mtodo de placa, se prepara una dilucin 1:16 y se sigue el mismo procedimiento. Ml 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005 No diluida 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 Diluida 1/16 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400

Las mezclas suero-antgeno no son verdaderas diluciones, el antgeno de placa tiene una concentracin celular de manera que cuando se mezclen 0.03 ml de este con la cantidad prueba en tubo. PRUEBA DE ROSA DE BENGALA (ANTGENO AL 8%) Esta prueba se basa en la inactivacin de las IgM a un PH bajo. Es sensible y detecta IgG1 y su positividad persiste por mucho tiempo. Es til para Brucelosis aguda. Se considera positiva al evidenciar aglutinacin y los positivos deben ser sometidos a la prueba de Tubo y 2-Mercaptoetanol(2 ME). Colocar 0.03 ml de suero y agregar reactivo Rosa de Bengala 0.03 ml. Mezclar bien el suero y el antgeno usando un palillo. Hacer girar la placa por 4 min. de suero, los resultados son comparables con las diluciones de la

Leer la placa evidenciando la aglutinacin o no.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS La prueba es cualitativa: Positivo o Negativo.

PRUEBA DE TUBO Y DEL 2-MERCAPTOETANOL (ANTGENO INCOLORO 4.5%) La prueba sirve para corroborar los resultados de la prueba de aglutinacin en placa. Esta prueba esta sujeta a menos errores de manipulacin y presenta menos reacciones inespecficas que la de placa. Detecta tanto IgG como IgM. El 2-Mercaptoetanol se basa en la propiedad de los compuestos qumicos con grupos IgG. Preparar antgeno para la prueba en tubo: 1 ml de antgeno mas 99 ml de SS 0.85% Fenolada al 0.5%. Preparar antgeno para el 2ME: 2 ml de antgeno mas 98 ml de SS al 0.85% Solucin de 2ME 0.1 Molar: 0.78 ml de 2ME Q.P. mas 99.22 ml de SS 0.85%. Conservar en la refrigeradora en frasco oscuro y descartada luego de una semana. Por cada muestra de suero se coloca una hilera de 5 tubos de 13 x 100 en cada una de 2 gradillas. Una de las gradillas se destina a la prueba en tubo y se marca con una T. La otra sirve para el 2ME. Sulfidrilos de inactivar las IG M. Es una prueba selectiva que solo detecta

Agregar a los 5 tubos 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 ml. respectivamente de la hilera.

Para la aglutinacin en tubo. Repetir para el 2 ME. Agregar 2 ml de antgeno fenolado a cada tubo de la gradilla para la prueba en tubo. Agitar. Agregar 1 ml de solucin 2ME a cada tubo de la gradilla para 2ME. Agitar y dejar a T.A por 30 minutos. Aadir 1 ml de antgeno para 2 ME a estos tubos, agitar. Incubar ambas gradillas por 48 horas a 37C. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Las muestras deben ser observadas sobre un fondo negro opaco, con luz indirecta. En la reaccin positiva la mezcla suero-antgeno es clara y se presentan grumos que no se rompen con una agitacin suave. En la reaccin incompleta la mezcla suero-antgeno es parcialmente clara y la agitacin suave no rompe los grumos, si la aglutinacin es mayor del 50% se reporta como positivo. Si se quiere conocer el titulo final del suero por el mtodo del tubo se preparar una dilucin 1:16 y se sigue el mismo procedimiento. Ml 0.08 0.04 No diluida 1/25 1/50 Diluida 1/16 1/400 1/800

0.02 0.01 0.005 Fenmeno de zona

1/100 1/200 1/400

1/1600 1/3200 1/6400

Es la ausencia de aglutinacin o presencia de aglutinacin parcial en las diluciones bajas y aglutinacin completa en las diluciones altas y est usualmente asociado con sueros que contiene un alto titulo de aglutininas. Con este tipo de reaccin se debe reportar la dilucin positiva ms alta como titulo final e indicar las diluciones en las cuales ocurre el fenmeno de zona. ANTICUERPOS INCOMPLETOS Todos los tubos que no presentan aglutinacin o esta sea incompleta en la prueba de 2ME, sern numeradas y centrifugadas a 2000 RPM por 15 min. Incubar los tubos a 37C por 30 min. Leer igual que en la prueba de tubo, se informa la presencia de anticuerpos incompletos cuando existe diferencia de dos diluciones o ms en la prueba de 2ME. El titulo del suero esta dada por la dilucin ms alta que presente aglutinacin total. Es comn encontrar ttulos de aglutinacin en tubo centrifugado comparables con el ttulo de la prueba en placa, lo que explica que solo se informe el resultado en la prueba de 2ME centrifugado. Los sueros hemolizados no son adecuados en la aglutinacin en tubo por interferencia del fenol con la hemoglobina libre, que puede ocasionar pseudo aglutinacin.

ANTICUERPOS BLOQUEADORES Colocar 0.04 ml de suero (1/25) en un tubo Agregar 1 ml de Antgeno para prueba en tubo Agitar e incubar a 37C por 3 horas. Usar un suero positivo cuyo titulo este entre 1/100 y 1/400 en la prueba en tubo. Titulo del suero 1/100 1/200 1/400 Cantidad a usar en ml 0.02 0.01 0.005

Agregar la cantidad necesaria de suero positivo de acuerdo al titulo. Agitar e incubar a 37C por 24 horas. Leer como en la prueba en tubo.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Si el paciente presenta anticuerpos estos bloquean los determinantes antignicos del antgeno, por lo que al aadir el suero positivo este no puede reaccionar. Si existe aglutinacin el suero es negativo a anticuerpos bloqueadores. Si no existe aglutinacin el suero es positivo a anticuerpos bloqueadores y debe titularse. Se usan las siguientes cantidades de suero 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 ml y se sigue el mismo procedimiento. Se observar un fenmeno de zona seguido de tubos que presentan aglutinacin. La dilucin del suero del paciente en el tubo que precede a aquel con aglutinacin completa ser el titulo de anticuerpos bloqueadores. Se considera un titulo de 1/100 como positivo