AO DE LA INVERSIN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERA INDUSTRIAL Escuela Profesional de Ingeniera Agroindustrial e Industrias Alimentarias

LABORATORIO N5 INMOVILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS

CURSO : BIOTECNOLOGIA

DOCENTE

: JORGE BERMEJO BENITES

ALUMNA

: CHECA VILELA GIANMARCO GUZMN GARCIA DIANA CAROLINA LOPEZ VERA GIANCARLOS MAZA PEA PAUL DAVID REMIGIO LIZANA ANGELA

CICLO

: 2013 I

PIURA - PER

INTRODUCCION El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un rea de la Biotecnologa en continua expansin. Un aspecto clave del proceso es el uso del catalizador (Clula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo dando como resultado una disminucin de los costos del proceso y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad etc. Tambin se puede pensar en la reutilizacin del biocatalizador en procesos Bath. Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan. La definicin de la European Federation of Biotechnology aclara el concepto. "Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas, clulas u organelos (o combinacin de ellos) confinados o localizados en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y continuo.

Las clulas libres en suspensin presentan un rpido decaimiento en su actividad cataltica; sin embargo, las clulas inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y por lo tanto la inmovilizacin es un requisito necesario para poder reutilizar las clulas. El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, vara normalmente entre 20 y 50 das.

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos entre ellas; presentan una gran actividad cataltica; muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica. A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y productos es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable.

OBJETIVO Determinar la accin que ejercen las clulas inmovilizadas sobre un determinado medio.

FUNDAMENTO TEORICO II.1.- INMOVILIZACIN DE ENZIMAS La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: 1. El aumento de la estabilidad de la enzima 2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. 3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son: 1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte. 3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin. 4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

II.2.- METODOS DE INMOVILIZACION

II.2.1.- POR RETENCIN FSICA a) Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del

monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.

b) Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos: 1) Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos.

2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Esta adsorcin se puede realizar de dos formas: mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la membrana; por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

II.2.2.- POR UNIN QUMICA a) Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin

incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1. Soportes inorgnicos. Pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio, gel de slice, etc.) 2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: polisacridos protenas fibrosas Polmeros sintticos: Poliolefinas, Polmeros b) Adsorcin En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante Interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son: o el pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido; o la fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena; o el dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima; o la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado. Como principales ventajas de este mtodo destacan: su preparacin sencilla, su bajo coste, no hay cambios de especificidad enzimtica, los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente: la optimizacin de las variables que controlan la adsorcin, los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico,

la unin al soporte es dbil. Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

c) Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico.

Este mtodo presenta las siguientes ventajas: 1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla; 2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin; 3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado. 4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes: 1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo. 3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.

d) Reticulado Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

II.3.- EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN A menudo, la inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima.

II.3.1.- Efectos en la estabilidad Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones: 1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a soportes activados. La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima.

2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autolisis. 3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio. 4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxgeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa zona que en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, la acuofilia del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformacin activa.

II.3.2.- Efectos en la actividad enzimtica Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que: 1. la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido, 2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima, 3. la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, 4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima.

MATERIALES Y METODOS Mtodo En la siguiente tabla se realiza una comparacin de los diferentes mtodos de inmovilizacin anteriormente estudiados:

METODO

Inclusin en membranas

Atrapamiento

Reticulado

Adsorcin qumica

Unin covalente Difcil Fuerte

Preparacin Fuerza de unin

Intermedia Dbil

Difcil Media

Intermedia Dbilmedia

sencilla Media

Actividad enzimtica Regeneracin soporte Coste proceso Estabilidad Validez Resistencia microbiana

Media-alta Posible Medio alto Media General s

Baja Imposible Medio Alta General si

Baja Imposible Medio Alta Limitada si

Media Posible Bajo Baja General No

Alta Difcil Alto Alta Limitada No

MATERIALES 250 mL de aceite comestible Agar nutritivo Vaso precipitado de 200 mL Hielo - Jeringa de 5 mL - Levadura de laboratorio - Matraz erlenmeyer - Espectrofotmetro

PROCEDIMIENTO

Enfriar el agar nutritivo a 45 C y agregar 1 mL de la solucin del microorganismo. Mezclar Preparar recipiente con agua helada,

colocar en

este el vaso precipitado que

contiene 200 mL de aceite comestible y dejarlo ah hasta que el aceite se torne un poco gelatinoso. Con la jeringa aspirar cierta cantidad agar nutritivo (con la solucin del microorganismo) y dejar caer en pequeas gotas al vaso que contiene el aceite. Se observar la formacin de pequeas esferas. Enjuagar las esferas con agua destilada y pasar al medio. Medir la concentracin de azcar hasta que esta sea constante.

RESULTADOS

Las mediciones realizadas fueron las siguientes: PRIMER CONTEO: 17.4 Brix 0 Horas 5 Horas 29 Horas 53 Horas

SEGUNDO CONTEO: : 16.4 Brix TERCER CONTEO: CUARTO CONTEO: 16.1 Brix 15.4 Brix

Los resultados obtenidos fueron los esperados, pues la concentracin de azcar fue bajando da a da de una forma ms rpida comparndolo claro con experimentos ya realizados anteriormente con clulas libres, hasta alcanzar una medicin constante.

CONCLUSIONES

Se logr conocer el mtodo de inmovilizacin de clulas y la importancia que tienen en la industria en general.

La inmovilizacin de clulas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la produccin industrial de productos alimenticios; en el tratamiento de residuos, etc. Una aplicacin muy importante seria en la produccin de bebidas alcohlicas en las que se requiere un menor tiempo de fermentacin.

Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es necesario aplicar un mtodo de inmovilizacin adecuado, que depender del tipo de actividad cataltica de inters.

Las clulas inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y por lo tanto la inmovilizacin es un requisito necesario para poder reutilizar las clulas.

RECOMENDACIONES

Para contrarrestar las desventajas de la inmovilizacin se recomienda trabajar con partculas o cpsulas de menor dimetro porque reduce las limitaciones difusionales que pueden ser importantes.

Cuando se trabaja con soportes para la inmovilizacin de clulas lo ms recomendable es utilizar los de forma esfrica pues los microorganismos se adhieren en toda la superficie y de esta forma habr un rendimiento ptimo.

Referencias Bibliogrficas

http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm http://www.uib.es/depart/dba/microcore/

ANEXOS