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REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN PROCARIONTES

Vernica Gonzlez Nez Universidad de Salamanca

ESQUEMA. Regulacin de la expresin gnica en procariontes

1. Introduccin. Importancia de la regulacin de la expresin gnica 2. Promotores 3. El operon Lac - Concepto de operon - El operon lac 4. Represin por catabolito - Relacin entre la presencia de glucosa y los niveles de cAMP - La protena CAP como ejemplo de protena de unin al DNA 5. Control positivo y negativo por una misma protena: el operon araBAD 6. Atenuacin: el operon trp 7. Regulacin de la sntesis de rRNA

INTRODUCCION. Importancia de la regulacin de la expresin gnica

No todas las protenas han de expresarse simultneamente - gasto de materia y - interferencia en las funciones entre protenas

Los organismos han de adaptarse muy rpidamente a cambios ambientales Determinados programas genticos necesitan de la expresin ordenada de un conjunto de genes Sntesis de cada protena en el momento en que sea necesaria

La expresin gnica se regula fundamentalmente a nivel transcripcional

Importancia de la regulacin de la expresin gnica (II)

Procariontes Acoplamiento de la transcripcin y la traduccin Los genes suelen ser policistrnicos Cambios ambientales muy drsticos y repentinos la adaptacin ha de ser muy rpida (minutos) El control de la transcripcin suele ejercerse durante la iniciacin

Importancia de la regulacin de la expresin gnica (III)

Eucariontes Compartimentacin celular 1. La transcripcin tiene lugar en el ncleo 2. El mRNA es transportado al citoplasma 3. El mRNA es traducido por los ribosomas La modificacin de la expresin gnica no ha de ser ni tan rpida (en horas das), ni tan drstica Excepcin: durante el desarrollo y la diferenciacin se necesita de la expresin diferencial y ordenada de mltiples genes El control de la expresin gnica puede ejercerse sobre - la iniciacin de la transcripcin - el splicing - el transporte de los mRNAs - la estabilidad de los mRNAs - la traduccin

El control transcripcional
Mecanismo de control de la transcripcin Interacciones especficas entre productos en trans = protenas sobre secuencias en cis =DNA - productos en trans: difunden y ejercen su accin sobre elementos alejados de su lugar de sntesis - secuencias en cis: slo pueden afectar a regiones vecinas del DNA El control de la expresin gnica se suele ejercer sobre el inicio de la transcripcin Tipos de genes - Constitutivos = housekeeping - Inducibles: aumenta su expresin en respuesta a un cambio ambiental - Reprimibles: inhibicin de su expresin en presencia a una seal represora

Tipos de regulacin gnica (I)

Regulacin negativa La union de un represor inhibe la transcripcin FormaI 1.Elrepresor esta unido constitutivamente alpromotor gen reprimido 2.Launiondeuna molcula seal provoca ladisociacin delrepresor delpromotor 3.Latranscripcin tiene lugar

FormaII 1.Elrepresor nopuede unirse perse alpromotor gen activado 2.Launin deuna molcula seal permite que elrepresor seuna alpromotor molecula seal =corepresor +represor =aporepresor 3.Latranscripcin sebloquea

Tipos de regulacin gnica (II)

Regulacin positiva La unin de un activador facilita la transcripcin

FormaI 1.Elactivador esta unido constitutivamente alpromotor gen activado 2.Launin deuna molcula seal causa ladisociacin delactivador delpromotor 3.Latranscripcin sebloquea

FormaII 1.Elactivador nopuede unirse perse alpromotor gen reprimido 2.Launin deuna molcula seal permite que elactivador seuna alpromotor molecula seal =coactivador +activador =apoactivador 3. Latranscripcin tiene lugar

TIPOS DE PROMOTORES (I)

Promotoreficiente fuerte
Secuenciamuyparecidaalasecuenciaconsenso Altatasadetranscripcin encondicionesbasales Laexpresingnicasecontrolaconunrepresor:Regulacinnegativa Represin: disminucindelatasadesntesisdeunaenzimaenpresencia deundeterminadometabolito EnOPERONESREPRIMIBLES

Tipos de promotores (II)

Promotorineficiente dbil
Lasecuenciadifieremuchodelasecuenciacannica Bajatasadetranscripcin encondicionesbasales Laexpresingnicasecontrolaconuninductor oactivador Regulacinpositiva Induccin: aumentodelasntesisdeunenzimaenpresenciadeun sustratodeterminado EnOPERONESINDUCIBLES

EL OPERON (I)
Concepto de operon Unidad de expresin gnica, que permite la transcripcin coordinada de varios genes implicados en una misma ruta metablica

Estructura de un operon: Distribucin lineal de los componentes - centro operador: cerca del promotor y del inicio de la transcripcin lugar de reconocimiento para los efectores - promotor: puede solaparse con el operador - genes estructurales = codifican las enzimas de una ruta metablica mRNA policistrnico

O DNA

Operador Promotor

Genesestructurales

El operon (II)
Gen regulador Codifica un efector que interacciona con el centro operador Controla la transcripcin de los genes estructurales El efector interacciona generalmente con el DNA y con la RNA polimerasa

P DNA

R Genregulador

Operon sobre elque actua elgen regulador O DNA

Operador Promotor Genesestructurales

EL OPERON lac (I)

Codifica las enzimas involucradas en el metabolismo de la lactosa El operon slo se activa cuando hay lactosa en el medio

EstructuradelOperon Lac FueradelOperon Lac:geni

unindelaproteinaCAP p=promotor o=operador 3genesestructurales:z,y&a z=galactosidasa y=galactsido permeasa a=tiogalactsido transacetilasa Regulador:determinalosnivelesde transcripcin deloperon lac Represordifusible queactaentrans

El operon lac (II)

P i

gen i R

CAP P DNA
Promotor

Sitio de unionaCAP

Operador

Genesestructurales

Eloperon lac ysu regulacin por elrepresor codificado por elgen i

Estructura del represor Lac

Tetrmero con un eje de simetra binario Cada subunidad - 360 (37 KDa). cada subunidad - codificado por el gen i - cada subunidad puede unir una molcula de inductor (IPTG) - Dominio N-terminal: unin al DNA - Dominio C-terminal: unin del inductor y oligomerizacin El represor Lac es un regulador negativo Bloquea la transcripcin

Estructura delrepresor Lacdimrico

Fuente de la imagen: RCSB PDB. N. acceso: 1JWL

Mecanismo de regulacin del operon Lac (I)

En ausencia de inductor El gen i se transcribe el represor se sintetiza Represor Lac sin inductor - el represor en forma tetramrica se une al DNA se desliza a travs del DNA hasta que llega al operador lac - unin de alta afinidad represor # operador lac Bloqueo de la transcripcin

Mecanismo: la interaccin represor # operador - estimula la unin de la RNA polimerasa al DNA - pero impide la iniciacin de la transcripcin: la RNA polimerasa no puede formar un complejo abierto (aumento de la barrera ) la RNA polimerasa no puede adquirir alta procesividad durante la elongacin

Mecanismo de regulacin del operon Lac (II) Enpresencia deinductor=lactosaenelmedio

Las pocas molculas de galactosidasa catalizan latransformacindelactosa1,6alolactosa Inductorfisiolgico=1,6alolactosa (portransglicosilacin delalactosa) Inductornometabolizable =IPTG (isopropiltiogalactsido) Elinductorseunealrepresor LauninIPTG#RepresorLac disminuye laafinidaddelrepresorporeloperador ElrepresorseseparadelDNA  transcripcion deloperon lac
Implicacionesbiotecnolgicasdeloperon Lac &tcnicasdeclonacin

1,6alolactosa

IPTG

Mecanismo de regulacin del operon Lac (III)

En ausencia de inductor

gen i R

Operon lac P O z y a
Bloqueo delatranscripcin

En presencia de inductor

gen i R

Transcripcin Traduccin

Estructura del operador Lac (35bp)

Regin palindrmica de 28 bp - eje de simetra binario - localizada en el lugar de unin de la RNA polimerasa - correlacin entre el eje de simetra del represor y del operador adaptacin DNA # protena

Operador lac

TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA ACAACTCACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT

Operador constitutivo (Oc) Al menos 8 mutaciones que provocan una disminucin en la simetra  afinidad del represor por el operador & el represor no se puede unir al DNA El operon se transcribe de manera constitutiva
(* Aplicaciones biotecnolgicas)

REPRESION POR CATABOLITO

Efecto inhibidor de la Glc = Represin catablica La Glc es el metabolito por excelencia En presencia de Glc en el medio: no se utiliza otra fuente de se inhibe la expresin de las enzimas del metabolismo de cualquier otra fuente Operones regulados por represin por catabolito - suelen tener promotores ineficientes dbiles - doble control: 1. cAMP: seal de ausencia de Glc en el medio 2. Inductor propio: seal de presencia de la fuente metabolizada por las enzimas codificadas en el operon Circuito regulador global Coordina la expresin gnica con el estado fisiolgico de la clula - operones regulados por cAMP - genes de choque trmico - genes sos: activados por lesin en el DNA

Control de la expresin gnica por la protena CAP (I)

Relacin inversa entre Glc y [cAMP] CAPinactiva  [Glc]  [cAMP]

 [Glc]  [cAMP]

 [Glc]  [cAMP]

Mecanismo - fosforilacin de una enzima - la enzima-P activa la adenilato ciclasa

cAMP CAPactiva

cAMP  [Glc]  [cAMP] Mecanismo - transporte de Glc a travs de la membrana

UninaCAPcAMP #CAP bindingsite enlosoperones Activacin delatranscripcin

- la Glc estimula desfosforilacin de la enzima:  enzima-P - inactivacin de la adenilato ciclasa

Proteina CAP y [cAMP] (I)

CAP: Catabolite Activator Protein = CRP: cAMP Receptor Protein Homodmero. Estructura de cada monmero - dominio N-terminal: unin de cAMP (1 sitio por monmero) - dominio C-terminal: unin al DNA (HTH) - un eje de simetra binario, que coincide con su centro de unin al DNA

CAP per se no se une a los promotores, sino CAP-cAMP Regin del DNA reconocida por CAP - region palindrmica CAP binding site

La unin CAP-cAMP # DNA produce la activacin gnica CAP es un regulador positivo

Proteina CAP y [cAMP] (II)

Interaccin CAP-cAMP # DNA 2 posibilidades no mutuamente excluyentes 1. CAP # cAMP interacciona directamente con la RNA polimerasa El sitio CAP se solapa con el promotor 2. CAP # cAMP se une al promotor El DNA se dobla 90 sobre su centro de simetra Se forma un complejo cerrado RNA polimerasa # promotor Se facilita la iniciacin de la transcripcin Estructura deundmero deCAPcAMP unido alDNA
Fuente de la imagen: RCSB PDB. N. acceso: 1CGP

Control de la expresin gnica por la protena CAP (II)

Ejemplo. Operon lac

En presencia de Glc y ausencia de inductor - [cAMP] bajos CAP inactiva - El represor lac se une al operador, impidiendo la transcripcin Bloqueo de la transcripcin del operon lac

En ausencia de Glc y presencia de inductor (alolactosa) - [cAMP] altos CAP-cAMP activa se une al CAP binding site del operon lac - El represor lac # alolactosa se separa del operador Activacin de la transcripcin del operon lac

CONTROL POSITIVO Y NEGATIVO POR UNA MISMA PROTENA: EL OPERON araBAD

Operon araBAD Codifica las enzimas necesarias para el metabolismo de la arabinosa xilulosa-5P

4 sitios de control upstream del inicio de la transcripcin (en sentido upstream) - araO2: operador 2, situado a -270bp del inicio del operon araBAD y tambin upstream del gene araC (se transcribe en direccin opuesta al operon araBAD) - araO1: operador 1 del gen araC - CAP - araI: [I inductor] 2 secuencias idnticas de 17bp - araI1 & araI2 repeticiones directas separadas por 4bp araI2 se solapa con la regin -35bp del promotor araBAD

EL OPERON araBAD (II) Genes estructurales del operon araBAD transformacin de la arabinosa xilulosa-5P - ara B = ribulokinasa - ara A = arabinosa isomerasa - ara D = ribulosa-5P epimerasa

Gen araC Codifica la protena de unin de L-arabinosa (292 ) - dominio N-terminal: unin de L-arabinosa; es el dominio de dimerizacin - dominio C-terminal: unin al DNA En ausencia de arabinosa se comporta como represor En presencia de arabinosa, araC # arabinosa acta como activador

Mecanismo de accin propuesto (I)

Operon araBAD: regulado por CAP-cAMP y por AraC La RNA polimerasa transcribe el gen araC

En presencia de AraC y ausencia de L-arabinosa y de CAP-cAMP - AraC se une a araO1, araO2 & araI bucle en el DNA, que une araI & araO2 dimerizacin de la protena araC - Se impide la unin de la RNA polimerasa  Transcripcin de araC y araBAD CONTROL NEGATIVO y Autorregulacin de la transcripcin de araC

Mecanismo de accin propuesto (II)

Cuando AraC, L-arabinosa y cAMP (baja [Glc]) estn presentes - CAP-cAMP se une a un sitio CAP - L-ara se une a araC: AraC-arabinosa se separa de araO2 y aumentando su afinidad por araI2: no se forma el bucle en el DNA  Transcripcin de araBAD araC permenece reprimido (unin de AraC-arabinosa a araO1) CONTROL POSITIVO

Operon araBAD y principios generales de la regulacin gnica

1. Una protena puede regular su propia sntesis al reprimir la expresin del gen que la codifica 2. La unin de un efector a una protena puede alterar su conformacin y/o su funcionalidad: cambio de un inhibidor a un activador gnico 3. Los centros reguladores de un gen no tienen por qu localizarse junto al inicio de la transcripcin de los genes que regulan La formacin de bucles en el DNA es un mecanismo muy extendido para poner en contacto dos regiones de DNA 4. Los cambios inducidos por efectores pueden revertirse de manera rpida y sencilla El sistema se puede adaptar de forma muy eficiente a cambios ambientales

ATENUACIN: EL OPERON trp

Mecanismo utilizado para controlar la expresin de operones que codifican enzimas implicadas en la biosntesis de aminocidos Operones de Trp, Phe, His, Leu, Thr, ilv (Ile, Leu & Val) La secuencia lder es rica en codones que codifican para los sintetizados por las enzimas del operon
gnc4 en levaduras: mecanismo anlogo en eucariontes

Operon trp Codifica 5 polipptidos que forman 3 enzimas implicadas en la biosntesis de Trp a partir de corismato Se expresan de manera coordinada bajo la regulacin del represor trp El operon trp slo se induce en ausencia de Trp en el medio

Estructura del represor Trp

Protena homodimrica - 1 monmero = 107 - codificado por el gen trpR (en un operon distinto)

Estructura de cada monmero de represor trp - dominio N-terminal = regin de dimerizacin - spacer - dominio C-terminal = HTH de interaccin con el DNA Estructura deundmero delrepresor TRP#Trp unido alDNA

Fuente de la imagen: RCSB PDB. N. acceso: 1TRO

Mecanismo de accin del represor Trp (I)

Represor per se: no se puede unir al DNA transcripcin del operon trp

Represor trp-Trp - cambio conformacional: los dos dominios HTH se separan cada una de las HTH encaja en un surco mayor del DNA (surcos consecutivos) - puente de hidrgeno entre el Trp y un grupo fosfato del DNA - H2O: puentes entre el DNA y el represor Interaccin Represor trp-Trp # trpO:  expresin del operon trp (se impide la unin de la RNA polimerasa al promotor)

trpO - region palindrmica del DNA con un eje de simetra binario - se solapa con el promotor

Mecanismo de accin del represor Trp (II)

Consideraciones - El Trp actua como Co-represor - El represor trp tambin controla la expresin de otros dos operones: trpR y aroH (biosintesis del corismato) - El represor trp tambin regula su propio operon trpR = Autorregulacin regulacin autgena

En ausencia de Trp - El represor trp no puede unirse al DNA Activacin de la transcripcin del operon trp En presencia de Trp en el medio - El represor trp # Trp se une a trpO del DNA Bloqueo de la transcripcin del operon trp

Atenuacin
Niveles de Trp bajos: se transcribe todo el mRNA policistrnico, incluido trpL (7Kb) Niveles mayores de Trp: la mayora de los mRNAs son de 140 nucletidos

El aumento de los niveles de Trp provoca una terminacin prematura de la transcripcin

trpL Secuencia gua lder de 162bp que contiene el atenuador centro de terminacin controlada Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser (STOP)

Estructura del atenuador (I)

4 segmentos que pueden formar horquillas mutuamente excluyentes Antiterminador horquillas 2y3 La transcripcin contina de forma normal

Terminador horquillas1y2 & 3y4 Seal de terminacin de la transcripcin: secuencia rica en G+C que forma una horquilla, seguida de Us La transcripcin se termina

Estructura del atenuador (II)

Trp (UGG) Trp (UGG)

Trp (UGG) Trp (UGG) UUUUU Segmento rico enGC

STOP leader

Horquilla 1#2 Horquilla 3#4

STOP leader Horquilla 2#3

Terminador

Antiterminador

Mecanismo de accin del atenuador (I)

Basado en la presencia de dos codones consecutivos de Trp en procariontes, la transcripcin y la traduccin estn acopladas

Cuando el Trp es escaso = escasez de Trp-tRNATrp (aminocido activado) - el ribosoma comienza a traducir el mRNA, pero se para sobre los codones que codifican para el Trp (ausencia de tRNAs cargados) - se impide la formacin de la horquilla 1y2 en el mRNA - al continuar la transcripcin, se forma la horquilla 2y3 Horquilla 2y3 = Antiterminador Se transcribe un mRNA de 7 Kb Sntesis de todas las enzimas implicadas en la biosntesis de Trp

Mecanismo de accin del atenuador (II)

Si el Trp es abundante = abundancia de Trp-tRNATrp

(Si la RNA polimerasa ha logrado esquivar la inhibicin por el represor) - se transcribe y el operon trp, y los ribosomas comienzan a traducir el mRNA - el ribosoma impide que se forme la horquilla 2y3 en el mRNA - se forman las horquillas 1y2 & 3y4 Horquilla 3y4 = terminador de la transcripcin Se transcribe un mRNA de 140 nt No se sintetizan las enzimas implicadas en la biosntesis de Trp

REGULACIN DE LA SNTESIS DE rRNA (I)

Coordinacin de la biosntesis de rRNA con las necesidades de sntesis de protenas

The stringent response respuesta restrictiva La falta de cualquier aminoacil-tRNA, que pueda limitar la biosntesis de protenas, produce un reajuste metablico en la clula La clula se prepara para situaciones de falta de nutrientes - reduccin (1:10 1:20) en la biosntesis de rRNAs y tRNAs - represin de rutas anablicas, excepto la activacin de la biosntesis de

Regulacin de la sntesis de rRNA (II)

ppGpp: guanosina 5-difosfato-3-difosfato Acta como mensajero intracelular, afectando los niveles de expresin de varios operones - Inhibe la transcripcin de rRNAs - Estimula la transcripcin de operones trp y lac

Estructura delppGpp

La respuesta restrictiva y ppGpp

Falta de nutrientes: aumenta la concentracin de ppGpp

Gen relA Factor restrictivo (sintetasa). Cataliza la sntesis de ppGpp ATP + GDP AMP + ppGpp Su actividad es mxima cuando el ribosoma est unido a un mRNA y a un tRNA no cargado con La unin de un aminoacil-tRNA disminuye la sntesis de ppGpp

Gen spoT Metaboliza ppGpp ppGpp GTP + PPi