UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS EAP: MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

Familia Vibrionaceae, Aeromonadaceae, Pseudomonadaceae

Curso: Bacteriologa

Grupo 1 Mesa 2
Profesores: Jorge Len Quispe. Mnica Huamn Iturrizaga. Elena Quillama Polo. Alumnos: Espinoza Guerrero Cindy. Hoyos Camones Mercy.

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Familia Vibrionaceae, Aeromonadaceae, Pseudomonadaceae Contenido

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INTRODUCCIN ................................................................................................................................... 2

OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 3

PRINCIPIOS TERICOS ...................................................................................................................... 4

MATERIALES .......................................................................................................................................... 6

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 7 PROTOCOLO PARA AISLAMIENTO DE Pseudomonas y Aeromonas: ................................ 7

RESULTADOS DEL AISLAMIENTO PRIMARIO: Pseudomonas, Aeromonas y Vibrio .............. 9

RESULTADOS DE LAS PREUBAS DIFERENCIALES .................................................................. 12

ANEXOS ................................................................................................................................................. 19 MIO Medio.............................................................................................................................................. 19 Instrucciones ........................................................................................................................................ 20

BIBLIOGRAFA .................................................................................................................................... 20

Familia Vibrionaceae, Aeromonadaceae, Pseudomonadaceae INTRODUCCIN

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Entre las enfermedades de mayor importancia para la acuicultura estn las de etiologa bacteriana, aunque los problemas causados por ellas pueden ser exacerbados por un manejo inapropiado (altas densidades de cultivo) y por condiciones adversas de calidad de agua (alta carga orgnica). En estos sistemas el balance natural de la flora bacteriana se ve alterado, lo que produce una disminucin de la capacidad de tolerancia a tales cambios por parte de los organismos bajo cultivo (Garriques y Arvalo, 1995). En acuicultura, el agua y los organismos acuticos (incluidas las microalgas y la Artemia) han sido reconocidos como importantes fuentes de bacterias potencialmente patgenas (Austin y Allen, 1982).

Las bacterias Gram negativas, fundamentalmente los vibrios, predominan en los ambientes marinos y usualmente constituyen la mayor parte de la flora intestinal de peces y crustceos (Brisou et al., 1965; Sakata, 1989). Existen estudios sobre la identificacin de bacterias causantes de enfermedades en camarones marinos (Lightner, 1993; Alapide-Tendencia et al., 1997), aunque existen pocos estudios en los cuales se describa la flora bacteriana normal de camarones sanos (Gmez-Gil et al., 1998).

En la actualidad predomina la tendencia de cultivar camarones marinos en mayores densidades, por lo que la atencin se centra cada vez ms en el monitoreo rutinario de estas poblaciones para el seguimiento de sus condiciones sanitarias, ya que algunas especies de bacterias que estn asociadas normalmente a los camarones ocasionan enfermedades, mientras que otras parecen ser de utilidad en su nutricin, sobretodo en la fase larvaria de cultivos en gran escala (Yasuda y Kitao, 1980).

En tal sentido es necesario conocer la flora bacteriana en animales sanos, en nmero y diversidad especfica, lo que ser de utilidad en la interpretacin de observaciones que se aparten de la normalidad. Esto permitir aplicar medidas de prevencin de las enfermedades de etiologa bacteriana (conociendo sus reservorios y el rango de condiciones ambientales que favorecen su desarrollo), facilitar el diagnstico de estas enfermedades y aplicar medidas de control ms efectivas.

El objetivo de esta investigacin fue examinar la flora bacteriana aerobia de poblaciones slvestres, Lilopenaeus schmilli y cultivadas, L. vannamei y L. stylirostris, del camarn marino, para identificar qu especies de los gneros Vibrio y Aeromonas la forman.

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OBJETIVOS
General: Conocer las especies que pertenecen a la Familias: Vibronaceae, Aeromonadaceae y Pseudomonadaceae. Identificar segn pruebas bioqumicas los miembros de estas familias Especficos: Elegir los medios de cultivo necesarios para el aislamiento y diferenciacin presuntiva correctos, sealando los componentes que los hacen selectivos. Describir tcnicas y fundamentos relacionados para el aislamiento de estos microorganismos. Familiarizarnos con las formas microscpicas y el comportamiento cultural de estos grupos bacterianos.

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PRINCIPIOS TERICOS
FAMILIA VIBRIONACEAE: Las especies del gnero Vibrio son bacilos curvos gramnegativos no entricos, de vida libre y rpido crecimiento. No producen esporas, se mueven de forma errtica gracias a un nico flagelo, son aerobios y anaerobios facultativos, fermentadores de glucosa y oxidasa positivos. Toleran pH alcalinos y algunas especies necesitan medios de alta salinidad para crecer (halfilos). Tiene un antgeno flagelar H que no distingue entre vibriones patgenos y no patgenos, y un antgeno somtico O que s permite esta distincin. Son ubicuos en la naturaleza en ambientes acuticos, capaces de mantenerse virulentos, sin multiplicarse, en el agua dulce y en el agua de mar durante largo tiempo. Son ms frecuentes en aguas templadas y pueden aislarse en mariscos y pescados, donde pueden alcanzar concentraciones elevadas. . Se han identificado ms de 35 especies del gnero Vibrio, de las que 12 son vibriones marinos, grmenes ambientales que no se han asociado a una patologa humana. El resto de las especies (V. cholerae, V. parahemolyticus, V. fluvialis, V. vulnificus, V. damsela, V. hollisae, V. mimicus , entre otros), producen gastroenteritis, infeccin de heridas y tejidos blandos y sepsis/bacteriemia. No obstante, la especie ms destacable es el V. cholerae, cuyas cepas O1 (denominadas as porque se aglutinan con el antisuero O1) son causantes de los casos clsicos de clera pandmico. Las cepas no-O1 del V. cholerae y el resto de las especies no causan sndromes diarreicos tan graves y producen ms frecuentemente infecciones extraintestinales FAMILIA AEROMONADACEAE: Estn formados por bacilos gramnegativos, no esporulantes y anaerobios facultativos. Presentan numerosas similitudes con la familia Enterobacteriaceae. Se divide en dos grupos. El grupo de las aeromonas psicrfilas inmviles est formado por una nica especie, A. salmonicida, un patgeno obligado de peces que no se aborda ms a fondo en este documento. El grupo de las aeromonas mesfilas mviles (con un flagelo polar nico), considerado potencialmente peligroso para la salud humana, est formado por las especies A. hydrophila, A. caviae, A. veronii subsp. sobria, A. jandaei, A. veronii subsp. veronii y A. schubertii. Estas bacterias viven de manera habitual en el agua dulce y estn presentes en el agua, el suelo y muchos alimentos, especialmente en la carne y la leche. Las Aeromonas sp pueden ocasionar infecciones en las personas, como septicemia, especialmente en pacientes inmunodeprimidos, infecciones de heridas e infecciones del aparato respiratorio. Algunas fuentes han afirmado que Aeromonas sp pueden causar enfermedades del aparato digestivo, pero las pruebas epidemiolgicas al respecto no son coherentes. A pesar de 4

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que las aeromonas producen cantidades importantes de toxinas in vitro, no se ha presentado diarrea en los animales de experimentacin ni en voluntarios humanos. FAMILIA PSEUDOMONADACEAE: Este grupo, est formado por bacilos gramnegativos mviles, aerobios, morfolgicamente similares a las enterobacterias, pero se diferencian de stas en que no fermentan la glucosa y la mayora son oxidasa positivas. Crecen en medios habituales no selectivos. Desde el punto de vista clnico se caracterizan por producir infecciones oportunistas principalmente en medio hospitalario. Crean con facilidad resistencia a los antibiticos. Gneros: - Pseudomonas - Stenotrophomonas - Acinetobacter - Burkholderia - Alcalgenes Gnero Pseudomonas. Pseudomonas es un gnero de bacilos rectos o ligeramente curvados, mviles gracias a los flagelos polares que poseen, oxidasa positivos, aerbios estrictos. Algunas especies sintetizan una capa polisacrida que facilita la adhesin celular y la formacin de biopelculas aumentando as su patogenicidad. No forman esporas. Las especies ms importantes son: - Pseudomonas aeruginosa - Pseudomonas fluorescens- Pseudomonas stutzeri - Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Es la especie ms importante y la que con mayor frecuencia produce infecciones en el hombre (muchas de ellas graves). Ms de la mitad de los aislamientos clnicos producen piocianina, un pigmento que confiere un color azul-verdoso al medio de cultivo. Tienen un olor dulzn debido a la produccin de 2-aminocetofenona y en ocasiones las colonias presentan un brillo metlico. Muestra una especial predileccin por los ambientes hmedos (equipos respiratorios, desinfectantes, las piscinas de fisioterapia.). La mayora de las infecciones que produce son hospitalarias, y en pacientes inmunodeprimidos o con alteraciones de las barreras normales -piel

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y mucosas- (quemaduras / ciruga / cateterismo / intubacin). Adems de la resistencia a los antimicrobianos, tambin son muy resistentes a losdesinfectantes.

MATERIALES
1 frasco estril con un espcimen marino (cangrejo o pez). Pipetas de 1ml y propipetas Tubos de ensayo 13 x 100 mm Mango y asa de siembra Algodn y alcohol 70 Batera para tincin Gram. Placas con agar TCBS Placas con agar CETRIMIDE Placas con agar Mac Conkey Placas con agar GSP Caldo GSP Caldo APA Batera bioqumica: Citrato, TSI, LIA, OF y MIO Solucin salina Agua oxigenada Guantes, mascarilla y tocas. Encendedor y marcador

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PROTOCOLO PARA AISLAMIENTO DE Pseudomonas y Aeromonas:

Tincin Gram
Se realiza un corte fino para poder obtener las agallas del pez y colocarlas en un tubo de ensayo con solucin salina para su respectiva dilucin.

Solucin salina ms agallas de pescado

Sembramos en medios selectivos

Agar CETRIMIDE

Agar GSP

Agar MacConkey

Incubamos a 30 C x 48 hrs.

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA

1. Reconocimiento y seleccin de colonias 2. Coloracin Gram 3. Prueba de la Oxidasa

Tincin Gram

PRUEBAS DIFERENCIALES

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TSI LIA Citrato

OxidacinFermentacin

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PROTOCOLO PARA AISLAMIENTO DE VIBRIOS

Tincin Gram
Solucin salina ms intestino de cangrejo

Se realiza un corte alrededor del caparazn para poder retirar parte de las vsceras.

Sembramos en medios selectivos

Agar TCBS Caldo APA Incubamos a 30 C x 48 hrs.

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA

1. Reconocimiento y seleccin de colonias 2. Coloracin Gram 3. Prueba de la Oxidasa

Tincin Gram

PRUEBAS DIFERENCIALES 8
TSI LIA

OxidacinFermentacin

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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO PRIMARIO: Pseudomonas, Aeromonas y Vibrio

En esta coloracin Gram podemos observar claramente bacilos Gram (-) filamentosos

Coloracin Gram de la muestra de intestino de cangrejo

En las placas de GSP y TCBS no presentaron crecimiento porque tienen solo 12 horas de sembrado. Para poder tener la presencia de Pseudomonas deben de pasar por lo menos unas 72 horas para su lectura.

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En el medio TCBS (muestra: vsceras y branquias de cangrejo) se observa un leve crecimiento de colonias pequeas amarillas, lo que indicara que son sacarosa (+)

Medio TCBS con colonias pequeas amarillentas Muestra de vsceras y branquias de cangrejo

Se observan en este pequeas y escazas

medio

colonias

Si se hubiesen obtenido colonias que presentan pigmentacin verduzca o a veces solo alrededor de las colonias o toda la placa para poder presumir de que se trata de P. aeruginosa.

Medio cetrimide con muestra de vsceras ms branquias de cangrejo

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En este medio se obtuvieron colonias pequeas amarillentas, lo que evidenciara que son lactosa (-). Se puede presumir, ante las caractersticas presentadas, que se tratara de Aeromonas.

Medio MacConkey presenta colonias pequeas

Como la mayora de nuestras placas no presentaron un crecimiento ptimo, utilizamos las muestras patrn entregadas por el profesor para poder realizar nuestras pruebas diferenciales y as poder hacer una descripcin de las diferencias que tienen las 3 familias.

La colonia que se seleccion para realizar la coloracin Gram, proviene del medio Cetrimide donde se poda observar colonias pequeas y un color verde plido alrededor de la colonia. En esta coloracin cocobacilos Gram (-). Gram se observan

Coloracin Gram de la muestra patrn del medio Cetrimide

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RESULTADOS DE LAS PREUBAS DIFERENCIALES

BATERIA BIOQUMICA PARA Vibrio

OF CITRAT TSI MI O LI A

Por la coloracin amarilla que presenta, podemos decir que el indicar que es el prpura de bromocresol vir a amarillo por la acidez que gener el medio, lo que indicara la fermentacin de la glucosa. Por el color amarillo tambin podemos decir que la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa es nula, por lo que se puede decir que la prueba es negativa para ornitina. La movilidad que presenta tambin es nula.

Medio MIO

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En este medio se puede notar claramente el viraje del medio en ambos tubos, lo que demostrara que Vibrio es un anaerobio facultativo produciendo fermentacin.

Oxidacin-Fermentacin Medio Hung y Leifson

Este es el medio citrato, donde se observa la coloracin verduzca, evidencindose que la prueba es negativa porque no hubo consumo del citrato ya sea por ausencia de las enzimas o por un escaso crecimiento de la bacteria.

Medio Citrato

Este medio es LIA y aqu podemos observar claramente que tiene una coloracin azul ail lo que significa que es lisina descarboxilasa postiva sin la formacin de manchas negras lo que podra indicar la ausencia del fierro (iron).

Medio LIA

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Se observa que en el plano inclinado est de color rojo y el resto amarillo, lo que indicara que lactosa no fue utilizada, mientras que la glucosa fue metabolizada haciendo virar el rojo de fenol a amarillo. Tambin podemos afirmar que la enzima cisteinasa no tuvo accin por lo que no hay un precipitado color negro

Medio TSI

BATERIA BIOQUMICA PARA Aeromonas

MI O

LI A

CITRAT

OF

TSI

OF

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En este medio se puede notar claramente el viraje del medio en ambos tubos, lo que demostrara que Aeromonas es un anaerobio facultativo produciendo fermentacin, si es de color amarillo, como es en este caso, se puede decir que lo que se metaboliz es glucosa.

Notamos que todo el tubo presenta una coloracin negruzca y espacios que demostraran la produccin de gas, esto debido a que cisteinasa o desulfidrasa tuvo un trabajo ptimo al quitarle las molculas de azufre a la cistena liberndose H2S (gas) y con la presencia de sales ferrosas formarn S2Fe que es lo que le dar un precipitado color negro. Si observa detenidamente,

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observamos que en parte final del pico de flauta existe una coloracin rojiza esto es posiblemente por la escaza metabolizacin de lactosa.

En este caso podemos observar que el medio citrato vir a color azul, esto porque hubo la produccin de cidos y estos formaran los bicarbonatos que alcalinizaran el medio haciendo que el medio se torne de color azul. En esta prueba se comprueba la capacidad de Aeromonas de consumir el citrato mediante la enzima citritasa que es el citrato oxalacetato liasa o citrato desmolasa.

En este caso se observa el color prpura caracterstico cuando el prpura de bromocresol est en presencia de un medio alcalino, esto se debe a que al actuar la enzima ornitina descarboxilasa sobre la ornitina alcalinizndose el medio y como consecuencia el viraje a prpura. Notamos tambin que hay motilidad.

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Se observa un color violceo, lo que indicara que es lisina descarboxilasa positivo, tambin se nota la presencia de manchas negras, esto debido al fierro (iron), que por la presencia de cistena formar el H2S (gas).

BATERIA BIOQUMICA PARA Pseudomonas:

CITRAT

OF

LI A

OF

MI O

TSI

En este caso se puede observar que para el tubo 1 la prueba es positiva, lo que comprobara la naturaleza de Pseudomonas como aerobia; y en el tubo 2 para la prueba es negativo porque este tubo estuvo en anaerobiosis. Por lo que Pseudomonas realizar oxidacin de la glucosa

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Se observa un color violceo, lo que indicara que es lisina descarboxilasa positivo, tambin se nota la presencia de manchas negras, esto debido al fierro (iron), pero en este caso no se da la produccin de gas.

Se observa que en la primera parte del tubo existe una coloracin prpura (que como ya explicamos se debe a la alcalinidad del medio) y en la base del tubo un color amarillo (por la acidez del medio). De esto se puede concluir que en aerobiosis Pseudomona puede descarboxilar la ornitina.

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Podemos notar que el comportamiento de Pseudomonas en medio TSI es K/K sin la produccin de gas.

ANEXOS
MIO Medio.
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol. Fundamento Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la

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ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 3.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de Peptona 10.0 agua destilada. Calentar a ebullicin hasta Triptena 10.0 completa disolucin. Distribuir en tubos y Clorhidrato de L-ornitina 5.0 esterilizar 15 minutos a 121C. Agar 2.0 Prpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 0.2

Cetrimida Agar Base.

Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del gnero. Fundamento La frmula de este medio est desarrollada para favorecer la seleccin de P. aeruginosa y estimular la formacin de pigmentos. Es ste un medio muy semejante al King A, en el cual el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fsforo de las clulas de casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin algunas especies de Pseudomonas. Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina Cloruro de magnesio Sulfato de potasio Agar Cetrimida Instrucciones 20.0 Suspender 45,3 g del polvo por litro 1.4 de agua destilada. Agregar 10 ml de 10.0 glicerina. Dejar reposar 5 minutos. 13.6 Calentar agitando frecuentemente 0.3 y hervir durante 1 minuto. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C. pH final: 7.2 0.2

BIBLIOGRAFA
http://www.mcd.com.mx/pdfs/medio_mio.pdf

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Enfermedades infecciosas. Principios y Prctica. Mandell GL, Dolin R, Bennett J, editores. 6. a ed. Madrid: Elsevier Churchill Livingstone; 2006. http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio8.pdf

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