PRCTICA N 5 RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS Y HONGOS EN PLACAS OBJETIVOS: Aplicar las tcnicas de control microbiolgico basadas en la deteccin de microbios

s indicadores de calidad higinica. Realizar el anlisis microbiolgico de alimentos empleando las tcnicas RTBAMV y RTML. Interpretar correctamente los resultados. INTRODUCCIN RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS Y HONGOS EN PLACAS El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero de microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables 2.- Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas viables 3.- Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables con capacidad reductora 4.- Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las no viables

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METODO DE RECUENTO EN PLACAS

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores: -mtodo de muestreo utilizado -distribucin de los microorganismos en la muestra-naturaleza de la microflora del alimento -naturaleza del alimento-antecedentes del alimento-adecuacin nutricional del medio de cultivo -temperatura y medio de incubacin -pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio -tipo de diluyente utilizado-nmero relativo de microorganismos en la muestra Tcnica del recuento total de microorganismos mesfilos Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la composicin del medio
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y el tiempo de incubacin. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos: a) los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrtofos b) los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos c) los que crecen por encima de los 45 C: termfilos Recuento de aerobios mesfilos En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lpiz graso a lo largo de los dimetros. El nmero de unidades formadoras de colonia o UFC/mL de la muestra original ser: Nmero de UFC/g = Nmero de colonias x factor de dilucin x 10 Tener en cuenta que en la expresin anterior:

S "Nmero de colonias" = media del nmero de colonias contadas en cada una de las placas de la dilucin elegida

S "Factor dilucin" = inverso de la dilucin elegida para el recuento

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MATERIALES Muestras de alimentos(jugo de ceviche) 6 placas Petri estriles 1 matraz Erlenmeyer (250mL) con 50 Ml de agar Sabouraud 1 matraz Erlenmeyer (250mL) con 50 Ml de agar PCA 3 TUBOS (16 x150mm) con 9,0 mL c/u de agua destilada estril 2 pipetas de 1,0 mL estriles Gradillas Estufa Horno esterilizador Material de asepsia, desinfeccin y esterilizacin

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MTODO DEL RECUENTO EN PLACAS PROCEDIMIENTO: 1. Se prepar 1 matraz Erlenmeyer (250 mL ) con 50 mL de agar PCA y otro similar con 50 mL de agar sabouraud, 3 tubos ( 16 x 150 mm ) con 9,0 mL de agua destilada cada uno. Agar PCA: 23,5 g X Agar Sabouraud: 65g Y 100mL 50mL Y=3,25 g de agar Sabouraud 500 mL 50mL X = 2,35g de Agar PCA

2. Se acondicionaron y esterilizaron en el autoclave todo el conjunto.

3. Se esterilizaron 6 placas Petri en el horno.

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4. Se realiz la correcta asepsia de los estudiantes y la desinfeccin de la mesa de trabajo.

5. Se realizaron diluciones seriadas (10

-1

, 10

-2

, 10

-3

) de la muestra a

analizar utilizando los tubos con agua destilada, para ello se pipeteo 1,0 mL. de la muestra original y se transfiri al primer tubo con agua destilada, se mezcl bien y se rotulo 10 -1y de este se transfiri 1,0 mL al segundo tubo, se mezcl y se rotulo 10
-2

, finalmente de este se

transfiri 1,0 mL al tercer tubo, se mezcl bien y se rotulo 10 -3.

6. Para el recuento total de bacterias aerobias mesfilas viables (RTBAMV): Se realiz una mezcla por incorporacin de cada una de las diluciones (empezando por estriles vacas. Con la ayuda de una pipeta de 1,0 mL estril se transfiri 1,0 mL de la dilucin 10
-3

la mayor

dilucin) a tres placas

a una placa estril vaca. Se prosigui de la

misma manera con las diluciones 10 -2 y finalmente con 10 -1.

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 Agregar

el

agar

PCA

fundido

una

temperatura

de

aproximadamente 45-50 C a las tres placas sembradas, homogenizar bien antes que solidifique el medio.

Rotular con plumn indeleble sobre las placas y tambin sobre el papel datos como: muestra, medio de cultivo, fecha, carrera profesional y curso. 7. Para el recuento total de mohos y levaduras (RTML). Se sembr por incorporacin al igual que para (RTBAMV), se incorpor las diluciones en orden.Se agreg el agar Sabouraud a las tres placas sembradas y se homegenizaron, por ltimo se rotularon correctamente.

8. Se llevaron todas las placas a incubacin en posicin invertida a la estufa a 37C durante 48 horas. 9. Transcurrido el tiempo de incubacin se recogieron las placas, se realiz el recuento de colonias. 10. Los clculos se realizaron de igual manera como en el control microbiolgico de ambientes, superficies y personal.

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RESULTADOS Agar PCA 10 -1 10 -2 10 -3

Agar Sabouraud

10 -1

10 -2

10 -3

Diluciones seriadas 10 -1 10
-2

Agar PCA 57 x10= 570 5 x100= 500 1 x1000=1000 690 UFC/mL 6,9 x 10 2 UFC/mL

Agar Sabouraud 55 x10= 550 10 x100=100 5 x1000=5000 533 UFC/mL 5,3 x10 2 UFC/mL

10 -3 ) promedio

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DISCUSIN DE RESULTADOS

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

STRYER, LUBERT. 2005. BIOQUMICA. Cuarta edic. traducido por Jos Macarulla. Editorial Reverte. Barcelona

Beishir, L. Microbiology in practice. A self -instructional laboratory course. 5 Ed. Harper Collins Pub. Inc., 1991.

Daz,

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Gamazo

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Lpez-Goi.

Manual

prctico

de

Microbiologa. 2 Ed. Masson, S.A. Barcelona, 1999. http://www.odon.uba.ar/uacad/Pagina%20Microbiologia/fotos%20book/g uias%20de%20clases/medios%20de%20cultivos.pdf

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