UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO COCOS GRAM POSITIVOS

Maye Bernal Rivera

Introduccin Los cocos gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos ms frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el ao 1836. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se producen por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, o por penetracin a travs de piel y mucosas mediante objetos corto punzantes por heridas, trauma o procedimientos quirrgicos o por la accin de toxinas producidas por cepas de algunas especies. Staphylococcus Los estafilococos son clulas esfricas gram positivas dispuestas en grupos semejantes a racimos de uvas en medios slidos o en pares, cadenas o ttradas, en medios lquidos. Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos: blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemlisis. Son catalasa positivos, inmviles, no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o anaerobios facultativos. Streptococcus Los estreptococos son clulas esfricas u ovaladas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas o largas. Son ms exigentes que los estafilococos, no crecen en medios simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Producen diferentes tipos de hemlisis, caracterstica que permite clasificarlos en beta hemolticos, alfa hemolticos o no hemolticos. No forman pigmentos, son catalasa negativos, inmviles, no esporulados, con formacin de cpsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos. Enterococcus Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son clulas esfricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los estreptococos requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son capaces de desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones (6.5%) de NaCl y de bilis (40%). Pueden producir hemlisis de tipo alfa, beta o ser no hemolticos. No forman pigmentos, son catalasa negativos,

inmviles, no esporulados, con formacin de cpsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos.

PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo Proporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de los mtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento e identificacin de las principales especies de cocos gram positivos que afectan al hombre

PARTE I. SIEMBRA
Objetivos especficos Establecer la diferencia entre gneros de cocos gram positivos Conocer las caractersticas macroscpicas, microscpicas y cambios producidos en el medio de diferentes especies de cocos gram positivos Realizar algunas de las pruebas bioqumicas de laboratorio utilizadas para la identificacin de especies de cocos gram positivos Identificar especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus Aislar e identificar la cepa recibida

Materiales Asa curva Mechero de gas Cepas Caldo BHI Agar Sangre Campana con vela (CO2 ) e incubadora a 37C

Procedimiento 1. Marcar adecuadamente cada uno de los medios. 2. Repicar la cepa asignada en caldo BHI y en agar sangre (por agotamiento) 3. Incubar a 37C por 24 horas en aerobiosis con atmsfera de CO2 Actividad 1. Investigue 3 caractersticas que diferencien las bacterias gram positivas de las gram negativas 2. Escriba que pruebas se debe realizar para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus 3. Cules son las especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus ms importantes en patologa humana?

PARTE II.
LECTURA E INTERPRETACION PARA LA DIFERENCIACION E IDENTIFICACIN DE GNERO Y ESPECIE Sthaphylococcus. Diagnstico de Laboratorio Las colonias de estafilococo son fciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a 3 mm o ms, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas de crecimiento tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del gnero estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cuales estn las siguientes. Pruebas Bioqumicas

CATALASA
Principio La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno segn la siguiente reaccin: 2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la familia Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae. Materiales - Cepa a estudiar - Perxido de hidrgeno al 3% Procedimiento 1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos. 2. Agregar una gota de perxido de hidrgeno al 3% y observar la formacin de efervescencia o burbujas. Resultados - Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparicin rpida y sostenida de burbujas o efervescencia. - Negativa: Unas pocas burbujas pequeas despus de 20 a 30 segundos se considera un resultado negativo.. - Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de la colonia.

COAGULASA
Principio

La coagulasa es una protena de composicin qumica desconocida, que tiene actividad similar a la protombina, capaz de convertir el fibringeno en fibrina, lo que da como resultado la formacin de un cogulo visible en los sistemas apropiados. Se utiliza para identificar Staphylococcus aureus de otras especies. La coagulasa se presenta en dos formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dos procedimientos: en lmina y en tubo; si la prueba en lmina da positiva, no hay necesidad de hacer la prueba en tubo. Prueba en lmina ( Coagulasa ligada ) Materiales - Cepa en estudio - Lmina - Plasma de conejo Procedimiento - Colocar 1 gota de plasma sobre la lmina - Agregar la colonia en estudio - Mezclar Resultados - Positivo: La presencia de aglutinacin o formacin de grumos - Negativo: No se observa aglutinacin, permanece emulsionada la colonia Prueba en tubo ( Coagulasa libre ) Materiales - Cepa en estudio - Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo Procedimiento - Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo - Incubar a 35C por 4 horas; si no se ha formado el cogulo, reincubar por 24 horas a temperatura ambiente Resultados - Positivo: La formacin de un cogulo - Negativo: No se observa formacin de coagulo, permanece lquido el plasma MANITOL Principio Al utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistema Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales cidos que provocan la disminucin del pH en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo. Materiales - Cepa en estudio

Caldo de Manitol

Procedimiento - Sembrar la colonia en el caldo - Incubar a 35C por 24 horas Resultados - Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo - Negativo: cuando conserva su color rojo DNAsa Principio Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molcula de DNA. Para evidenciar la presencia de la enzima, se inunda el medio con cido clorhdrico normal, el cual precipita la molcula del cido pero no sus polmeros. Materiales - Cepa en estudio - Agar DNA - Acido clorhdrico 1 Normal Procedimiento - Sembrar por estra gruesa la colonia en estudio, en el agar DNA - Incubar a 35C por 24 horas A las 24 horas: Inundar la superficie del medio con HCL 1N, esperar 2 minutos

Resultados - Positivo: La formacin de un halo transparente alrededor de la siembra indica presencia de DNAsa. - Negativo: La formacin de un precipitado alrededor de la siembra indica ausencia de la enzima NOVOBIOCINA Principio Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y resistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies resistentes, la ms frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto urinario. Por lo tanto esta prueba proporciona una identificacin presuntiva confiable de esta especie. Materiales - Cepa en estudio - Disco de novobiocina de 5ug

Agar sangre de carnero

Procedimiento - Preparar una suspensin (equivalente al estndar 0.5 de McFarland) del microorganismo en agua destilada. - Sembrar con escobilln en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton - Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro - Incubar a 35C durante por 24 horas Resultados - Sensible: Halo de inhibicin mayor a 16 mm - Resistente: Halo de inhibicin menor a los 12 mm

Tabla de identificacin gnero Staphylococcus

Prueba

S. aureus + + +

S. epidermidis S

S. saprophyticus R

Coagulasa DNAsa Manitol Novobiocina

Streptococcus y Enterococcus. Diagnstico de Laboratorio Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de la especie; Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas de crecimiento tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del gnero estafilococo, el cual produce esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cuales estn las siguientes. Pruebas Bioqumicas BACITRACINA Principio Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de Bacitracina. Materiales - Cepa en estudio - Agar sangre - Discos de Bacitracina Procedimiento:

Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente Incubar a 35C por 24 horas

Resultados - Sensible: La aparicin de cualquier halo de inhibicin alrededor del disco - Resistente: Crecimiento alrededor del disco CAMP Principio Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida por algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de lisina. Materiales - Cepa en estudio - Agar sangre - Cepa de Staphylococcus aureus lisina positivo Procedimiento: - Sembrar sobre la palca de agar una estra de estafilococo lisina positivo - Perpendicular al estafilococo, hacer una estra con la colonia en estudio - Incubar a 35C por 24 horas Resultados - Positivo: Presencia de una zona de hemlisis en forma de flecha - Negativo: Ausencia de la hemlisis en flecha OPTOQUINA Principio El clorhidrato de etildihidrocuprena (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibe en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina puede inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones ms altas. Materiales - Cepa en estudio - Agar sangre - Discos de Optoquina 5 ug. Procedimiento: - Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre - Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente - Incubar a 35C por 24 horas Resultados

KF

Sensible: La aparicin de un halo de inhibicin mayor a 16 mm de dimetro Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm

Principio Determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en un medio inhibidor y fermentar un carbohidrato produciendo un cambio de color. Materiales - Cepa en estudio - Agar KF Procedimiento: - Sembrar por doble picadura y estra en la superficie - Incubar a 35C por 24 horas Resultados - Positivo: El medio vira a amarillo - Negativo: el medio permanece del color original

PRACTICA DE LABORATORIO
PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS
Objetivos especficos Estudiar las caractersticas macroscpicas de las colonias de cocos gram positivos Diferenciar los tipos de hemlisis Observar las caractersticas microscpicas de los diferentes gneros Conocer diferentes pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de cocos gram positivos

Materiales Cultivos bacterianos Lminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente Colorantes para Gram Microscopio y aceite de inmersin Reactivos y medios para las diferentes pruebas bioqumicas

Procedimiento 1. Describir las caractersticas macroscpicas de la colonia 2. Clasificar el tipo de hemlisis 3. Observar las caractersticas microscpicas mediante la coloracin de Gram

4. Realizar las pruebas bioqumicas especficas, de acuerdo con los hallazgos anteriores y la instruccin de su profesor Actividad 1. Dibuje las diferentes morfologas, tipo de agrupacin y afinidad con respecto al Gram, de los cocos gram positivos 2. Defina los diferentes tipos de hemlisis 3. Realice un flujograma para la identificacin de la bacteria que le fue asignada

PRACTICA DE LABORATORIO
PARTE III. LECTURA E INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS
Objetivos especficos Leer e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas Conocer las tablas de identificacin bacteriana Identificar gnero y especie

Materiales Cultivos bacterianos Pruebas bioqumicas Reactivos especficos cuando fuere necesario Tabla de identificacin

Procedimiento 1. Leer las pruebas bioqumicas 2. Con base en los resultados obtenidos buscar en la tabla de identificacin 3. Informar gnero y especie Actividad 1. Escriba 5 enfermedades infecciosas que produzca cada una de las especies de cocos gram positivos importantes en patologa humana