RESULTADOS Anlisis de secuencias de los familiares PHEP (para la protena extracelular Phakopsora),.

Tres protenas de bajo peso moleculares, denominado aqu PHEP 107 (GenBank adhesin no. BK008466), PHEP 280 (BK008467) y PHEP 369 (BK008465), fueron identificados previamente por MALDI-TOF/TOF espectrometra de masas como la representacin de los puntos ms abundantes visualmente en geles 2D teidas de azul coloidal (17). Estas protenas se identificaron mediante bsquedas en contra traducidos P. pachyrhizi ESTs, utilizando el software MASCOT. las 3 protenas se identificaron en las fracciones de protenas solubles extrados de P. pachyrhizi urediniosporas germinacin. PHEP 107 y PHEP 369 estuvieron presentes en el agua la germinacin de las esporas que germinaron tambin y se detectaron como varios lugares en 2DE. PHEP PHEP 107 y 369 son casi idnticos en longitud (108 y 109 aminocidos, respectivamente) y la cuota de 64% de identidad de secuencia de aminocidos (76% de similitud de clase de aminocidos). tBLASTn bsquedas (2) contra el Centro Nacional para Informacin de Biotecnologa no redundante (NCBInr) y bases de datos de EST revelaron tres ORFs adicionales (EH254430, EH26023, y EH238470.1) con alta similitud con PHEP 369 (Fig. 1), lo que indica que el PHEPs representan una pequea familia de genes. Se compararon las secuencias de las secuencias PHEP 369 usando PCR con primers rPHEP 369 de ADN genmico (gDNA) aisl de uredosporas sin germinar de una recoleccin internacional de P. pachyrhizi asla de 6 pases (Cuadro 1). Slo se detectaron dos mutaciones silenciosas dentro de todos los aislados secuenciados (vase la fig. S1 en el material suplementario), lo que indica que el gen PHEP 369 (s) est altamente conservado en las especies. Anlisis de P. pachyrhizi fosmid y secuencias EST con tBLASTn (2) bsquedas en contra de la NCBInr y las tecnologas ecolgicamente racionales revel cuatro ORFs (sitios de origen de vectormarco abierto de lectura) y una truncada EST con secuencias estrechamente relacionadas y estructuras intrn / exn a PHEP 369, (EH254430, EH26023 y EH238470.1) (Fig. 1), constituyendo de este modo una pequea familia de genes. La secuencia PHEP 369 fue identificado en P. pachyrhizi fosmid clon AC188845.2. La secuencia de 522-pb que contena dos intrones, uno 100 pb y los otros 98 pares de bases, y tres exones. PHEP 369 se en-codificada con los sitios de inicio y parada y contena una caja TATA 142 pb aguas arriba del codn de inicio. Bsquedas dominio conservado con miembros de la familia PHEP no mostraron evidencia de la similitud de secuencia o putativo relacin funcional con cualquiera de las secuencias depositadas en bases de datos de cdigo abierto. Anlisis de la fosmid no revel otras copias para PHEP 369 o cualquiera de las protenas PHEP relacionados. Adicionalmente, los resultados de anlisis de

transferencia Southern (vase la fig. S2 en el material de apoyo plemental) indicaron que PHEP 369 es un gen de copia nica. Perfil bsquedas de protenas en ExPASy, incluyendo PFAM, HAMAP, PROSITE, y ELM (10), indicaron que no hubo patrn conservado o de la relacin funcional de PHEPs a cualquier familias de protenas bien caracterizados. Aunque ambas protenas contienen dominios hidrofbicos y cargados cerca del extremo N terminales, los algoritmos de prediccin (4) no revelan la presencia de un pptido seal cannica para cualquiera de las protenas, y ningn sitio de escisin de pptido seal fue identificado por los algoritmos de prediccin. Adems, levadura ensayos trampa de secrecin preliminares, utilizando PHEP107 y PHEP369 clones en un vector de secrecin de levadura (16), fueron negativos (K. Pedley, comunicacin personal, los datos no presentados). Bsquedas Motif aplican no clsica (sin lder) la secrecin de algoritmos (5, 6) produjeron resultados de salida de la red neuronal que superen el umbral normal dada para SecretomeP motivo de las bsquedas (12) y tambin revelaron carbohidratos putativo y dominios de unin a fosfato, lo que puede explicar por qu las mltiples formas de PHEP 369 fueron identificados en 2DE. Manchas Lectina realizados por sondeo protenas gurado-iniospore separadas por 2DE con concanavalina A la evidencia preliminar pro-provisto para los dominios de unin a manosa en PHEP 369 (ver fig. S3 en el material complementario). Parcelas de Kyte-Doolittle (no se muestra) muestran una clara evidencia de hidrofobicidad que era evidente en regiones de los genes PHEP ricos en alanina, isoleucina, leucina, y valina (15). Regio-nes Hydrophobic fueron localizados a las regiones ms conservadas, mientras que la variabilidad de alto est fue evidente en los dominios ms hidrfilas. Parcelas antigenicidad generados utilizando la herramienta en lnea Pro ABIE (versin3,0; Chang Biosciences, Castro Valley, CA) revel numerosas secuencias de pptidos como los principales candidatos para el diseo de anticuerpos. Reactividad y especificidad del anticuerpo. Los anticuerpos policlonales se generaron contra rPHEP 107 y las protenas rPHEP 369, y fracciones de IgG se purificaron para estudios de caracterizacin. Protenas recombinantes pueden ser detectados en las transferencias de puntos por deteccin quimioluminiscencia a niveles tan bajos como 100 pg a una dilucin de anticuerpos de 1:5.000. Por anlisis de transferencia Western, se encontr que el anti-rPHEP 107 y anti-rPHEP 369 Pabs no eran completamente especfica. Anti-rPHEP 107 PAb fue altamente reactivo con rPHEP 107 y moderadamente reactivos contra rPHEP 369. En comparacin, el anti-rPHEP 369 PAb era altamente reactivo con rPHEP 369 pero slo ligeramente con rPHEP 107 (fig. 2). Los anticuerpos monoclonales se generaron luego contra la protena purificado rPHEP 369. Seis lneas celulares MAb se seleccionaron despus de dos rondas de cribado con la

protena rPHEP 369. Dos lneas celulares AcMo especfico para rPHEP 369 (3G6H7-3 y 3G6E11) y no una reaccin cruzada con rPHEP 107, mientras que dos anticuerpos monoclonales (2E8E5-1 y 2E8H6) se hace reaccionar con ambas protenas recombinantes. Western blots ilustra la reactividad y especificidad para 2 anticuerpos monoclonales con rPHEP107 y 369 (Fig. 2). Utilizando ELISA para determinar la sensibilidad de MAb, se detect 300 pg de protena rPHEP 369 a una dilucin de 1:3000 de cualquiera de 2E8E5-1 (mAb1) o 3G6H7-3 (MAB3) cuando se utiliza como anticuerpos primarios, y 1 ng de protena rPHEP 369 se detect a una dilucin de 1:26,000 de cualquiera de mAb1 o MAB3 cuando se utilizan como anticuerpos primarios. PHEP 369 en hoja solubles de protenas extractos de soja inoculados con 0.375 mg / ml de P. pachyrhizi aislar TW72-1 podra ser detectada por Western Blot a menos de 3 ppp utilizando mAb1 y dentro de 5 ppp utilizando MAB3 (fig. 3). Se evaluaron las especificidades de MAb1 y MAB3 a extractos de plantas infectadas con patgenos comunes de Estados Unidos de soja, extractos de cultivaron patgenos comunes de soja, y extractos de esporas de hongos de la roya relaciona-dos utilizando ELISA y anlisis de transferencia Western y se ilustran en la Tabla 2. MAb1 y MAB3 no reaccionaron con extractos de plantas infectadas con patgenos comunes estadounidenses de soja, extractos de cultivos de soja patgenos comunes, o extractos de esporas de hongos de la roya relacionados. MAb1 era reactiva contra P. meibomiae esporas no germinadas y ligeramente reactiva contra Phaseolus lunatus (frijol lima) infectados con P. meibomiae recogi en 14 dpi durante la esporulacin con numerosas pstulas (Fig. 4), pero no reaccion con esporas germinadas de P. meibomiae. Ensayos de inmunolocalizacin y de inmunofluorescencia (IFA). Un estudio de microscopa electrnica se realiz para determinar la localizacin de las protenas PHEP en P. pachyrhizi urediniosporas. Pabs PHEP recombinantes fueron elegidos para el estudio debido a su reactividad a las esporas. Pabs marcado con oro localizados PHEP 369 a echinulations (espinas) en la superficie de no germinadas P. pachyrhizi uredinio-esporas (Fig. 5). Las partculas de oro son evidentes en las espinas que sobresalen de la pared urediniosporas. En general, se observ que la mayora de las espinas contenan mltiples partculas. Ensayos de inmunofluorescencia con urediniosporas antes de y durante la germinacin confirmaron la localizacin de PHEP 369 a echinulations sobre la superficie pachyrhizi urediniosporas P. utilizando PAb 369 (Fig. 6A, B, C) y MAb 2E8E5-1 (Fig. 6D, E, F) . Los controles sin anticuerpo primario mostraron autofluorescencia mnima. Anlisis funcional de protenas. Teniendo en cuenta la secuencia de anlisis de los miembros de la familia PHEP y la ausencia de cualquier homologos conocidos, el papel funcional de las protenas PHEP en desarrollo, la infeccin por hongos, y la

interaccin con el husped no est claro. Se llevaron a cabo intentos para establecer si las altas concentraciones de r107 o r369 protenas aplicadas a una superficie de la hoja de soja podran inducir una respuesta fenotpica. Ni rPHEP 107 ni rPHEP 369 indujeron una respuesta fenotpica visible hipersensible o de otro tipo cuando se infiltro en cantidades de hasta 1 g en las hojas de soja susceptibles cultivar Williams (ver. Fig. S4 en el material complementario). Cuando se aadieron rPHEP 107 y 369 a rPHEP inculo en la misma concentracin, no previenen la infeccin subsiguiente (ver fig. S5 en el material complementario). Luego preguntamos si la presencia de PAb r369 durante la germinacin de esporas podra interrumpir las etapas crticas del proceso de infeccin. En los experimentos de incubacin de P. pachyrhizi urediniosporas con PAb 369, se observ un efecto consistente de la protena recombinante en la germinacin urediniosporas (vase el cuadro S1 en el material complementario) o adherencia a las hojas separadas (vase la Tabla S2 en el material de apoyo plemental).