Validación de Métodos Analíticos

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VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS.

Es un proceso donde se establece, por estudios de laboratorio, que el mtodo satisface los requisitos para las aplicaciones analticas deseadas, es decir, permite evaluar su confiabilidad. En general se consideran 3 tipos de validacin: Validacin prospectiva: Para mtodos analticos nuevos. Validacin retrospectiva: Para mtodos repetidamente utilizados, no validados anteriormente y de los que se tiene documentacin suficiente para probar la bondad del mtodo. Revalidacin : Es volver a validar un mtodo al cual se le han realizado cambios que puedan afectar la bondad del mtodo. Cambios en la sntesis del principio activo de un medicamento. Cambios en la composicin del producto terminado. Cambios en el procedimiento analtico. VALIDACIN : Es verificar experimentalmente y documentalmente que un mtodo hace lo que tiene que hacer. o caractersticas
CALIFICACIN : Es verificar las cualidades inherentes a un equipo. CALIBRACIN : Es una parte de la calificacin.
FARMACOPEAS Los mtodos descritos en monografas de farmacopeas u otros textos oficiales se consideran validados. Hay que aclarar que se aplica solo a mtodos generales y a materias primas. En cuanto a producto terminado, habr que hacer validacin del mtodo analtico, puesto que los excipientes sern diferentes para cada fabricante.
Material recopilado con propsito docente por Gustavo Rodrguez A. Q.F. Especialista en Toxicologa Forense U.de A.
VALIDACIN Y BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO. Instalaciones adecuadas y suficientes Personal capacitado Equipos apropiados, calificados (calibrados). Procedimientos adecuados para la toma de muestras. Utilizacin de reactivos apropiados y soluciones valoradas. Utilizacin de material de laboratorio (vidrio) adecuado y cumpliendo con el procedimiento estandarizado de limpieza. (calibrado el material volumtrico). Utilizacin de patrones y muestras de referencia correctas. Estndar primario Estndar secundario Garanta de calidad de los resultados obtenidos (elaboracin de documentos). Higiene y seguridad en el laboratorio. Los estudios de validacin deben ser realizados por analistas con experiencia, de tal manera que se eviten errores debido a la falta de experiencia, precisamente porque el propsito del estudio es la evaluacin de errores y posible sesgo del mtodo en s mismo, de ah la importancia de minimizar la variacin introducida por el analista DOCUMENTACION Procedimientos estandarizados de trabajo. PET SOPs : Standard Operating Procedures FASES EN EL DESARROLLO DE UN METODO ANALITICO. Definir las caractersticas y requerimientos que debe satisfacer el mtodo analtico. De acuerdo al mtodo a seguir Volumtrico Gravimtrico Potenciomtrico Microbiolgico Instrumental Tipo de instrumentacin Grado de especificidad Grado de sensibilidad Precisin necesaria Tiempo por anlisis Costo por anlisis
Estandarizacin del mtodo analtico. Comprende desde los primeros estudios de tanteo con estndares hasta la utilizacin de mtodo en muestras reales. Se debe establecer los parmetros de idoneidad que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del anlisis. Validacin del mtodo analtico. Identificacin de los parmetros apropiados de validacin. Diseo de experimentos para la elaboracin del parmetro. Determinacin del cumplimiento de cada parmetro en validacin. Traduccin de los resultados en el procedimiento del mtodo.
la
DATOS ELEMENTALES REQUERIDOS PARA LA VALIDACION DE UN ENSAYO. Los procedimientos de valoracin varan, desde determinaciones analticas de alta exactitud, hasta la evaluacin subjetiva por atributos, considerando esta variedad de los ensayos, es mas que lgico decir que los diferentes mtodos de prueba requieren diferentes esquemas de validacin. Las categoras ms comunes de ensayos, los cuales requieren validacin, son los siguientes segn USP 23: CATEGORIA I: Mtodos analticos para la cuantificacin de componentes mayoritarios de materias primas a granel o ingredientes activos (incluyendo preservativos) en productos farmacuticos terminados. CATEGORIA II: Mtodos analticos para la determinacin de impurezas en materias primas a granel o compuestos de degradacin en productos farmacuticos terminados. Estos mtodos incluyen valoraciones cuantitativas y pruebas limites. CATEGORIA III: Mtodos analticos para la determinacin de caractersticas de desempeo (por ejemplo disolucin).
PARAMETRO
CATEGORIA II
CUANTIFICACIO N ENSAYO LI M IT E
III
ESPECIFICIDAD SI SI SI * LINEALIDAD SI SI NO * RANGO SI SI * * PRECISION SI SI NO SI EXACTITUD SI SI * * LIM. DETECCION NO NO SI * LIMITE NO SI NO * CUANTIFICACIO N * PUEDE SER REQUERIDA, DEPENDIENDO DEL ENSAYO. En el suplemento 4 de la USP 23, desaparece de la tabla anterior el criterio para ROBUSTEZ. CARACTERISTICAS DE LA ANALITICO SEGN ICH. VALIDACION DE UN METODO
TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICO: 1. PRUEBAS DE IDENTIFICACION 2. PRUEBAS PARA LA DETERMINACION DE IMPUREZAS 3. VALORACIONES TANTO DE POTENCIA Y CONTENIDO DE UN PRINCIPIO ACTIVO, COMO DE ENSAYOS DE DISOLUCION. PARAMETRO 1 TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICO 2 3
CUANTIFICACIO N ENSAYO LI M IT E
ESPECIFICIDAD LINEALIDAD RANGO PRECISION EXACTITUD LIM. DETECCION LIMITE CUANTIFICACIO N
SI NO NO NO NO NO NO
SI SI SI SI * SI NO SI
SI NO NO NO NO SI NO
SI SI SI SI * SI NO NO
LA PRECISIN SERA DADA POR LA REPETIBILIDAD Y LA PRECISIN INTERMEDIA. * CUANDO LA REPRODUCIBILIDAD HA SIDO DETERMINADA, LA PRECISIN INTERMEDIA NO SE REQUIERE.
LA ROBUSTEZ DEBE SER CONSIDERADA EN LA ETAPA FINAL DEL DESARROLLO DEL METODO ANALITICO. CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS METODOS ANALITICOS. Las caractersticas de funcionamiento de un mtodo analtico comprenden todos los datos y resultados experimentales que demuestran su aptitud para el uso al cual es destinado. CARACTERISTICAS DE FIABILIDAD (CONFIABILIDAD) Son las que demuestran la capacidad de un mtodo analtico para mantener los criterios fundamentales de la validacin a lo largo del tiempo. Capacidad de un mtodo para determinar el analito sin interferencia de impurezas, excipientes, productos de degradacin u otras sustancias presentes en la muestra. Selectividad Especificidad Proporcionalidad entre la concentracin del analito y la respuesta del instrumento. Linealidad y rango Sensibilidad Dispersin de una serie de resultados alrededor de un valor medio. Precisin Repetibilidad Reproducibilidad Precisin intermedia Robustez Tolerancia Diferencia entre el valor hallado en el anlisis y el valor verdadero. Exactitud Porcentaje de recuperacin Cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultado significativo. Sensibilidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin PRACTICABILIDAD Se evalan en la fase del desarrollo del mtodo analtico. Tiempo Costo Tamao de la muestra
Equipo IDONEIDAD (SYSTEM SUITABILITY) Los parmetros de idoneidad no son de validacin y se consideran dentro de las buenas practicas de laboratorio ( GLP ) analtico. Se aplica al conjunto de parmetros relacionados con la verificacin del buen funcionamiento de los instrumentos analticos. Un sistema analtico es idneo (adecuado) si responde, en el momento de su utilizacin, a los requisitos fijados en la validacin del mtodo. Los instrumentos se califican. Los mtodos se validan. System suitability (idoneidad) verifica el buen funcionamiento del sistema (instrumento y mtodo) en el momento de su uso.
Este parmetro se refiere a la propiedad del mtodo de producir una respuesta debida solo a la presencia del analito de inters, libre de interferencia de otros componentes que pueden ser excipientes de un frmaco, productos de degradacin, subproductos o productos laterales de sntesis de un medicamento, metabolitos del mismo analito en fluidos biolgicos. Un aspecto importante de su aplicacin, es el mbito de utilizacin del mtodo. Ciertos mtodos, como los gravimtricos o volumtricos son adecuados nicamente para el anlisis de macroconstituyentes de una muestra. La mayor parte de los mtodos instrumentales pueden determinar hasta trazas de sustancias. La seleccin de un estndar interno adecuado es fundamental para los mtodos que lo requieren, y se debe garantizar que el mtodo sea especifico tanto para el estndar interno como para el analito problema.
La especificidad del mtodo analtico puede determinarse de la siguiente forma: Analizar el placebo (la formulacin sin el principio activo, solo los excipientes). Analizar por triplicado placebo adicionado con los productos de degradacin, sustancias relacionadas y sustancias de inters equivalente al 100%. Analizar por triplicado muestras solas, solo el analito de inters. Comparar los datos obtenidos de los anlisis del placebo adicionado de la sustancia de inters y de sus sustancias relacionadas, con los obtenidos en los anlisis de muestras solas.
EL METODO SE CONSIDERA ESPECIFICO CUANDO : AL ANALIZAR EL PLACEBO NO HAY RESPUESTA. NO HAY NINGUNA VARIACION EN LOS RESULTADOS OBTENIDOS, AL ANALIZAR EL PLACEBO ADICIONADO Y LAS MUESTRAS SOLAS.
La linealidad del mtodo analtico se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin del analito y su respuesta, en un rango determinado. El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrn del analito, como sobre muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito. Realizar anlisis mnimo por triplicado de soluciones con la sustancia de inters a diferentes concentraciones.
El numero de soluciones puede estar comprendido entre 3 y 10, y los niveles de concentracin se seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. Valoracin de una materia prima. Analizar de 3 a 5 soluciones patrn a un intervalo de concentraciones comprendido entre 80 a 120 % del valor terico. Para 5 niveles de concentracin se podra ensayar 80, 90, 100, 110 y 120 % mnimo por triplicado. Valoracin de un principio activo en producto terminado. Analizar 5 a 7 soluciones estndar con niveles de concentracin comprendidos entre el 50 al 150 % del valor terico. Para 5 niveles de concentracin se podra ensayar 50, 80, 100, 120 y 150 % mnimo por triplicado. Si la concentracin del analito puede variar ampliamente, como es el caso de ensayos de impurezas, productos de degradacin, determinacin de analito y de metabolitos en fluidos biolgicos. Los patrones debern abarcar todo el intervalo de concentraciones previsto. 10 a 100 ppm para una impureza. 10 a 200% de la concentracin promedio del analito en fluidos biolgicos. Realizar para cada nivel de concentracin el anlisis mnimo por triplicado. Registrar los resultados obtenidos. Realizar los clculos de regresin lineal por el mtodo de los mnimos cuadrados, para saber si el grfico obtenido es del tipo lineal.
ECUACION DE LA LINEA RECTA Y = bX + a

Y: X: b: a: RESPUESTA ( VARIABLE DEPENDIENTE) CONCENTRACION O CANTIDAD DE ANALITO (VARIABLE INDEPENDIENTE) PENDIENTE INTERCEPTO
X Y b = ______________n______________ a = Y - b x 2 2 X ( X ) n n XY - X Y r = ___________________________________n_____________________ X2
-
XY -
( X )
Y2
( Y )
Valores muy elevados de r (coeficiente DE CORRELACIN ) no deben tomarse errneamente como indicadores de linealidad; la linealidad se demuestra estadsticamente por otros procesos que se describen a continuacin: El cuadrado del coeficiente de correlacin se denomina COEFICIENTE DE DETERMINACION ( R2 ) e indica la proporcin de la varianza total de Y que es explicada por el modelo lineal de regresin. La variable independiente explica En un % de la varianza total de Y. Prueba t para el coeficiente de correlacin. El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 % ).
t exp
= | r|(n2) ( 1 r2 )
H0 : No existe correlacin entre X y Y.
t experimental > t tabla
Se rechaza la hiptesis nula, lo cual indica que existe correlacin significativa entre X y Y. Prueba de linealidad de la pendiente b. COEFICIENTE DE REGRESION
S2y,x = _Y2 - a Y - b_XY

ERROR
( VARIANZA DEL EXPERIMENTAL
n2
TOTAL)
10
S2b = ______ S2y,x _________ _

X
2 -
( X )
( VARIANZA DE LA PENDIENTE)
Sb =
S2b
b
Sb rel (%) = Sb x 100

Lmites de confianza de la pendiente
b t tabla Sb
El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ). Prueba t para la pendiente. El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ).
exp
= b Sb
H0 : b = 0
Se rechaza la hiptesis nula. Indica buena linealidad del mtodo. t experimental > t tabla
Este valor indica que la probabilidad de ser b 0 es muy elevada, superior al 95 %. Si fuera b = 0 significara que la recta es paralela al eje de las abscisas y no habra regresin. SIGNIFICACION ESTADISTICA DE LA VARIANZA DE LA PENDIENTE (b) A mayor pendiente: habr mayor sensibilidad del mtodo.
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A menor varianza de la pendiente: habr mejor linealidad del mtodo. Prueba de linealidad del intercepto a. (Proporcionalidad) Indica el error sistemtico del mtodo, idealmente debe ser cero. Cuando la concentracin del analito de inters sea cero, su respuesta deber ser cero.
S2a
S2b
( X )
Sa =
S2a
Sa rel (%) = Sa x 100 a

Lmites de confianza del intercepto a t tabla Sa El valor t tabla de la distribucin de student para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %). Si estos limites cubren el cero, se cumple la condicin de proporcionalidad. Prueba t para el intercepto a. El valor t tabla de la distribucin de student para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %). t exp = a Sa
H0 : a = 0
Se rechaza la hiptesis nula. Indica buena proporcionalidad del mtodo. t experimental > t tabla
Este valor indica que la probabilidad de ser a = 0 es muy elevada, superior al 95 %.
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Representacin grfica de la recta de regresin. Realizar la grfica con los datos obtenidos, que relaciona la respuesta (rea, absorbancia, volumen) con la concentracin o cantidad de analito. Adems realizar el trazado de las hiprboles indicativas de los intervalos de confianza.
TEST DE LINEALIDAD COEFICIENTE DE VARIACION DE LOS FACTORES DE RESPUESTA. El factor de respuesta es la relacin entre la lectura (valor de la respuesta la concentracin o cantidad de analito F= RESPUESTA CONCENTRACION
En una calibracin lineal los factores de respuesta deben ser semejantes entre s y cercanos al valor de la pendiente. Por este motivo se puede tomar el coeficiente de variacin de los factores de respuesta como una expresin de la linealidad. Se considera que coeficientes de variacin superiores al 5 % indican falta de linealidad. ANOVA DE LA REGRESION. ANALISIS DE VARIANZA DE LA REGRESION . TABLA ANOVA PARA REGRESION
13 Fuente de Variacin Modelo de Regresin Residual (error) Suma de Cuadrados SCR SCE Grados de Libertad 1 N Cuadrado medio CMR CME f CMR CME Valor p
-2
TOTAL
SCT
N -1
SCT =
Yi2 - ( Yi )2 n
SCT = b2 ( Xi X )2 SCE = SCT - SCR En muchos casos, es interesante comparar los resultados de la recta de regresin obtenida para el analito puro (estndar), con el correspondiente analito adicionado a la matriz. La no correspondencia de las rectas indica problemas por efecto de matriz y est relacionada con la exactitud del mtodo. Estos efectos de matriz pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza en aditivos y multiplicativos. Los aditivos se refieren a un desplazamiento positivo del cero en presencia de la matriz y los multiplicativos a un cambio de la pendiente. ANALISIS DE RESIDUALES Los residuos son la diferencia entre la respuesta medida en cada punto de la curva y la calculada a partir de la ecuacin de regresin. El residuo indica el acercamiento al ajuste con los valores predichos, sus caractersticas ideales son: Valor pequeo del residuo. Consistencia de magnitud del residuo. Ausencia de tendencias en su signo.
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El rango de un mtodo analtico es el intervalo entre los niveles superior e inferior (incluyendo estos niveles) en los cuales se ha demostrado que son determinados con precisin, exactitud y linealidad, utilizando el mtodo como se ha descrito.
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica repetidamente a la misma muestra. La idea de precisin, en general, viene expresada por la media para el valor central y la desviacin estndar para la dispersin de los resultados. Un estudio de precisin requiere la repeticin del anlisis sobre una muestra. La precisin as obtenida se denomina del mtodo, puesto que incluye todo el procedimiento analtico, desde la
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preparacin de la muestra hasta la lectura instrumental. Tambin se puede determinar directamente la precisin del sistema instrumental, hallando la variabilidad de respuesta de una solucin patrn. La precisin es expresada matemticamente por el coeficiente de variacin (CV) o la desviacin estndar relativa (RSD). El valor aceptable de precisin de un mtodo depende de la concentracin del analito y del numero de repeticiones del anlisis.
El valor de CV obtenido analizarlo en la siguiente tabla: CV mximo aceptable de un mtodo analtico en funcin de los lmites de aceptacin del resultado y del nmero de replicas:
CRITERIO DE ACEPTACION CV (%) MAXIMO ACEPTABLE
95 90 85 99 98.5 92
105 110 115 101 101.5 102
n=1 1.9 3.9 5.8 0.39 0.58 0.77
n=2 2.7 5.5 8.2 0.55 0.82 1.09
n=3 3.3 6.7 11.6 0.67 1.00 1.33
n=4 3.8 7.8 11.6 0.78 1.16 1.54
n=5 4.2 8.7 12.9 0.87 1.30 1.72
En anlisis de producto terminado pueden utilizarse coeficientes de variacin inferiores al 2 y 3 % para el ensayo de repetibilidad y del 4 al 5 % en el ensayo de reproducibilidad. DIFERENTES COEFICIENTES DE VARIACION EN FUNCION DEL PORCENTAJE DE ANALITO EN LA MUESTRA SEGN KOLTHOFF Y SEGN HORWITZ. % DE ANALITO EN LA MUESTRA 100 50 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 CV ( %) MAXIMO KOLTHOFF 0.1 0.3 0.3 1 25 5 10 10 --CV ( %) MAXIMO HORWITZ 2 2.2 2.8 4 5.7 8 11.3 16
Estos lmites son orientativos y no deben interpretarse rgidamente.
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LIMITES DE CONFIANZA Se pueden expresar de diferentes maneras : De los resultados individuales Media ms o menos la desviacin estndar X s Media ms o menos dos veces la desviacin estndar X 2 s Media ms o menos la desviacin estndar multiplicada por la t de Student X t s Estadsticamente sta es la expresin ms correcta ya que tiene en cuenta la distribucin de Student cuando el nmero de rplicas es inferior a 30. El valor de t se halla en las tablas de Student para n 1 grados de libertad y una significacin del 95 %. De los resultados promedio Los lmites de confianza de la media de una serie de resultados son: X t s / n
Es la medida de la precisin de los resultados de un mtodo efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos, reactivos y en el curso de la misma serie de anlisis efectuados, generalmente, en un corto intervalo de tiempo durante el mismo da. El siguiente estudio lo realiza un solo analista. Se pueden utilizar de 3 a 5 niveles de concentracin, el numero de repeticiones debera ser superior a 5 para cada nivel. Se realiza el anlisis de muestras en el mismo laboratorio, el mismo da, en el mismo equipo y el mismo analista. Cada nivel de concentracin se analiza 6 veces.
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Es la medida de la precisin de los resultados de un mtodo analtico cuando es realizado sobre una misma muestra pero en condiciones diferentes tales como en diferentes laboratorios, por diferentes analistas, en diferentes equipos y en diferentes das. Un ensayo de reproducibilidad debe estudiar las principales condiciones de variabilidad del mtodo analtico. Los anlisis de las muestras se pueden realizar por triplicado con tres niveles de concentracin, utilizando para ello 2 laboratorios diferentes, 2 equipos diferentes, donde los anlisis sean realizados por 3 personas diferentes, durante 4 das diferentes. La reproducibilidad global se determina por el coeficiente de variacin. Si se desea estudiar el efecto de cada uno de los factores (diferentes analistas, equipo, da) por separado, se debe realizar un anlisis de varianza (ANOVA). Nmero de determinaciones : Valor medio global : S: CV de reproducibilidad :
Fue previamente conocida como parte de la tolerancia. El atributo evala la confiabilidad del mtodo en diferentes ambientes operacionales que los usados durante el desarrollo del mtodo.
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El objetivo es asegurar que el mtodo producir los mismos resultados cuando muestras similares son analizadas una vez que la fase de desarrollo del mtodo ha terminado. Dependiendo del tiempo y los recursos, el mtodo puede ser probado en el mismo laboratorio, en diferentes das, por diferentes analistas y en diferentes instrumentos. La precisin en el mtodo analtico puede ser parcialmente asegurada con unas buenas especificaciones para la idoneidad del sistema.
Indica la capacidad del mtodo analtico para dar resultados lo ms prximos posibles al valor real. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor real es pequea, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados o sistemticos que deberan corregirse. Matemticamente la exactitud se expresa como el porcentaje de recuperacin de la cantidad de analito presente en la muestra. Estadsticamente suele efectuarse un test de student para determinar si el valor medio hallado y el valor considerado como verdadero no difieren significativamente para un grado de probabilidad del 95 % con n 1 grados de libertad. Normalmente se calcula para todos los niveles de concentracin.
texp =
VR X s
VR : Valor real
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S texperimental < ttablas

Indica que el mtodo analtico tiene la exactitud requerida . La formula anterior se puede utilizar tambin con porcentajes de recuperacin. Basta con sustituir el valor medio X por el porcentaje de recuperacin R, el valor VR por 100 y la desviacin estndar s por el coeficiente de variacin CV.
texp =
100 R CV
DETERMINACION DE LA EXACTITUD ANLISIS REPETITIVO DE UNA MUESTRA DE CONCENTRACIN UNICA CONOCIDA. La muestra, generalmente, ser un placebo al que se le aade una concentracin conocida de analito patrn. Se analiza varias veces de 6 a 10 repeticiones y se evala la exactitud por uno de los siguientes mtodos. Los resultados expresados como porcentaje de recuperacin y se efecta con una prueba t de Student. Se pueden comparar los resultados del placebo con analito, con los del analito solo a la misma concentracin. ( Comparing two-samples en el STATGRAPHICS).
ANALISIS REPETITIVO DE VARIAS MUESTRAS DE CONCENTRACIONES DIFERENTES CONOCIDAS. Si la proporcin de analito en la muestra varia notablemente (rango amplio) o se requiere un estudio de exactitud riguroso, deber evaluarse este parmetro para diferentes concentraciones del analito. Un diseo habitual utiliza 3 concentraciones (alta, media, baja) dentro del rango de linealidad, cada una se analiza por triplicado.
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A partir de un placebo se preparan 3 muestras por adicin de cantidades exactas de analito correspondiente a cada nivel de concentracin. Calcular el porcentaje hallado Calcular la media del porcentaje hallado s Varianza Para determinar si el factor concentracin tiene alguna influencia en los resultados, se utiliza una prueba de igualdad de varianzas para varios grupos de muestras del mismo tamao. Utilizando la prueba G de COCHRAN
Gexp =
____S2max___________ S2 1 + S2 2 + S2 3
K=3 n=3
Gtablas con p= 0.05 Gexp

<
Gtablas
Significa que las varianzas de las 3 concentraciones utilizadas son equivalentes (iguales). El factor concentracin no influye en la variabilidad de los resultados. Para hallar si la exactitud es aceptable, se expresan los resultados como porcentaje de recuperacin y se aplica una prueba t de Student.
texp =
100 R CV
S texp < ttablas
No hay diferencia significativa, confirmando la buena exactitud del mtodo.
Es la capacidad de un mtodo analtico de registrar ligeras variaciones de concentracin.

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SENSIBILIDAD DE CALIBRADO Es la igual a la pendiente de la recta de calibracin. SENSIBILIDAD ANALITICA Es la sensibilidad de calibrado dividida por la desviacin estndar de la respuesta. Mientras que la sensibilidad de calibrado es constante, dentro de un intervalo determinado, la sensibilidad analtica varia con la concentracin del analito, puesto que la precisin cambia con la cantidad de analito presente en la muestra.
Es la menor concentracin o cantidad de analito detectable con razonable certeza por un procedimiento analtico, pero no necesariamente cuantificado. Un resultado positivo no es suficiente para que el analista considere como detectado un analito. Se requiere conocer el lmite de deteccin en las condiciones del mtodo. De lo contrario se puede incurrir en un falso positivo.
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El lmite de deteccin es un parmetro de gran inters en ensayos lmite, anlisis de trazas, contaminantes y productos de degradacin. Los trminos cualitativos ( menor cantidad detectable) del tipo ausencia de o resultado negativo (no detectado), tienen su expresin numrica en el lmite de deteccin. Es ms correcto expresar menos de 1 ppm de que no ausencia de . DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN BASADO EN LA EVALUACIN VISUAL Puede ser usado tanto para mtodos no instrumentales como instrumentales. El lmite de deteccin es determinado por el anlisis de muestras de concentraciones conocidas del analito. BASADO EN LA RELACIN SEAL / RUIDO Para mtodos instrumentales donde la lnea base presenta ruido. Se compara la respuesta del blanco de la muestra, con la respuesta de muestras preparadas por la adicin de pequeas cantidades de analito al blanco. Para ello primero se obtiene el nivel medio de ruido del blanco, y se multiplica por 2 o 3 para el lmite de deteccin, estos valores se comparan con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallndose finalmente la concentracin de analito que corresponde al valor de la seal. ESTIMACIN DEL LMITE DE DETECCIN MEDIANTE EL VALOR DE LA ORDENADA EN EL ORIGEN Si la recta de calibracin del ensayo de linealidad (Y = bX + a) se ha confeccionado con un rango de concentraciones bajo (0 a 25 %), se admite utilizar el valor del intercepto para estimar, aproximadamente, el lmite de deteccin expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de calibracin.
LMITE DE = 3 a___ DETECCIN b ANALISIS REPETIDO DEL BLANCO EN LA MUESTRA
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Se analizan una serie de blancos de la muestra ( n 10) y se calcula la media Y y la desviacin estndar s de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores, existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad ( pendiente de la recta de calibracin b). Las frmulas a utilizar varan en funcin del procedimiento: Mtodos con correccin de lectura frente al blanco Este es el caso de muchos procedimientos espectroscpicos (UV / VIS) en los que la lectura de la muestra se obtienen por comparacin con un blanco. LMITE DE = 3 s DETECCIN b Mtodos sin correccin de lectura frente al blanco Este es el caso de los procedimientos cromatogrficos (GC, HPLC ) . LMITE DE = Y + 3 s DETECCIN b El grado de ajuste de la recta de calibracin: si el ajuste es defectuoso intervienen las desviaciones estndar de la pendiente sb y del trmino independiente sa Las frmulas anteriores slo son vlidas si la mayor fuente de error es la desviacin estndar del blanco s, es decir si: s >> sa y sb Cuando los tests de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibracin revelan falta de ajuste hay que sustituir la desviacin estndar del blanco s en las frmulas anteriores por la siguiente expresin:
Esta expresin tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo. Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimacin obtenida con esta frmula ser poco confiable; al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar el lmite de deteccin por un mtodo que tenga menos trabajo experimental ( relacin seal/ruido).
s 2 + sa2 + ( a )2 sb2 b
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DEL NMERO DE RPLICAS QUE SE EFECTAN AL ANALIZAR LA MUESTRA PROBLEMA. Si en el mtodo analtico se efecta la medicin final por duplicado o triplicado, disminuye la incertidumbre de la medicin y mejora la precisin. Por ste motivo el lmite de deteccin es menor y se introduce el factor 1 / n. n: nmero de mediciones en las frmulas anteriores. LMITE DE = 3 s DETECCIN b
___1___
n
LMITE DE = Y + 3 s DETECCIN b
__1___
n
DETERMINACION POR EXTRAPOLACION A CONCENTRACION CERO DE MUESTRAS QUE CONTIENEN BAJAS CONCENTRACIONES DE ANALITO. En primer lugar y partiendo de las respuestas de cada concentracin, se extrapolar grfica o matemticamente la respuesta para concentracin cero, la cual se tomar como estimacin de un blanco hipottico Y. A continuacin, se determinar la desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero, extrapolacin grfica o matemtica, la cual se tomar como estimacin de la desviacin estndar de la respuesta de un hipottico blanco s . Conociendo Y y s se aplicarn las frmulas anteriores segn el caso.
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Es la menor concentracin o cantidad de analito que puede ser determinada con aceptable precisin y exactitud bajo las condiciones experimentales establecidas. Es un trmino cuantitativo que expresa la menor cantidad medible. DETERMINACIN DEL LMITE DE CUANTIFICACIN BASADO EN LA EVALUACIN VISUAL Puede ser usado tanto para mtodos no instrumentales como instrumentales. El lmite de cuantificacin es determinado por el anlisis de muestras de concentraciones conocidas del analizo. BASADO EN LA RELACIN SEAL / RUIDO Para mtodos instrumentales donde la lnea base presenta ruido. Se compara la respuesta del blanco de la muestra, con la respuesta de muestras preparadas por la adicin de pequeas cantidades de analito al blanco. Para ello primero se obtiene el nivel medio de ruido del blanco, y se multiplica por 10 para el lmite de cuantificacin, estos valores se comparan con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallndose finalmente la concentracin de analito que corresponde al valor de la seal. ESTIMACIN DEL LMITE DE CUANTIFICACIN MEDIANTE EL VALOR DE LA ORDENADA EN EL ORIGEN Si la recta de calibracin del ensayo de linealidad (Y= bX + a) se ha confeccionado con un rango de concentraciones bajo (0 a 25%), se admite utilizar el valor del intercepto para estimar, aproximadamente, el lmite de cuantificacin expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de calibracin.
LMITE DE
= 3
a___
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CUANTIFICACIN
ANALISIS REPETIDO DEL BLANCO EN LA MUESTRA Se analizan una serie de blancos de la muestra ( n 10) y se calcula la media Y y la desviacin estndar s de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores, existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad (pendiente de la recta de calibracin b). Las frmulas a utilizar varan en funcin del procedimiento: Mtodos con correccin de lectura frente al blanco Este es el caso de muchos procedimientos espectroscpicos (UV / VIS) en los que la lectura de la muestra se obtienen por comparacin con un blanco. LMITE DE = CUANTIFICACIN 10 s b
Mtodos sin correccin de lectura frente al blanco Este es el caso de los procedimientos cromatogrficos (GC, HPLC). LMITE DE = CUANTIFICACIN Y + 10 s b
El grado de ajuste de la recta de calibracin: si el ajuste es defectuoso intervienen las desviaciones estndar de la pendiente sb y del trmino independiente sa Las frmulas anteriores slo son vlidas si la mayor fuente de error es la desviacin estndar del blanco s, es decir si: s >> sa y sb Cuando los tests de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibracin revelan falta de ajuste hay que sustituir la desviacin estndar del blanco s en las frmulas anteriores por la siguiente expresin:
s 2 + s a 2 + ( a ) 2 s b2 b
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Esta expresin tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo. Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimacin obtenida con esta frmula ser poco confiable; al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar el lmite de cuantificacin por un mtodo que tenga menos trabajo experimental ( relacin seal/ruido). DEL NMERO DE RPLICAS QUE SE EFECTAN AL ANALIZAR LA MUESTRA PROBLEMA. Si en el mtodo analtico se efecta la medicin final por duplicado o triplicado, disminuye la incertidumbre de la medicin y mejora la precisin. Por ste motivo el lmite de cuantificacin es menor y se introduce el factor 1 / n. n: nmero de mediciones en las frmulas anteriores. LMITE DE = CUANTIFICACIN LMITE DE = CUANTIFICACIN 10 s b Y + 10 s b
___1___
n
___1___
n
DETERMINACION POR EXTRAPOLACION A CONCENTRACION CERO DE MUESTRAS QUE CONTIENEN BAJAS CONCENTRACIONES DE ANALITO. En primer lugar y partiendo de las respuestas de cada concentracin, se extrapolar grfica o matemticamente la respuesta para concentracin cero, la cual se tomar como estimacin de un hipottico blanco Y. A continuacin, se determinar la desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero, extrapolacin grfica o matemtica, la cual se tomar como estimacin de la desviacin estndar de la respuesta de un hipottico blanco s . Conociendo Y y s se aplicarn las frmulas anteriores segn el caso.
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Es una medida de la capacidad de un mtodo analtico, para permanecer inafectado por pequeas variaciones deliberadas en los parmetros del mtodo y que dan indicacin de su confiabilidad durante el uso normal. Para ello se introducen deliberadamente variaciones razonables en la condiciones experimentales y se observa su influencia. Por lo general, no se estudia cada variable una a una sino que se introducen varios cambios a la vez de forma que se puedan investigar los efectos de cada uno de ellos. Con un programa cuidadosamente planificado se pueden investigar muchas variables con pocas determinaciones. Aquellos factores que ejerza un efecto dominante sobre la variacin de los resultados debern ser objeto de un control riguroso en el mtodo analtico. Para los que se expresan numricamente ( temperaturas, flujos, pH, tiempos) se indicaran el rango de trabajo. Las variables cualitativas ( calidades de material y reactivos) debern definirse detalladamente. Uno de los principales factores a tener en cuenta, que muchas veces justifica por si solo la realizacin de un estudio de robustez, es la evaluacin de la estabilidad del analizo en la solucin de medida, para determinar el periodo de tiempo que puede conservarse antes de proceder a su anlisis sin comprometer la precisin. Este estudio es especialmente importante cuando se realizan anlisis de series grandes de muestras y el tiempo transcurrido entre el primer anlisis y el ultimo es largo, o bien cuando se han recogido distintas muestras a lo largo de un cierto periodo de tiempo y se pretende analizar el analizo en todas ellas al final de
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dicho periodo. Normalmente este estudio de estabilidad se realiza a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo de 24 horas. Para disear un estudio de robustez con varios factores de variabilidad se puede recurrir al esquema de Youden y Steiner. La tabla de Youden y Steiner otorga dos valores a siete factores diferentes. En maysculas aparecen los valores normales para cada factor ( A,B,C,D,E,F,G) y en minsculas los valores alternativos (a,b,c,d,e,f,g). Se efectan 8 anlisis de la muestra y cada anlisis es una combinacin diferente de los factores. Para cada factor existen 4 combinaciones ( AAAA) y 4 combinaciones ( aaaa). Los resultados se indican por las letras s,t,u,v,w,x,y,z. La comparacin de las medias de los resultados revela en efecto, de cambiar el valor normal por el alternativo. Por ejemplo, el efecto de cambiar el factor A por a se determina restando la media(s + t + u + v )/4 de la media ( w + x + y + z) /4. Ocho combinaciones de siete factores en un estudio de robustez. 1 2 3 4 5 6 7 8 A B C D E F G s A B c D e f g t A b C d E f g u A b c d e F G v a B C d e F g w a B c d E f G x a b C D e f G y a b c D E F g z
E A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g RESULTAD O
F : FACTOR
E : ENSAYO DIFERENCIAS PARA CADA FACTOR
VA VB VC VD VE VF
= = = = = =
( s + t + u + v) ( s + t + w + x) ( s + u + w + y) ( s + t + y + z) ( s + u + x + z) ( s + v + w + z)
(w+x+y+z) (u + v + y + z ) (t+v+x+z) (u+v+w+x) (t+v+w+y) (t+ u+x+y)
= = = = = =
Aa Bb Cc Dd Ee Ff
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VG = ( s + v + x + y) ( t + u + w + z ) =
Gg
A continuacin se hace una lista de estas diferencias ordenndolas de mayor a menor. Puede ocurrir que existan una o dos diferencias claramente superiores, lo cual significa que los respectivos factores ejercen una influencia dominante sobre la precisin de los resultados y debern ser objeto de un control riguroso en el mtodo analtico. Para decidir si un factor tiene una influencia importante, suele compararse el valor hallado en el cuadro de diferencias (V A, VB, VC, VD, VE, VF, VG ) con la expresin S2 siendo S el valor de la desviacin estndar hallada en el estudio de repetibilidad. Las diferencias (V A, VB, VC, VD, VE, VF, VG ) superiores en valor absoluto a S 2 se consideran significativas. Cuando el numero de variables a estudiar es inferior a 7 se puede utilizar igualmente el cuadrado de Youden y Steiner aplicando una ligera modificacin. Supongamos que solo se estudian 6 variables y queda por determinar, por tanto, los valores de los factores G y g. Al factor g se le asocia una operacin sin sentido analtico y al factor G la omisin de esta operacin. . Las diferencias entre G y g, lgicamente, deben ser irrelevantes.
Es el grado de reproducibilidad de los ensayos de prueba obtenidos por anlisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones normales de ensayo, tales como diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, diferentes lotes de reactivos, diferentes tiempos parciales, diferentes temperaturas, diferentes das, etc. Es normalmente expresada como la falta de influencia de los resultados de pruebas de variables operacionales y ambientales del mtodo analtico.*** Es una medida de la reproducibilidad de los resultados bajo condiciones operacionales normales de laboratorio a laboratorio y de analista a analista.
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Es determinada por anlisis de alicuotas de lotes homogneos en diferentes laboratorios, por diferentes analistas, usando condiciones operacionales y ambientales que pueden diferir pero estn aun dentro de los parmetros especificados para el ensayo. El grado de reproducibilidad de los resultados de la prueba son luego determinados como una funcin de las variables del ensayo. Esta reproducibilidad puede ser comparada a la precisin del ensayo bajo condiciones normales para obtener una medida de la tolerancia del mtodo analtico.

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VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS.

ESPECIFICIDAD LINEALIDAD RANGO PRECISION EXACTITUD LIM. DETECCION LIMITE CUANTIFICACIO N

ECUACION DE LA LINEA RECTA Y = bX + a

H0 : No existe correlacin entre X y Y.

t experimental > t tabla

S2y,x = _Y2 - a Y - b_XY

( VARIANZA DEL EXPERIMENTAL

S2b = ______ S2y,x _________ _

Sb rel (%) = Sb x 100

t experimental > t tabla

Sa rel (%) = Sa x 100 a

t experimental > t tabla

105 110 115 101 101.5 102

n=1 1.9 3.9 5.8 0.39 0.58 0.77

n=2 2.7 5.5 8.2 0.55 0.82 1.09

n=3 3.3 6.7 11.6 0.67 1.00 1.33

n=4 3.8 7.8 11.6 0.78 1.16 1.54

n=5 4.2 8.7 12.9 0.87 1.30 1.72

Estos lmites son orientativos y no deben interpretarse rgidamente.

S texperimental < ttablas

Gtablas con p= 0.05 Gexp

S texp < ttablas

No hay diferencia significativa, confirmando la buena exactitud del mtodo.

Es la capacidad de un mtodo analtico de registrar ligeras variaciones de concentracin.

LMITE DE = 3 a___ DETECCIN b ANALISIS REPETIDO DEL BLANCO EN LA MUESTRA

E A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g RESULTAD O

E : ENSAYO DIFERENCIAS PARA CADA FACTOR

(w+x+y+z) (u + v + y + z ) (t+v+x+z) (u+v+w+x) (t+v+w+y) (t+ u+x+y)

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S2b = S2y,x ___ _