NJBG FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS PRCTICA N:02 COLORACIN GRAM

NOMBRE DEL DOCENTE: AMELIA CASTRO GAMERO NOMBRE DE LA ALUMNA: VERENIS MILAGRO ROBLES CALIZAYA CGIGO: 08-31985 LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL Y DE ALIMENTOS AO DE ESTUDIOS: 3 AO GRUPO: DA LUNES DE 11:00 13:00 FECHA DE REALIZACIN DE LA PRCTICA: 24/05/10 TACNA PER

2010
PRCTICA N 02 COLORACIN GRAM

I.

INTRODUCCIN: La coloracin Gram ha constituido, desde los albores de la bacteriologa, un elemento fundamental para la taxonoma e identificacin. Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador Dans Christian Gram, pasaron muchos aos durante los cuales se efectuaron las ms variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloracin. El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, tanto en el aspecto fsico como en su composicin molecular que fueron logradas a partir de la dcada del sesenta, demostr que la coloracin Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y los Gram negativas, que encima de esta, presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacridos lipopretena, denominada membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisionesen sistemtica bacteriana: las que no la poseen, Firmicutes (Gram +) y las que s, Gracilicutes (Gram -). La diferencia entre ambos grupos es de enorme importancia taxonmica. Esta coloracin permite la clasificacin, de las bacterias en GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS SEGN LA COMPOSICIN DE SU PARED CELULAR. Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias gram positivas no pueden ser removidos con el agente decolorante que es el alcohol acetona.

La clula permanece de color azul violeta, en cambio las bacterias gram negativas, al decolorarse con el alcohol acetona, se dejan colorear con la fuscina safranina, quedando de color rosado.

II.

OBJETIVOS: Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de las bacterias. Distinguir las bacterias gram positivas de las gram negativas. Conocer la tcnica de tincin gram, conocer el procedimiento y observar las bacterias en el microscopio clasificndolas en gram positivas y gram negativas.

III.

FUNDAMENTO TEORICO:

QU SON LAS BACTERIAS? Son organismos diminutos que estn prcticamente por todas partes. En ocasiones manifiesta su presencia heridas que se infecten, leche que se corta, carne que se pudre normalmente no nos percatamos de su presencia porque sus actividades son menos obvias y debido a su pequeo tamao. La propia existencia de las bacterias fue desconocida hasta el desarrollo del microscopio en el siglo XVII. LA TINCIN: Se utiliza frecuentemente para detectar, clasificar o identificar bacterias, o para observar componentes especficos de las bacterias; en la mayor parte de los casos las clulas mueren y se fijan antes de ser teidas. Los colorantes, se aplican normalmente sobre una fina capa de clulas en un portaobjeto de microscopio.

Las tinciones se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El mtodo, por consiguiente, es bastante drstico y puede producir artificios. Las tinciones bsicas tien uniformemente en las clulas bacterianas, a menos que antes de destruyan el ARN del citoplasma. Tambin se pueden usar tcnicas de tincin especiales para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, grnulos, nucletidos y esporas.

LA TINCIN DE GRAM: Una caracterstica taxonmica importante de las bacteria es su respuesta a la tincin a de Gram esta caracterstica parece ser fundamental, reaccin a la tincin se correlaciona a con muchas otras propiedades morfolgicas en maneras relacionadas filogenticamente. El procedimiento para tincin de Gram se inicia con la aplicacin de un colorante bsico el cristal de violeta. Luego se aplica una solucin de yodo en este momento todas las bacterias de tien de azul. Continuacin las clulas se tratan con alcohol las clulas grampsitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran completamente por el alcohol. Por ltimo se aplican un colorante de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera, las clulas gramnegativas, previamente descoloradas, toman el colorante de contraste y las clulas grampositivas ahora aparecen prpura. La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica diferencial es una de las de uso ms comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna otra solucin de contraste conveniente. Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje ms alto de lpidos que de las bacterias grampositivas. Las paredes celulares de la bacterias gramnegativas son tambin ms delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lpidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular gramnegativa.

IV.

EQUIPOS Y MATERIALES:

1. Microscopio 2. Asa de inoculacin 3. Lminas de vidrio 4. Alcohol Acetona o alcohol 95 5. Solucin de cristal violeta 6. Solucin de lugol 7. Solucin de safranina 8. Aceite de cedro 9. Cultivos de streptococcus thermophilus, bulgaricus y saccharomyces cerevisiae. lactobacillus

V.

PREPARACION DEL REACTIVO:

1. SOLUCIN DE CRISTAL VIOLETA: COMPOSICIN: Cristal violeta 2gr. Alcohol etlico a 95%.... 20ml. Oxalato amnico 0.8 ml. Agua destilada 80 ml.

PREPARACIN:

Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amnico en el agua destilada. Mezclar las dos soluciones y esperar 24 horas antes de utilizar la mezcla.

2. SOLUCIN DE YODO: COMPOSICIN. Yodo 1gr. Yoduro de potsico 2gr. Agua destilada 100ml.

PREPARACIN: Triturar el yoduro de potsico y el yodo junto en un mortero aadiendo sucesivamente pequeas cantidades de agua durante la operacin. Pasar la solucin a un matraz volumtrico y enjuagar el mortero completando el volumen a 100 ml. NOTA: Puede utilizarse tambin la modificacin de Gram de la solucin de yodo de lugol. Esta solucin es la misma que la de Burke, excepto que la cantidad de agua es de 300 ml. En lugar de 100 ml.

3. COLORACIN DE CONTRASTE: COMPOSICIN: Safranina 0.25gr. Alcohol etlico 10 ml. Agua destilada 100 ml.

PREPARACIN: Disolver la safranina en el alcohol y mezclar la solucin resultante con el agua destilada.

VI.

PROCEDIMIENTO: 1. Limpie dos lminas portaobjetos. Realizar en cada una un frotis de los cultivos indicados.

2. Secar al mechero Bunsen a una temperatura moderada, pasando varias veces la lmina por la llama hasta que toda el agua sea evaporada.

3. Recubrir la lmina con la solucin de cristal violeta por 1 minuto.

4. Lavar suavemente con agua.

5. Recubrir con la solucin de lugol por 1 minuto. Eliminar el exceso.

6. Lavar suavemente con agua.

7. Decolorar con alcohol acetona.

8. Lavar con agua para eliminar el alcohol - acetona residual.

9. Recubrir la lmina de safranina por 30 segundos.

10. Lavar suavemente con agua.

11. Secar con papel filtro o al calor del mechero.

12. Observar al microscopio con el objetivo se inmersin. (Emplear aceite de cedro).

VII.

OBSERVACIONES:

Se aplic el procedimiento con cada muestra, procurando controlar bien el tiempo y se pudo observar en el microscopio lo siguiente: Las formas que presentan pueden ser:
BACTERI

COCO

Levadura Fleischmann de pan:

YOGURT NO PROBITICO: Cepa para yogurt leche tibia. Cultivo normal, sin probitico.

YOGURT PROBITICO: microorganismo vivo cuya ingestin es beneficiosa para la salud. Principalmente, son bacterias cidas lcticas, llamadas as por producir cido lctico y la mayora se incluyen en los gneros Lactobacillus o Bifidobacterium.

SALMUERA DE ACEITUNA:

VIII.

CONCLUSIONES: Todos las muestras que utilizamos son gram positivas, por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias gram positivas no pueden ser removidos con el agente decolorante que es el alcohol acetona. La clula permanece de color azul violeta. Se observo en la leche no prebitico: mayormente cocos en forma de cadenas y algunos bacilos. En el yogurt probitico se observo cocos y bacilos En el caso de la aceituna se observo con gran diferencia, los bacilos. En la levadura del pan se observo con gran claridad los cocos, en una muestra estuvieron esparcidas y en otras agrupadas.

IX.

RECOMENDACIONES: Utilizar correctamente los materiales en esta tcnica de tincin. Mantener el orden y la limpieza para no cometer errores.

X.

BIBLIOGRAFIA:

 PAUL SINGLETON, BACTERIAS EN BIOLOGIA, BIOTECNLOGIA Y MEDICINA, -EDICIN LENGUA ESPAOLA EDITORIAL ACRIBIA ZARAGOZA 2004. R. DAS, C. GAMAZO, I. LOPEZ GOI de microbiologa. Manual prctico

REFERENCIAS EN PG WEB:

http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/ColoracionGR AMv2.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion. html