ISOLAMENTO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS

Na grande maioria das vezes, para que se possa identificar com segurana o agente etiolgico de uma doena, faz-se necessrio dispor desse organismo, sob forma de cultura pura em meio artificial. Uma vez dispondo da cultura pura, estudos sero feitos sbre sua patogenicidade, anatomia, fisiologia, ecologia, etc., facilitando sua identificao e caracterizao. O isolamento de bactrias fitopatognicas demanda especiais cuidados de assepsia pois o nmero de operaes envolvidas grande e bactrias saprfitas acham-se quase sempre presentes associada ao tecido doente, principalmente nas leses mais velhas.

PROCEDIMENTO

O material deve ser coletado (rgo vegetal ou planta inteira) nos estgios iniciais da infeco. Leses velhas devem ser evitadas, pois nelas abundam fungos e bactrias saprfitas que mascaram e comprometem o sucesso do isolamento. O transporte de material do campo para o laboratrio deve ser rpido e em recipientes de papel. O uso de sacos plsticos proporciona um ambiente super-mido, altamente favorvel ao desenvolvimento de organismos saprfitas. BDA, o meio universalmente utilizado em fitopatologia, presta-se bem a esta finalidade, embora outros meios, mais ricos e mais completos ofeream melhores condies para bom desenvolvimento da bactria isolada. O meio que tm-se mostrado bom para crescimento da maioria das bactrias fitopatognicas, o meio 523 de Kado e Heskett cuja composio a seguinte:

Sacarose Casena cida hidrolisada Extrato de levedura K2HPO4 (anidro) MgSO4.7H2O Agar gua destilada

10,0 g 8,0 g 4,0 g 2,0 g 0,3 g 5,0 g 1000 ml

ISOLAMENTO DE FOLHAS

Esquema para o isolamento de bactrias em folhas

- Escolha leses tpicas e recentes. Destaque pequenos fragmentos do tecido lesionado (zona de transio), com o auxlio de uma tesoura, gillette ou bistur. Coloque esses fragmentos dentro de um recipiente contendo etanol (50%) durante 30 segundos, a fim de evitar a formao de bolhas de ar em sua superfcie quando tratadas pelo desinfetante; - Com o auxlio de uma pina, passe-os a soluo desinfetante (NaClO - 2%) durante 3 minutos, o tempo de desinfestao varia

de acrdo com a consistncia e espessura do material. O volume de desinfetante deve ser pelo menos cinco vezes maior que o material a desinfestar;

- Decorrido o tempo para esterilizao superficial dos tecidos, transfira os fragmentos (pina flambada) para gua destilada estril (retirar o excesso de desinfetante), pelo menos 3 vezes (recipientes diferentes), aps retireos colocando os mesmos em placa de Petri (esterilizada) vazia; - Pegue lamina escavada e coloque uma gota de soluo salina na cova. Retire um ou mais fragmentos da placa e coloque-os sbre a cova, com o auxlio de uma pina e bisturi corte os fragmentos em pedaos menores;
- Com um basto de vidro, macere esses fragmentos que esto na

lamina at formar uma suspenso bacteriana; - Aps a macerao, com basto de vidro, transfira uma gota da suspenso para placa(s) de Petri com meio de cultura apropriado, pelo mtodo de estrias ou risca; - Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27C; - 24 a 48 horas aps o semeio, repique colnias bem isoladas, para tubos de cultura. As colnias que surgem com 24 horas ou menos so geralmente, de bactrias saprfitas.

ISOLAMENTO DE SEMENTES
- Colocar 100 sementes dentro de um recipiente contendo etanol 96% durante 30 minutos, aps esse perodo, retirar as sementes e, coloc-las dentro de um bequer contendo o desinfetante (hipoclorito de sdio - 2%) por 10 minutos. Enxaguar as sementes pelo menos 3 vezes em gua estril; - Dividir as sementes em grupos de 25 e coloc-las em 4 placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa 0,75 ml de soluo salina; - Incubar a 25 - 27C durante 24 bactrias das sementes; - Aps este perodo, com o auxlio de um basto de vidro, transfira uma gota, de cada placa, da suspenso bacteriana formada, para placas de Petri, contendo meio apropriado, pelo mtodo de estrias; - 48 horas, para extrair as

- Etiquete as placas, inverta-as e incube-as a 25 - 27C; - 24 - 48 horas aps o semeio, repique colnias bem isoladas para os tubos de cultura.

ISOLAMENTO DE SOLO
- Preparar 10 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de soluo salina; - Pesar 1 grama de solo, peineirado, e colocar em um recipiente

contendo 100 ml de soluo salina. Agitar para perfeita homogeinizao durante 5 minutos; - Com uma pipeta esterilizada, transfira 1 ml desse recipiente para um dos tubos com 9 ml de soluo salina. Agitar durante 1 minuto, desse ltimo transferir, com pipeta esterilizada, para outro com 9 ml e assim sucessivamente at a diluio desejada; - Aps, transfira uma gota do tubo para placa(s) de Petri, contendo meio apropriado, pelo mtodo de estrias; - Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27C; - 24 a 48 horas aps o semeio, repique colnias bem isoladas para os tubos de cultura. OBS: Essa tcnica tm o inconveniente de se formarem numerosas colnias de fungos e bactrias que vivem no solo e, na grande maioria no fitoparasitas. Por isso, para o isolamento de fitopatgenos que, vivendo no solo, infectam as plantas hospedeiras quando ainda na fase de muda, penetrandoas atravs de suas partes hipgeas, poder-se- empregar a tcnica seguinte: semear em terra infectada, sementes sadias e desinfestadas, e aguardar o aparecimento de sintomas nas mudinhas e, isolar delas o patgeno.

ISOLAMENTO DE FEIXES VASCULARES

- Para este tipo de isolamento o mtodo o mesmo descrito para folhas. Porm, os fragmentos de tecidos infectados do caule devem ser de 3 a 4 cm.

ISOLAMENTO DE TUMORES
As bactrias indutoras de galhas podem ser fcilmente isoladas

de leses novas, ou provenientes de caules tenros, atravs do mtodo descrito para folhas. Entretanto, o mesmo no ocorre quando os isolamentos so

feitos apartir de galhas duras, ou, desenvolvidas em caules lenhosos. Para tal corta-se a galha em V e, inocula-se em plantas tenras, apartir dessa ento executa-se o isolamento.

Mtodo do semeio de bactrias em listra ou risca