Eal HP DissertPDF Turma2004 DissertThaisFontoura2006

URI CAMPUS DE ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CINCIAS AGRRIAS

PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Produo de lipases por
fermentao em estado slido e fermentao submersa
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo

Thas da Luz Fontoura Pinheiro

Dissertao de Mestrado submetida ao Programa
de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-
Campus de Erechim, como requisito parcial
obteno do grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, rea de concentrao: Engenharia de
Alimentos, da Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Misses URI - Campus de
Erechim.

ERECHIM, RS BRASIL
MARO DE 2006

ii

Dedico esta conquista ao meu grande amor
Daniel, pela sua compreenso, incentivo e todas
as alegrias que sempre me deu.

iii
AGRADECIMENTOS

A Deus pelo amparo constante.
Aos meus pais, Odete e Edina, pelo incentivo e amor demonstrados em
todos os momentos.
s minhas irms, Angelita e Marta, e madrinha Celi por todo o apoio que
me deram.
s minhas orientadoras, Prof. Dbora de Oliveira e Prof. Helen Treichel,
pela oportunidade de realizar este trabalho, pelo imenso aprendizado durante o
trabalho de pesquisa, pela pacincia e rigor com os meus erros, pelo carinho e
compreenso, e tambm pelos conselhos dispensados em um perodo difcil da
minha vida.
Ao Prof. Marco Di Luccio por todas as contribuies a este trabalho e
minha formao e por ter me ajudado a chegar at aqui.
Prof. Francine Padilha e Prof. Rogrio Cansian por toda a ateno
dispensada e por todo o conhecimento que me transmitiram.
Prof. Denise Freire por ter cedido o fungo Penicillium verrucosum para o
desenvolvimento desta pesquisa.
Aos amigos da Central de Materiais por me auxiliarem sempre que
necessrio.
s colegas Ndia e Aniela pelo desenvolvimento de parte do trabalho e por
terem me ensinado muito sobre fermentao.
minha querida Geciane, pelo carinho que me recebeu e por todo o
conhecimento que me transmitiu.
inesquecvel J, pelas palavras de incentivo e ombro amigo sempre
oferecido nas horas em que eu mais precisava.
bolsista Natlia, pela colaborao com este trabalho e pela
disponibilidade em me ajudar.
Ao Lindomar, por toda a contribuio tcnica que deu esta dissertao.
s queridas colegas Patrcia e Stephani, pela amizade, companheirismo e
pelo apoio emocional e tcnico concedido durante todo este perodo.
iv
querida amiga Silvana, por ter contribudo enormemente com este
trabalho, compartilhando interesses, atividades, preocupaes e alegrias.
Aos demais colegas e amigos do Curso de Mestrado em Engenharia de
Alimentos da URI-Campus de Erechim e do Laboratrio de Biotecnologia de
Alimentos, pelos momentos de alegria e descontrao, e pelas experincias
compartilhadas.
grande amiga Potira, pela amizade e pelo auxlio prestado durante
momentos difceis.
URI-Campus de Erechim e ao Departamento de Engenharia de Alimentos
pelo apoio no desenvolvimento do projeto e por possibilitarem a minha formao.

v
SUMRIO

RESUMO ...............................................................................................................xiii
ABSTRACT............................................................................................................xiv
1 INTRODUO....................................................................................................1
2 REVISO BIBLIOGRFICA...............................................................................4
2.1 Definio de lipases........................................................................................4
2.2 Fontes de lipases............................................................................................5
2.3 Vantagens e aplicaes das lipases microbianas...........................................5
2.3.1 Indstria de alimentos...............................................................................7
2.3.2 Indstria oleoqumica................................................................................7
2.3.3 Indstria de detergentes...........................................................................8
2.3.4 Indstria farmacutica..............................................................................8
2.3.5 Tratamento de efluentes..........................................................................9
2.4 Produo de lipases microbianas.................................................................10
2.5 Formas de produo de lipases....................................................................13
2.5.1 Fermentao em estado slido..............................................................13
2.5.2 Fermentao submersa..........................................................................19
2.6 Caracterizao de lipases.............................................................................22
2.7 Consideraes finais.....................................................................................23
3 MATERIAL E MTODOS..................................................................................24
3.1 Materiais........................................................................................................24
3.1.1 Reagentes e meios de cultura.................................................................24
3.1.2 Equipamentos..........................................................................................24
3.2 Mtodos.......................................................................................................25
3.2.1 Fermentao em Estado Slido............................................................ 26
3.2.1.1 Microrganismo............................................................................... 26
3.2.1.2 Inculo............................................................................................26
3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................27
3.2.1.4 Preparo das amostras....................................................................27
3.2.1.5 Mtodos Analticos.........................................................................28
vi
3.2.1.6 Estudo da produo de lipases......................................................31
3.2.1.7 Caracterizao da lipase obtida por fermentao em estado
slido..............................................................................................35
3.2.2 Fermentao Submersa.........................................................................36
3.2.2.1 Microrganismo................................................................................36
3.2.2.2 Inculo............................................................................................36
3.2.2.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................37
3.2.2.4 Preparo das amostras....................................................................37
3.2.2.5 Mtodos Analticos.........................................................................37
3.2.2.6 Estudo da produo de lipases......................................................40
3.2.2.7 Caracterizao das lipase obtida por fermentao
submersa........................................................................................43
4 RESULTADOS E DISCUSSO. ......... ............................................................44
4.1 Caracterizao dos substratos e indutores..................................................44
4.2 Fermentao em Estado Slido...................................................................45
4.2.1 Estudo do indutor........ ...........................................................................45
4.2.2 Estudo do inculo ideal...........................................................................48
4.2.3 Avaliao da concentrao de suplemento na produo de lipases por
fermentao em estado slido............................................................... 49
4.2.4 Otimizao da produo de lipase por fermentao em estado
slido......................................................................................................51
4.2.5 Cintica de produo de lipase para a condio otimizada...................54
4.2.5.1 Avaliao dos parmetros cinticos.................................................56
4.2.6 Caracterizao parcial da lipase produzida por fermentao em estado
slido......................................................................................................57
4.2.6.1 Temperatura e pH timos...............................................................58
4.2.6.2 Temperatura de estabilidade..........................................................60
4.2.6.3 Influncia do pH no estudo da estabilidade da lipase................... 63
4.2.7 Consideraes finais............................................................................. 64
4.3 Fermentao Submersa...............................................................................65
4.3.1 Estudo do indutor....................................................................................65
vii
4.3.1.1 Produo de Biomassa...................................................................68
4.3.2 Otimizao da produo de lipase por fermentao
submersa................................................................................................69
4.3.2.1 Meio Sinttico.................................................................................69
4.3.2.2 Meio Industrial................................................................................76
4.3.3 Caracterizao parcial da lipase obtida por fermentao
submersa................................................................................................84
4.3.3.1 Meio Sinttico.................................................................................84
4.3.3.2 Meio Industrial................................................................................88
4.3.4 Consideraes finais..............................................................................90
5 CONCLUSES E SUGESTES.......................................................................91
5.1 Concluses..................................................................................................91
5.2 Sugestes para trabalhos futuros................................................................92
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................94
7 ANEXO I..........................................................................................................106

viii
NDICE DE TABELAS

Tabela 2.1. Principais aplicaes da FES na indstria alimentcia.........................17

Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados..
.....................................................................................................................25
Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 2
2

para otimizao das condies de processo por FES.................................33
Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para temperatura e pH timos da enzima obtida por FES...........................36
Tabela 3.4. Variveis e nveis estudados no planejamento experimental PB de 12
ensaios mais 3 pontos centrais para produo de lipases por FS em meio
sinttico........................................................................................................41
2
para
o meio de cultura sinttico por FS................................................................42
industrial.......................................................................................................42
3
para
o meio de cultura industrial por FS...... ......................................................43
2
para
temperatura e pH timos da enzima obtida por FS.....................................43

Tabela 4.1. Caracterizao dos substratos e indutores..........................................44
Tabela 4.2. Indutores estudados para produo de lipases por FES e suas
respectivas atividades enzimticas..............................................................46
Tabela 4.3. Anlise estatstica (Teste de Tukey) dos melhores resultados
obtidos..........................................................................................................47
Tabela 4.4. Resultados do estudo cintico para a atividade lipsica em meio basal
e PDA...........................................................................................................48
ix
Tabela 4.5. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para produo de lipases por
FES..............................................................................................................51
Tabela 4.6. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FES.......................52
Tabela 4.7. Parmetros cinticos para produo de lipase por FES utilizando
Penicillium verrucosum...............................................................................57
Tabela 4.8. Matriz do planejamento experimental completo para avaliao da
temperatura e pH timos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FES.........................................................................59
Tabela 4.9. Anlise de varincia para a atividade lipsica.....................................59
Tabela 4.10. Acompanhamento da atividade lipsica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 25C...... ....................................................61
por FES sob a temperatura de 35C............................................................61
Tabela 4.15. Valores das atividades enzimticas versus os valores de pH
estudados em FES.......................................................................................63
Tabela 4.16. Indutores estudados e suas respectivas atividades lipsicas em
FS.................................................................................................................65
Tabela 4.17. Teste de indutores para produo de lipases por FS
.....................................................................................................................67
Tabela 4.18. Produo de biomassa em funo dos indutores utilizados em
FS.................................................................................................................68
Tabela 4.19. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3
pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade
lipsica no decorrer da FS utilizando meio sinttico.................................. 70
x

Tabela 4.20. Matriz do planejamento fatorial 2
2
(valores codificados e reais) com
as respostas da atividade de lipase no decorrer da FS utilizando meio
sinttico........................................................................................................73
lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................77
3
com as respostas de atividade
lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................80
atividade de lipase por FS em meio sinttico...............................................85
Tabela 4.24. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FS.......................86
atividade de lipase por FS em meio industrial.............................................88

xi
NDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.................................11

Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES...........................................................27
Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de
fermentao.................................................................................................34

Figura 4.1. Atividade lipsica em 48 horas de fermentao para os diversos
indutores estudados por FES.......................................................................47
Figura 4.2. Cintica de produo de lipase em meio basal e PDA.........................49
Figura 4.3. Curvas cinticas de atividade lipsica em funo da concentrao de
leo de soja por FES....................................................................................50
Figura 4.4. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida por FES.............................................................................................53
Figura 4.5 Cintica de produo de lipase, protease e crescimento celular
(glicosamina) por FES..................................................................................55
Figura 4.6. Evoluo do pH e atividade protesica ao longo da
FES..............................................................................................................56
Figura 4.7. Atividade lipsica obtida por FES em funo da temperatura e
pH.................................................................................................................60
Figura 4.8. Grfico normalizado da atividade lipsica em funo do tempo e da
temperatura de exposio por FES.............................................................63
Figura 4.9. Atividade lipsica em funo do tempo e do pH de extrao da enzima
por FES........................................................................................................64
indutores estudados em FS.........................................................................66
Figura 4.11. Perfil da atividade lipsica utilizando diferentes indutores por
FS.................................................................................................................67
Figura 4.12. Cintica de FS para produo de lipases utilizando meio sinttico:
Planejamento experimental PB...................................................................71
xii
Figura 4.13. Grfico de Pareto da produo de lipases por FS utilizando meio
sinttico em funo das variveis independentes estudadas: Planejamento
experimental PB..........................................................................................72
Planejamento fatorial 2
2
...............................................................................74
Figura 4.15. Grfico de Pareto para produo de lipases por FS utilizando meio
sinttico em funo das variveis independentes estudadas em 96 horas de
fermentao: Planejamento fatorial 2
2
.........................................................74
Figura 4.16. Cintica de produo de lipase e crescimento celular (peso seco) na
melhor condio experimental utilizando meio sinttico por
FS.................................................................................................................75
Figura 4.17. Perfil da FS para produo de lipases utilizando meio industrial:
Planejamento experimental PB....................................................................78
industrial: Planejamento experimental PB...................................................79
3
...............................................................................81
industrial: Planejamento fatorial 2
3
...............................................................82
melhor condio experimental utilizando meio industrial por FS.................83
Figura 4.22. Superfcie de resposta e curva de contorno para a atividade
enzimtica em funo da temperatura e pH por FS....................................87
Figura 4.23. Grfico de Pareto para determinao da temperatura e pH timos da
atividade lipsica obtida por FS em meio industrial.....................................89

xiii
RESUMO

Produo de lipases por fermentao em estado slido e fermentao submersa
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo
Maro/2006

Orientadoras: Dbora de Oliveira e Helen Treichel

O crescente interesse na produo de lipases est especialmente relacionado ao
grande potencial biotecnolgico que estas enzimas apresentam. No entanto, os altos
custos de produo destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua utilizao. A
aplicao de subprodutos agroindustriais como substrato na produo de lipases, alm de
agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a reduzir em muito o preo
final da enzima. Neste trabalho investigou-se a produo de lipases por Penicillium
verrucosum por fermentao em estado slido utilizando farelo de soja como substrato
slido e por fermentao submersa fazendo uso de meios sinttico e industrial. Avaliou-se
o efeito de algumas variveis de processo e diferentes suplementaes do meio sobre a
produo de lipases em escala de bancada, utilizando a tcnica de planejamento de
experimentos e anlise de superfcie de resposta, visando obter condies que
maximizem a produo da enzima. Observou-se que o fungo Penicilllium verrucosum
apresentou um bom desempenho na produo da enzima por fermentao em estado
slido, permitindo-se obter altos valores de atividade lipsica, 40 U/g em 48 horas de
fermentao e 52 U/g em 72 horas de fermentao nas condies operacionais
otimizadas (T= 27,5
o
C e U= 55%). A enzima bruta obtida por FES apresentou condies
timas de atividade a 30C em pH 7,0 e manteve-se estvel a 35C em valores de pH
entre 6,0 e 7,0. A produo da enzima por fermentao submersa apresentou valores de
3,15U/mL em 96 horas de fermentao no meio sinttico e de 2,22 U/mL em 72 horas de
fermentao no meio industrial. A enzima obtida por meio sinttico apresentou as faixas
de temperatura e pH timos de 29C a 32C, 40C a 45C e 7,0 a 8,5 respectivamente; e
a lipase obtida por meio industrial apresentou a faixa de temperatura de 30C a 40C e pH
entre 5,0 e 9,0 como valores timos.

xiv

ABSTRACT

Lipase production by solid state fermentation and submerged fermentation
using Penicillium verrucosum

Maro/2006

Advisors: Dbora de Oliveira e Helen Treichel

The growing interest in lipase production is especially related to the great
biotechnogical potential that these enzymes present. However, the high production costs
of these biocatalysts many times restrict their use. The application of agro industrial by-
products as substrate in lipase production, besides joining value to low cost materials in
the market, can reduce the final price of the enzyme. In this work, lipase production was
investigated, using Penicillium verrucosum and solid state fermentation of soy bran as
substrate and by submerged fermentation using a synthetic and an industrial medium. The
effects of some process variables and different media supplementations on lipase
production were evaluated in laboratory scale, using the experimental design technique
and response surface analysis, in order to obtain the conditions that maximize the
production of the enzyme. The Penicilllium verrucosum presented a good performance in
the enzyme production by solid state fermentation, yielding high values of lipase activity,
40 U/g in 48 hours of fermentation and 52 U/g in 72 hours of fermentation in the optimized
operational conditions (T=27,5
o
C and U=55%). The crude enzymatic extract presented
optimum pH and temperature of 7.0 and 30C, respectively, and stayed stable at
temperature of 35C in pH values between 6.0 and 7.0. The enzyme production by
submerged fermentation presented lipase activity of 3.15 U/mL in 96 hours of fermentation
in the synthetic media and 2.22 U/mL in 72 hours of fermentation in the industrial media.
The enzymatic extract obtained using synthetic medium showed optimum temperature and
pH of 29C to 32C, 40C to 45C and 7,0 to 8,5, respectively; and the lipase obtained
using industrial medium presented the strip of temperature from 30C to 40C and pH
between 5,0 and 9,0 as optimum.
Captulo 1 Introduo
1
1 INTRODUO

As lipases so enzimas pertencentes famlia das hidrolases que tm
como funo biolgica primordial catalisar a hidrlise de triacilgliceris insolveis
para gerar cidos graxos livres, mono e diacilgliceris e glicerol. Alm de sua
funo natural, as lipases podem catalisar reaes de esterificao,
interesterificao e transesterificao em meio no-aquoso (Houde et al., 2004;
Freire, 1996). Lipases microbianas so biocatalisadores de grande valor, devido
principalmente a caractersticas como: ao sob condies amenas, estabilidade
em solventes orgnicos, especificidade ao substrato e rgio enncio seletividade.
(Snellman et al., 2002).
Recentemente, as lipases assumiram um lugar de destaque no mercado
mundial das enzimas, evidenciado pelo aumento da quantidade de informao
reportada na literatura, o que reflete uma mdia de 1000 publicaes por ano.
Depois das proteases e amilases, as lipases so consideradas como o terceiro
grande grupo em volume de vendas, movimentando bilhes de dlares. Essa
conquista se deve tanto pela sua versatilidade de aplicao quanto pela relativa
facilidade de produo em massa, tornando-as especialmente atrativas para
aplicaes industriais (Hasan et al., 2006; Jaeger e Reetz, 1998; Freire, 1996).
O potencial de aplicaes industriais que as lipases possuem abrange a
indstria de alimentos como aditivos (modificao de aromas), qumica fina
(sntese de steres), detergentes (hidrlise de gorduras), tratamento de efluentes
(decomposio e remoo de substncias oleosas), couro (remoo de lipdios
das peles dos animais), farmacutica e a rea mdica (remdios, digestivos e
enzimas para diagnsticos) (Burkert, 2002; Burkert et al., 2004). No entanto, os
altos custos de produo destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua
utilizao (Freire, 1996).
A produo de lipases pode ser realizada por fermentao submersa (FS)
ou por fermentao em estado slido (FES). O primeiro processo utiliza um meio
de cultura lquido, sendo este o mais utilizado e descrito em maior nmero de
trabalhos com maiores detalhes (Martins, 2001); j o segundo, baseia-se na
Captulo 1 Introduo
2
utilizao de substratos slidos com baixas porcentagens de gua em sua
composio (Alonso, 2001). Por estes substratos poderem oferecer suporte
nutricional e de crescimento ao microrganismo, a FES apresenta-se como um
processo mais vantajoso em relao fermentao submersa, alm de fornecer,
em geral, altos rendimentos e facilidade na recuperao dos produtos (Sharma et
al., 2001).
A utilizao de subprodutos agroindustriais como substrato na produo de
lipases, alm de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a
reduzir em muito o preo final da enzima, sendo que a aplicao da fermentao
em estado slido em muitos casos diminui consideravelmente os custos do
processo, quando comparada fermentao submersa (Castilho et al., 2000a).
Assim, estudos sobre a utilizao de diferentes microrganismos,
suplementos e substratos para a produo de lipases em meio lquido e meio
slido podem contribuir no sentido de encontrar combinaes ideais para se obter
lipases com altos rendimentos, utilizando substratos e condies operacionais que
possibilitem a reduo dos custos do processo de produo em escala industrial
(Vargas, 2004).
Com base nestes aspectos, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a
produo de lipases por fermentao submersa e fermentao em estado slido
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo. Como objetivos
especficos pode-se citar: avaliao de diferentes meios e suplementaes
visando obter condies que maximizassem a produo da enzima e a
caracterizao da enzima bruta. Investigou-se o efeito de algumas variveis de
processo e diferentes suplementaes em escala de bancada, utilizando a tcnica
de planejamento de experimentos e anlise de superfcie de resposta. A
caracterizao da enzima bruta proveniente da fermentao em estado slido e
submersa foi realizada quanto ao pH timo e de estabilidade e a temperatura
tima e de estabilidade, no intuito de conhecer algumas propriedades das lipases
obtidas.
Como forma de apresentao, o presente trabalho foi dividido em captulos,
os quais contemplam uma reviso da literatura buscando inserir o trabalho
Captulo 1 Introduo
3
desenvolvido, embasando-o teoricamente (Captulo 2). O Captulo 3 apresenta os
materiais e metodologias empregadas para o desenvolvimento de todas as etapas
do trabalho. No Captulo 4 so apresentados e discutidos os resultados obtidos
para a produo de lipases por fermentao em estado slido e fermentao
submersa utilizando Penicillium verrucosum e o Captulo 5, como forma de
fechamento do trabalho, apresenta as concluses e sugestes para a
continuidade do mesmo.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica
4
2 REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo ser apresentada uma abordagem sobre lipases, dando
nfase especial s formas de produo, foco principal deste trabalho,
contextualizando com dados e informaes reportadas na literatura.

2.1 DEFINIO DE LIPASES

As lipases so enzimas classificadas como hidrolases e atuam sobre
ligaes ster presentes em acilgliceris, liberando cidos graxos e glicerol,
constituindo uma classe especial de esterases

(Jaeger e Reetz, 1998). A
caracterstica de atuao em uma interface entre a fase aquosa e no-aquosa as
distingue das esterases (Pandey et al., 2000).
Lipases catalisam reaes de substratos insolveis em gua (Alvarez-
Macarie et al., 1999) e a hidrlise de acilgliceris para cidos graxos,
diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol (Mahadik et al., 2002). Sob certas
condies, elas tambm catalisam reaes de esterificaes, transesterificaes
(acidlise, interesterificao, alcolise), aminlise e tiotransesterificao em
solvente orgnico anidro, sistema bifsico e em soluo micelar com alta
especificidade. O deslocamento do equilbrio na reao, no sentido direto
(hidrlise) ou inverso (sntese), controlado pela quantidade de gua presente na
mistura reacional (Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).
As lipases geralmente no requerem cofatores, atuam em uma ampla faixa
de pH, so relativamente estveis a altas temperaturas, apresentam
especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enncio-seletividade
(Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).
Pesquisas relacionadas s lipases tm aumentado devido gama de
possveis aplicaes prticas que possuem a nvel industrial. Estas enzimas tm
sido utilizadas na hidrlise de gorduras, produo de cidos graxos e aditivos de
5
alimentos, sntese de steres e peptdeos, resoluo de misturas racmicas ou
adio em detergentes (Maleata, 1996).

2.2 FONTES DE LIPASES

Tradicionalmente, as lipases eram obtidas do pncreas de animais. A
descoberta foi feita por Claude Bernard, em 1856 e anos mais tarde, aumentou o
interesse pelas lipases microbianas devido s dificuldades de acesso ao material
de origem animal (Hasan et al., 2006).
As lipases so originrias de grande nmero de bactrias, fungos, plantas e
animais, tendo suas propriedades variveis de acordo com sua procedncia.
(Saxena et al., 2003). Particularmente, as enzimas microbianas so mais estveis
que as extradas de plantas e animais, tornando sua produo mais conveniente e
segura (Hasan et al., 2006).
As lipases provenientes de microrganismos constituem um grupo de
valiosas enzimas de aplicao biotecnolgica, devido principalmente
versatilidade de suas propriedades, no que se refere atuao enzimtica e
especificidade ao substrato, e facilidade de produo em massa, sendo um dos
grupos mais utilizados no segmento industrial (Hasan et al., 2006).

2.3 VANTAGENS E APLICAES DAS LIPASES MICROBIANAS

O uso de enzimas nas indstrias permite o desenvolvimento de processos
tecnolgicos muito prximos aos eficientes processos executados pela natureza
(Hasan et al., 2006).
Em funo da busca de novas fontes de enzimas, o interesse por
microrganismos tem crescido muito nos ltimos anos. Existe um grande apelo
econmico pelas lipases microbianas, j que a maioria destas enzimas
6
extracelular e, desta forma, os processos de produo e processamento das
enzimas, com suas etapas de purificao, tm custo diminudo (Alonso, 2001).
Nos ltimos anos, devido a sua excelente capacidade rgio enncio seletiva
numa variedade de solventes orgnicos e substratos, lipases tm emergido como
um importante biocatalisador em aplicaes biomdicas (Pandey et al., 1999).
Para sua utilizao na indstria biomdica e farmacutica, as lipases necessitam
de um alto grau de pureza com propriedades especficas, sendo ento
indispensvel o conhecimento de propriedades relacionadas ao substrato e
parmetros do processo (pH, temperatura, etc.) (Benjamin e Pandey, 2000).
A versatilidade das lipases fazem com que estas possuam um vasto
potencial de aplicao em alimentos, detergentes, farmacutica, couro, txtil,
cosmtica e indstria papeleira (Houde et al., 2004). Alm disso, a utilizao de
lipases pelas indstrias apresenta vantagens como: estabilidade a altas
temperaturas e amplas faixas de pH, facilidade de separao dos produtos e,
quando imobilizadas, podem ser submetidas s condies industriais tpicas, com
reatores com temperaturas superiores a 70C por longos perodos de tempo
As lipases tm sido investigadas extensivamente como alternativas de rotas
para novas biotransformaes; centenas de snteses bio-orgnicas usando lipases
tm sido descritas recentemente; a diversidade das aplicaes industriais gerais e
propostas excede em muito as aplicaes de outras hidrolases (Alonso, 2001).
Atualmente, as lipases so aplicadas em escala industrial, na produo de
alimentos, detergentes, cosmtica e farmacutica (Jaeger e Reetz, 1998) e
representam um mercado com grande potencial de crescimento (Alonso, 2001).
Apesar de existirem diversas lipases sendo produzidas em larga escala e
aplicadas comercialmente, a plena utilizao industrial destas enzimas passa
necessariamente pela reduo de custos de produo. Isso poder ser alcanado
atravs da seleo de novos microrganismos produtores, de melhoramento
gentico, de modificaes no meio de cultura e de otimizao das condies de
cultivo e dos sistemas de produo (Gutarra, 2003).
7
Nos itens a seguir sero apresentados alguns exemplos de aplicaes
industriais das lipases.

2.3.1 INDSTRIA DE ALIMENTOS
As lipases microbianas tm sido utilizadas para a obteno de cidos
graxos livres a partir da hidrlise seletiva de leos e gorduras presentes em
diversos alimentos. Os cidos graxos livres podem ou no sofrer modificaes
qumicas e, dependendo do tamanho da cadeia carbnica e do grau de
insaturao, conferem um peculiar sabor e aroma para os alimentos,
representando um importante papel nas propriedades fsico-qumicas,
organolpticas e nutricionais de diversos produtos (Jaeger e Reetz, 1998).
Na indstria de queijos elas so empregadas na alterao e intensificao
do sabor e em processos de acelerao da maturao. Tambm na indstria de
laticnios, as lipases so utilizadas para a obteno de margarinas de baixo teor
calrico, entre outras (Alonso, 2001).
A literatura reporta a hidrlise do leo de fgado de bacalhau para a
produo de cidos graxos mega 3 insaturados, destinados s dietas de
grupos clnicos especiais (Pandey et al., 1999). O enriquecimento de leos com
cidos graxos poliinsaturados, como por exemplo, cido linolnico, conferem a
estes atividades anti-carcinognicas e anti-esclerticas, sendo chamados
atualmente de alimentos nutracuticos (Martins, 2001).

2.3.2 INDSTRIA OLEOQUMICA
O uso de lipases para a hidrlise de gorduras em mbito industrial
proporciona vantagens como a diminuio de gastos com energia e a minimizao
da degradao trmica dos compostos, quando comparado s vias qumicas
tradicionais. Estas so provavelmente as principais atraes que levam
substituio das tecnologias qumicas atuais pelas biolgicas. Devido ao seu valor
nutritivo, a no degradao de cidos graxos poliinsaturados pode ser importante
para a preservao de aditivos de alimentos tais como mono e diacilgliceris,
sendo estes ltimos, os componentes principais dos novos leos para cozimento,
8
que tm a proposta de retardar o aumento de triglicerdios e colesterol no sangue
O espao para a aplicao de lipases na indstria oleoqumica amplo. As
gorduras e os leos so produzidos em grande escala pelo mundo gerando em
torno de 60 milhes de toneladas sendo que mais de 2 milhes de toneladas so
utilizadas em processos que consomem uma grande quantidade de energia tais
como hidrlise, glicerlise e alcolise. Entretanto, apesar de sua superioridade
aparente, os mtodos enzimticos ainda no alcanaram um nvel de explorao
comercial proporcional a seu potencial de aplicaes (Hasan et al., 2006).

2.3.3 INDSTRIA DE DETERGENTES
O campo de aplicao das lipases mais importante comercialmente a
indstria de detergentes. Aproximadamente 1000 toneladas de lipases so
adicionadas a 13 bilhes de toneladas de detergentes produzidos a cada ano,
competindo com os surfactantes normalmente empregados, pela maior eficincia
na remoo de manchas, em superfcies e em tecidos, pela menor temperatura
necessria lavagem e pela biodegradabilidade (Martins, 2001).
Os desafios para a utilizao de lipases em formulaes de detergentes
consistem nas caractersticas que estas enzimas devem apresentar, como
estabilidade nas condies de lavagem, entre pH 10,0 e 11,0 das formulaes e
em temperaturas de 30 a 60C; alm disso, devem apresentar pouca ou nenhuma
especificidade pelo substrato, sendo capazes de atuar sobre diversos leos, e por
fim, devem resistir aos componentes da formulao e degradao causada por
enzimas proteolticas tambm presentes (Martins, 2001).

2.3.4 INDSTRIA FARMACUTICA
Recentemente foi evidenciado o esforo da indstria farmacutica em
produzir compostos opticamente puros, em detrimento da produo das misturas
racmicas, que por sua vez levava a uma srie de implicaes, como a ocorrncia
de vrios efeitos colaterais indesejados. Isto porque a maioria dos frmacos
9
sintetizados possui um ou mais centros quirais, e ainda continua a ser
comercializada como uma mistura racmica (Alonso, 2001).
H interesse nos leos de peixes de regies frias (anchova e sardinha)
devido aos efeitos fisiolgicos e teraputicos (atuam no sistema cardaco,
circulatrio e imunolgico e nos processos inflamatrios e carcinognicos)
encontrados nos cidos graxos de cadeia longa, presentes nesses leos. A maior
parte da produo mundial dos cidos EPA (eicosapentaenico) e DHA
(docosahexaenico) so hidrogenados para a produo de margarinas e outros
produtos, praticamente destruindo suas propriedades teraputicas. Por isso de
interesse industrial obter triglicerdeos homogneos a partir desses cidos, j que
os triglicerdeos so encontrados nos alimentos e no organismo humano. Portanto,
a sntese catalisada por lipases desejvel para produo de triglicerdeos a partir
desses cidos com um alto grau de pureza (Burkert, 2002).

2.3.5 TRATAMENTO DE EFLUENTES
O tratamento de efluentes de diversas origens uma nova rea de
aplicao para as lipases. O derramamento de leo em oceanos e rios e em
grandes reas de terra tem sido uma constante nos dias atuais. O despejo do
rejeito da indstria de laticnios e indstria oleoqumica, principalmente nos leitos
fluviais, ocorre de forma criminosa no Brasil, seja pela falta de uma legislao
mais rgida ou pelo descaso das autoridades competentes. As lipases surgem
como uma excelente alternativa para o tratamento do rejeito industrial composto
por material graxo (Alonso,2001).
Cabe ressaltar que as aplicaes das lipases citadas anteriormente so
apenas ilustrativas e esto em nmero bastante reduzido em relao s
possibilidades de utilizao destas enzimas no futuro. A sua plena utilizao
esbarra na reduo dos custos dos processos de produo e purificao, na
busca por novas cepas produtoras, no melhoramento gentico destas cepas, alm
da mutagnese stio dirigida, ou da modificao qumica das lipases afim de que
produzam maiores quantidades destas enzimas em tempos menores, com
caractersticas desejveis (Martins, 2001).
10
2.4 PRODUO DE LIPASES MICROBIANAS

Microrganismos so muito versteis, porm bastante sensveis s
condies do ambiente ao qual esto sendo submetidos. Em um planejamento
experimental para produo de lipases, fatores que influenciam o processo como
composio do meio, pH, temperatura e aerao devem ser estritamente
controlados (Alonso, 2001; Marek e Bednarski, 1996).
As lipases microbianas em geral so extracelulares, sendo excretadas
atravs da membrana externa para o meio de cultura. A otimizao das condies
de fermentao para lipases microbianas de grande interesse, desde que as
condies de cultura no influenciem nas propriedades da enzima, bem como na
proporo de lipase extracelular e intracelular (Wooley e Peterson, 1994).
Uma grande variedade de microorganismos tem habilidade de produzir
lipases, sendo funo de alguns parmetros reacionais e apresentando diferentes
especificidades, massa molecular, sensibilidade temperatura e pH (Burkert,
2002; Burkert et al., 2004). No entanto, do ponto de vista industrial, os fungos so
os preferidos como fontes de lipases, pois as enzimas produzidas por eles
geralmente so extracelulares, facilitando a sua extrao do meio fermentado e
tambm por serem considerados microorganismos seguros para aplicao na
indstria de alimentos, bebidas e farmacutica (Mahadik et al., 2002; Burkert,
2002; Burkert et al., 2004).
A literatura reporta que diversos gneros de fungos filamentosos tm sido
estudados como fontes de lipases por exemplo, Rhizopus (Pastore et al., 2003),
Aspergillus (Mahadik et al., 2004), Rhizomucor (Cordova et al., 1998), Penicillium
(Jesus et al., 1999), Mucor (Abbas et al., 2002), entre outros.
Penicillium considerado um gnero universal de fungos encontrados em
todo o planeta. A maioria das espcies saprfita e geralmente ou
ocasionalmente encontrada no solo, vegetais podres, sementes e gros. H mais
de 20 anos tm-se estudado a taxonomia e classificao das espcies do gnero
Penicillium com base em dados morfolgicos e qumicos Penicillium verrucosum
comumente encontrado em cereais estocados em regies de clima temperado
11
(Jesus et al., 1999). Apresenta como caractersticas principais: colnia radialmente
sulcada, velutinosa, miclio branco, conidiognese moderada de cor verde-
acinzentada. A Figura 2.1 apresenta algumas caractersticas do fungo Penicillium
verrucosum.

Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.

Na formulao de um meio fermentativo deve-se proporcionar nutrientes
necessrios ao crescimento do microrganismo e produo de metablitos e alm
disso, este deve ser adequado para suprir energia para biossntese e manuteno
celular (Smits et al., 1996).
Este deve ser composto basicamente por fonte de carbono, fonte de
nitrognio (seja ela orgnica ou inorgnica), sais orgnicos, vitaminas e indutores,
quando necessrios para a produo de lipase, visto que existem lipases
induzveis e constitutivas. As lipases constitutivas so aquelas que so produzidas
independente do meio de cultura onde o microrganismo se encontra, j as lipases
induzveis tm sua produo estimulada pela presena de algum indutor presente
no meio de cultivo (Alonso, 2001).
Foi demonstrado que a presena de substratos lipdicos (e seus
metablitos, como cidos graxos) pode estimular a produo de lipases, como em
Candida rugosa (Dalmau et al., 2000). Neste estudo, avaliou-se os efeitos de
diferentes fontes de carbono, testando substratos lipdicos e no-lipdicos.
Verificou-se que no segundo grupo de substratos, alguns do suporte para o

12
crescimento do microrganismo, porm pouca atividade lipsica obtida. Foi ainda
realizada a combinao de dois tipos de substratos, o que no aumentou a
produo da enzima.
Na produo de lipase por Penicillium restrictum foi estudada a influncia
da razo carbono/nitrognio adicionado ao meio de cultivo, fazendo uso de leo
de oliva, peptona e amido. Observou-se que pequenas variaes nos nveis de
nutrientes exercem grande influncia na quantidade de enzima obtida e que, o
meio basal, ao ser enriquecido diferentemente, pode proporcionar a produo de
enzimas variveis (Gombert et al., 1999).
Como fonte de carbono podem ser utilizados carboidratos, lipdios ou
protenas, sendo o lipdio normalmente utilizado como indutor. Comumente as
fontes de nitrognio j presentes no meio de cultura contm algumas, seno todas
as vitaminas necessrias para o metabolismo do microrganismo. Porm, existem
casos onde alguma vitamina ou uma suplementao necessria para o
crescimento celular (Alonso, 2001; Becker et al.,1997).
Cada microrganismo apresenta um valor de pH timo para o crescimento e
que muitas vezes no o mesmo para produo de lipases (Gao et al., 2000).
possvel que ocorram variaes nos valores de pH durante o cultivo, os quais
podem ser influenciados tanto pelo microrganismo e pela composio do meio,
quanto pelos demais parmetros da fermentao (Alonso, 2001).
Calor produzido tanto pela atividade microbiana quanto pela agitao do
sistema; sendo que para se obter boas condies para o crescimento e produo
de enzimas, torna-se indispensvel o controle da temperatura ideal (Alonso,
2001).
Microrganismos produtores de lipases apresentam uma ampla faixa de
temperatura de crescimento. Em geral, fungos e leveduras tm uma temperatura
tima entre 22 e 30C (Toida et al., 1995).
Os processos fermentativos, em sua maioria, so aerbicos e desta forma o
fornecimento de oxignio se torna indispensvel. A demanda de oxignio em uma
fermentao seja ela a nvel industrial ou laboratorial, normalmente suprida pela
agitao e aerao do meio fermentativo. A produtividade de muitas fermentaes
13
para produo de lipases ou outros metablitos pode ser influenciada pela
disponibilidade do oxignio, portanto, qualquer fator que possa interferir nesta
disponibilidade do oxignio para as clulas microbianas deve ser considerado
(Alonso, 2001).
Pesquisas tm demonstrado que a agitao e aerao so parmetros que
influenciam diretamente a produo de lipases. Elibol e Ozer (2000) verificaram
que a produtividade da enzima depende fortemente da agitao quando se utiliza
Rhizopus arrhizus. Neste caso, a aerao exerceu forte influncia no crescimento
celular, o que tambm foi observado por Koutinas et al. (2003), que avaliou estes
parmetros com Aspergillus awamori. Resultados semelhantes foram encontrados
para os cultivos realizados com Penicillium restrictum. Neste estudo a produo de
lipases mostrou-se positivamente influenciada pela variao da agitao e a
aerao no apresentou efeito sobre a produo da enzima (Freire et al., 1997).

2.5 FORMAS DE PRODUO DE LIPASES

2.5.1 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
O processo de fermentao em meio slido bastante caracterstico e
utiliza substratos insolveis com baixas porcentagens de gua em sua
composio, os quais devem atuar tanto como suporte fisiolgico quanto como
fonte de nutrientes na ausncia de gua livre (Alonso, 2001; Pandey, 1992;
Pandey, 2003). Na formulao do meio de fermentao vrias fontes de carbono
(substrato principal) so utilizadas, entre elas cita-se (Alonso, 2001): Farelo de
trigo (Silva et al., 2000; Ellaiah et al., 2004), farelo de arroz (Ellaiah et al., 2004),
farelo de cevada (Dominguez et al., 2003), bagao de cana-de-acar (Cordova et
al., 1998; Ellaiah et al., 2004), torta de cco (Benjamin e Pandey, 2001), torta de
soja (Vargas, 2004), torta de babau (Palma et al., 2000; Gombert et al., 1999;
Castilho et al., 2000), entre outros, alm da incorporao opcional de alguma fonte
de carbono indutora para a produo de lipases (leos, cidos graxos,
detergentes). Em alguns casos, fontes de nitrognio complementar so utilizadas:
14
licor de milho, extrato de levedura, uria, sais de amnio e outros. Sais metlicos e
micro-elementos podem ser suplementados para suprir as necessidades do
microrganismo (Alonso, 2001).
No processo de fermentao em estado slido deve-se levar em
considerao alguns aspectos importantes, como a seleo do microrganismo, a
escolha do substrato, a otimizao dos parmetros do processo, o isolamento e a
purificao do produto, dentre outros fatores (Pandey, 2003).
Com base na classificao terica, o fato da umidade contida no meio de
fermentao ser muito baixa, somente permitiria o uso de um nmero limitado de
microrganismos, principalmente fungos e leveduras para fermentao em estado
slido. Culturas de bactrias exigem alta atividade de gua e, portanto, no seriam
adequadas fermentao em estado slido. No entanto, existem relatos que
demonstram que bactrias podem ser usadas nestes processos, quando bem
controladas e manipuladas (Pandey et al., 2000; Pandey, 2003).
Nos ltimos anos, a tcnica de fermentao em estado slido tem recebido
uma maior ateno dos pesquisadores, tanto para produo de enzimas, quanto
para obteno de substncias de interesse da indstria de alimentos, pois tem
mostrado que pode ofertar maior produtividade ou produtos com melhores
caractersticas do que a fermentao submersa. Alm disso, h a possibilidade de
utilizao de substratos de baixo valor agregado, diminuindo assim o custo da
produo (Robinson e Nigam, 2003).
Desde 1986, h no Brasil uma srie de pesquisas sendo desenvolvidas a
fim de agregar valor aos produtos e subprodutos da agricultura tropical,
principalmente pelo aumento da gerao de resduos agroindustriais na regio. A
utilizao dos resduos da agroindstria brasileira, alm de fornecer diferentes
alternativas de substratos para fermentao, tambm ajuda na diminuio dos
problemas de poluio (Pandey et al., 1999).
O processo seletivo dos substratos slidos depende de vrios fatores, entre
eles, o custo e viabilidade envolvendo assim a investigao de diferentes resduos
agroindustriais. Estes, normalmente so ricos nutricionalmente, sendo que no
processo de fermentao em estado slido eles fornecem no somente os
15
nutrientes para a cultura, mas tambm servem como suporte das clulas
microbianas (Couto e Sanromn, 2006).
Dentre os fatores importantes para o crescimento microbiano e atividade no
substrato, particularmente o tamanho das partculas (granulometria) e nveis de
umidade/atividade de gua so pontos crticos. Geralmente pequenas partculas
de substrato fornecem uma grande superfcie de contato com o microrganismo,
mas resulta num baixo crescimento. Contrariamente, grandes partculas fornecem
maior aerao, mas limitam a superfcie de contato para uso microbiano. Portanto
o tamanho da partcula dever ser selecionado de acordo com cada processo em
particular (Pandey et al., 1999).
Estudos demonstram que a umidade do meio de fermentao um fator
determinante no sucesso deste processo, sendo que nveis elevados de umidade
causam diminuio da porosidade e dificultam a transferncia de oxignio. No
entanto, nveis baixos de umidade do meio diminuem a solubilidade do substrato
slido e produzem um aumento do turgor da gua (Mahadik et al., 2002).
Atualmente, h poucos modelos de biorreatores que operam em condies
de estado slido disponveis no mercado. Isto ocorre, principalmente devido aos
vrios problemas encontrados no controle de diferentes parmetros, sabendo-se
que difcil o controle das condies ambientais em biorreatores, particularmente
temperatura e umidade (Couto e Sanromn, 2006).
O equipamento utilizado para este tipo de fermentao composto por
cmaras de fermentao de volume definido, onde existe um controle da
temperatura e da porcentagem de umidade do meio. Em escala industrial de
produo, este meio disposto em bandejas de alta rea superficial e com uma
profundidade que varia de 1 a 10 centmetros. Em escala laboratorial so
utilizadas bandejas menores ou placas de Petri, que so acondicionadas nas
cmaras (Alonso, 2001).
O tempo e a temperatura de fermentao so bastante variveis.
Dependendo do microrganismo em questo, o tempo costuma variar de 1 a 7 dias,
enquanto a temperatura pode variar de 20 a 40C (Alonso, 2001).
16
A fermentao em estado slido apresenta como vantagens o baixo custo
das matrias primas empregadas no meio de cultivo, a simplicidade do meio de
fermentao utilizado, a menor probabilidade de contaminao do meio pela
menor quantidade de gua presente e a possibilidade de obteno da enzima
extracelular mais concentrada (Martins, 2001; Alonso, 2001). Outra questo
interessante a alta produtividade obtida com esta tcnica (Couto e Sanromn,
2006). Benjamin e Pandey (1995) e Castilho et al. (2000) compararam a
fermentao submersa e a fermentao em estado slido como sistemas de
produo de lipases, constatando aumento da produo da enzima e de sua
estabilidade por meio do segundo sistema.
Apesar do processo de fermentao em estado slido apresentar vrias
vantagens, alguns problemas so apresentados durante a sua execuo. A
dificuldade nas medidas dos parmetros como aerao, pH, temperatura, umidade
e a baixa homogeneidade do meio so questes que dificultam a produo de
substncias de interesse em grande escala (Martins, 2001; Couto e Sanromn,
2006). A automao deste processo dificultada pelo equipamento em si e
apresenta um maior custo em mo de obra em escala industrial. Alm desses
inconvenientes, existe a necessidade do pr-tratamento do substrato para a
eliminao de possveis contaminantes que venham a interferir na produo de
lipase e no crescimento do microrganismo (Alonso, 2001).
A fermentao em estado slido reproduz processos microbiolgicos
naturais. No caso de aplicaes industriais, estes processos naturais, se
monitorados, produzem o produto desejado (Couto e Sanromn, 2006). Assim,
vrios produtos de valor agregado tm sido produzidos por essa tcnica fazendo
uso de matrias primas provenientes da natureza (Pandey, 2000).
Esse tipo de fermentao tem mostrado tambm um enorme potencial
tecnolgico no que diz respeito ao desenvolvimento de produtos que apresentam
componentes derivados de microrganismos como raes para animais, produtos
para a indstria alimentcia, qumica e farmacutica. Estas aplicaes envolvem a
biotransformao de produtos e resduos agrcolas para enriquecimento
nutricional, produo de biomassa e formao de produtos com alto valor
17
agregado, como metablitos secundrios biologicamente ativos, incluindo
antibiticos, alcalides, enzimas, cidos orgnicos, biopesticidas, micro-pesticidas
e bioerbicidas, biossufactantes, biocombustveis, compostos aromticos, etc.
(Pandey, 2003).
As principais aplicaes do processo de fermentao em estado slido na
indstria de alimentos esto apresentadas na Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Principais aplicaes da FES na indstria alimentcia.
Aplicao Referncias
Produo de flavors Medeiros et al., 2001; Larroche et al., 1999.

Produo de enzimas

Alfa-amilases

Lipases

Pectinases

Francis et al., 2003; Ramachandran et al., 2004.

Jesus et al., 1999; Vargas, 2004; Gombert et al.,
1999; Palma et al., 2000.

Castilho et al., 2000; Bai et al., 2004.

Produo de cidos orgnicos

cido ltico

cido ctrico

Naveena et al., 2005.

Prado et al., 2004.

Produo de goma xantana Stredansky e Conti, 1999.

Estudando a produo de lipases por fermentao em estado slido, Palma
et al. (2000) utilizaram o fungo Penicillium restrictum e torta de babau como meio
basal. O meio foi enriquecido com peptona, tween 80 e leo de oliva verificando-
18
se que a maior atividade lipsica (27,8 U/g em 25 horas de fermentao) foi obtida
quando se utilizou a peptona como suplemento.
Cordova et al. (1998) investigaram o uso de bagao de cana de acar e
torta de oliva (resduo da indstria de leo de oliva) para a produo de lipases por
Rhizopus rhizopodiformis e Rhizomucor pusillus. As maiores atividades
enzimticas obtidas foram de 79,6 U/g com R. rhizopodiformis e 20,2 U/g com R.
pusillus respectivamente, quando se utilizou uma mistura de 50:50 dos substratos
estudados.
A produo de lipases por Penicillium simplicissimum em meio slido
usando torta de soja como substrato foi estudada por Vargas (2004). Foi
constatado que a maior produo da enzima (30 U/g em 80 horas de fermentao)
ocorreu sob as condies de 27,5C e 55% de umidade do meio e que a torta de
soja rica em nutrientes e no necessita de adio de fontes suplementares de
carbono e nitrognio para aumentar a produo de lipases.
Diferentes resduos agroindustriais foram utilizados para a produo de
lipases por Aspergillus niger em uma pesquisa feita por Kamini et al. (1998). As
maiores atividades lipsicas obtidas foram de 363 U/g em 72 horas quando
utilizou-se torta de leo de gengibre e de 303 U/g em 96 horas de fermentao
fazendo uso de farelo de trigo como substrato. Neste estudo, a adio de fontes
de nitrognio e de indutores foi ineficaz para o aumento da produo da enzima.
Domnguez et al. (2003) investigaram a produo de lipases por Yarrowia
lipolytica por fermentao em estado slido. Observou-se que o uso de materiais
orgnicos como suporte para a produo de lipases alm de diminuir os custos de
produo da enzima proporciona maiores atividades lipsicas quando comparado
ao uso de suportes sintticos. Concluiu-se que a utilizao de nozes trituradas
como substrato gerou cerca de 69 U/g de atividade enzimtica em 10 dias de
fermentao, superando os resultados obtidos com farelo de cevada
suplementado com leo de girassol, milho e oliva.

19
2.5.2 FERMENTAO SUBMERSA
A fermentao submersa, que tem como caracterstica principal a utilizao
de um meio fermentativo lquido com nutrientes solveis, o processo mais
utilizado para a produo de lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001).
Esse tipo de sistema de produo de lipases pode ser realizado em frascos
agitados (erlenmeyers, por exemplo), fermentadores de bancada ou
fermentadores em escala industrial. Os processos realizados em frascos agitados
apresentam dificuldades no controle de certos parmetros, como por exemplo, a
aerao, que uma varivel determinante em alguns casos de produo de
lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001). Apesar disso, a fermentao submersa para
produo de lipases comumente executada em agitadores de bancada (frascos
agitados) em escala laboratorial (Elibol e Ozer, 2000; Elibol e Ozer, 2002; Dalmau
et al., 1999; Ellaiah et al., 2004, Kanwar et al., 2002, Tan et al., 2003; Mahadik et
al., 2003; Ciafardini et al., 2006; Benjamin e Pandey, 1995; Asther et al., 2002).
Existem fermentadores que operam de forma contnua, semi-contnua ou
descontnua. No regime contnuo (Montesinos et al., 1996), h uma constncia na
entrada de substrato conforme as necessidades do microrganismo e na sada do
meio fermentado.
J os processos descontnuos podem ser realizados na forma de batelada,
isto , quantidades nicas de substrato so fornecidas ao microrganismo no incio
do cultivo, sendo este muito utilizado para produo de lipases (Shu et al., 2006;
Koutinas et al., 2003; Li et al., 2001; Li et al., 2004; Freire et al., 1997; Freire et al.,
1997; Freire et al.,1999). um processo de baixo custo, porm, necessita de uma
maior vigilncia operacional para assegurar a reprodutibilidade e constncia das
propriedades do produto.
A batelada alimentada consiste em realimentar o processo durante sua
execuo, visando aumentar a produo, permitindo a explorao de aspectos
cinticos do processo (Martins, 2001).
A tcnica de fermentao submersa possui relativa facilidade de cultivo em
grande escala, j que garante homogeneidade do meio e facilidade no controle
dos parmetros do processo, principalmente se monitorados por sensores
20
adequados (Couto e Sanromn, 2006). No entanto, a maior probabilidade de
contaminao, pela maior quantidade de gua, um inconveniente deste
processo. Outra limitao quando a enzima produzida extracelular, sendo
obtida uma preparao mais diluda, inserindo uma etapa de concentrao mais
trabalhosa na purificao (Alonso, 2001).
A questo da viabilidade econmica da fermentao submersa frente
fermentao em estado slido outro problema encontrado na conduo do
processo, j que os meios de fermentao normalmente apresentam um alto
custo.
Com a finalidade de estudarem a induo de diferentes fontes de carbono
na produo de lipases por Fusarium solani, Maia et al. (2001) utilizaram um meio
basal que consistia de 0,11% de MgSO
4
.7H
2
O, 0,015% de KH
2
PO
4
, 0,3% de
NaNO
3
, 0,015% de NaCl, 0,015% de ZnSO
4
e 0,001% de FeSO
4
, 0,5% de leos
vegetais e 0,5% de triolena como fonte de carbono. Dentre os indutores
estudados, o leo de gergelim foi o que proporcionou maior produo de lipases
(0,88 U/mL) em 120 horas de fermentao a 28C e 120 rpm.
Dalmau et al. (2000), pesquisando a produo de lipases por Candida
rugosa, utilizaram um meio de cultura contendo por litro 15g de KH
2
PO
4
, 5,5g de
K
2
HPO
4
, 5g de (NH
4
)
2
SO
4
, 0,5g de MgSO
4
.7H
2
O, 0,1g de NaCl, 0,1g de CaCl
2
.
Foram testados como fonte de carbono na concentrao de 2g/L: cido palmtico,
cido olico, triolena e Tween 80, sendo o cido palmtico o melhor indutor para a
produo da enzima nas condies de 30C, 150 rpm em 48 horas de
fermentao, gerando cerca de 5,3 U/mL.
Freire et al. (1997) investigaram como fonte de carbono para produo de
lipases por Penicillium restrictum o leo de oliva, a glicose e a lactose. Os
resultados demonstraram que o crescimento celular para o leo de oliva e a
glicose foi semelhante, porm, a atividade enzimtica foi cerca de 6 vezes superior
com o uso de leo de oliva, indicando que a produo da enzima pode ser
regulada pela glicose. Na presena da lactose no houve crescimento celular e
ocorreu baixa produo da enzima, devido ao microrganismo no metabolizar este
acar. Peptonas de carne, soja e casena a 2% foram investigadas como fonte de
21
nitrognio e resultaram em um crescimento celular semelhante, no entanto, a
capacidade de produo da enzima alcanou melhores nveis com a peptona de
carne, obtendo um mximo de 13 U/mL de atividade enzimtica. O microrganismo
em estudo foi incapaz de crescer na presena de nitrognio inorgnico.
Em continuidade ao trabalho anterior, Freire et al. (1997a) verificaram o
efeito da temperatura e pH inicial do meio de cultura na produo de lipase
utilizando o mesmo microrganismo. As temperaturas estudadas foram 25C, 30C,
37C, e a faixa de pH variou de 5,5 a 8,0. Foi observado que a maior produo da
enzima foi de 14 U/mL em 80 horas de fermentao sob temperatura de 30C e
pH inicial de 5,5. A enzima foi caracterizada quanto sua estabilidade e condies
timas de atuao. Atravs deste estudo foi possvel concluir que o pH e a
temperatura tima foram de 7,0 e 37C, respectivamente. A enzima foi estvel na
faixa de 30C a 37C em pH 7,0.
A produo de lipases por Antrodia cinnamomea foi avaliada por Shu et al.
(2006). O meio basal composto por 3% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de
extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte, 0,1% de KH
2
PO
4
, 0,1% de
MgSO
4
.7H
2
O e 0,1% de vitamina B
1
foi suplementado por 0,01% de leo de oliva
e protagonizou um aumento de 15 U/mL para 26 U/mL no 16 dia de fermentao
sob as condies de 28C e 150 rpm.
Um estudo comparativo de fermentao submersa e fermentao em
estado slido utilizando Penicillium restrictum foi realizado por Castilho et al.
(2000). Verificou-se que para a fermentao submersa foi necessrio um
investimento capital 78% maior que o valor investido para a fermentao em
estado slido, indicando que o segundo processo mais atrativo
economicamente. Observou-se que as principais vantagens da fermentao em
estado slido a possibilidade de uso de resduos agroindustriais como substrato
e a produtividade que este processo apresenta, o que reduz consideravelmente os
custos de produo de enzimas.

22
2.6 CARACTERIZAO DE LIPASES

Lipases de vrias origens tm sido aplicadas em vrios segmentos, como
na indstria farmacutica e na clnica. Nesse sentido, a caracterizao destas
enzimas essencial tanto para o estabelecimento das condies de trabalho e
aplicaes como para a determinao da temperatura e pH timos e de
estabilidade (Alonso, 2001).
Pastore et al. (2003) realizaram a caracterizao bioqumica da lipase
produzida por Rhizopus sp., verificando que a enzima bruta apresentou condies
timas de atividade a 40C em valores de pH entre 6,0 e 6,5 e manteve 50% ou
mais de sua atividade quando aquecida por 60 minutos temperaturas entre 40C
e 55C.
A lipase produzida por Antrodia cinnamomea apresentou atividade tima
com pH 8,0 e 40C, e tanto a atividade quanto a estabilidade diminuram
significativamente com valores de pH acima de 10. A estabilidade da atividade
enzimtica foi testada na faixa de temperatura de 25C a 60C e apresentou-se
estvel na faixa de 25C a 45C (Shu et al., 2006). Burkert (2002) e Burkert et al.
(2004) verificaram que a lipase produzida por Geotrichum candidum NRRL-Y552
apresentou condies timas de atividade a 37C e em pH 7,0 e observaram que
a estabilidade da lipase maior em baixas temperaturas, como a de 30C, por
exemplo.
A lipase produzida por Aspergillus niger caracterizada por Kamini et al.
(1998) apresentou atividade tima em pH 7,0 e 37C e mostrou-se estvel em
valores de pH entre 4,0 e 10,0 e na faixa de temperatura de 40C a 50C, sendo
que esta tambm manteve sua estabilidade na presena de detergentes.
Kamini et al. (1998) ainda neste estudo, compararam a estabilidade trmica
da lipase produzida por fermentao submersa e por fermentao em estado
slido, verificando que a primeira manteve 57% de atividade a 60C, enquanto a
segunda manteve 69% de atividade sob a mesma temperatura, mostrando que
Aspergillus niger possui habilidade em produzir a enzima com maior estabilidade
trmica por fermentao em estado slido.
23
2.7 CONSIDERAES FINAIS

Como pde ser observado atravs da reviso bibliogrfica apresentada
neste captulo, h um grande interesse na obteno da enzima lipase devido ao
seu amplo potencial de aplicao industrial.
Verifica-se que, dependendo do microrganismo usado na fermentao, a
lipase obtida possui uma especificidade em particular. As inmeras variveis que
envolvem o processo de obteno da enzima vo desde a composio do meio
(fonte de carbono, fonte de nitrognio, sais e indutores) at as condies
operacionais como pH, temperatura, agitao, aerao e forma de conduo do
processo fermentativo.
A busca pela reduo dos custos de produo de lipases faz com que
aumente as investigaes sobre substratos e formas de fermentao para que a
obteno da enzima se torne mais vivel economicamente. Atualmente, a
fermentao em estado slido vem ganhando espao e a ateno de
pesquisadores por apresentar vantagens econmicas perante fermentao
submersa, porm necessrio um estudo mais aprofundado a fim de conhecer a
fisiologia do microrganismo e verificar sua melhor adaptao, para assim
determinar o processo fermentativo mais vantajoso.
Portanto, de grande valia estudos sistemticos como o caso do uso da
metodologia do planejamento experimental, para a definio de variveis
significativas como a concentrao dos meios de cultura e as condies de
temperatura visando obter as condies timas de produo de lipase. A
caracterizao da enzima tambm se torna interessante, pois possibilita um maior
conhecimento das propriedades da lipase obtida.
Captulo 3 Material e Mtodos
24
3 MATERIAL E MTODOS

Neste captulo sero descritos os materiais, procedimentos experimentais e a
metodologia analtica usados para o desenvolvimento do estudo da produo de
lipases por Penicillium verrucosum durante a realizao deste trabalho.

3.1 MATERIAIS

3.1.1 REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
Os nutrientes necessrios para a formulao dos meios de cultivo e os
principais reagentes e produtos utilizados encontram-se listados na Tabela 3.1.

3.1.2 EQUIPAMENTOS
Os principais equipamentos utilizados neste estudo foram os seguintes:

Cmara de fluxo laminar (Pachane);
Germinadora para incubao (Tecnal TE-401);
Bomba a vcuo (Marconi);
Banho termosttico (Tecnal TE-210);
Estufa para secagem (Marconi);
Balana analtica (Bel Engineering);
Agitador orbital (Marconi MA-410);
Potencimetro (Gehaka);
Espectrofotmetro (Agilent Tecnologies 8453);
Dessecador (Kartell);
Mixer manual (Black & Decker);
Centrfuga (Hettich).

25
Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados.
Produtos Reagentes
Acetato de sdio (Synth) Fosfato de Sdio Monobsico (Synth)
Acetil Acetona (Vetec) Glicose (Synth)
Acetona (Quimex) Goma Arbica (Synth)
cido actico glacial (Quimex) Hidrolisado de Levedura (Prodeza, Mogi
Mirim-SP)
cido clordrico (Quimex) Hidrxido de Potssio (Quimex)
cido tricloro-actico (Vetec) Hidrxido de Sdio (Nuclear)
Agar (Vetec) Meio PDA* (Acumedia)
gua de macerao de Milho (Corn
Products do Brasil)
Melao (Usina Ester, Cosmpolis-SP)
Amido solvel (Synth) leo de mamona (Delaware)
Azocasena (Sigma) leo de milho (Salada)
Carbonato de Clcio (Vetec) leo de oliva (Arisco)
Carbonato de Sdio (Synth) leo de soja (Soya)
Cloreto de Sdio (Proton) p-dimetilaminobenzaldedo (Vetec)
Etanol (Quimex) Peptona bacteriolgica (Inlab)
Extrato de levedura (Vetec) Biftlato de Potssio (Nuclear)
Farelo de Soja (Olfar) Sulfato de Amnio (Vetec)
Fenolftalena (Nuclear) Sulfato de Magnsio (Synth)
Fosfato de Potssio (Vetec) Tween 80 (Vetec)
Fosfato de Sdio Dibsico (Nuclear)
* Composio: aps o preparo de 39g em 1L o meio contm: 4g/L de infuso de batata,
20g/L de glicose e 15g/L de gar.

3.2 MTODOS

Nesta seo est apresentada a metodologia empregada para a produo de
lipases por Penicillium verrucosum. Primeiramente, ser descrita a metodologia
empregada na execuo dos experimentos por fermentao em estado slido e,
numa segunda etapa, a metodologia empregada na fermentao submersa.
26
3.2.1 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO

3.2.1.1 Microrganismo
O fungo Penicillium verrucosum empregado foi isolado previamente por
Freire (1996) em solo brasileiro. Este microorganismo foi pr-selecionado como
bom produtor de lipases atravs das metodologias de seleo em meio slido e
lquido descritas na literatura (Freire, 1996). Este fungo tem sido
permanentemente estocado em glicerol, slica e meio slido recoberto com leo
mineral sob refrigerao. A propagao de esporos para posterior fermentao foi
feita por um perodo de 7 dias a 27,5C.

3.2.1.2 Inculo
Foram testados dois meios para a produo de inculo. O primeiro
chamado de meio basal constitudo por: amido solvel 2%; leo de oliva 1%;
extrato de levedura 0,1%; MgSO
4
. 7H
2
O 0,025%; KH
2
PO
4
0,5%; CaCO
3
0,5% e
Agar 1,5%, (m/v). Todos os componentes do meio foram solubilizados e levados
fervura para completa dissoluo do amido. Aps a fervura o meio basal foi
emulsificado com auxlio de um mixer manual e 100 mL de meio foram
transferidos para erlenmeyer de 500 mL. O segundo meio (Potato Dextrose Agar -
PDA) constitudo por PDA 3,9% (m/v) e gua destilada. Aps a solubilizao
completa do componente, ocorre a transferncia de 100 mL de meio para
erlenmeyer de 500 mL. Os dois meios foram autoclavados a 121C por 30
minutos.
Do tubo estoque, retirou-se uma alada e transferiu-se para um tubo de
ensaio contendo 10 mL de soluo de Tween 80. Aps a homogeneizao retirou-
se 0,30 mL e inoculou-se nos erlenmeyers j resfriados mantendo-se em cmara
de germinao a 27,5C por 7 dias (Vargas, 2004). O recolhimento de esporos foi
feito adicionando-se 10 mL de soluo de Tween 80 (0,1% v/v) e prolas de vidro
estreis ao erlenmeyer. Retirou-se 1 mL da soluo contendo esporos, este
volume foi transferido para um tubo de 9 mL de soluo de Tween 80 sendo
estocados a 4C por, no mximo, 15 dias.
27
3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo
O substrato utilizado em todos os experimentos de fermentao em meio
slido consistiu de farelo de soja obtido no moinho Olfar (Erechim- RS) o qual foi
peneirado (Tyler 35-60) e armazenado em freezer at o momento da sua
utilizao.
A fermentao em meio slido foi realizada em bqueres de polipropileno
de 500 mL tampados com manta acrlica de acordo com a Figura 3.1.
Em cada bquer eram colocados 10 g de farelo de soja e a adio de gua
ao meio era realizada de acordo com a determinao prvia da umidade desejada
e por gotejamento manual com auxlio de pipeta volumtrica de forma que toda a
rea do farelo fosse recoberta. Os bqueres eram autoclavados a 1,0 atm por 15
minutos e aps o resfriamento, inoculava-se a suspenso de esporos previamente
diluda at concentrao de esporos desejada (4 x 10
8
esporos/g).

Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES.

3.2.1.4 Preparo das amostras
Aps macerao das amostras em cmara de fluxo, retirava-se de cada
frasco duas alquotas de 0,5 g para posterior anlise de umidade e pH. Ao
restante do material, o qual era pesado em erlenmeyers de 250 mL, eram
adicionados 45 mL de tampo fosfato de sdio 100mM pH 7,0 e se efetuava a
28
incubao em agitador orbital temperatura de 37C e velocidade de agitao de
150 rpm por 30 minutos. Em seguida, era feita a extrao da frao lquida por
prensagem manual em filtro de nylon e o sobrenadante era utilizado para a
dosagem de atividade lipsica e protesica. A frao slida retida no filtro era
utilizada para dosagem de glicosamina, que foi utilizada como medida indicativa
do crescimento microbiano.

3.2.1.5 Mtodos Analticos

Caracterizao dos substratos e indutores
A caracterizao do farelo de soja, do hidrolisado de levedura, do melao e
da gua de macerao de milho foi feita seguindo as Normas Analticas do
Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985). As anlises realizadas foram: umidade (diferena
de massa), lipdeos (Mtodo Soxhlet e solvente a frio) e nitrognio (mtodo de
Kjeldahl).

Medida de atividade lipsica
Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipsica, leo de
oliva (10% m/v) emulsionado por trs minutos com goma arbica (5%p/v) em
tampo fosfato de sdio 100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulso contidos em
erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 2mL da amostra. Aps incubao por
15 minutos a 37C e 150 rpm, a reao foi interrompida e os cidos graxos
extrados pela adio de 20 mL de uma soluo de acetona/etanol (1:1 v/v). Os
cidos graxos eram, ento, titulados com uma soluo de NaOH (0,05 M) at pH
11.
Os brancos reacionais eram preparados colocando-se as amostras aps a
incubao em agitador orbital e adicionando-se imediatamente acetona/etanol,
realizando-se aps, a titulao. As dosagens de atividade foram feitas em
duplicata e a mdia aritmtica dos valores encontrados foi utilizada para o clculo
da atividade lipsica.
29
Uma unidade de atividade lipsica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1 mmol de cido graxo por minuto nas condies descritas
acima que pode ser determinada atravs da equao 3.1 (Leal, 2000).

( )
|
\
|
\
|

=
Au
As
m
Vd
Vc t
M Vb Va
A
1000
(3.1)

Onde:

A = atividade lipsica (U/g);
Va = volume da amostra titulada (mL);
Vb = volume do branco titulado (mL);
Vc = volume da amostra usada na reao (mL);
Vd = Volume do tampo usado para a extrao (mL);
t = tempo de reao (minutos);
M = molaridade da soluo de NaOH;
m = massa contida no erlenmeyer (g);
As = massa da amostra seca (g);
Au = massa da amostra mida (g).

Medida de atividade protesica
Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra
e 0,5 mL de soluo de azocasena
1
0,5% (m/v) preparada em tampo acetato 50
mM pH 5,0. Os tubos foram ento incubados durante 15 minutos
2
a 37C. Aps o
perodo de incubao, a reao enzimtica foi interrompida adicionando-se 0,5 mL

1
Detalhes sobre preparo desta soluo ver Anexo 1
2
Tempo determinado aps acompanhamento cintico da reao utilizando algumas amostras

30
de soluo de cido tricloro-actico (TCA) 10% (m/v), em banho de gelo. Os tubos
com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se ento
1 mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1 mL de soluo de hidrxido de
potssio 5 M. Fazia-se ento a determinao da absorbncia da soluo por
espectrofotmetro (Agilent Tecnologies) em 428 nm. O branco das reaes era
preparado adicionando-se a amostra aps a adio do TCA. O branco do aparelho
foi preparado substituindo-se o volume de amostra por tampo acetato 50 mM pH
5,0.
Uma unidade de atividade protesica foi definida como a quantidade de
enzima que produz uma diferena unitria de absorbncia por minuto de reao
entre o branco reacional e a amostra nas condies de ensaio, determinada
atravs da Equao 3.2 (Charney e Tomarelli, 1947).

( )
|
\
|
(
(
|
|
\
|

=
Au
As
m
Vd
Va t
f Abs f Abs
A
b b a
(3.2)

Onde:

A = atividade protesica (U/g);
Abs
a
= leitura de absorbncia da amostra;
Abs
b
= leitura de absorbncia do branco;
f = fator de diluio;
Va = volume de amostra (mL);
Vd = Volume do tampo usado para a extrao (mL);
m = massa contida no erlenmeyer (g);
As = massa da amostra seca (g);
Au = massa amostra mida (g).

31
Medida de crescimento celular
Como forma indireta de quantificar o crescimento celular, foi utilizada a
dosagem de glicosamina, segundo Aidoo et al. (1981). Adicionou-se 5 mL de uma
soluo de cido clordrico 6 M a 0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em
banho de gua fervente por duas horas. Em seguida, a amostra foi resfriada e
filtrada a vcuo. Do sobrenadante, transferia-se 1 mL para um balo de 25 mL,
adicionando-se uma gota de soluo alcolica de fenolftalena 0,5% (p/v). Logo
aps, a neutralizao foi efetuada adicionando-se soluo de hidrxido de sdio 3
N, at que a mistura atingisse a colorao rosa. Procedia-se ento titulao
reversa com uma soluo de KHSO
4
1%, at que a colorao rosa
desaparecesse. O volume do balo foi ento completado com gua destilada.
Aps a etapa de extrao descrita acima, tomava-se 1 mL da soluo e
adicionava-se mesma 1 mL de soluo de acetil acetona
3
em Na
2
CO
3
0,5 N,
colocando a mistura em banho de gua fervente por 20 minutos. Aps o
resfriamento das amostras, adicionava-se 6 mL de etanol, em seguida, 1 mL de
reagente de Erlich
4
. Os tubos foram ento incubados a 65 C por 10 minutos, e a
absorbncia lida em espectofotmetro (Agilent Tecnologies) a 530 nm. O branco
foi preparado adicionando-se gua no lugar da amostra.

3.2.1.6 Estudo da Produo de Lipases

Uso de diferentes indutores
O tempo e a temperatura de fermentao na etapa da escolha dos
indutores foram definidos em 48 horas e 27,5C, respectivamente, segundo
resultados obtidos em estudo com Penicillium simplicissimum (Vargas, 2004). Os
experimentos foram realizados em duplicata para a definio do melhor
suplemento em funo da atividade lipsica obtida.
Os meios de cultivos foram suplementados com os diferentes indutores,
numa concentrao de 1% (p/v), sendo eles: leo de oliva extra-virgem (Arisco);

3,4
Detalhes sobre preparo desta soluo ver Anexo 1

32
leo de milho (Salada); leo de soja (Soya); leo de mamona (Delaware); melao
(Usina Ester, Cosmpolis-SP); hidrolisado de levedura (Prodex lac
- Prodeza-
Mogi Mirim-SP); gua de macerao de milho (Corn Products do Brasil) e glicose
(Nuclear). Utilizou-se farelo puro de soja com duas granulometrias: tyler 16-42 e
tyler 35-60 para verificao da real necessidade de indutores e a influncia da
granulometria na produo da enzima e avaliou-se tambm o efeito do meio de
crescimento, utilizando-se inculo proveniente do meio basal e do meio PDA.
Para a fermentao em estado slido misturou-se o indutor em gua
deionizada e homogeneizou-se com mixer por 2 minutos. O volume da mistura a
ser adicionado no farelo de soja foi determinado de acordo com a umidade final
desejada de 55% (Vargas, 2004), descontando-se 2,5 mL adicionados no
momento da inoculao com a suspenso de esporos e a umidade presente no
farelo.
A adio da mistura (gua e indutor) ao farelo foi feita por gotejamento
manual com auxlio de pipeta volumtrica de forma que toda a rea do farelo fosse
recoberta. Os bqueres foram ento tampados com manta acrlica e papel
alumnio e autoclavados a 1,0 atm por 15 minutos. Aps o resfriamento dos
bqueres, inoculou-se a suspenso de esporos previamente diluda at
concentrao de esporos desejada (4x10
8
esporos/g). A concentrao de esporos
da suspenso de estoque foi determinada por contagem em cmara de Neubauer
aps diluio adequada (10
-3
).

Os bqueres contendo os meios de cultivo foram incubados em cmara de
germinao temperatura de 27,5C por 48 horas com injeo de ar umidificado,
de forma a manter a umidade da cmara em 99%. Ao final do tempo de
fermentao, as amostras foram retiradas para posterior anlise.

Otimizao das condies de processo na produo de lipases
A tcnica de planejamento de experimentos uma ferramenta estatstica
que permite determinar as variveis que exercem maior influncia no desempenho
de um determinado processo, assim como avaliar possveis inter-relaes entre
variveis de um processo. Alm disso, essa ferramenta tambm permite otimizar o
33
sistema em estudo, com o objetivo de maximizar ou minimizar uma resposta. A
principal vantagem da utilizao desta ferramenta a reduo do nmero de
experimentos e a conseqente reduo de custos (Barros et al., 1996).
Para que as condies de produo de lipases pelo fungo Penicillium
verrucosum fossem otimizadas, utilizou-se a tcnica de planejamento fatorial de
experimentos e anlise de superfcie de resposta.
Um planejamento fatorial completo 2
2
com dois pontos axiais para cada
varivel independente e um ponto central repetido trs vezes foi realizado. O
tempo de fermentao foi fixado em 48 horas. A metodologia de superfcie de
resposta foi utilizada para determinar a influncia das variveis estudadas e
otimizar as condies de cultivo para a produo de lipases por fermentao em
estado slido.
As variveis e nveis estudados encontram-se na Tabela 3.2 e foram
determinadas com base na experincia prvia do grupo (Capra et al; 2003) e
trabalhos disponveis na literatura (Vargas, 2004).

Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 2
2

para otimizao das condies de processo.
Nvel Temperatura (C) Umidade (%)
-1,41 15 30
-1 18,6 37,3
0* 27,5 55
+1 36,4 72,7
+1,41 40 80
* Ponto Central

Ao final dos experimentos, os resultados obtidos foram analisados usando-
se o programa Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.,2001).

Cinticas de fermentao
Para realizao do estudo cintico, avaliou-se o efeito da concentrao de
substrato, utilizando-se a condio otimizada da etapa anterior (sem adio de
34
suplemento) e com adio de 0,5% e 2,0% de leo de soja. O tempo de
fermentao foi de 156 horas, avaliando-se a atividade lipsica a cada 12 horas.

Avaliao de parmetros cinticos
Com o intuito de avaliar a evoluo dos valores de crescimento celular e
dos valores do produto (atividade lipsica) formado em funo do tempo,
determinou-se os parmetros cinticos ou parmetros de transformao. A Figura
3.2 demonstra algumas curvas de ajuste que permitem calcular os parmetros
desejados.
Foram construdas curvas de Atividade Lipsica x Tempo e Concentrao
de Glicosamina x Tempo de onde se retirou os valores para os clculos utilizando
as equaes 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 e 3.9 (Borzani et al., 2001).

Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de
fermentao.

r
X
= dX/dt (3.3) r
P
= dP/dt (3.7)
X
= (1/X)*dX/dt (3.4)
P
= (1/X)*r
P
(3.8)
P
X
= (Xf Xo)/tf (3.5) P
P
= (Pf Po)/tf (3.9)
Y
X/P
=
X
/
P
(3.6)

35
Onde:
r
X
: velocidade instantnea de produo de biomassa;
r
P
: velocidade instantnea de formao de produto;
X
: velocidade especfica de formao de biomassa num determinado tempo;
P
: velocidade especfica de formao de produto num determinado tempo;
P
X
: Produtividade em biomassa;
P
P
: Produtividade em produto;
Y
X/P
: Fator de converso de biomassa em produto;
tf: Tempo de fermentao em que se deseja conhecer a produtividade.
A velocidade instantnea e o fator de converso (biomassa/produto) foram
obtidos na fase exponencial de crescimento (t=48h); j os demais parmetros
foram determinados no tempo desejado.

3.2.1.7 Caracterizao da lipase obtida por fermentao em estado slido

Temperatura e pH timos
Na determinao dos valores timos de temperatura e pH para a atividade
lipsica, foi realizado um planejamento fatorial completo 2
2
. Preparou-se a
emulso utilizada como substrato para medida de atividade lipsica com diferentes
valores de pH de tampo fosfato de sdio e as amostras foram incubadas a
variadas temperaturas por 15 minutos e 150 rpm. As faixas de pH e temperatura
estudadas esto relacionadas na Tabela 3.3. Os experimentos foram realizados
em duplicata.

Temperatura de estabilidade
A fim de determinar a temperatura de estabilidade do extrato enzimtico
obtido por fermentao em estado slido, este foi submetido diferentes
temperaturas no banho termosttico, sendo estas: 25C, 35C, 45C, 55C, 65C.
As dosagens de atividade lipsica nos tempos 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24
horas aps incubao foram realizadas conforme descrito anteriormente. Os
experimentos foram realizados em duplicata.
36
2
para
temperatura e pH timos.
Nvel Temperatura (C) pH
-1,41 29,95 4,88
-1 32 5,5
0* 37 7,0
+1 42 8,5
+1,41 44,05 9,11
* Ponto Central

pH de estabilidade
Para determinao do pH de estabilidade, a enzima foi extrada com
tampo fosfato de sdio 100 mM formulados com os seguintes valores de pH: 5,5;
6,0; 6,5; 7,0 e 7,5. O extrato enzimtico foi incubado a 50C e a determinao da
atividade lipsica foi realizada conforme descrito anteriormente, nos tempos 0, 15
e 30 minutos, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas aps incubao. Os experimentos foram
realizados em duplicata.

3.2.2 FERMENTAO SUBMERSA

3.2.2.1 Microrganismo
A descrio do microrganismo e a metodologia usada para a manuteno
do mesmo foi apresentada no item 3.2.1.1.

3.2.2.2 Inculo
O meio para a produo de inculo foi defno estudo por FES e era
constitudo por PDA 3,9% (m/v) e gua destilada e a metodologia empregada foi
descrita no item 3.2.1.2.

37
3.2.2.3 Preparo dos meios de cultivo
Para a conduo do processo por fermentao submersa, para fins de
comparao, utilizou-se um meio sinttico e outro industrial. O primeiro era
composto por peptona bacteriolgica, extrato de levedura, cloreto de sdio e leo
de oliva. O segundo consistiu de gua de macerao de milho (AMM), hidrolisado
de levedura (Prodex Lac), cloreto de sdio e leo de oliva.
A fermentao em meio submerso foi realizada em erlenmeyers de 250 mL
tampados com algodo envolvido por gaze. Os meio de cultivo eram esterilizados
a 1,0 atm por 15 minutos e aps seu resfriamento eram inoculados com a
suspenso de esporos com concentrao de 2x10
6
esporos/mL.

3.2.2.4 Preparo das amostras
Aps o perodo de fermentao, as amostras eram filtradas em filtros
whatman 44 e o sobrenadante era utilizado para dosagem de atividade lipsica e
protesica. A frao slida retida no filtro era usada para avaliar o crescimento
celular por massa seco.

3.2.2.5 Mtodos Analticos

Caracterizao dos substratos e indutores
A caracterizao dos substratos e indutores foi realizada conforme item
descrito para fermentao em estado slido.

Medida de atividade lipsica
Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipsica, leo de
oliva (10% m/v) emulsionado por trs minutos com goma arbica (5%p/v) em
tampo fosfato de sdio 100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulso contidos em
erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 2mL da amostra. Aps incubao por
15 minutos a 37C e 150 rpm, a reao foi interrompida e os cidos graxos
extrados pela adio de 20 mL de uma soluo de acetona/etanol (1:1 v/v). Os
38
cidos graxos eram, ento, titulados com uma soluo de NaOH (0,05 M) at pH
11.
Os brancos reacionais eram preparados colocando-se as amostras aps a
incubao em agitador orbital e adicionando-se imediatamente acetona/etanol,
fazendo-se aps, a titulao. As dosagens de atividade foram feitas em duplicata e
a mdia aritmtica dos valores encontrados foi utilizada para o clculo da atividade
lipsica.
Uma unidade de atividade lipsica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1 mmol de cido graxo por minuto nas condies descritas
acima, e pode ser determinada atravs da equao 3.10 (Leal, 2000).

( )
Vc t
M Vb Va
A

=
1000
(3.10)

Onde:
A = atividade lipsica (U/mL);
Va = volume da amostra titulada (mL);
Vb = volume do branco titulado (mL);
Vc = volume da amostra usada na reao (mL);
M = molaridade da soluo de NaOH.

Medida de atividade protesica
Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra
e 0,5 mL de soluo de azocasena
5
0,5% (p/v) preparada em tampo acetato 50
mM pH 5,0. Os tubos foram ento incubados durante 15 minutos
6
a 37C. Aps o
perodo de incubao, a reao enzimtica foi interrompida adicionando-se 0,5 mL
de soluo de cido tricloro-actico (TCA) 10% (p/v), em banho de gelo. Os tubos

5
Detalhes sobre preparo desta soluo ver Anexo I
6
Tempo determinado aps acompanhamento cintico da reao utilizando algumas amostras
39
com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se ento
1mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1mL de soluo de hidrxido de
potssio 5M. Fazia-se ento a determinao da absorbncia da soluo por
espectrofotmetro (Agilent Tecnologies) em 428nm. O branco das reaes era
preparado adicionando-se a amostra aps a adio do TCA. O branco do aparelho
foi preparado substituindo-se o volume de amostra por tampo acetato 50mM pH
5,0.
Uma unidade de atividade protesica foi definida como a quantidade de
enzima que produz uma diferena unitria de absorbncia por minuto de reao
entre o branco reacional e a amostra nas condies de ensaio, determinada
atravs da Equao 3.11 (Charney e Tomarelli, 1947).

( )
Va t
f Abs f Abs
A
b b a a

=
(3.11)

Onde:
A = atividade protesica (U/mL);
Abs
a
= leitura de absorbncia da amostra;
Abs
b
= leitura de absorbncia do branco;
f = fator de diluio;
Va = volume de amostra (mL).

Medida do crescimento celular
O crescimento microbiano por fermentao submersa foi quantificado pelo
peso seco das amostras. Um volume conhecido da amostra era filtrado em papel
Whatman n44 previamente dessecado em estufa a 105C por 4 horas. Aps a
filtrao, os filtros eram incubados na mesma estufa e pesados periodicamente at
a obteno do peso constante. A biomassa foi determinada pela equao 3.12.

40
( )
a
a
V
F F
B
1000
=
(3.12)

Onde:
B = Biomassa (mg/mL);
F
a
= Filtro com amostra aps dessecao (mg);
F = Filtro dessecado (mg);
V
a
= Volume da amostra filtrada (mL).

3.2.2.6 Estudo da Produo de Lipases

Uso de diferentes indutores
O tempo e a temperatura de fermentao na etapa da escolha dos
indutores foram definidos em 48 horas e 27,5C, respectivamente, segundo
resultados obtidos em estudo com Penicillium simplicissimum (Vargas, 2004). Os
experimentos foram realizados em duplicata para a definio do melhor
suplemento em funo da atividade lipsica obtida.
Os meios de cultivos foram suplementados com os diferentes indutores,
numa concentrao de 1% (m/v), sendo eles: leo de oliva extra-virgem (Arisco);
leo de milho (Salada); leo de soja (Soya); leo de mamona (Delaware); melao
(Usina Ester, Cosmpolis-SP); hidrolisado de levedura (Prodex lac
- Prodeza-
Mogi Mirim-SP), gua de macerao de milho (Corn Products do Brasil) e glicose
(Nuclear).

Para a avaliao do melhor indutor para a produo de lipases utilizou-se o
meio sinttico suplementado com os diferentes indutores j descritos, sendo que
os indutores lipdicos substituram o leo de oliva, o qual faz parte da composio
do meio.
Os erlenmeyers contendo o meio suplementado foram ento tampados com
algodo, gaze e papel alumnio e levados autoclave a 1,0atm por 15 minutos.
Aps o resfriamento destes, inoculou-se a suspenso de esporos previamente
diluda at concentrao de esporos desejada (2x10
6
esporos/g). A concentrao
41
de esporos da suspenso de estoque foi determinada por contagem em cmara
de Neubauer (200 mm) aps diluio adequada (10
-3
).

A incubao dos meio foi feita em agitador orbital temperatura de 27,5C
por 48 horas a 150rpm. Ao final do tempo de fermentao, as amostras foram
retiradas para posterior anlise.

Otimizao das condies de processo na produo de lipases
Assim como foi feito no estudo de otimizao de produo de lipases por
fermentao em estado slido, para que as condies de produo de lipases por
fermentao submersa fossem otimizadas, utilizou-se a tcnica de planejamento
fatorial de experimentos e anlise de superfcie de resposta.
Na primeira etapa do estudo de otimizao da produo de lipases aplicou-
se no meio sinttico a tcnica de planejamento de experimentos utilizando-se uma
matriz do tipo Plackett-Burman (PB) de 12 ensaios mais 3 pontos centrais, para
que os principais efeitos das variveis em estudo pudessem ser avaliados. A
Tabela 3.4 apresenta a faixa de valores estudados neste planejamento. Aps
anlise dos resultados aplicou-se um planejamento fatorial completo 2
2
para este
meio, cuja faixa de valores est apresentada na Tabela 3.5.

sinttico.
Nvel
Temperatura
(C)
Inculo
(%m/v)
Peptona
(%m/v)
Extrato de
levedura
(%m/v)
Cloreto de
sdio
(%m/v)
leo de
oliva
(%m/v)
-1 28 2,5 2 0,5 0,5 1
0* 32 7,5 5 1,75 1,75 1,5
+1 36 12,5 8 3 3 2
*Ponto Central

De forma similar primeira etapa do estudo de otimizao da produo de
lipases utilizando um meio sinttico, aplicou-se para o meio industrial uma matriz
42
do tipo Plackett-Burman (PB) de 12 ensaios mais 3 pontos centrais, sendo que a
faixa de valores estudados neste planejamento est descrita na Tabela 3.6. Aps
anlise dos resultados aplicou-se um planejamento fatorial completo 2
3
para o
meio industrial, cuja faixa de valores est apresentada na Tabela 3.7.

2
para
o meio de cultura sinttico por FS.
Nvel Temperatura (C) Peptona (%m/v)
-1 20 4
0* 28 8
+1 36 12
* Ponto Central

industrial.
Nvel
Temperatura
(C)
Inculo
(%m/v)
gua de
Macerao
de Milho
(%m/v)
Hidrolisado de
Levedura
(%m/v)
Cloreto de
sdio
(%m/v)
leo de
oliva
(%m/v)
-1 28 2,5 2 0,5 0,5 1
0* 32 7,5 5 1,75 1,75 1,5
+1 36 12,5 8 3 3 2
* Ponto Central

Cinticas de fermentao
Para realizao dos estudo cinticos, avaliou-se o efeito das concentraes
dos substratos nos tempos de 48, 72 e 96 horas. As melhores condies
encontradas para os meios sinttico e industrial foram avaliadas em at 108 horas,
dosando-se a atividade lipsica a cada 12 horas.

43
3
para
o meio de cultura industrial por FS.
Nvel Temperatura (C) gua de Macerao
de Milho (%p/v)
Hidrolisado de
Levedura
(%p/v)
-1 20 4 2
0* 28 8 4
+1 36 12 6
* Ponto Central

3.2.2.7 Caracterizao da lipase obtida por fermentao submersa

Nesta etapa, a lipase obtida por FS foi parcialmente caracterizada em
termos de temperatura e pH timos, conforme metodologia descrita a seguir.

Temperatura e pH timos
Na determinao dos valores timos de temperatura e pH para a atividade
lipsica, foi realizado um planejamento fatorial completo 2
2
tanto para o extrato
enzimtico bruto obtido em meio sinttico, quanto para o extrato obtido em meio
industrial. Adicionou-se tampo fosfato de sdio com diferentes valores de pH
emulso utilizada como substrato para medida de atividade lipsica e as amostras
foram incubadas diferentes temperaturas por 15 minutos e 150rpm. As faixas de
pH e temperatura estudadas esto relacionadas na Tabela 3.8. Os experimentos
foram feitos em duplicata.

2
para
temperatura e pH timos da enzima obtida por FS.
Nvel Temperatura (C) pH
-1,41 29,95 4,88
-1 32 5,5
0* 37 7,0
+1 42 8,5
+1,41 44,05 9,11
* Ponto Central
Captulo 4 Resultados e Discusso
44
4 RESULTADOS E DISCUSSO

Neste captulo sero apresentados e discutidos todos os resultados obtidos
ao longo dos processos de produo e de caracterizao parcial da(s) lipase(s) de
Penicillium restrictum obtidos por fermentao em estado slido e fermentao
submersa. Primeiramente ser apresentada a caracterizao dos substratos e
indutores utilizados no desenvolvimento deste trabalho.

4.1 CARACTERIZAO DOS SUBSTRATOS E INDUTORES

A Tabela 4.1 apresenta os resultados da caracterizao dos substratos e
dos indutores utilizados neste trabalho.

Tabela 4.1. Caracterizao dos substratos e indutores.
Amostra Gordura (%) Umidade (%) Protena (%)
Farelo de Soja 2,4 12,8 35,8
Melao de cana 0,7 39,0 2,2
gua de macerao de milho 0,6 59,0 19,3
Hidrolisado de levedura 1,2 9,6 39,8
Extrato de levedura 0 5,4 8,9
Cloreto de sdio 0 5,9 0
leo de soja 100 0 0
leo de milho 100 0 0
leo de mamona 100 0 0
leo de oliva 100 0 0
Peptona bacteriolgica 0 5,6 12,5

Atravs da caracterizao pode-se considerar que o farelo de soja um
meio rico em nutrientes e, portanto, pode constituir-se em um substrato adequado
fermentao em estado slido. De fato, ao se comparar a composio deste
meio com tortas provenientes da agroindstria, observa-se que o teor de
45
nitrognio (proporcional ao teor de protena) do farelo de soja maior do que o
teor de nitrognio de tortas como a de babau (Gombert et al., 1999; Palma et al.,
2000; Leal et al., 2003, Castilho et al., 2000), de coco, de arroz, farelo de trigo (Ul-
Haq et al., 2002) e torta de oliva (Cordova et al., 1998), porm menor que o teor
de nitrognio obtido em torta de soja por Vargas (2004). Ainda assim, optou-se por
se realizar um estudo sistemtico da suplementao do farelo de soja com outros
componentes de baixo custo, a fim de se verificar as necessidades nutricionais do
microrganismo para maximizar a produo de lipase.
Alguns desses suplementos tambm foram caracterizados para verificao
do teor de nitrognio, umidade e gordura, sendo que a umidade obtida foi levada
em considerao nos ajustes de umidade dos meios durante os experimentos
realizados por fermentao em estado slido. O hidrolisado de levedura e a gua
de macerao de milho, ao contrrio do melao de cana, apresentam alto teor de
nitrognio, pois a diferena entre os valores obtidos pode ser amenizada pelo alto
teor de umidade da gua de macerao de milho, sendo considerados, ento,
bons suplementos para incrementar o teor deste componente no meio, podendo
ser tambm utilizados como substratos para fermentao submersa. J os leos
foram considerados fontes suplementares de carbono no meio pois os mesmos
somente contm lipdeos.

4.2 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO

Neste item sero apresentados e discutidos os resultados referentes
produo de lipases por Penicillium verrucosum em fermentao em estado
slido.

4.2.1 ESTUDO DO INDUTOR
O teste de indutores para produo de lipases foi realizado em 48 horas de
fermentao, tempo fixado com base em estudos anteriores com P.
46
simplicissimum (Vargas, 2004). Os resultados esto apresentados na Tabela 4.2 e
podem ser melhor visualizados atravs da Figura 4.1.

Tabela 4.2. Indutores estudados para produo de lipases por FES e suas
respectivas atividades enzimticas.
Indutor Atividade Lipsica (U/g)
Desvio Padro ( )
Controle (farelo tyler 16-42) com inculo em meio
basal
43,3 2,2
Controle + leo de Soja (1% m/v) 16,7 7,9
Controle + leo de Oliva (1% m/v) 10,0 2,0
Controle + leo de Milho (1% m/v) 11,5 0,6
Controle + Glicose (1% m/v) 3,2 0,6
Controle + leo de Mamona (1% m/v) 6,5 1,1
Farelo (tyler 35-60) 20,6 2,9
Controle + Melao (1% m/v) 23,3 0,2
Farelo (tyler 35-60) com inculo em PDA 52,2 9,1
Controle + Hidrolisado de levedura (1% m/v) 24,0 2,9
Controle + gua de macerao de milho (1% m/v) 7,0 0,4

Atravs da anlise estatstica (Teste Tukey), observou-se que no existe
diferena significativa entre as amostras de farelo puro (controle, Farelo tyler 35-
60 com inculo em PDA e Farelo tyler 16-42 com inculo em PDA). Para a real
verificao, fez-se uma nova anlise estatstica entre as trs melhores amostras. A
Tabela 4.3 apresenta os resultados da segunda anlise estatstica.

47
0
10
20
30
40
50
60
C tyler
16-42
OS OO OM Gli OM F tyler
35-60
Mel F tyler
35-60
PDA
F tyler
16-42
PDA
Hid AMM
Indutor
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
g
)

indutores estudados por FES.

Tabela 4.3. Anlise estatstica (Teste de Tukey) dos melhores resultados obtidos.
Indutor Atividade Lipsica (U/g)
Desvio Padro ( )
Controle (farelo tyler 16-42) 43,3 2,28
a

a

a

Obs: Letras iguais correspondem amostras sem diferena significativa a nvel de 5%.

Observa-se que a adio de diferentes indutores, na concentrao de 1%
(m/v), no tem efeito na produo de lipases pelo fungo Penicillium verrucosum,
sendo que se constatou que o farelo puro obteve as maiores atividades lipsicas,
independente da granulometria do mesmo. Atravs da anlise estatstica concluiu-
se que no existe diferena significativa a nvel de 5% entre as trs melhores
amostras na produo de lipase e optou-se por adotar o farelo de soja com tyler
16-42 como substrato para os estudos posteriores.
Nesta etapa foi possvel se obter uma atividade lipsica de
aproximadamente 40 U/g de farelo seco em 48 horas de fermentao, sendo este
valor maior que o encontrado por Gombert et al. (1999) que avaliaram a produo
48
de lipase por Penicillium restrictum utilizando torta de leo de babau como
substrato obtendo a atividade mxima de 6 U/g de torta em 24 horas de
fermentao.

4.2.2 ESTUDO DO INCULO IDEAL
Apesar de no haver diferena significativa a nvel de 5% entre o controle e
o farelo de soja com inculo em PDA, realizou-se um estudo cintico com tempo
de fermentao de 48 horas para definio do inculo ideal, levando-se em
considerao, alm da atividade lipsica, a facilidade de obteno do meio e a
homogeneidade de crescimento celular. Os inculos estudados foram
provenientes de dois meios diferentes meio basal e meio PDA - utilizando farelo
de soja com granulometria tyler 16-42 para ambos. A Tabela 4.4 apresenta os
resultados do estudo cintico e estes podem ser melhor observados na Figura 4.2.

Tabela 4.4. Resultados do estudo cintico para a atividade lipsica em meio basal
e PDA.
Tempo
(horas)
Atividade Lipsica (U/g)
Desvio Padro ( )
Controle
Desvio Padro ( )
PDA
12 0 2,68 0 0,34
24 4,9 2,70 3,2 0,70
36 10,2 1,06 9,0 0,01
48 25,0 0,05 35,0 0,06
72 39,9 11,54 16,6 5,14
96 15,8 1,19 19,4 0,37
120 25,5 3,31 15,6 3,61
144 19,4 8,90 11,9 0,74
168 16,1 5,32 32,3 8,96

49
Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
s
i
c
a

(
U
/
g
)
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
CONTROLE
PDA

Figura 4.2. Cintica de produo de lipase em meio basal e PDA.

De acordo com a Figura 4.2, pode-se observar que o inculo oriundo do
meio PDA apresentou uma atividade lipsica superior para um tempo de 48 horas,
tempo este em estudo. Devido, ento, a esta maior atividade lipsica bem como
facilidade de preparo do meio e homogeneidade de crescimento das clulas,
definiu-se que o inculo proveniente do meio PDA seria o ideal para as
fermentaes.

4.2.3 AVALIAO DA CONCENTRAO DE SUPLEMENTO NA PRODUO
DE LIPASES POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
Em estudo anterior, avaliou-se a produo de lipases utilizando-se uma
concentrao de suplemento fixada em 1% m/v. Com o intuito de estudar o
comportamento da atividade lipsica em diferentes concentraes de suplemento,
variou-se a adio de leo de soja em 0,5% e 2,0% m/v, faixa inferior e superior
estudada. A escolha deste suplemento baseia-se em Pastore et al. (2003), que diz
que os substratos naturais de lipases so os triacilgliceris, apresentando maior
afinidade por cidos graxos de cadeia longa, e tambm no fato do substrato j
50
conter leo de soja e este, dentre os leos estudados, ter mostrado o melhor
resultado.
A Figura 4.3 apresenta as curvas cinticas obtidas de atividade lipsica
para as variveis estudadas. Observa-se que a atividade lipsica obtida
apresentou um pico de atividade mxima de cerca de 52 U/g, em torno de 72
horas de fermentao para a amostra controle. Observa-se, tambm, que ocorre
diminuio da atividade lipsica quando o meio suplementado, confirmando o
estudo anterior.

Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0
10
20
30
40
50
60
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
CONTROLE
0,5 %
2,00 %

Figura 4.3. Curvas cinticas de atividade lipsica em funo da concentrao de
leo de soja por FES.

Geralmente os lipdios promovem um aumento da produo de lipases
(Gombert et al., 1999; Domnguez et al., 2003; Mahadik et al., 2002), entretanto,
neste estudo as fontes lipdicas parecem ter exercido um efeito inibitrio na
produo da enzima. Uma situao semelhante foi observada por Vargas (2004)
que avaliou a produo de lipase por Penicillium simplicissimum e verificou que a
adio de diferentes leos torta de soja usada como substrato provocou uma
diminuio da produo de lipases, dando indicativos de ocorrncia de inibio por
excesso de substrato.
51
4.2.4 OTIMIZAO DA PRODUO DE LIPASE POR FERMENTAO EM
ESTADO SLIDO

Nesta etapa, avaliou-se o efeito da temperatura e da umidade na produo
de lipase por fermentao em estado slido. Foi utilizado um planejamento fatorial
completo com pontos axiais para verificao dos efeitos de primeira e segunda
ordem bem como as interaes entre as variveis.
A Tabela 4.5 apresenta a matriz do planejamento com os valores reais,
codificados e as respostas para a atividade lipsica. interessante observar que
as condies se basearam em estudo anterior realizado por Vargas (2004), que
utilizou Penicillium simplicissimum e torta de soja como substrato.

Tabela 4.5. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para produo de lipases por FES.
Ensaio Temperatura
(C)
Umidade
(%)
Desvio Padro ( )
1 -1 (18,6) -1 (37,3) 2,4 0,30
2 +1 (36,4) -1 (37,3) 5,3 1,30
3 -1 (18,6) +1 (72,7) 7,7 1,12
4 +1 (36,4) +1 (72,7) 18,3 1,99
5 -1,41 (15) 0 (55) 4,4 0,34
6 +1,41 (40) 0 (55) 4,0 2,27
7 0 (27,5) -1,41 (30) 4,9 2,28
8 0 (27,5) +1,41 (80) 29,2 1,51
9* 0 (27,5) 0 (55) 36,5
10* 0 (27,5) 0 (55) 37,7
11* 0 (27,5) 0 (55) 48,2
* Ponto central

Verifica-se que o ensaio que apresentou uma maior atividade enzimtica
em 48 horas de fermentao corresponde ao ponto central (T= 27,5C e U=55%),
52
seguido da condio experimental 7 (T=27,5C e U=80%). A mnima atividade
lipsica obtida no planejamento foi encontrada na condio experimental 1
(T=18,6C e U=37,3%). Observa-se neste estudo que o microrganismo tende a
produzir mais lipase, dentro da faixa de estudo das variveis, de condies
intermedirias a condies superiores de umidade. Os valores mximos de
atividade enzimtica obtidos nos pontos centrais caracterizaram que a mesma foi
otimizada em funo da temperatura e umidade dentro da faixa estudada.
A Equao 4.1 apresenta o modelo codificado otimizado para a produo
da enzima em funo da temperatura e da umidade, o qual foi validado pela
anlise de varincia apresentada na Tabela 4.6. Verifica-se que o coeficiente de
correlao obtido (0,90) e o teste F (4,3 vezes maior que o valor tabelado)
validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construo da
superfcie de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.4.

Atividade lipsica (U/g)= 40,8 20,5.Temperatura
2
13,06.Umidade
2
(4.1)

Tabela 4.6. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FES.
Fonte de Variao Soma
Quadrtica
Graus de
Liberdade
Mdia
Quadrtica
F calculado
Regresso 2672,78 2 1336,39 19,34
Resduo 552,77 8 69,10
Falta de ajuste 470,27 6
Erro puro 82,50 2
Total 3225,55 10
Coeficiente de correlao: R=0,90 , F
0,95;2;8
=4,46
53

15 27,5 40
Temperatura (
o
C)
30
55
80
U
m
i
d
a
d
e

(
%
)

Figura 4.4. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida por FES.

A atividade lipsica mxima obtida para 48 horas de fermentao para o
fungo Penicillium verrucosum foi de, aproximadamente, 40,8 U/g de farelo seco,
valor este maior se comparado com Vargas (2004) que utilizou Penicillium
simplicissimum e torta de soja como substrato e obteve 12,5 U/g de torta seca
para 48 horas de fermentao e cerca de 30 U/g para 80 horas de fermentao.
54
Verifica-se que a atividade obtida superior encontrada por Gutarra
(2003), que utilizou torta de babau suplementada com 3,3% de leo de oliva e
obteve, aproximadamente, 6 U/g em 48 horas e 18,5 U/g em 72 horas de
fermentao com Penicillium verrucosum. Gombert et al. (1999) utilizaram torta
de babau enriquecida com 2% de leo de oliva e estudaram a produo da
enzima por Penicillium restrictum encontrando 30,3 U/g em 24 horas de
fermentao.
A produo de lipases verificada neste estudo superou tambm os valores
relatados por Cordova et al. (1998) que avaliaram a produo de lipases por
Rhizomucor pusillus fazendo uso de bagao de cana de acar e torta de leo de
oliva como substratos, obtendo uma produo enzimtica mxima de 20,24 U/g
em 25 horas de fermentao.
Observa-se que em temperaturas superiores e inferiores do ponto central
h uma queda na produo da enzima, j para uma umidade muito superior (80%)
do ponto central (55%) e mantendo-se a temperatura de 27,5C, verifica-se que
a atividade lipsica apresenta valores satisfatrios. Isto pode ocorrer devido ao
fato de que os fungos produtores de lipases, em geral, so mesfilos,
apresentando temperatura tima entre 20 e 30C (Toida et al., 1995); e a
umidade em nveis muito baixos, prejudica o transporte de nutrientes e toxinas
atravs da membrana e pode causar a perda das propriedades funcionais de
enzimas da cadeia metablica celular (Gervais e Molin, 2003).

4.2.5 CINTICA DE PRODUO DE LIPASE PARA A CONDIO OTIMIZADA
A melhor condio para a produo da lipase por fermentao em estado
slido, determinada atravs da metodologia de anlise da superfcie de resposta,
foi a condio experimental correspondente ao ponto central do planejamento
experimental (T=27,5C e U=55%). Nesta condio foi ento avaliado o
comportamento cintico da fermentao. A cintica de crescimento celular,
produo de lipases e atividade protesica, para a condio otimizada encontram-
se na Figura 4.5.
55
Observa-se na curva de atividade lipsica uma queda de produo a partir
de 72 horas de fermentao, o que pode ser explicado pelo aumento da atividade
protesica, onde o pico mximo de produo ocorreu em 132 horas de
fermentao com valor de 0,69 U/g, valor este semelhante ao obtido por Vargas
(2004) e menor que o obtido por Gutarra (2003).
Nesta etapa, observou-se que o crescimento mximo microbiano se deu em
156 horas de fermentao, sendo este de 76,9 mg/g, o que caracteriza um alto
crescimento. Vargas (2004) obteve em 48 horas de fermentao com o fungo
Penicillium simplicissimum uma concentrao de glicosamina de 7,2 mg/g. Neste
estudo, em 48 horas de fermentao, a concentrao obtida foi de 33,1 mg/g,
podendo-se concluir ento que o meio de cultivo utilizado bom para o
crescimento celular.

Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
s
i
c
a

(
U
/
g
)
C
o
n
c
.

d
e

G
l
i
c
o
s
a
m
i
n
a

(
m
g
/
g
)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
r
o
t
e
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
ATIV. LIPSICA
GLICOSAMINA
ATIV. PROTESICA

Figura 4.5. Cintica de produo de lipase, protease e crescimento celular
(glicosamina) por FES.

A queda da atividade lipsica a partir de 72 horas de fermentao pode ter
ocorrido tambm pela sua desativao com aumento do pH do meio pela ao da
protease, fato este que pode ser observado na Figura 4.6.

56
Tempo (horas)
p
H
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
r
o
t
e
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
5.2
5.6
6.0
6.4
6.8
7.2
7.6
8.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
pH
Ativ. Protesica

Figura 4.6. Evoluo do pH e atividade protesica ao longo da FES.

Observa-se na Figura 4.6 que o pH apresenta o mesmo comportamento
que a atividade protesica, ou seja, medida que a atividade protesica aumenta,
h um aumento tambm no pH, ainda que bem pequeno. O aumento de atividade
protesica e pH ao longo do tempo de fermentao foi observado por Freire et al.
(1997a), Palma et al. (2000), Vargas (2004) e Gombert et al. (1999). Os
pesquisadores citados anteriormente sugerem que este efeito esteja
possivelmente relacionado protelise, que gera aminocidos, cuja desaminao
libera amnia para o meio.

4.2.5.1 Avaliao dos parmetros cinticos
Com base nas curvas cinticas obtidas no estudo anterior, determinou-se
alguns parmetros cinticos com o intuito de avaliar a eficincia do processo de
produo de lipase usando-se como microrganismo o fungo Penicillium
verrucosum.
Na Figura 4.6 pde-se visualizar as curvas de crescimento celular e
atividade lipsica e atividade protesica referentes condio otimizada no
planejamento experimental (T=27,5C e U=55%; crescimento celular em meio
PDA, farelo de soja tyler 16-42 como substrato).
57
Atravs da figura apresentada anteriormente, calculou-se na fase
exponencial a velocidade instantnea de produo de biomassa (r
X
), velocidade
instantnea de formao de produto (r
P
) e o fator de converso de biomassa em
produto (Y
X/P
). Obteve-se tambm em 48 horas de fermentao as velocidades
especficas de formao de biomassa (
X
) e de formao de produto (
P
), bem
como a produtividade em biomassa (P
X
) e a produtividade em produto (P
P
). Os
valores desses parmetros cinticos encontram-se na Tabela 4.7.

Tabela 4.7. Parmetros cinticos para produo de lipase por FES utilizando
Penicillium verrucosum.
Parmetro r
X
(U/g.h) r
P
(U/g.h) Y
X/P

X
(h
-1
)
P

(h
-1
)
P
X

(mg/g.h)
P
P
(U/g.h)
Fase
exponencial
1,019 1,636 0,63 - - - -
48 h de
fermentao

-

-

-

0,026

0,041

0,48

0,80

A produtividade em produto foi determinada em 72 horas de fermentao,
onde encontrou-se 0,74 U/g.h. Comparando-se com outros trabalhos realizados
verifica-se que este valor supera a produtividade em produto obtida por Gutarra
(2003), que obteve 0,26 U/g.h. em 72 horas de fermentao, e tambm por
Castilho et al. (2000) que avaliaram a produtividade da enzima produzida em 24
horas de fermentao por Penicillium restrictum utilizando torta de babau e leo
de oliva como substratos, obtendo 0,24 U/g.h.

4.2.6 CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE PRODUZIDA POR
FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
Aps a extrao da enzima produzida por fermentao em estado slido na
condio otimizada, procedeu-se a sua caracterizao parcial.

58
4.2.6.1 Temperatura e pH timos
A determinao dos valores de temperatura e pH timos foi feita atravs da
realizao de um planejamento fatorial 2
2
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos
centrais, e a matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipsica obtidos esto apresentados na Tabela 4.8. Observando-se os
resultados de atividade enzimtica obtidos verifica-se que o valor mximo
encontra-se no ensaio 6, o qual corresponde a um pH de 7,0 e temperatura de
44C.
Em relao ao pH timo, Kamini et al. (1998) caracterizaram a lipase de
Aspergillus niger e encontraram um valor de 7,0. Um resultado similar foi obtido
por Benjamin e Pandey (2001), os quais relataram que uma das trs formas
distintas de lipases produzidas por Candida rugosa apresentou atividade tima em
pH 7,0 e temperatura de 40C. Esta mesma temperatura foi encontrada como
tima por Pastore et al. (2003) que estudaram a caracterizao de lipase
produzida por Rhizopus sp. e determinaram um pH timo entre 6,0 e 6,5. A
caracterizao parcial da lipase produzida por Yarrowia lipolytica foi executada por
Martins (2001) que determinou a temperatura tima de 45C e pH timo de 9,0
para a enzima. A mesma temperatura foi reportada como tima por Shu et al.
(2006) em um estudo de caracterizao de lipase proveniente de Antrodia
cinnamomea, sendo que o pH timo encontrado foi de 8,0.
A Tabela 4.9 apresenta a anlise de varincia para a atividade enzimtica
obtida nos nveis estudados. Verifica-se que o coeficiente de correlao e o F
calculado permitiram a validao do modelo codificado apresentado na equao
4.2, o qual possibilitou a construo da superfcie de resposta e curva de contorno
apresentada na Figura 4.7.

Atividade lipsica (U/mL)= 1,38 + 0,431. pH 0,520. pH
2
(4.2)

59
atividade de lipase por FES.
Ensaio pH Temperatura (C) Atividade Lipsica
(U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32) 0
2 -1 (5,5) 1 (42) 0,17
3 1 (8,5) -1 (32) 1,19
4 1 (8,5) 1 (42) 0
5 0 (7,0) -1,41 (30) 1,50
6 0 (7,0) 1,41 (44) 2,25
7 -1,41 (4,88) 0 (37) 0
8 1,41 (9,11) 0 (37) 1,72
9 0 (7,0) 0 (37) 1,14
10 0 (7,0) 0 (37) 1,23
11 0 (7,0) 0 (37) 1,76

Tabela 4.9. Anlise de varincia para a atividade lipsica.
Fontes de
Variao
Soma dos
Quadrados
Graus de
Liberdade
Quadrados
Mdios
F calculado
Regresso 3,12 2 1,56 3,49
Resduos 3,57 8 0,45
Erro Puro 0,22 2
Total 6,70 10
Resduos = Falta de ajuste + Erro Puro
F
0,90;2;8
= 3,11
Coeficiente de correlao: R = 0,90
60

Figura 4.7. Atividade lipsica obtida por FES em funo da temperatura e pH.

4.2.6.2 Temperatura de estabilidade
Os resultados obtidos de atividade lipsica no extrato concentrado em
funo do tempo de incubao em diferentes temperaturas esto apresentados
nas Tabelas 4.10, 4.11, 4.12, 4.13 e 4.14, e podem ser melhor visualizados na
Figura 4.8.
61
por FES sob a temperatura de 25C.
Tempo (h) Atividade lipsica (U/mL) A/A
0

0 1,84 1
0,5 2,72 1,48
1 3,45 1,87
2 2,55 1,39
4 1,50 0,81
6 0,64 0,34

0

0 1,24 1
0,5 3,08 2,48
1 1,48 1,19
2 1,91 1,54
4 3,32 2,68
6 0 0

0

0 3,56 1
0,5 1,56 0,44
1 2,7 0,76
2 3,72 1,04
4 0,74 0,20

62
0

0 2,29 1
0,5 2,32 1,01
1 1,32 0,57
2 0,85 0,37
4 0,71 0,31
6 0 0

0

0 2,32 1
0,5 2,96 1,27
1 3,5 1,51
2 2,64 1,14
4 0,18 0,08
6 0 0

Atravs dos resultados encontrados para a temperatura de estabilidade
para a lipase produzida por fermentao em estado slido pelo fungo Penicillium
verrucosum observou-se que a temperatura de maior estabilidade, dentro da faixa
estudada, a de 35C.
Maia et al. (2001) obtiveram a temperatura de 35C como a de maior
estabilidade para a lipase produzida por Fusarium solani. Kamini et al. (1998)
verificaram que a lipase de Aspergillus niger apresentava estabilidade quando
submetida a temperaturas de at 40C. Um estudo realizado por Burkert (2002)
mostrou que a lipase de Geotrichum candidum NRRL-Y552 diminui sua
estabilidade medida em que se aumenta a temperatura, concluindo que a
enzima mais estvel a baixas temperaturas como a de 30C.
63

Figura 4.8. Grfico normalizado da atividade lipsica em funo do tempo e da
temperatura de exposio por FES.

4.2.6.3 Influncia do pH no estudo da estabilidade da lipase
A estabilidade da lipase foi analisada extraindo-a em diferentes valores de
pH (5,5 7,5) em tampo fosfato de sdio 100mM a 35C. Os resultados esto
apresentados na Tabela 4.15 e graficados na Figura 4.9.

Tabela 4.15. Valores das atividades enzimticas versus os valores de pH
estudados em FES.
Tempo (h) pH = 5,5 pH = 6,0 pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5
0 4,02 5,82 3,11 1,24 3,97
0,5 1,91 3,6 2,06 3,08 3,6
4 1,8 3,22 2,88 3,32 1,72
6 0 2,45 2,81 1,91 1,04
8 1,61 1,01 1,48 0
12 0 0 0

0 0,5 1 2 4 6
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A
/
A
0
25C
35C
45C
55C
65C
64

Figura 4.9. Atividade lipsica em funo do tempo e do pH de extrao da enzima
por FES.

A anlise dos resultados demonstra que a lipase de Penicillium verrucosum
apresenta uma maior estabilidade em pH 6,0 e 7,0. Pastore et al. (2003)
verificaram que a lipase de Rhizopus sp. mostrou-se mais estvel na faixa de
valores de pH entre 5,6 e 8,0. A lipase de Aspergillus niger apresentou uma faixa
de maior estabilidade entre 5,0 e 8,5 (Kamini et al., 1998) e 6,5 e 7,5 em tampo
tris-HCl para lipase de Candida rugosa (Benjamin e Pandey, 2001). Freire et al.
(1997a) encontraram para a lipase de Penicillium restrictum uma maior
estabilidade no intervalo de pH 7,0 at 8,0.

4.2.7 CONSIDERAES FINAIS: Produo de lipases por fermentao em
estado slido por Penicillium verrucosum
A fermentao em estado slido mostrou ser um processo bastante eficaz para
a produo de lipases e, neste estudo, promoveu resultados superiores aos
encontrados na literatura. O fungo Penicillium verrucosum apresentou uma boa
adaptao ao farelo de soja utilizado como substrato, confirmando o enorme
0 0,5 4 6 8 12
Tempo (h)
0,0
1,0
1,8
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
pH=5,5
pH=6,0
pH=6,5
pH=7,0
pH=7,5
65
potencial que os resduos agroindustrais possuem como meios de cultura
nutritivos para a produo de lipases.

4.3 FERMENTAO SUBMERSA

Neste item sero apresentados e discutidos os resultados referentes
produo de lipases por Penicillium verrucosum por fermentao submersa.

4.3.1 ESTUDO DO INDUTOR
Os resultados do teste de indutores para produo de lipases por
fermentao submersa esto apresentados na Tabela 4.16 e podem ser melhor
visualizados atravs da Figura 4.10. Cabe salientar que, bem como no estudo por
fermentao em estado slido, estes resultados foram obtidos aps 48 horas de
fermentao.

Tabela 4.16. Indutores estudados e suas respectivas atividades lipsicas em FS.
Indutor Atividade Lipsica (U/mL)
Desvio Padro
Controle (Peptona, extrato de levedura, NaCl
e gua)
0,54 0,05
Glicose 0,08
gua de macerao de milho 0 0,5
Hidrolisado de levedura 0 0,11
Melao de cana 0 0,11
leo de soja 1,12 0,29
leo de milho 0,37 0,05
leo de mamona 0 0,05
leo de oliva 1,41 0,23

66
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
C Gli AMM Hid Mel OS OMi OMa OO
Indutor
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)

indutores estudados em FS.

Verificou-se que a maior atividade enzimtica foi obtida quando o meio
recebeu como suplemento o leo de oliva, enquanto a glicose proporcionou um
decrscimo na atividade lipsica. O uso de leo de mamona e rejeitos
agroindustriais, tais como gua de macerao de milho, melao e hidrolisado de
levedura no colaborou para o aumento da produo da enzima, parecendo ter
efeito inibitrio.
De acordo com Burkert (2002), os leos de oliva e soja possuem
composies semelhantes entre si, apresentando cerca de 15% de cidos graxos
saturados e 85% de cidos graxos insaturados, o que explicaria o comportamento
semelhante na produo de lipase com a utilizao destes dois leos.
Maliszewska e Mastalerz (1992) reportaram que cidos graxos saturados
inibiram a produo de lipases por Penicillium citrinum, enquanto os cidos graxos
insaturados aumentaram a produo da enzima.
Com o intuito de definir um indutor para maximizar a produo de lipases,
realizou-se a cintica enzimtica dos trs indutores que apresentaram as melhores
atividades, tendo seu resultado em exposio na Tabela 4.17. Por meio da Figura
4.11 pode ser observado o perfil da atividade enzimtica para os diferentes
ensaios aps 24, 48, 72 e 96 horas de fermentao.
67
Tabela 4.17. Teste de indutores para produo de lipases por FS.
Indutor Atividade
Lipsica (U/mL)
24 h
Atividade
Lipsica (U/mL)
48 h
Atividade
Lipsica (U/mL)
72 h
Atividade
Lipsica (U/mL)
96 h
Controle 0 0,60 0 0
leo de soja 0 1,12 0 0,04
leo de oliva 0 1,52 1,88 0,52

24 48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Controle
leo Soja
leo Oliva

Figura 4.11. Perfil da atividade lipsica utilizando diferentes indutores por FS.

Como pode-se verificar, o leo de oliva usado como suplemento provoca
um efeito indutor na produo de lipases por fermentao submersa utilizando P.
verrucosum. Um estudo realizado por Freire et al. (1997) para definir a melhor
fonte de carbono para a produo de lipases por Penicillium restrictum concluiu
que o leo de oliva aumentou a produo da enzima em 6 vezes em relao s
atividades antes obtidas.

68
4.3.1.1 Produo de biomassa
Os resultados da produo de biomassa (ou de crescimento celular) obtidos
pelo experimento que avaliou o uso de diferentes indutores para produo de
lipases em 48 horas de fermentao esto representados na Tabela 4.18. Por
meio da anlise desta tabela possvel verificar que a produo mxima de
biomassa foi obtida com a utilizao de leo de oliva como agente indutor,
correspondendo mxima atividade lipsica apresentada no mesmo experimento.
Um resultado semelhante foi obtido por Freire et al. (1997) que avaliaram os
efeitos da concentrao de biomassa na produo de lipases por Penicillium
restrictum. Neste estudo, a maior produo de clulas e de lipase ocorreu quando
se utilizou leo de oliva como fonte de carbono, gerando uma concentrao de
14,2 mg/mL e de 13 U/mL, respectivamente. DAnnibale et al. (2006) verificaram
que tanto a atividade lipsica quanto a produo de biomassa por Candida
cylindracea NRRL Y-17506 aumentaram com a adio de leo de oliva ao meio
basal.

Tabela 4.18. Produo de biomassa em funo dos indutores utilizados em FS.
Indutores Biomassa (mg/mL) DP
Controle (Peptona, extrato de levedura, NaCl e
gua)
0,10 0,03
Glicose 0,11 0,02
gua de macerao de milho 1,00 1,12
Hidrolisado de levedura 0,36 0,32
Melao de cana 0,16 0,08
leo de soja 0,82 0,44
leo de milho 1,02 0,09
leo de mamona 0,23 0,06
leo de oliva 1,11 0,06

No entanto, a mesma situao de correspondncia no pode ser verificada
com o uso de leo de soja e de milho, onde se obteve resultados de 1,12 U/mL e
69
0,82 mg/mL e 0,37 U/mL e 1,02 mg/mL, respectivamente. Maia et al. (2001)
estudaram a produo de lipases e crescimento celular por Fusarium solani. A
maior produo da enzima teve como fonte suplementar o leo de gergelim,
apresentando 0,88 U/mL de atividade lipsica em 120 horas de fermentao.
Entretanto, o mesmo suplemento gerou o menor crescimento celular em
comparao com outras fontes de carbono testadas no experimento, sendo este
de 6,8 mg/mL. Freire et al. (1997) constataram que a glicose usada como
suplemento para a produo de lipases por Penicillium restrictum proporciona uma
alta produo de biomassa, porm, reprime a sntese da enzima.
Portanto, no possvel, com base nos resultados obtidos neste trabalho,
relacionar os resultados da produo de biomassa com as atividades lipsicas
obtidas nos experimentos.

4.3.2 ESTUDO DA PRODUO DE LIPASES POR FERMENTAO
SUBMERSA
Com o intuito de definir um meio de produo de lipases que viesse de
encontro fisiologia do fungo estudado, trabalhou-se com dois meios diferentes:
meio sinttico e meio industrial.

4.3.2.1 Meio sinttico

Plackett-Burman: Estudo da variao de temperatura, volume de
inculo, concentrao de peptona, extrato de levedura, cloreto de sdio e
leo de oliva na produo de lipases
Neste procedimento as variveis independentes estudadas foram:
temperatura, volume de inculo, concentrao de peptona, extrato de levedura,
cloreto de sdio e leo de oliva, escolhido como indutor na etapa anterior do
trabalho para a produo da enzima. A resposta avaliada foi a atividade lipsica
no decorrer da fermentao.
A Tabela 4.19 apresenta a matriz do planejamento com os valores reais,
codificados e as respostas para a atividade lipsica. Em uma anlise preliminar,
70
pode-se notar que as maiores atividades lipsicas foram obtidas em 72 e 96 horas
de fermentao.

lipsica no decorrer da FS utilizando meio sinttico.

Ensaio
Temp.
(C)
Inculo
(%m/v)
Peptona
(%m/v)
Extrato
lev.
(%m/v)
Cloreto
sdio
(%m/v)
leo
oliva
(%m/v)
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
48h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
72h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
96h
1 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 1,77 1 0 1,53 0,5
2 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) -1 (0,5) -1 (1) 0 0 0
3 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) -1 (1) 1,38 0,05 1,41 0,59 2,64 0,1
4 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0,48 0,1 0,34 0,48 0,23 0,1
5 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0 1,26 0,59 0
6 1 (36) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 0 0,69 0,2
7 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 1,2 0,2 1,34 1,6 2,72 0,2
8 -1 (28) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0,82 0,1 3,48 0,4 2,79 0,05
9 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) 1 (2) 2,12 0,6 2,99 0,3 2,83 0,3
10 36 (1) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 0 0 0,2
11 -1 (28) 1 (12,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2) 0,75 0,1 2,26 1,4 0
12 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0 0,49 0,1 0,84
13* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,18 0,1 0,53 0,1 1,3 0,5
14* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,11 0,05 0,49 0,1 1,22 0,3
15* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,22 0,34 0,05 1,15 0,1
*Ponto Central

Atravs da Figura 4.12 pode ser observado o perfil da atividade enzimtica
para os diferentes ensaios realizados neste planejamento. Analisando as
respostas obtidas verifica-se que em 8 dos 15 ensaios ocorreu aumento da
atividade lipsica em 96 horas de fermentao, tempo no qual os resultados foram
analisados estatisticamente. Verifica-se ainda que os ensaios que apresentaram
71
maior atividade da enzima tiveram como temperatura de fermentao 28C.
Estudos feitos por Ellaiah et al. (2004) e Maia et al. (2001) para a produo de
lipases por Aspergillus niger e Fusarium solani constataram que 28C foi a
temperatura ideal para a produo de enzima por estes microrganismos.

Planejamento experimental PB.

Para uma anlise mais consistente dos resultados do primeiro
planejamento, os dados obtidos em 96 horas de fermentao foram tabulados e
analisados utilizando o pacote Statistica, mdulo de Planejamento de
Experimentos (Experimental Design). Um planejamento do tipo Plackett-Burman
permite apenas a avaliao dos efeitos principais e estes so melhor visualizados
atravs do Grfico de Pareto (Figura 4.13), que apresenta a magnitude dos efeitos
absolutos das variveis manipuladas sobre as variveis de resposta.
Observou-se que, com 95% de confiana, a temperatura apresentou um
efeito negativo sobre a produo de lipases enquanto a peptona mostrou
influenciar positivamente. As demais variveis em estudo no foram significativas.

Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Ensaio 14
Ensaio 15
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
72
Figura 4.13 Grfico de Pareto da produo de lipases por FS utilizando meio
sinttico em funo das variveis independentes estudadas: Planejamento
experimental PB.

2
: Estudo da variao de temperatura e da
concentrao de peptona

A partir dos resultados obtidos no planejamento do tipo Plackett-Burman
selecionou-se a temperatura e concentrao de peptona como variveis a serem
estudadas em um planejamento fatorial 2
2
visando a otimizao da produo de
lipase por este meio de cultura. Optou-se por fixar a concentrao de inculo no
nvel 0 (7,5% m/v). Quanto s concentraes de extrato de levedura, de cloreto de
sdio e de leo de oliva foram fixadas no nvel 1 (0,5%, 0,5% e 1% m/v,
respectivamente), j que no apresentaram influncia nesta etapa do estudo de
produo de lipases. Este resultado economicamente muito interessante quando
se projeta um processo em escala industrial, diminuindo o custo do meio de cultivo
na produo da enzima desejada ou outro bioproduto (Burkert, 2002). A matriz do
planejamento experimental realizado, com os nveis codificados e reais, bem como
as respostas de atividade enzimtica obtidas encontram-se na Tabela 4.20.

-,61299
-1,00014
1,322768
1,673048
3,194001
-4,31858
p=,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
leo
Inculo
Extrato de Levedura
NaCl
Peptona
Temperatura
73
2
(valores codificados e reais) com
as respostas da atividade de lipase no decorrer da FS utilizando meio sinttico.
Ensaio Temperatura
(C)
Peptona
(%m/v)
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
48h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
72h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
96h
1 -1(20) -1 (4) 0 1,76 3,22
2 1(36) -1(4) 0 0,23 0
3 -1(20) 1 (12) 0 1,98 3,03
4 1(36) 1(12) 0 0,82 0
5* 0 (28) 0 (8) 0,61 0 0,15
6* 0 (28) 0 (8) 0,53 0 0,37
7* 0 (28) 0 (8) 2,38 0 0,15
* Ponto Central

A produo de lipase foi observada atravs do acompanhamento da
atividade enzimtica ao longo do tempo de fermentao como mostrado na Figura
4.14. Em 96 horas de fermentao pde ser verificado que os ensaios
experimentais 1 e 3 alcanaram o mximo de atividade enzimtica de 3,22 U/mL e
3,03 U/mL, respectivamente.
Para definir em quais condies seria realizado o estudo cintico, construiu-
se um grfico de Pareto (Figura 4.15) para avaliar os principais efeitos e
interaes das variveis estudadas em 96 horas de fermentao. Observou-se
que, com 95% de confiana, a temperatura mostrou influenciar negativamente na
produo da enzima, enquanto a peptona demonstrou no aumentar a produo
de lipases neste estudo.
Para a avaliao da cintica de fermentao decidiu-se utilizar as mesmas
condies usadas no ensaio 1 deste experimento, j que neste fez-se o uso do
menor nvel de peptona (4% m/v). A inteno de diminuir os custos da produo
de lipases justifica esta escolha.

74
2
.

sinttico em funo das variveis independentes estudadas em 96 horas de
fermentao: Planejamento fatorial 2
2
.

-,747931
,747931
-24,603
p=,05
Peptona(L)
TxP(L)
(1)Temperatura(L)
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
75
Cintica de produo de lipases na condio maximizada utilizando
meio sinttico
A melhor condio para a produo da lipases por fermentao submersa
utilizando meio sinttico foi a condio experimental do ensaio 1 do planejamento
fatorial 2
2
(20C, 7,5% m/v de inculo, 4% m/v de peptona, 0,5% m/v de extrato de
levedura, 0,5% m/v de NaCl e 1% m/v de leo de oliva). Nesta condio foi ento
avaliado o comportamento cintico da fermentao. A cintica de crescimento
celular e a produo de lipase se encontra na Figura 4.16.
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Tempo (h)
0,00
0,25
0,97
1,30
3,15
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
2,38
2,97
3,88
6,52
7,93
8,88
B
i
o
m
a
s
s
a

(
m
g
/
m
L
)
Atividade Lipsica
Biomassa

melhor condio experimental utilizando meio sinttico por FS.

Observa-se que na curva de atividade lipsica h 2 picos de produo da
enzima, sendo o maior em 96 horas. Burkert (2002) realizou um teste de cintica
de produo de lipases em frascos agitados por Geotrichum candidum NRRL Y-
552, encontrando o pico de atividade enzimtica de 11,51 U/mL em 48 horas de
fermentao. Em 96 horas praticamente no havia mais a presena de lipases no
meio fermentativo que era constitudo por 5% m/v de peptona, 0,1% m/v de
NaNO
3
, 0,1% m/v de MgSO
4
e 1% m/v de leo de soja.
76
O valor mximo de atividade lipsica obtido neste experimento foi de
3,15U/mL, sendo este maior que o valor encontrado por Puthli et al. (2006), que
avaliaram a produo de lipases por Candida rugosa obtendo um mximo de
atividade de 1,84U/mL em 66 horas de fermentao. No entanto, menor que a
atividade lipsica de 12,55U/mL em 72 horas de fermentao obtida por Benjamin
e Pandey (1996) utilizando Candida rugosa.
Nesta etapa, observou-se que o crescimento celular mximo, assim como a
maior atividade lipsica, se deu em 96 horas de fermentao, sendo este de
8,88mg/mL o que caracteriza um bom crescimento. A produo de biomassa
deste estudo supera os valores encontrados por Maia et al. (2001) que, em estudo
da produo da enzima por Fusarium solani, obtiveram 6,8mg/mL em 120 horas
de fermentao e por Puthli et al. (2006) que encontraram um valor mximo de
5,87mg/mL em 72 horas de fermentao por Candida rugosa.
A determinao da atividade protesica foi realizada nesta condio
experimental maximizada utilizando meio sinttico por fermentao submersa,
porm no foi apresentada por ter sido desprezvel.
O fato da quantidade de protease presente no meio ser muito pequena, no
comum em estudos de produo de lipases por fermentao submersa. Neste
caso, provvel que o tipo de protease contida no meio tenha sofrido hidrlise de
outras proteases, diminuindo assim a quantidade de protease total no meio
fermentativo (Burkert, 2002).

4.3.2.2 Meio industrial

Plackett-Burman: Estudo da variao de temperatura, volume de
inculo, concentrao de gua de macerao de milho, hidrolisado de
levedura, cloreto de sdio e leo de oliva na produo de lipases
Nesta primeira etapa aplicou-se o mesmo planejamento de experimentos
utilizado no meio sinttico para que pudessem ser avaliados os efeitos principais
de cada varivel na resposta atividade lipsica. Foi analisada a variao da
77
temperatura, volume de inculo, concentrao de gua de macerao de milho,
hidrolisado de levedura, cloreto de sdio e leo de oliva na produo de lipases.
A Tabela 4.21 apresenta os valores codificados, reais e as respostas para a
atividade lipsica obtidas neste planejamento. A Figura 4.17 apresenta o
acompanhamento da atividade enzimtica ao longo das 48, 72 e 96 horas de
fermentao.

lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial.
Ensaio Temp.
(C)
Inculo
(%) m/v
AMM**
(%) m/v
Prodex
Lac***
(%) m/v
Cloreto
sdio
(%) m/v
leo
oliva
(%)
m/v
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
48h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
72h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
96h
1 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0,69 0,2 0,23 0,1 0,73 0,7
2 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) -1 (0,5) -1 (1) 0,34 0,2 0 0,65 0,4
3 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) -1 (1) 0,76 0,1 0,19 0,2 0 0,4
4 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0 0,84 0,3 0,31 0,2
5 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0 0 0 0,7
6 1 (36) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0,07 0,1 0 0 0,6
7 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0 0 0 0,3
8 -1 (28) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0,34 0,1 1,38 0,6 0 0,6
9 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) 1 (2) 0,49 0,2 0 0 0,4
10 36 (1) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 0,2 0,15 0,27 0,1
11 -1 (28) 1 (12,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2) 0 0 0,92 0,1
12 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0,61 0,43 0 0,34 0,05
13* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,19 0,05 0,11 0,1
14* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,23 0,23 0,3
15* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,19 0,05 0,34 0,1
*Ponto Central; ** AMM= gua de macerao de milho; ***Prodex Lac= Hidrolisado de levedura.

78

Planejamento experimental PB.

Verifica-se pela Tabela 4.21 que a maior atividade enzimtica foi obtida em
72 horas de fermentao no ensaio 8 (1,38 U/mL). Esta condio tem como
caractersticas os menores nveis de temperatura, volume de inculo e
concentrao de leo de oliva e os maiores nveis de gua de macerao de
milho, Prodex Lac e cloreto de sdio.
Analogamente anlise do primeiro planejamento aplicado ao meio
sinttico, realizou-se a avaliao dos resultados obtidos neste planejamento
utilizando o pacote Statistica
. O grfico de Pareto, representado pela Figura 4.18,

mostra a anlise estatstica dos efeitos das variveis sobre a atividade lipsica,
onde pode-se observar que todas as variveis estudadas foram estatisticamente
significativas a 5% de significncia.
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Ensaio 14
Ensaio 15
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
79
industrial: Planejamento experimental PB.

Pela anlise da Figura 4.18, verifica-se que as variveis gua de
macerao de milho, hidrolisado de levedura e cloreto de sdio apresentam
efeitos significativos positivos, o que indica que um deslocamento dos nveis de
concentrao das mesmas para valores superiores acarretaria num aumento dos
valores de atividade enzimtica. As concentraes do inculo e de leo e a
variao da temperatura mostram exercer um efeito negativo na produo de
lipases.

3
: Estudo da variao de temperatura,
concentrao de gua de macerao de milho e hidrolisado de levedura

Aps anlise dos resultados obtidos, props-se um planejamento
experimental fatorial 2
3
para avaliar a variao de temperatura e concentraes de
gua de macerao de milho e hidrolisado de levedura na produo de lipases. A
concentrao do inculo foi fixada no mesmo valor do ponto central do
planejamento Plackett-Burman, bem como o efetuado quando do estudo de
produo de lipase por fermentao submersa utilizando meio sinttico. J a
concentrao de leo de oliva, que apresentou um efeito negativo, teve seu valor
-4,375
8,125
-10,125
20,625
-30,125
31,125
p=,05
Temperatura
NaCl
leo
Prodex
Inculo
AMM
80
fixado no mnimo e, contrariamente, o cloreto de sdio foi fixado no nvel +1 por ter
apresentado em efeito positivo na produo da enzima.
A Tabela 4.22 apresenta os valores reais e codificados deste planejamento,
e as respostas para a atividade enzimtica, na qual verifica-se que ocorreu um
aumento dos valores quando comparada com o do tipo Plackett-Burman antes
estudado, sendo que o mximo obtido foi de 2,63 U/mL em 72 horas de
fermentao no ensaio de nmero 5. Este caso pode ser melhor visualizado por
meio da Figura 4.19.

3
com as respostas de atividade
lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial.
Ensaio Temperatura
(C)
AMM
(%m/v)
Prodex
Lac
(%m/v)
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
48h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
72h
Ativ.
Lipsica
(U/mL)
DP
96h
1 -1 (20) -1 (4) -1 (2) 0 0,31 0,47
2 1 (36) -1 (4) -1 (2) 0,13 0 0,98
3 -1 (20) 1 (12) -1 (2) 0,35 0 0
4 1 (36) 1 (12) -1 (2) 0 0 0,78
5 -1 (20) -1 (4) 1 (6) 0,08 2,63 0
6 1 (36) -1 (4) 1 (6) 0 0 0,27
7 -1 (20) 1 (12) 1 (6) 1,23 0,03 0
8 1 (36) 1 (12) 1 (6) 0 0 0,64
9* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,47 0,9
10* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,47 1,5
11* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,39 1,2
* Ponto Central

Os nveis de concentrao de gua de macerao de milho e de Prodex
Lac foram deslocados para valores superiores, conforme indicou a anlise das
respostas do planejamento Plackett-Burman, considerando que os efeitos dos dois
81
substratos foram positivos e significativos com 95% de confiana. Mesmo com
concentraes maiores de gua de macerao de milho e Prodex Lac o meio
ainda muito mais econmico se comparado ao sinttico.

3
.

Construiu-se um grfico de Pareto (Figura 4.20) para avaliar os principais
efeitos e interaes das variveis estudadas na produo de lipases. Observou-se
que, com 95% de confiana, o Prodex Lac apresentou efeito positivo sobre a
atividade lipsica. No entanto, a temperatura e a gua de macerao de milho
apresentaram efeitos negativos. importante salientar que as interaes entre a
gua de macerao de milho e o Prodex Lac tiveram efeitos negativos, e o fato do
efeito de um substrato industrial isolado ser positivo e a interao entre eles ser
negativa ocorre devido composio destes substratos. Nenhum deles pode ser
considerado como fonte de nitrognio, carbono ou outros sais minerais ou
vitaminas, pois estes substratos possuem uma composio bastante complexa,
que contm diversos nutrientes, que individualmente pode causar efeito positivo,
porm a interao entre eles pode ocasionar um excesso em alguns destes
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
82
nutrientes importantes para a fermentao e causar uma inibio indesejada
(Treichel, 2004).
Para a realizao do estudo cintico de fermentao submersa optou-se
por utilizar as mesmas condies do ensaio 5 deste planejamento, que foi o que
apresentou maior atividade lipsica.

industrial: Planejamento fatorial 2
3
.

Cintica de produo de lipases na melhor condio experimental
utilizando meio industrial por fermentao submersa
Ao utilizar um meio industrial, a melhor condio encontrada para a
produo da lipases por fermentao submersa foi a determinada para o ensaio 5
do planejamento fatorial 2
3
(20C, 7,5% mm/v de inculo, 4% m/v de gua de
macerao de milho, 6% m/v de Prodex Lac, 3% m/v de NaCl e 1% m/v de leo de
oliva). Esta condio foi ento realizada novamente para acompanhamento
cintico.
A Figura 4.21 apresenta a cintica de crescimento celular e a produo de
lipases para a melhor condio encontrada para o meio industrial. A atividade
lipsica desta vez apresentou um pico de atividade mxima de cerca de 2,22 U/mL
-17,5292
17,98844
-17,9884
22,27505
-22,275
-22,7343
p=,05
AMMxProdex(L)
Prodex(L)
TxProdex (L)
TxAMM (L)
AMM(L)
Temperatura(L)
83
em 72 horas de fermentao. Este valor comparvel aos obtidos por
fermentao submersa utilizando Aspergillus niger como microrganismo produtor
de lipases (Mahadik et al., 2004), mas bem inferior do que os obtidos por Freire et
al. (1997 e 1997a).

melhor condio experimental utilizando meio industrial por FS.

Neste grfico pode-se notar com clareza a associao do crescimento com
a produo de lipase, conforme observado por Elibol e Ozer (2000) em estudo
avaliativo da produo de lipases por Rhizopus arrhizus por fermentao
submersa. Os autores verificaram que h uma relao entre o crescimento
microbiano e produo da enzima, sendo que obtiveram uma atividade lipsica e
produo de biomassa mxima de aproximadamente 21U/mL e 8,5mg/mL
respectivamente, em 48 horas de fermentao.
O incremento da biomassa iniciou em aproximadamente 36 horas de
fermentao, estendendo-se at 72 horas. O meio de cultura industrial utilizado
neste trabalho mostrou ser razovel para o crescimento celular, apresentando
uma concentrao celular mxima de 26,33mg/mL, superando os valores de
concentrao de biomassa obtidos em estudos de produo de lipases realizados
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Tempo (h)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
B
i
o
m
a
s
s
a

(
m
g
/
m
L
)
Atividade lipsica
Biomassa
84
por Maia et al. (2001), Freire et al. (1997 e 1997a), Mahadik et al. (2004), Puthli et
al. (2006), Elibol e Ozer (2000) e Benjamin e Pandey (1996) , com diferentes
microrganismos.
A determinao da atividade protesica foi realizada nesta condio, e
como ocorreu no estudo cintico realizado na melhor condio experimental
utilizando meio sinttico, no foi apresentada por ter sido desprezvel.

4.3.3 CARACTERIZAO PARCIAL DA LIPASE OBTIDA POR
FERMENTAO SUBMERSA
Aps a obteno do extrato enzimtico por fermentao submersa,
procedeu-se a sua caracterizao parcial em funo da temperatura e pH timos.

4.3.3.1 Meio Sinttico
A determinao dos valores de temperatura e pH timo da enzima obtida
por fermentao submersa utilizando um meio sinttico foi realizada atravs da
execuo de um planejamento fatorial 2
2
centrais, e a matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipsica obtidos esto apresentados na Tabela 4.23.
Analisando-se as respostas obtidas na Tabela 4.23, verifica-se que as
maiores atividades lipsicas foram de 4,02U/mL e 4,37U/mL correspondendo aos
ensaios 4 e 5, respectivamente. A condio de 30C de temperatura e pH 7,0 foi a
que promoveu a maior atividade lipsica (4,37U/mL).
Resultados semelhantes aos encontrados neste planejamento foram
obtidos por Tan et al. (2003) que analisaram a produo de lipases por
fermentao submersa por Candida sp, determinando 28C e 7,0 como
temperatura e pH timos, respectivamente.
A literatura reporta que o pH neutro geralmente definido como timo para
a atividade lipsica, com pode ser verificado nos trabalhos de Tan et al. (2003),
Abbas et al. (2002), Burkert (2002), Kamini et al. (1998), Fadiloglu e Soylemez
(1997), Freire et al. (1997a) e Benjamin e Pandey (2001).

85
temperatura e pH timos (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de
lipase por FS em meio sinttico.
Ensaio pH Temperatura (C) Atividade Lipsica
(U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32)
0,69
2 -1 (5,5) 1 (42)
1,92
3 1 (8,5) -1 (32)
3,91
4 1 (8,5) 1 (42)
4,02
5 0 (7,0) -1,41 (30)
4,37
6 0 (7,0) 1,41 (44)
3,95
7 -1,41 (4,88) 0 (37)
2,11
8 1,41 (9,11) 0 (37)
2,34
9 0 (7,0) 0 (37)
2,72
10 0 (7,0) 0 (37)
2,42
11 0 (7,0) 0 (37)
2,53

A Tabela 4.24 apresenta a anlise de varincia para a atividade enzimtica
obtida nos nveis estudados. Verifica-se que o coeficiente de correlao e o F
calculado permitiram a validao do modelo codificado, apresentado na equao
4.3.

Atividade lipsica (U/mL)= 2,55 + 0,66.Temperatura
2
+ 0,70.pH 0,30. pH
2
(4.3)

Tabela 4.24. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FS.
Fontes
de Variao
Soma dos
Quadrados
Graus de
Liberdade
Quadrados
Mdios
F calculado
Regresso 8,02 3 2,67 4,05
Resduos 4,62 7 0,66
Erro Puro 0,05 2
Total 12,64 10
Resduos = Falta de ajuste + Erro Puro
F0,90;3;7 = 3,11
Coeficiente de correlao: R = 0,80
86

Este modelo possibilitou a construo da superfcie de resposta e curva de
contorno apresentada na Figura 4.22.

Figura 4.22. Superfcie de resposta e curva de contorno para a atividade
enzimtica em funo da temperatura e pH por FS.
87

Analisando-se esta figura nota-se que um aumento da temperatura e um
aumento dos valores de pH ocasionaria um incremento na atividade lipsica.
Verifica-se tambm que as faixas de temperatura de 29C a 32C e 40C a 45C e,
valores de pH entre 7,0 e 8,5 representam as condies timas de atividade
lipsica.

4.3.3.2 Meio industrial
Um planejamento fatorial 2
2
centrais foi realizado com a finalidade de determinar os valores de temperatura e
pH timos da enzima obtida por fermentao submersa utilizando um meio
industrial. A matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipsica obtidos esto apresentados na Tabela 4.25.
Observando-se os resultados obtidos neste planejamento, verifica-se que
os ensaios 1, 8 e dos pontos centrais foram os que apresentaram as maiores
atividades lipsicas.
A temperatura de 37C e o pH 7,0 so as condies referentes aos pontos
centrais e, as mesmas foram definidas como timas para as lipases obtidas por
Fadiloglu e Soylemez (1997) que utilizaram Candida rugosa como microrganismo
produtor da enzima e por Burkert (2002), que caracterizou a lipase proveniente de
Geotrichum candidum NRRL-Y552. Igualmente para a lipase de Penicillium
restrictum foi encontrada uma temperatura tima de 37C e pH 7,0 (Freire et
al.,1997a).

88
atividade de lipase por FS em meio industrial.
Ensaio pH Temperatura (C) Atividade
Lipsica (U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32) 1,76
2 -1 (5,5) 1 (42) 0,4
3 1 (8,5) -1 (32) 0
4 1 (8,5) 1 (42) 0
5 0 (7,0) -1,41 (30) 0
6 0 (7,0) 1,41 (44) 0,96
7 -1,41 (4,88) 0 (37) 0,4
8 1,41 (9,11) 0 (37) 1,6
9 0 (7,0) 0 (37) 1,6
10 0 (7,0) 0 (37) 1,92
11 0 (7,0) 0 (37) 1,76

A anlise estatstica dos resultados de atividade lipsica permitiu somente a
obteno dos efeitos de primeira e segunda ordem da temperatura e pH sobre
esta resposta, uma vez que no foi possvel se obter um modelo estatisticamente
significativo. Os efeitos foram expressos na forma de Grfico de Pareto
apresentado na Figura 4.23.
89

Figura 4.23. Grfico de Pareto para determinao da temperatura e pH timos da
atividade lipsica obtida por FS em meio industrial.

Observou-se que, com 90% de confiana, a temperatura apresentou a
maior influncia na atividade da lipase, seguida pelo pH. As duas variveis
apresentaram efeitos negativos na atividade lipsica, enquanto a interao entre
elas mostrou influenciar positivamente na resposta.
Em uma avaliao global pode-se notar que a temperatura tima para a
atividade lipsica encontra-se na faixa de 30C a 40C, como se verifica conforme
evidenciaram tambm os resultados obtidos por Abbas et al. (2002), Kolossvary
(1996), Burkert (2002), Kamini et al. (1998), Fadiloglu e Soylemez (1997), Freire et
al. (1997b) e Benjamin e Pandey (2001).
A anlise dos efeitos mostra que os valores do pH devem ser diminudos
para que ocorra um incremento da atividade lipsica. Comparando com os valores
de pH estudados para a definio de pH timo observa-se que estes esto de
acordo com os dados da literatura para outras lipases que apresentam valores de
pH timo na faixa de 5,0 a 9,0 reportados, por exemplo, nos trabalhos de Mahadik
et al. (2002), Martins (2001), Kolossvary (1996), Abbas et al. (2002), Shu et al.
(2006), Tan et al. (2003), Burkert (2002), Freire et al. (1997), Kamini et al. (1998),
Benjamin e Pandey (2001), Pastore et al. (2003) e Fadiloglu e Soylemez (1997).
-,014163
-1,03569
4,25
-6,38185
-10,2509
p=,1
Temperatura (L)
pH (L)
TxpH (L)
pH(Q)
Temperatura(Q)
90
4.3.4 CONSIDERAES FINAIS: Produo de lipases por fermentao
submersa por Penicillium verrucosum
Neste estudo a produo de lipases por fermentao submersa apresentou
resultados razoveis.
Cabe ressaltar que o cultivo de fungos, tais como Penicillium, apresenta
problemas inerentemente clssicos. O crescimento celular elevado dificulta a
transferncia de massa e influencia na produo de biomassa e da enzima e a
maioria dos trabalhos da literatura no apresenta uma discusso sobre a
dificuldade de se trabalhar com fungos e a falta de reprodutibilidade nos
resultados.
O meio sinttico foi mais eficiente na produo lipsica perante o meio
industrial, porm, eleva o custo de produo, principalmente quando h interesse
em produzir a enzima em escala industrial. O meio de fermentao composto por
resduos provenientes da agroindstria mostrou sofrer interaes entre seus
componentes, o que pode ter interferido negativamente na produo da enzima.

Captulo 5 Concluses e Sugestes
91
5 CONCLUSES E SUGESTES

5.1 CONCLUSES

A utilizao de fermentao em estado slido na produo de lipase
utilizando como substrato farelo de soja apresentou resultados satisfatrios. O
fungo Penicillium verrucosum apresentou um bom desempenho na produo da
enzima, permitindo obter valores de atividade lipsica de 40U/g em 48 horas de
fermentao e 52U/g em 72 horas de fermentao nas condies operacionais
otimizadas (T=27,5C, U=55%). Alm disso, obteve-se baixa atividade protesica,
quando comparado a outros microrganismos e meios reportados na literatura, o
que torna vantajosa a utilizao deste sistema para a produo de lipases.
O farelo de soja demonstrou ter um grande potencial nutricional,
possibilitando o bom desenvolvimento do microrganismo tanto em termos de
crescimento quanto em produo de lipase, uma vez que os resultados obtidos
neste trabalho mostraram no haver a necessidade de utilizao de fontes
suplementares, o que pode levar a uma considervel economia com matrias-
primas no processo industrial.
A caracterizao parcial da lipase bruta produzida por FES apresentou
condies timas de atividade a 44C em pH 7,0 e manteve sua estabilidade a
35C em valores de pH entre 6,0 e 7,0.
A produo de lipases por fermentao submersa apresentou menores
atividades do que as encontradas na literatura. Procurando definir um meio
fermentativo que pudesse vir a diminuir os custos da produo da enzima, testou-
se um meio sinttico e outro industrial. Os valores de atividade lipsica obtidos
foram de 3,15U/mL em 96 horas para o meio sinttico e 2,22U/mL em 72 horas
para o meio industrial, sendo que este ltimo mostrou ser razovel para o
crescimento celular, gerando uma concentrao de clulas de 26,33mg/mL.
Apesar da atividade lipsica do meio industrial ser menor que a
apresentada pelo meio sinttico, h que se levar em considerao o baixo custo
92
do primeiro, sendo que, mesmo que haja a necessidade de aumentar as
concentraes dos substratos, este ainda muito mais econmico do que o
segundo, podendo tornar esta forma de conduo do processo economicamente
mais vivel.
A enzima contida no extrato bruto proveniente do meio sinttico apresentou
as faixas de temperatura timas de 29C a 32C e de 40C a 45C e pH timo
entre a faixa de valores 7,0 e 8,5. A lipase obtida a partir de meio industrial
apresentou 30C a 40C de temperatura e pH entre 5,0 e 9,0 como faixa de
valores de temperatura e pH timos, respectivamente. Possivelmente os
resultados obtidos para estes extratos refletem a caracterizao resultante de
diferentes formas de lipases existentes em ambos os meios fermentativos.

5.2 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Com base nos resultados e concluses obtidos neste estudo sugere-se como
trabalhos futuros:
Avaliao da estabilidade do extrato bruto enzimtico produzido por
FES e FS em relao ao armazenamento baixas temperaturas;
Definio das condies timas para extrao da lipase obtida por
FES;
Avaliao da atividade de esterificao dos extratos enzimticos
obtidos, visando sua aplicao em reaes de interesse na rea de
alimentos (esterificao, alcolise, acidlise e transesterificao);
Realizao de estudos de concentrao, purificao, imobilizao e
caracterizao das fraes enzimticas obtidas;
Avaliao da atividade (hidroltica e de esterificao) dos extratos
enzimticos (brutos, liofilizados, concentrados, purificados e
imobilizados) em fluidos pressurizados, buscando confrontar com
93
resultados j disponveis para lipases comerciais, visando propor
novas aplicaes para as lipases obtidas;
Utilizao das tcnicas de dosagem do crescimento microbiano por
FES, com utilizao de mtodos respiromtricos, para uma avaliao
mais precisa do crescimento e verificao da associao da produo
da enzima com o crescimento microbiano;
Realizao de estudos por fermentao em estado slido e submersa
com outros tipos e configuraes de biorreator utilizando resduos
agroindustriais como substrato e P. verrucosum ou outros
microrganismos para a produo de lipases.
Estudos de aplicao da enzima como catalisador de reaes
(hidrlise e esterificao) de interesse para as indstrias.
Captulo 6 Referncias Bibliogrficas
94
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Captulo 7 Anexos I
106
7 ANEXO I

Procedimentos para o preparo de algumas solues

1. Soluo de azocasena 0,5%

Pesar 0,5 g de azocasena, adicionar 20 mL de gua destilada, acrescentar
soluo de hidrxido de sdio 40% at chegar a pH 12,0. Adicionar cido actico
at chegar ao pH 5,0, completar o volume para 100 mL com tampo acetato de
sdio 50 mM pH 5,0.
Obs: Estocar sob refrigerao por, no mximo, 30 dias.

2. Soluo de acetil acetona em Na
2
CO
3
0,5 N

Misturar 1 mL de acetil acetona em 50 mL de soluo de Na
2
CO
3
0,5 N.
Obs: Esta soluo no pode ser estocada, deve ser preparada na hora do
ensaio.

3. Reagente de Erlich

Dissolver 2,67 g de DAB (p-dimetilaminobenzaldedo) em um volume
pequeno (em torno de 30 mL) de etanol/cido clordrico 1:1. Aps a dissoluo,
completar o volume para 100 mL com gua destilada.

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. O grfico de Pareto, representado pela Figura 4.18,

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