FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Extraccin de un preparado enzimtico crudo (PEC)

BIOTECNOLOGIA DE LOS PAI
INTEGRANTES:

MONZON LLEMPEN ALEXIS

QUEZADA MONCADA ASTHRY

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EXTRACCIN DE UN PREPARADO ENZIMTICO CRUDO I. INTRODUCCIN Las enzimas son protenas que se comportan como catalizadores; es decir, aceleran la velocidad con la que las reacciones se llevan a cabo sin alterar el equilibrio. Son catalizadores especficos, cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. La actividad de una enzima refleja la capacidad que tiene de transformar un substrato determinado a un producto o productos, en una unidad de tiempo. La actividad enzimtica puede ser cuantificada en milimoles de sustrato transformados por minuto, bajo las condiciones ptimas de ensayo (Poulos L, 2003). Son escasos los procesos que realmente pueden llamarse enzimticos, ya que en la mayor parte de los casos las enzimas fungen un papel de aditivos con funciones como disminuir la viscosidad, clarificar, etc. Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis del almidn, son de origen fngico, bacteriano o vegetal (especialmente granos germinados). Industrialmente presentan mltiples aplicaciones, por ejemplo la obtencin de jarabes a base de maltosa y glucosa. Es muy relevante tener conocimientos de las propiedades de productos enzimticos para mejorar la seleccin de las propiedades de los productos. Se debe lograr un adecuado control en sus aplicaciones tecnolgicas, as como para facilitar el diseo de un apropiado proceso de modo que pueda aplicarse a los al campo de ingeniera agroindustrial. Se ha descrito que las enzimas muestran varias acciones farmacolgicas: aumentan la absorcin de otros medicamentos, se han utilizado en tratamientos de desrdenes digestivos, en enfermedades virales y en la formulacin de vacunas. Tienen potencialidades como antiedematosas, antiinflamatorias, antitrombticas y fibrinolticas. A pesar de que se han estudiado menos del 1 % de las especies de enzimas vegetales conocidas, con este porcentaje en los ltimos aos se demostr que las enzimas poseen la cualidad de promover la posible actividad antitumoral de cisteno-proteasas como la bromelina, por esta razn nace y permanece el inters en la bsqueda de nuevas fuentes naturales de obtencin de las mismas.

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II. OBJETIVOS Elaborar un preparado enzimtico crudo a partir de distintos vegetales Identificar cualitativamente en el Preparado Enzimtico Crudo, la actividad enzimtica de la amilasa.

III.

FUNDAMENTO TERICO

ENZIMAS Son protenas especializadas en la funcin cataltica y las sustancias sobre las cuales actan se denomina sustratos. Lo que distingue a las enzimas de las dems protenas es precisamente que, una vez producido el reconocimiento molecular del sustrato, se realiza la transformacin de la sustancia reconocida, como consecuencia de diferentes interacciones entre la protena enzimtica y su sustrato este experimenta un reordenamiento de sus elementos constituyentes debido a la ruptura y formacin de algunos enlaces qumicos. La que resulta de la accin de la enzima sobre el sustrato recibe el nombre de producto. La existencia del complejo enzima-sustrato y la caracterstica de que la mayora de los sustratos presentan un tamao varias veces menor que la estructura de la enzima, implica que la enzima solo entra en contacto con el sustrato en una pequea zona especfica de su voluminosa estructura. Las protenas enzimticas presentan dos regiones o sitios importantes, uno de ellos reconoce y liga al sustrato (sitio de reconocimiento) y el otro cataliza la reaccin (sitio cataltico) toda vez que el sustrato se ha unido. Estos dos sitios estn adyacentes uno al otro en la forma activa de la enzima y en ocasiones, el sitio cataltico es parte del de reconocimiento, estas dos regiones en conjunto reciben el nombre de centro activo.

Las enzimas poseen dos propiedades fundamentales, derivndose estas de las caractersticas del centro activo: Gran eficiencia cataltica. Elevada especificidad.

Siendo la Elevada Especificidad, la que sirve de fundamento para establecer la clasificacin y nomenclatura de las enzimas.

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Se han establecido 6 grupos principales:

Oxidoreductasas: Enzimas que catalizan reacciones de oxidoreduccin. Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo qumico entre un donante y un aceptor, se excluyen aquellas que transfieren electrones o sus equivalentes, pues pertenecen a la clase anterior y aquellas en que el aceptor del grupo es el agua y pertenece a la clase siguiente.

Hidrolasas: Catalizan la ruptura de enlaces qumicos con la participacin de las molculas de agua. Liasas: Catalizan reacciones en las cuales se produce la adicin o sustraccin de grupos qumicos a dobles enlaces. Isomerasas: Catalizan la interconversin de dos ismeros. Ligasas: Catalizan la unin covalente de dos sustratos mediante la energa de hidrlisis de nuclesidostrifosfatados, generalmente el ATP.

A) Estabilidad de las Enzimas La frgil naturaleza proteica de las enzimas, que conlleva a una estabilidad limitada de su estructura y funcionalidad, constituye un aspecto importante en un contexto tecnolgico. Se considera que una enzima es apropiada para una aplicacin comercial, si su estabilidad es suficiente para dicha aplicacin. Las enzimas se obtienen por fermentacin en cultivos semislidos, sumergidos, extraccin de tejidos ya sea en plantas o animales bajo condiciones controladas.

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Figura 1. Diagrama de Enzymes Biotechnology.

Diagrama de flujo para la produccin de enzimas a partir de tejidos animales o vegetales Diagrama de Enzymes Biotechnology

B) Fuentes de enzimas Es obvio que hay tres fuentes de enzimas: clulas animales, vegetales y microbianas. En aos pasados, las plantas y los animales fueron las fu entes tradicionales de enzimas, pero dados los avances recientes de la biotecnologa, probablemente el futuro est en los sistemas microbianos.

1. Enzimas de origen animal Obtenidas a partir de tejidos animales, por lo general, se preparan de animales recin sacrificados. Inmediatamente despus del sacrificio, se quitan los tejidos y se congelan para evitar la degradacin bioqumica y de sulfuracin. Se remueven los tejidos extraos, particularmente los cuerpos grasosos, y a continuacin el tejido es cortado en rebanadas o se pasa a travs de un molino de martillos. En algunos casos la preparacin resultante se pasa tambin por un mezclador para obtener un pur fino. Varios tejidos animales se usan como fuente de enzimas, incluyendo el pncreas, bazo, hgado y varias porciones del intestino. Por supuesto, la extraccin de la enzima va acompaada por varios pasos de purificacin, los cuales sern tratados con enzimas microbianas (Scragg, 1996).

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Tabla 1. Enzimas extraidas de tejidos animales

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Enzima -amilasa Lipasa/estearasa de cidos grasos LIsozima Fosfolipasa A Tripsina Quimo tripsina Pepsina Renina Fuente, Scragg, 1996. 2. Clulas y tejidos vegetales

Fuente Pncreas Pncreas bovino/porcino Albmina de huevo de bovino Pncreas porcino Pncreas bovino/porcino Pncreas bovino/porcino Mucosa porcina Bovino

Por muchos aos se han hecho preparaciones alimentarias de enzimas vegetales (Tabla 2). Sin embargo, la extraccin de enzimas a partir de plantas es a menudo difcil y requiere equipo pesado para macerar y moler el material tpicamente fibroso. Los sistemas de molienda comunes por lo general son insuficientes, excepto en los casos donde la fuente de materia es tejido de las hojas y es posible usar molinos de martillos de uso rudo modificado.

Tabla 2. Enzimas derivadas de tejidos vegetales

Enzima -amilasa Peroxidasa Papana Bromelina Ficina Fuente: Scragg, 1996

Fuente Grano de cebada Raz de rbano Ltex del rbol de papaya Bromas sp. Higuera

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3.

Clulas microbianas

Se acepta generalmente que la fuente principal de enzimas a escala industrial sern, en el futuro, los microorganismos (Tabla 3). Las razones son: Los sistemas de produccin microbianos pueden mantenerse bajo estrecho control. Las concentraciones de enzimas y, por lo tanto, la productividad, se pueden manipular en forma gentica y ambiental. El aumento progresivo y la alimentacin del sistema no presentan el mismo problema logstico que una fuente derivada de la agricultura. Hay un grado inherente de flexibilidad en el proceso a travs de la eleccin de varias enzimas. Los mtodos de tamizado para sistemas microbianos son comparativamente simples.

Tabla 3. Enzimas microbianas y sus aplicaciones

Enzima

Fuente Bacillus subtilis

Aplicacin

Amilasa

Asperyllusoryzae Penicilliumroquefort AspergillusNger

Deprestado de textiles, licuefaccin de almidn, produccin de glucosa.

Penicilinasa Bacillussubtilis Invertasa Aspergillus Nger Saccharomyecescerevisiae Aspergillus Nger Trichodermasp. Aspergillus niger Clostridiumsp

Degradacin de la penicilina. Industria de la confitera Disminucin de la viscosidad,

Celulasa Pectinasa Proteasa

auxiliares de digestin Clarificacin de vinos y jugos de fruta Suavizante, auxiliar en la digestin

Fuente, Scragg, 1996 La mayora de las enzimas microbianas usadas comercialmente son extracelulares, esto es, se producen en el interiro de las clulas y luego se excretan o difunden en el medio de cultivo, del cual pueden ser operados. Esto reduce el problema que se presentan a menudo con plantas y, algunas veces con tejidos animales, de tener que romper las clulas individuales (Scragg, 1996).

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C) Almidn Se encuentra en los cereales, tubrculos y en algunas frutas como polisacrido de reserva energtica y su concentracin vara con el estado de madurez; el caso del pltano es muy indicativo en este sentido; en estado verde o inmaduro, el almidn constituye la mayor fraccin de los hidratos de carbono, ya que los azcares son muy escasos; a medida que la fruta madura, el polisacrido se hidroliza por la accin de las amilasas, y mediante otros sistemas enzimticos se sintetiza sacarosa y fructosa que se encuentran cuando llega la maduracin. Qumicamente el almidn es una mezcla de dos polisacridos muy similares, la amilasa y la amilo pectina; el primero es el producto de la condensacin de D-glucopiranosas por medio de enlaces (1-4), que establece cadenas lineales con 200-2500 unidades y pesos moleculares hasta de un milln; es decir, la amilasa es una -D-(1-4)-glucana cuya unidad repetitiva es la -maltosa. Tiene la facilidad de adquirir una conformacin tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de la hlice consta de seis molculas de glucosa. Por su parte la amilopectina se diferencia de la amilasa en que contiene ramificaciones que le dan una forma molecular similar a la de un rbol; las ramas estn unidas al tronco central (semejante a la amilosa) por enlaces -D-(1-6), localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa. Su peso molecular es muy alto ya que algunas fracciones llegan a alcanzar hasta 200 millones de saltones. En trminos generales, los almidones contienen aproximadamente 17-27% de amilasa y el resto de amilopectina (Badui, 1996).

Identificacin de almidones Se hace de manera cualitativa se realiza de una manera muy sencilla. Esta prueba se basa en que el yodo reacciona con la amilasa y genera un fuerte color azul caracterstico debido al complejo que se establece entre una molcula de ste con cada 7-8 glucosas; como para desarrollar perfectamente la coloracin se requiere un mnimo de 40 residuos de monosacridos, las cadenas muy cortas de amilasa, en lugar de azul, producen un color rojo. Aparentemente, el complejo amilasa-Yodo se establece por la inclusin del I2en hlice, mecanismo semejante al que se observa en los mono glicridos que se usan en la elaboracin del pan. Por otra parte, la amilo pectina slo acompleja una pequea cantidad de I2 y desarrolla una coloracin roja (Badui, 1996).

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D) Carbohidrasas

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Enzimas comercialmente disponibles, las carbohidrasas son las ms abundantes y tal vez las ms empleadas principalmente de fuentes microbianas que pueden ser hongos, levaduras, bacterias i. Amilasas: En esta categora se encuentran la y la -amilasa, cuyos mecanismos de actividad se detallarn ms adelante. El uso ms importante de estas amilasas es en la industria de la panificacin, ya que hidrolizan el almidn y producen los azcares (glucosa y maltosa) que a su vez, facilitan las reacciones de oscurecimiento no enzimtico que dan origen al color en el horneado; tambin favorecen la generacin del anhdrido carbnico, pues son sustratos fciles para las levaduras, lo cual provoca el esponjamiento, y por ltimo mejoran la textura del pan (Badui, 1996). La -amilasa es una endohidrolasa que acta de manera aleatoria sobre los enlaces internos (1,4) de la amilasa y de la amilopectina, con lo cual se producen dextrinas; se le da el nombre de enzima licuante debido a que su presencia provoca la rpida reduccin de la viscosidad de las soluciones de almidn. Es capaz de romper las uniones glucosdicas adyacentes a ambos lados del enlace (1,6) de la amilopectina, aunque no ataca especficamente este enlace. Por su parte la -amilasa hidroliza los enlaces (1,4) a partir de los extremos no reductores de la amilasa y de la amilopectina, y produce molculas de maltosa; esta actividad la clasifica consecuentemente como una exoenzima. Su accin se detiene al llegar a las uniones (1,6) de la amilopectina, y su nombre se refiere a que ocasiona una inversin del enlace a y genera molculas de -maltosa. Durante la maduracin de cereales, como el trigo, la actividad de -amilasa se incrementa considerablemente, se concentra en las capas ms externas y disminuye cuando alcanza la madurez; la -amilasa tambin aumenta su actividad pero la mantiene cuando alcanza la madurez. ii. Amiloglucosidasa: Esta enzima, tambin llamada glucoamilasa, tiene la capacidad de hidrolizar tanto los enlaces (1,4) como los (1,6) de las glucanas; su accin prolongada puede causar la ruptura total del almidn, por lo que se emplea en la fabricacin de los jarabes de glucosa. iii. Dextranasa: Las dextranas son polmeros de glucosa sintetizados a partir de la sacarosa por accin del Leuconostocmesenteroides en el jugo de la caa; por sus caractersticas de hidrocoloide, estos polisacridos incrementan la viscosidad y dificultan la manipulacin de los lquidos. La adicin de la dextranasa se hace para hidrolizar estos

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carbohidratos y facilitar as la manipulacin de los lquidos en la elaboracin de la sacarosa. iv. Lactasa: La -galactosidasa o lactasa desdobla la lactosa en sus correspondientes monosacridos y se puede emplear en diversos productos lcteos, sobre todo en los que se elaboran para las poblaciones que no toleran este disacrido. En algunos pases existe incluso una prelacin a base de la enzima, que se le aade a la leche antes de consumirla para reducir la cantidad de lactosa (Badui, 1996). v. -glucanasa: La accin hidroltica de esta enzima se ejerce sobre los enlaces (1,3) y (1,4) de diversos polisacridos, como algunas gomas; s eemplea para mejorar la extraccin del mosto de cervecera. vi. Celulasa: La celulasa es en realidad un sistema complejo de enzimas que hidrolizan las uniones (1,4) de las glucanas, como la celulosa, produciendo celulodextrinas; se ha usado en forma limitada para mejorar la extraccin de aceites esenciales, as como para ablandar los tejidos celulsicos de verduras y frutas y para ayudar la rehidratacin de diversos productos. vii. Pululanasa: La pululanasahidroloza los enlaces (1,6) de la maltotriosa (pululano), por lo que tiene la capacidad de actuar sobre la amilopectina y las dextrinas lmites. viii. Invertasa: La -fructofuranosidasa o invertasa hidroliza la sacarosa en sus dos monmeros constituyentes: su mayor aplicacin es en la elaboracin del azcar invertido. ix. Hemicelulosa: Esta enzima acta sobre los enlaces (1,4) de gomas como la guar y la de algarrobo, por lo que ayuda a descascarar los granos de caf y en la produccin del mosto para la cervecera. x. Pectinasa: Las preparaciones comerciales de esta enzima son en realidad mezclas de la pectinmetilestearasa, la poligalacturonasa y la pectinliasa: la forma de accin de cada una de ellas fue descrita en los tems anteriores. Se usa en la extraccin, clarificacin y filtracin de diversos jugos de frutas y de vinos, as como en la elaboracin de purs y concentrados frutcolas.

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Figura 2. Polmero de Almidn

Formada por 1000 o ms unidades de alfa-glucosa unidas por enlaces glicosdicos.

Figura 3. Enlaces y disposicin del almidn El polmero de almidn existe en forma de espiral. La forma de espiral es mantenida por los enlaces de hidrgeno.

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IV. MATERIALES Y MTODOS A. Materiales y Equipos

Materiales 2 muestras de papaya 1 muestra de hgado de pollo de nuestro horario y la otra muestra del hgado del laboratorio de la maana Solucin de Almidn Agua destilada HCl 0.1M KCl 0.154M Solucin de I2 0.01N

Equipos Tubos de ensayo Centrifuga Mortero Embudo de Vidrio Gasa Pipetas Mortero

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B. Metodologa Tomar nuestras muestras de papaya e hgado de pollo (para este caso hacer varios lavados, para eliminar la sangre y luego triturarlo) 20g de cada uno.

Hacemos el lavado de las muestras con solucin de KCl al 0.154M.

Homogeneizamos en un Mortero con soluciones de KCl 20 mL, para el caso de las muestras de papaya e hgado. El KCl permite una diferente presin y llega a establecer un desprendimiento de la enzima. El KCl se agrega durante la Trituracin.

Hacemos un filtrado, con la ayuda de una gasa la cual esta debe estar humedecida con KCl (se pone en el embudo). Disolver bien el triturado y filtramos.

Centrifugamos los tubos preparados a 4000 RPM por 10 minutos.

Nos quedamos con el lquido sobrenadante de cada tubo (PEC , porque no sabemos si el preparado tiene enzimas.

En los tubos de ensayo ingreso el Sustrato la Solucin Almidn Soluble: 400ppm a 0.4g almidn en un litro de agua destilada.

A continuacin en Cuadro 1, la cual se muestra en Resultados; procedemos a realizar para la Identificacin del Preparado enzimtico Crudo.

De este modo preparamos los tubos blanco, problema y testigo.

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V. RESULTADOS Y DISCUSION

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Siguiendo la metodologa establecida las muestras problemas fueron obtenidas y separadas segn el origen de las mismas: muestra de trigo germinado, semilla de pacay, hgado de pollo y pulpa de papaya, se compar cualitativamente (coloracin) una a una versus los tubos testigo y blanco correspondientes (cuya formulacin se muestra en la tabla 1), el contraste del inicio y el final de este proceso de desnaturalizacin del almidn se muestra en la figura 4. Cuadro 1. Agregados para los tubos testigos, problemas y Blanco en PEC

Soluciones Solucin almidn 400 rpm Agua destilada PEC Agregar HCl 0.1N PEC Solucin de Iodo

Testigo 2.5 mL 0.4mL -----2.5 mL 0.1mL 0.1mL

Problema 2.5mL 0.4mL 0.1mL 2.5mL -----0.1mL

Blanco ------2.9mL 0.1mL 2.5mL -----0.1mL

Incubar a 35C por 15 minutos

El propsito de la elaboracin de un tubo blanco y un testigo es comparar matices de estos dos elementos frente a uno que es el problema a analizar para determinar a cul de los dos se asemeja y deducir que posee las mismas caractersticas que el elemento semejante (Badui.1996),

Figura 4. Antes y despus de las muestras de extractos vegetales y animales En las figuras 5, 6,7 y 8 del anexo, se muestra la comparacin de los matices del tubo problema, el testigo y el blanco de las 4 muestras analizadas, los resultados se muestran en el cuadro 2.

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Cuadro 2. Resultado del anlisis cualitativo resultado muestra semilla de pacay trigo germinado hgado de pollo pulpa de papaya con actividad X X X sin actividad X -

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Como se puede ver en el cuadro 2 para la muestra de hgado de pollo se observ una coloracin azul bien marcada lo cual nos indica la presencia de almidn en el medio, por tanto la ausencia de amilasas ya que si hay almidn entonces no hubo desnaturalizacin del mismo por enzima alguna. Segn Wiseman (1996), la identificacin de almidones presentes en un compuesto, se hace de manera cualitativa se realiza de manera muy sencilla. Esta prueba se basa en que el yodo reacciona con la amilasa y genera un fuerte color azul caracterstico debido al complejo que se establece entre una molcula de ste con cada 7-8 glucosas; como para desarrollar perfectamente la coloracin se requiere un mnimo de 40 residuos de monosacridos, las cadenas muy cortas de amilasa, en lugar de azul, producen un color rojo. Para el resto de casos el tubo problema presento coloraciones ms cercanas al tubo blanco que le corresponda a cada una de sus sistemas de muestras, la coloracin clara amarillento indica la ausencia de almidn por ende desnaturalizacin del mismo por accin de las enzimas amilasas presentes en la composicin de sus medios; estos casos se dan en la semilla de pacay,trigo germinado y pulpa de papaya donde las coloraciones se asemejan al tubo blanco indicando la ausencia de almidon y la presencia de amilasas en cada composicin. Segn Frazier (1981), en los tubos testigos hay presencia de sustrato y no reacciona, en los tubos problemas aqu solo hay reaccin y tiene sustrato y enzima. En el tubo Blanco no hay sustrato si enzima, por lo que no hay reaccin. Esto se comprob en las figuras 5,6,7y 8 del anexo donde en el tubo testigo no hay reaccin por la presencia del sustrato y no de la enzima, en la Figura 5, 6, 7 y 8 vemos que en el hgado de pollo el tubo testigo no hay reaccin pero si actividad enzimtica.

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VI. CONCLUSIONES

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Se logr preparar adecuadamente las soluciones enzimticas crudas para cada muestra utilizada, el contacto con un ambiente frio resulto de importancia para la disminucin de la desnaturalizacin de ciertos componente que se hubiesen perdido a temperatura ambiente en el proceso de molido o machacado. Se lleg a identificar cualitativamente un preparado enzimtico crudo con papaya e hgado de pollo en lo cual vemos que si el tubo de ensayo se torna de color azul indicar la presencia del almidn. se identific cualitativamente la actividad enzimtica de las mismas muestras donde los tubos testigos no haba reaccin porque a mayor color no hay reaccin y en los tubos blancos al tener un color ms claro si har reaccin. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

BADUI, S. (1996). Qumica de los Alimentos. Editorial Pearson Education. Mxico

CRUEGER, W. (1993). Biotecnologa - Manual de Microbiologa Industrial. Edit. Acribia, S.A Zaragoza. Espaa

FRAZIER, C. (1981). Microbiloga de los Alimentos, 2 Ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza. Espaa.

HERNNDEZ M, CARVAJAL C, SANTOS R, MRQUEZ M, BLANCO M, GONZLEZ J,( 1999). Purification alternatives of obtained bromelain from different sources. Pineapple News. 1999; 6:5.

Poulos L. (2003). New understanding of thermostable and piezostable enzymes. Estados Unidos. Pg. 360- 365.
WISEMAN, A. (1986). Principios de Biotecnologa. Editorial ACRIBIA S.A. ZARAGOSA (Espaa).

SCRAGG (1996). Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas Biolgicos en procesos tecnolgicos. Editorial Limusa Editores. Mxico D.F.

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ANEXOS

FIGURA 5. ANALISIS CUALITATIVO POR CONTRASTE EN LA MUESTRA DE HIGADO DE POLLO

FIGURA 6. ANALISIS CUALITATIVO POR CONTRASTE EN LA MUESTRA DE SEMILLAS DE PACAY

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FIGURA 7. ANALISIS CUALITATIVO POR CONTRASTE EN LA MUESTRA DE PULPA DE PAPALLA

FIGURA 8. ANALISIS CUALITATIVO POR CONTRASTE EN LA MUESTRA DE TRIGO GERMINADO

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FIGURA 9. TRITURADO Y MACHACADO DE LAS MUESTRAS

FIGURA 9. RECEPCION Y PESAJE DE LAS MUSTRAS PARA PEC

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