Microbiología Industrial Y Alimentaria

Microbiologa Industrial y Alimentaria
Que es la microbiologa industrial?

La microbiologa industrial es la microbiologa que estudia la aplicacin de la biotecnologa de los microorganismos en la industria. Esto implica la utilizacin de sistemas biolgicos en diferentes procesos industriales. En general puede abarcar diferentes mbitos: Fabricacin de diferentes compuestos orgnicos. Transformacin de productos, hecho que cada da tiene ms importancia, puesto que las reacciones mediadas por los seres vivos ocurren en condiciones de presin, temperatura,... normales. Por lo tanto puede ser ms barato el uso de seres vivos, ya que no se requieren condiciones especiales. Adems, en muchos casos sern reacciones ms eficaces que las qumicas. Se ha de tener en cuenta siempre que la industria buscar la mayor eficiencia posible y la reduccin de costes, ya que lo que interesa es tener beneficios. Reacciones con compuestos inorgnicos, como puede ser el caso de la lixiviacin de metales. Produccin de biomasa, con diferentes finalidades. A menudo el producto final de las reacciones son los propios microorganismos, por su valor en alimentacin humana, como Saccharomyces,... o animal, como las SCP. Degradacin de sustancias, como puede ser la depuracin de aguas, el tratamiento de residuos,... Biosensores, determinacin de la presencia de sustancias, mediante sistemas biolgicos. Tambin puede servir en los controles de calidad. Est adquiriendo una gran importancia en los ltimos aos, ya que es una muy importante herramienta de anlisis. Microbiologa Industrial Considera la parte positiva de lo microorganismos, sus posibles aplicaciones. microbiologa industrial va encaminada a grandes reas: - Servicios, como eliminacin de residuos - Produccin de sustancias de inte econmico - Anlisis, en el desarrollo de biosensores La microbiologa industrial se centra en lo posibles beneficios que se pueden obtener del de microorganismos en procesos industriales. Microbiologa Alimentaria Considera la parte negativa de los microorganismos. La microbiologa alimentaria aborda principalment 2 problemas. Los alimentos no pueden enfermedades un alimento su inocuidad, que no perjuicios al ser humano, por la presencia de organismos patgenos en ellos. Los alimentos han de poder durante un cierto tiempo, no se estropear por la accin de organismos ellos, o como mnimo retrasar la degradacin.
La microbiologa alimentaria se preocupa por l alteracin de los alim microorganismos desde el punto de vista sanitari organolptico.
Biotecnologa
Ambos tipos de microbiologa abarcan diferentes aplicaciones de la biotecnologa. La idea de la biotecnologa surge en los aos 20, ligada a la produccin de alimentos. Tuvo su auge en los aos 50, centrada en la produccin de plsticos e hidrocarburos. La biotecnologa ser por lo tanto el uso integrado de la bioqumica, la biologa y la ingeniera qumica para conseguir aplicaciones tecnolgicas de los sistemas biolgicos y los cultivos celulares. Una nueva definicin de biotecnologa actualmente dice que la biotecnologa es el conjunto de procesos industriales donde se utilizan organismos obtenidos mediante DNA recombinante y otras tcnicas genticas.
Existen diferentes definiciones de biotecnologa: Biotecnologa Manipulacin de organismos vivos, sobre todo a escala gentica, para obtener productos tiles.
definicin, parece que la microbiologa industrial no sera biotecnologa.
Combinacin de procesos industriales donde se usan sistemas biolgicos obtenidos mediante recombinante u otras tcnicas de manipulacin gentica. Se aproxima ms a la microbiologa industrial,
adecuada aun.
Uso integrado de la bioqumica, microbiologa y de la ingeniera qumica con el fin de obtener producto tiles y aplicaciones tecnolgicas de los microorganismos, cultivos celulares y otros sistem
Esta es la definicin ms adecuada a los contenidos de la microbiologa industrial y alimentaria.
De hecho distinguimos 2 clases de biotecnologa. Biotecnologa tradicional o clsica (Industrial) Es la rama de la biotecnologa que obtiene produccin a gran escala, con costes reducidos. Sus principales productos son alimentos o ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibiticos y cido ctrico. Se trata de produccin en toneladas y se valora en aproximadamente 31010 $ anuales Nueva biotecnologa o biotecnologa fina Se concentra en la fabricacin de productos al detalle. Produccin de tan solo kilogram son productos de un gran valor aadido, como pueden ser insulina, interfern, enzima uso de tcnicas ms nuevas de ingeniera gentica y de la fusin de clulas para obtener organism capaces de generar los productos deseados. Hacia 1989 la biotecnol aproximadamente 109 $ al ao, pero cada vez representa una mayor fraccin de la industria total. Esta divisin no quiere decir que la biotecnologa clsica no utilice las ms modernas tcnicas de ingeniera gentica, ya que si son necesarias, se usan. Ni tampoco quiere decir que en la biotecnologa fina no se usen los conocimientos adquiridos tras tantos aos de trabajo en la biotecnologa tradicional. En realidad, el ser humano aprovecha las reacciones mediadas por los microorganismos desde hace siglos: Ao 20000 aC 6000 aC 3000 aC Producto, proceso o descubrimiento Bebidas alcohlicas por fermentacin de diferentes zumos de frutas en pueblos primitivos Cerveza y pan en Mesopotamia, Egipto y China Cultivo de via en el sur del Cucaso Leches fermentadas y quesos en oriente medio Tecnologas de vinos y cervezas en Egipto y Sumeria Vinagre a partir de zumos fermentados Tecnologa del vino fermentado en Egipto Vino: No, babilonio Upnapishtim Cerveza en el Segri Quesos azules Queso Roquefort Cerveza con lpulo: Santa Hildegarda Espritu del vino Arnau de Vilanova: alcohol Vinagre industrial en Orlens Cultivo de championes en Francia
2600 aC 1800 aC 1100 aC 79 dC 1070 1133 1150 1300 1650
1680 1700 S. XIX S. XX 1920
Leeuwenhoek: visin de clulas de levaduras Primeras cerveceras industriales Nacimiento de la microbiologa con Pasteur
1 Guerra Mundial. Los alemanes ponen a punto la tecnologa necesaria para la fermentaciones a escala industrial, para la produccin de disolventes orgnicos. 1940 2 Guerra Mundial. Fleming descubre la penicilina. Se hacen importantes descubrimientos en ingeniera, como tcnicas de esterilizacin y se perfeccionan las tcnicas de mejora de cepas. 1940 1960 El producto estrella de la biotecnologa son los antibiticos. Tambin se desarrolla la transformacin de los esteroides y se perfeccionan los cultivos de clulas animales para el desarrollo de vacunas vricas. 1960 1970 En Japn se desarrolla la tecnologa para la produccin de aminocidos y 5 nuclesidos, estimulantes del sabor. Se perfecciona la produccin de enzimas, as como las tcnicas de inmovilizacin de clulas y enzimas. Se mejoran las fermentaciones en continuo, para la produccin de SCP. 1975 Aparicin de la tecnologa del DNA recombinante. Produccin de insulina humana en E. coli.
Aplicaciones de los microorganismos en la industria

Produccin de metabolitos primarios y de productos relacionados Bebidas alcohlicas Vinos Cervezas Etanol Etanol industrial cido lctico Productos lcticos Leches fermentadas Quesos Embutidos Vegetales fermentados: col cida,... Vinagre Saccharomyces
Lactobacillus Bacterias lcticas
Quesos Emmental Salsa de soja, miso, kimchi, sutu, Floriduras y bacterias tempeh,... lcticas Aminocidos L Glutmico Corynebacterium L Lisina Produccin de metabolitos secundarios Antibiticos lactmicos Penicilium Tetraciclinas Streptomyces Peptdicos Bacillus Aminoglicsidos Streptomyces Alcaloides Ergotamina Claviceps Pigmentos Astaxantina Phaffia Produccin de otros componentes biolgicos Polisacridos Dextrano Leuconostoc Xantano Xanthomonas Bioplsticos Vitaminas Transformacin de esteroides Polihidroxialcanatos B12 Riboflavina Alcaligenes Pseudomonas Ashbya Floriduras Streptomyces
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cido actico cido ctrico cido propinico Alimentos orientales fermentados
Acetobacter Aspergillus Propionibacterium
Aplicaciones ambientales Depuracin de aguas residuales
Fangos activos
Bacterias aerobias Protozoos Bacterias anaerbicas Arqueas Metangenes Pseudomonas Aspergillus Photobacterium Salmonela Saccharomyces Methylophilus Candida Chlorella Scenedesmus Spirulina Bacillus Paecilomyces Morchella Aspergillus Bacillus Escherichia Escherichia
Depuracin de materia orgnica Biodigestin anaerobia semislida Biodegradacin de xenobiticos Aplicaciones analticas Biosensores Bioensayos Tests mutagnicos Produccin de biomasa microbiana Microorganismos unicelulares Biodegradacin de hidrocarburos Anlisis de glucosa Tests de Toxicidad ambiental Test de Ames Levadura de panificacin Protena unicelular bacteriana Protena unicelular de levaduras Microalgas
Protena unicelular fngica Cultivo de setas Produccin de enzimas y otras protenas Enzimas Amilasas Hormonas Otras protenas Proteasas Insulina humana Interfern humano
Esporas bacteriana Biomasa fngica
Bioinsecticidas
Sistemas biolgicos usados en la microbiologa industrial

Un biocatalizador es un agente biolgico que se utiliza en la obtencin de un producto o servicio de inters biotecnolgico. En la microbiologa industrial se usan diferentes tipos de agentes biolgicos. Microorganismos: Son los sistemas biolgicos ms usados en la microbiolgica industrial. Se trat bacterias, hongos, protozoos y virus. Esporas: En ocasiones el sistema biolgico de inters para producir el producto o el servicio son la esporas, como en el caso de los bioinsecticidas. Obtendremos las esporas a partir de cultivos celulares. Enzimas y otras protenas. Cultivos celulares. Podemos usar cultivos celulares vegetales o animales para la fabricacin de o la obtencin de servicios, como por ejemplo el uso de hibridomas para la obtencin de antic monoclonales. En ocasiones se pueden usar solo algunos orgnulos. Los microorganismos presentan una serie de ventajas sobre los otros posibles sistemas biolgicos. Tienen una elevada diversidad metablica y una gran plasticidad. Siempre existir algn microorganismo que pueda hacer la reaccin que se desea en un determinado momento. El nico problema es que se ha de encontrar el microorganismo ms adecuado. Se cree que se conocen tan solo 1/3 de los microorganismos existentes en el mundo. Son extremadamente fciles y baratos de cultivar. o Crecen sobre sustratos baratos. En ocasiones pueden crecer sobre residuos de otras empresas, como papeleras, crnicas,...
Las condiciones de cultivo son baratas de obtener y mantener, en comparacin con las que se necesitara para las transformaciones qumicas. No es necesario normalmente incrementar la temperatura ni la presin. En muchos casos son los propios organismos los que provocarn un cambio de la temperatura. En ocasiones ser incluso necesario refrigerar.
Productos y servicios que puede ofrecer la microbiologa industrial 1. Produccin de clulas, como por ejemplo levaduras o algas con diferentes finalidades. La levadura ser necesaria para la produccin de pan. Las clulas se usan generalmente para la alimentacin, tanto humana, como en el caso de hongos o algas, como animales, como es el caso de la SCP, para formar parte del pienso, o para ser directamente el pienso. Otras veces se producirn clulas, pero slo se aprovechar una parte, como puede ser el caso de las esporas para los bioinsecticidas. Enzimas y otras protenas de elevado valor aadido. Existen muchos enzimas que pueden entraar inters para su produccin industrial, y con diferentes usos posibles. Incluso otros tipos de protenas pueden ser tiles, como la insulina, el interfern,... Metabolitos primarios y secundarios. Tanto un tipo como el otro pueden tener inters aplicado. Los metabolitos primarios son componentes relacionados con la sntesis de clulas microbianas, con su crecimiento. Aumentan en paralelo al crecimiento celular, o incluso de manera solapada. Son por ejemplo los productos finales de las fermentaciones como el etanol o los cidos orgnicos. Los metabolitos secundarios suelen acumularse en la fase que sigue a la fase de crecimiento activo, la trofofase, que es la que se denomina idiofase. Las sustancias que se producen en la idiofase no tienen relacin directa con la sntesis de materiales celulares, ni con el crecimiento. Son sustancias que no son bsicas para el crecimiento. La trofofase y la idiofase no son fases del crecimiento bacteriano, sino que son solo fases de la produccin de metabolitos, pueden coincidir con las fases de crecimiento, pero no son lo mismo. Otros productos. Los anteriores son los productos de mayor importancia, pero existen otros productos, como: polisacridos, que tienen muchos usos, como por ejemplo aditivos alimentarios. Bioplsticos Ciertas vitaminas Transformacin de microorganismos. Se obtienen un producto, pero el microorganismo no lo ha sintetizado todo, sino que tan solo ha realizado un par de reacciones sobre l. Es el caso de los esteroides, cidos grasos,... Pueden tener un gran valor aadido.
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Depuracin de residuos. Los ecosistemas tienen inercia y plasticidad. Cuando sufren alteraciones tienden a recuperarse. La actividad humana altera los ecosistemas, mediante la industria, por ejemplo. La industria que se instala al lado de un ro y usa el agua de este como refrigerante est produciendo en el ro una contaminacin fsica, ya que est alterando un factor bsico, como es la temperatura del ro. El ro continuar fluyendo y pasados unos kilmetros, habr vuelto a la temperatura que tena antes de pasar por la fbrica, ha conseguido restaurar el factor temperatura. Los ecosistemas tienen capacidades de regeneracin y recuperacin, pero la actividad humana actualmente ha superado con creces esta capacidad, por lo que los ecosistemas estarn permanentemente contaminados. Todo esto ha llevado al desarrollo de tecnologas de depuracin, que tratan de reducir el impacto de la actividad humana sobre los ecosistemas. Estas nuevas tcnicas se basan en la mimetizacin de los procesos que tienen lugar en el ro, pero aumentando la concentracin o la intensidad, como en el caso de las plantas de lodos activos. Aguas residuales. En los pases desarrollados hay una elevada produccin de aguas residuales, ya sean de origen domstico o industrial. Un elevado porcentaje de esta agua ser tratado biolgicamente. El objetivo de estos procesos es la eliminacin de la materia orgnica del agua, que no eliminarla directamente. Actualmente las aguas residuales se tratan siguiendo una serie de procesos aerbicos clsicos, como son: o o o o Lodos activos Lechos bacterianos Lagunas facultativas Reactores de clulas inmovilizadas
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Estos procesos hacen que la materia orgnica en suspensin en el agua se elimine por procesos de sedimentacin. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuracin de aguas eliminan residuos lquidos, pero los producen slidos, que debern ser tratados como otros residuos slidos. Residuos slidos. Son otro gran problema de los pases desarrollados. Estos residuos pueden ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuracin de aguas, pasando por residuos agrcolas e industriales. Los residuos slidos se someten normalmente a procesos de digestin anaerobia. Este tipo de digestin reduce el volumen de los residuos. En condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las bacterias deber ser dedicado a la obtencin de energa, de manera que el crecimiento de bacterias a partir del sustrato es bajo. Los residuos orgnicos pasan a ser casi totalmente CH4 y CO2, lo que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo que puede ser usado como fuente de energa, pero puesto que el principal objetivo es la reduccin del volumen de residuos y su estabilizacin, la produccin de metano no est optimizada, aunque se debe aprovechar el que se produzca. Xenobiticos. Adems de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos puntuales de xenobiticos. Se trata de productos producidos qumicamente por el hombre, no producidos por ningn ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningn ser vivo. Tambin pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difcil y lenta degradacin. Se han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son inoculados cuando se produce un vertido. El problema de los xenobiticos se est haciendo desgraciadamente cada da ms comn. Un problema que se encuentra tambin es que para recalificar el suelo industrial a urbanizable, mucho ms rentable, este debe estar limpio de productos xenobiticos.
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Aplicaciones analticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgnulos unidos a electrodos de manera que las reacciones biolgicas devengan corrientes elctricas. Esto permite medir concentraciones de compuestos especficos en diferentes entornos, detectando contaminantes, aditivos en alimentos,... Los biosensores han despertado un gran inters, pero an se estn poniendo a punto. Otro uso analtico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinacin de una sustancia biolgicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de dicha sustancia. Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumulara muy rpidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que demuestren dicha biodegradabilidad. En trminos legales, cuando hablamos de biodegradable, en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable, pasando a ser tan solo agua y dixido de carbono. El 30% restante no se degradar y su composicin permanecer desconocida. Esto es lo que estipula la ley. No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad. o Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestin a una concentracin muy elevada, durante un perodo breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos una vida de 40 aos, el perodo breve seran 5 minutos Crnicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un largo perodo de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para ver el efecto en estos.
Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teora debera haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos
tests sobre bacterias, de manera que si es txico para la bacteria no se comercializar. Pero pese a no ser txico para la bacteria podra ser txico para otros organismos. Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la descendencia, por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El test ms empleado actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo mutantes His- de S. typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversin elevada de aproximadamente 10-4, que Ames tena muy bien medida. Esta bacteria se pona en contacto con la sustancia a comprobar. Si aumentaba la tasa de reversin, se trataba de un producto mutagnico, en caso de no aumentar era no mutagnico. El problema radica en que muchas sustancias son premutgenos, que en su forma inicial no son mutagnicas, pero que al llegar al hgado se activan y pasan a ser mutgenos. Para comprobar que la sustancia no es un premutgeno se le administraba a una rata. Despus se sacrificaba, se extraa el hgado y se someta a ste a una centrifugacin diferencial. Aslas entonces las fraccin microsomal, que contendr premutgenos activados y la compruebas con S. typhimurium.
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Lixiviacin. Podemos usar los microorganismos para la recuperacin de metales a partir de minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundicin, el mtodo tradicional. La biolixiviacin la realiza Thiobacillus ferrooxidans.
Breve historia de la biotecnologa Podemos dividir la historia de la humanidad en tres perodos, considerando la manera de conseguir los alimentos. En una primera etapa de cazadores recolectores, el hombre deba perseguir y buscar los alimentos. En una segunda etapa de agricultores ganaderos, el hombre cultiva los alimentos, lo que implica un aumento de la poblacin, as como de la esperanza de vida, pero a la vez genera un problema, puesto que habr pocas del ao en las que no se podr recolectar alimento, por lo que el que se recoja en tiempos de disponibilidad deber durar todo el ao. Se empezaron a desarrollar mtodos de conservacin rudimentarios. Adems, debido a la accin microbiolgica, se desarrollaron otras tcnicas de conservacin, como pueden ser el queso, el yogurt, los embutidos,... En lo que respecta al vino y a la cerveza, se ha de tener en cuenta que hasta hace poco eran la forma ms sana de beber agua, ya que haba una gran posibilidad de que estuviese contaminada. Actualmente estamos en una tercera etapa, en la que somos ya gourmets, ya que en la alimentacin humana el problema no lo representa ya la disponibilidad de alimentos, sino que actualmente los alimentos han de ser saludables y sabrosos. Indicadores de desarrollo y calidad de vida Tpicamente, un indicador del desarrollo de un pas y de su calidad de vida suele ser la renta per cpita, el PIB,... pero la produccin de basuras por habitante y da puede ser un indicador tan bueno como cualquier otro. Una produccin de basura superior a 1Kg al da indica una buena situacin econmica, mientras que valores inferiores indican una situacin econmica peor. Otro valor que puede ser de inters es el consumo de agua diario. Un ser humano necesita estrictamente 1,5 l de agua al da, que es la que ha de beber, pero en la prctica, el consumo de agua por individuo al da es muy superior, sobre todo en pases desarrollados. En pases en vas de desarrollo el consumo diario oscila entre los 20 y los 40 litros diarios por persona. En pases ms desarrollados se alcanzan valores ms elevados. En Barcelona se oscila entre los 170 250 litros al da por habitante, pero considerando la totalidad de Espaa se alcanzarn valores cercanos a los 300, ya que se considerarn tambin todos los campos de cultivo. Los pases ms desarrollados tienen un consumo diario aproximado de 350 litros por habitante. Cada vez se usa ms agua, por lo que nos enfrentamos a un problema, ya que la precipitacin anual en Barcelona es de 400 550 mm. Bsicamente se siguen dos tcnicas para poder tener el agua necesaria. En primer lugar el agua se reutiliza, y en segundo lugar puede ser necesario traer agua de otras cuencas ms ricas.
Fermentaciones Industriales I
En los temas siguientes veremos todas las etapas que componen una fermentacin industrial. En la tabla las vemos todas resumidas. Curso de la fermentacin I II Preservacin del inculo Multiplicacin del inculo a. b. III IV Cultivo de prefermentacin Fermentacin de produccin Cultivo en matraces agitados Formacin de esporas en medio sli
1 3 cultivos de prefermentacin a. b. Fermentacin discontinua Fermentacin continua
Conservacin del inculo

El problema de trabajar con microorganismos es su bajo tiempo de vida, ya que para poder trabajar con ellos son necesarias sucesivas generaciones del organismo que se mantengan idnticas entre s. Esto puede presentar una serie de problemas. La conservacin de cepas de produccin a lo largo de un perodo largo de tiempo es un requerimiento bsico para la fermentacin industrial. El objetivo no ser solo la supervivencia del organismo, sino que este mantenga sus capacidades de produccin despus de la conservacin. El objetivo de la conservacin es mantener las cepas sin cambios celulares tanto tiempo como sea posible. Ha de encontrarse el mtodo ms adecuado para cada cepa. 1. Subcultivos. Es el mtodo ms fcil. Los microorganismos se mantienen como cultivo por picadura en agar o en cultivo lquido en nevera, pero presenta dos incovenientes: Tiene elevados costes. Peligroso: Existe un elevado riesgo de contaminacin y de mutacin, ya que se producir una mutacin cada 8 16 semanas, o alguna al ao. Incluso pueden morir todas las clulas al haber tardado en hacer un nuevo subcultivo.
En estos casos los cultivos se mantienen a bajas temperaturas, entre 2 y 6 C, para que las sucesivas resiembras estn espaciadas en el tiempo, hasta semanas, pero se han de hacer en un momento u otro. Una variante de este mtodo es el uso de medios pobres, ya sean medios mnimos o tan solo agua y agar. Al tener a los microorganismos en medios tan pobres, el crecimiento se ver ralentizado mucho, pudiendo llegar a alargar el tiempo entre las siembras a meses, entre 3 y 5, pero los riesgos son los mismos que se han dicho. 2. Esporulacin. Solo se puede usar en microorganismos esporulantes. En estos organismos habr suficiente con inducir la esporulacin Las esporas se almacenan entonces en un medio mineral, estril y seco, para que no germinen. Esto permite mantener los microorganismos viables durante mucho ms tiempo, incluso dcadas. Los esporuladores son los nicos organismos que no dan problemas de conservacin. Almacenamiento por congelacin. Un descenso de la temperatura de 10 C supone un descenso de la velocidad metablica del 50%. A temperaturas de ultracongelacin el metabolismo estar totalmente frenado, incluso la actividad qumica. Existen diferentes temperaturas de congelacin. Suave: -18 C, congelador domstico Fuerte: -80 C, congelador de 2 compresores Ultracongelacin: -196 C, congelacin en N lquido.
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La congelacin en nitrgeno lquido permite conservar incluso microorganismos delicados ms de 15 aos. Se ha de tener en cuenta, antes de usar este medio, que es caro, ya que se necesita electricidad para mantenerlo y que el nitrgeno lquido se va perdiendo, por lo que se deber ir renovando. En N liquido el organismo no se alterar, pero se ha de considerar si no existe un medio ms econmico de conservacin, acorde con el valor del cultivo. La congelacin ha de ser rpida pero gradual, para lo que se han de tener en cuenta las siguientes consideraciones. a. b. c. Los microorganismos deben estar en un medio rico y lquido, donde crecern en la fase exponencial hasta llegar a su Nmax, justo antes de llegar a la fase estacionaria. La concentracin de microorganismos ha de ser elevada, para lo que se eliminar el medio por filtracin y se repartir el cultivo en 50 100 viales. Adicin del crioprotector que evitar la formacin de cristales en el interior de la clula, que puede ser glicerol o DMSO, ya que son los ms usados. La concentracin de estos crioprotectores ha de estar entre el 5 y el 20%, ya que concentraciones ms elevadas daran problemas de toxicidad al descongelar. Se congela lo ms rpidamente posible. Al cabo de 10-15 das, una vez se haya estabilizado la congelacin, se debern coger 4 o 5 viales al azar, que se cultivarn. Esto es el control de calidad o control de viables y es bsico, ya que as podremos conocer el nmero aproximado de viables que habr en cada vial, ya que al congelar se habr reducido este nmero. El nmero de viables no ha de ser menor del 70 80% del nmero de viables original. Si se recuperan menos, significar que algo no habr ido bien. Si el control de viables da los resultados deseados, se reparten los viales restantes en 2 congeladores, por seguridad.
d. e.
f. 4.
Liofilizacin. Es el mejor mtodo de conservacin existente. Conserva tan bien como la congelacin, pero presenta la ventaja de que no es necesaria la conservacin a bajas temperaturas, con lo que resulta ms barato y seguro. En la liofilizacin o desecacin por congelacin trabajamos sobre el punto triple del agua, para pasar del estado slido al gaseoso sin pasar por el lquido, en un proceso de sublimacin. En primer lugar se congela y despus se pasa al vaco provocando la sublimacin del agua. El protocolo de liofilizacin es bsicamente idntico al de congelacin, hasta el apartado c, aunque en la liofilizacin no se usan ni glicerol ni DMSO como crioprotectores, debido a su toxicidad, ya que al eliminar el agua su concentracin sera txica para el microorganismo. En lugar de estos crioprotectores se usan azcares o leche. Entonces congelamos las muestras, nunca a temperaturas superiores a 50 C, y si son inferiores mejor. Eliminamos entonces el agua congelada al crear el vaco en la muestra. Para mantener la muestra liofilizada es bsico impedir que se pueda rehidratar, ya que sin agua no hay metabolismo. Una vez se ha deshidratado se ha de sellar hermticamente la botella. La temperatura ptima de almacenamiento est entre 0 y 18 C, pero nunca menor, ya que no se ha de congelar, y siempre en oscuridad. Una vez liofilizado se ha de hacer un control de calidad, como en el caso de la congelacin. La liofilizacin es el mtodo que se emplea en la conservacin de las grandes colecciones tipo, porque cuando se puede hacer, hay algunos organismos que no la toleran, es el mtodo ptimo. Permite mantener la viabilidad a largo plazo, con costes reducidos, y menos trabajo que la congelacin en N lquido, el segundo mtodo con mayor viabilidad a largo plazo.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la sntesis de material celular y la produccin de metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos qumicos, de composicin conocida, para la obtencin de medios de cultivo, que son medios sintticos, pero en las fermentaciones industriales los medios han de ser lo ms baratos posibles. En microbiologa industrial raramente se usan medios ptimos, equilibrados o definidos, sino que en muchos casos los medios usados estn formados a partir de subproductos de otras industrias. Sern medios muy variados en su composicin, nunca ptimos ni equilibrados, ni mucho menos definidos. Esto presenta una serie de consecuencias sobre el desarrollo de los organismos y sobre el control de la fermentacin. I. Un medio de cultivo ptimo y ms o menos equilibrado es obligatorio para conseguir la mxima produccin. Es necesario por lo tanto optimizar los medios industriales, lo que no es tarea fcil, teniendo en cuenta los ingredientes de los que se parte, muy complejos y variables. Los medios de cultivo industriales pueden optimizarse usando mtodos estadsticos, mediante programas diseados con ordenador. En caso de ser necesario pueden aadirse suplementos de elementos crticos ausentes o insuficientes en el medio. Control de calidad. Los medios se disean para conseguir la mxima produccin. En todos los casos, los nuevos sustratos han de ser evaluados precisamente antes de iniciar la produccin industrial, mediante fermentaciones prueba. Represin por el catabolito. Consiste en la represin de la sntesis de determinadas protenas como consecuencia de la presencia de una determinada fuente de carbono y energa, como puede ser la glucosa. La existencia de una fuente de carbono y energa ptima en el medio puede provocar que algunas protenas no se expresen, lo que puede reducir la eficacia de ciertas reacciones de inters industrial, o incluso impedirlas. La represin por el catabolito o por el producto puede eliminarse optimizando los nutrientes en el medio, de manera que no haya glucosa, por ejemplo, o por gestin adecuada del fermentador, de manera que se aada la glucosa poco a poco al medio. Si no funcionase esta aproximacin, deberan usarse cepas mutantes desreguladas para la produccin.
II.
III.
Sustratos usados como fuente de Carbono y de Nitrgeno Los carbohidratos son las fuentes de energa por excelencia en la industria de la fermentacin. Por razones econmicas, la glucosa o la sacarosa son usadas muy raramente como nica fuente de C, excepto en procesos que requieran un control muy preciso de la fermentacin. Los sustratos usados ms abundantemente en las fermentaciones son: Melazas. Subproducto de la industria azucarera, son los restos del refinado del azcar. Son una de las fuentes ms baratas de carbohidratos. Adems de una elevada cantidad de azcares contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos traza. En cualquier caso, su composicin vara en funcin de la materia prima usada para la obtencin del azcar, las condiciones climticas, la localidad y el proceso usado en la industria azucarera. Extracto de malta. Es el extracto acuoso de la cebada malteada. Se trata de un sustrato excelente para muchos hongos, levaduras y actinomicetes. El extracto seco de malta contienen entre un 90 y un 92 % de carbohidratos, concretamente hexosas, que son glucosa y fructosa, disacridos como la maltosa y la sacarosa, e incluso trisacridos como la maltotriosa. Las sustancias nitrogenadas en el extracto de malta incluyen pptidos, protenas, aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. La composicin de aminocidos vara en funcin del grano usado, pero la prolina siempre constituye ms de un 50%. Uno de los problemas que presentan los sustratos ricos en azcares es lo que se conoce como reaccin de Maillard, que se da a bajo pH y elevadas concentraciones de azcares reductores. Los grupos NH2 de las aminas, aminocidos y protenas reaccionan con los grupos CHO de los azcares reductores, lo que resulta en la formacin de productos de condensacin de color tostado, empeorando el aspecto del producto y que no pueden ser usados por los microorganismos, restando as nutrientes.
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Almidn y dextrinas. Pueden ser metabolizados directamente por los organismos productores de amilasas. El almidn ha adquirido importancia en la produccin de etanol. Lquidos sulfticos de las papeleras. Se trata de productos residuales que contienen azcar de la industria del papel. Los lquidos sulfticos de conferas contiene entre el 2 y 3 % de azcares, de los cuales el 80 % son hexosas y el resto pentosas. En el caso de los rboles de hoja caduca, el contenido es principalmente de pentosas. Celulosa. Debido a su gran disponibilidad y bajo coste, la celulosa est siendo utilizada como sustrato de fermentacin. Proviene de la paja, restos de mazorcas, turba, papel,... A menudo no puede ser utilizada directamente como fuente de carbono, por lo que se deber hidrolizar en primer lugar, ya sea qumica o enzimticamente, dando el jarabe de glucosa, que se usa en la produccin de etanol, butanol, acetona e isopropanol. Aceites vegetales, como aceite de soja, de algodn o de palmera. Son usados como ingredientes secundarios, cuando se usa ya una fuente de carbohidratos como principal aporte de energa. Etanol. Es el producto de la fermentacin del almidn sacarificado o de la celulosa y puede ser usado como nica fuente de carbono o como fuente complementaria para muchos organismos. Alcanos. Alcanos de 12 a 18 C son rpidamente metabolizados por muchos microorganismos. Estos alcanos son residuos del refinado del petrleo y su uso como alternativa a los carbohidratos depende de su precio.
Fuentes de Carbono y energa diferentes de los carbohidratos -
En lo que respecta a los sustratos usados como fuentes de nitrgeno, en muchos procesos industriales se usan los siguientes.
+
gaseoso.-
NH4+, sales, urea o NH

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Lquido de maceracin del maz. Se trata de un subproducto de la produccin de almidn a partir del maz. El extracto concentrado tiene un 4% de N y numerosos aminocidos, como son: Ala, Arg, Glu, Ile, Tre, Val, Fenil Alanina, Met y Cis. Extracto de levaduras. Es un sustrato excelente para muchos microorganismos. Se produce a partir de levaduras de panificacin, induciendo su autlisis a 50 55 C o por plasmlisis en alta concentracin de NaCl. Contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. El glucgeno y la triohalosa se hidrolizan a glucosa durante la produccin del extracto. Peptonas. Se trata de hidrolizados de protenas, de manera que contendr aminocidos y pptidos. Pueden ser usadas por muchos microorganismos, pero son bastante caras para la produccin industrial, aunque pese a este su uso est muy extendido. Las peptonas pueden tener dos orgenes. o o Protenas animales. Casena, gelatina, queratina. Protenas vegetales. Semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodn y girasol. Todo esto an retiene mucho nitrgeno, aun siendo subproductos de otras industrias.
La composicin de aminocidos y de pptidos variar segn el origen. Por ejemplo, la gelatina es rica en prolina e hidroxiprolina, pero casi no contiene aminocidos con azufre. En cambio los pptidos de la queratina tienen una elevada concentracin en prolina y cistena, pero carecen de lisina. La composicin del producto final est determinada tambin por el tipo de hidrlisis a que se someta, que puede ser cida o enzimtica. Especialmente afectado se ve el contenido en triptfano, ya que la hidrlisis cida reduce su nivel mucho.
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Para poder conocer los componentes que tenemos disponibles para confeccionar nuestro medio, existe lo que se conoce como la bolsa de residuos, que es un rgano pblico, donde las empresas deben declarar sus residuos. Los objetivos de la bolsa son: Censar los residuos que se producen, para saber donde se producen exactamente y en qu cantidad los diferentes tipos de residuos. Solucionar el transporte y la reutilizacin cuando se pueda. Muchos residuos de los que se producen pueden no tener utilidad para la empresa, pero s tenerla para otras empresas, lo que pueden implicar el reaprovechamiento.
Prospeccin y mejora
En el momento de fabricar un producto o proporcionar un servicio, se ha de encontrar un microorganismo que permita realizar este proceso. A excepcin de algunos productos de la industria alimentaria, donde se usan cepas silvestres, en la mayora de los casos, es necesario buscar microorganismos y despus mejorarlos. El protocolo clsico que se ha de seguir para realizar la mejora deseada consta de 3 pasos: prospeccin, seleccin y mejora. Caractersticas generales Como resulta evidente, el principal factor implicado en el xito o fracaso de un proceso de fermentacin es el microorganismo. Una cepa econmicamente rentable deber cumplir una serie de atributos generales, independientemente del proceso en que est implicada. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Tiene que estar disponible en cultivo puro, libre de otros organismos. Tiene que ser capaz de producir fcilmente clulas vegetativas y/o esporas u otras unidades de propagacin, para aumentar su valor. Tiene que crecer vigorosamente una vez introducida en el fermentador, ya que no todos los organismos crecen adecuadamente en volmenes grandes, y usar sustratos baratos. Tiene que formar un producto conveniente, preferiblemente uno solo, fcilmente recuperable y, si es posible, en ausencia de productos colaterales txicos. Tiene que producir la sustancia deseada en un tiempo corto, a ser posible menor a 3 das. Es mejor si tiene proteccin contra posibles contaminaciones, ya sea por crecer a pH cido, o a elevadas temperaturas,... Tiene que ser modificable, mejorable mediante agentes mutagnicos, pero ha de ser genticamente estable en ausencia de stos. Tiene que ser fcilmente conservable en perodos largos de tiempo.
Prospeccin Los microorganismos pueden aislarse a partir de: Colecciones tipo o similares. Las colecciones de cultivos actan como fuentes de cepas de referencia o como lugares de depsito de cultivos. Los cultivos de inters industrial se conservan permanentemente. Los cultivo de investigacin acabados de descubrir se guardan hasta descubrir aplicaciones futuras. De la naturaleza. Si no se encuentra nada en las colecciones tipo, se puede pasar a buscar en la naturaleza. Siempre es necesario buscar con criterio. Para encontrar organismos poco corrientes, es necesario buscar en nichos ecolgicos poco corrientes. Las fuentes ms comunes de los microorganismos industriales son suelos, lodos, lagos y ros.
La bsqueda de fuentes de microorganismos es tan solo un primer paso del proceso de prospeccin. Al buscar se encuentran cepas salvajes, de las cuales alguna puede tener inters, mientras que otras no lo tendrn. Una vez se tienen algunas muestras, se han de seleccionar las que tengan inters. Se han de realizar en primer lugar una serie de mtodos de enriquecimiento para aislar los microorganismos ms infrecuentes y dbiles, y potencialmente tiles. Se realiza entonces un proceso de seleccin primaria, que es nicamente un test cualitativo, para saber si cumple la funcin deseada. Generalmente se hace en medio slido.
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Existen una serie de recomendaciones que se han de seguir. Usar medios selectivos para el tipo de organismo deseado Usar desde el principio, o lo antes posible, el medio que se usar para la fermentacin, de manera que podemos ver si se adapta. Cultivar en unas determinadas condiciones ambientales Deteccin de productos o actividades especficas. La muestra deber ser plaqueada en medios diseados especficamente para detectar la actividad deseada. La deteccin ha de ser rpida, para poder hacer el mayor nmero de tests posibles en el menor tiempo. Algunos de los tests que se han diseado son: o o o o o Seleccin Una vez realizada la prospeccin tendremos cientos de cepas, de las cuales solo mantendremos unas decenas despus de la seleccin primaria. La seleccin primaria est diseada para aislar organismos potencialmente interesantes. La seleccin primara ideal debe cumplir una serie de requisitos. Predictiv Sensible Rpida Barata Adaptable a un nmero elevado de mu Especfica para las actividades deseadas Produccin de productos antimicrobianos mediante la tcnica de la placa superpoblada. Produccin de enzimas extracelulares. Produccin de inhibidores enzimticos. Produccin de productos especficos detectables porque provocan cambios en el medio. Produccin de metabolitos primarios, como aminocidos, vitaminas,... por la tcnica de la doble capa.
La seleccin primaria en placa permite detectar rpidamente microorganismos potencialmente interesantes, pero tiene como limitacin el hecho de que se hace en medio slido, mientras que para el crecimiento usaremos medio lquido. Deberemos hacer por lo tanto una seleccin secundaria, donde se valorar la produccin deseada, a nivel cuantitativo. Generalmente se hace en medio lquido, con las condiciones que habr en el fermentador, para determinar la cepa que producir mas, no la que producir ms rpido. Tambin permitir ver la que crecer mejor en el fermentador y la facilidad de separacin del producto. Diversos mtodos de seleccin primaria de cepas productoras Producto buscado Mtodo en placas de agar con: Antibiticos Microorganismos sensible antibitico Proteasas Casena Amilasas Lipasas Fosfatasas Aminocidos Almidn Emulsin de aceite Fenolftalena difosfato e indicador color Microorganismo auxtrofo aminocido en medio mnimo as productoras por: os de inhibicin del crecimiento icroorganismo sensible. os no teidos al aadir yoduro. Precipitacin de cidos grasos libres con Calcio. Cambio de color. Halos de crecimiento del auxtrofo.
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Optimizacin del producto y del biocatalizador Una vez tenemos el organismo que forma el producto de inters en elevada cantidad, es necesario conseguir que sea capaz de producirlo a nivel industrial. Se ha de incrementar la productividad de la cepa seleccionada, lo que puede conseguirse de dos maneras: Modificando el medio y las condiciones de cultivo Modificando el genoma del microorganismo. El aumento de productividad de una cepa se ve limitado por su genoma, por lo que modificamos el genoma. Mutagnesis al azar Fusin de protoplastos Tcnica del DNA recombinante
Podemos realizar 3 tipos bsicos de manipulaciones genticas en el organismo. -
Hasta los aos 80 90, lo que se haca principalmente, debido a la falta de conocimientos genticos adecuados, era la mutagnesis al azar. Esta tcnica, al igual que la fusin de protoplastos implica seleccin posterior, debido al fuerte componente aleatorio. En cambio, las tcnicas que implican DNA recombinante son dirigidas, por lo que no requieren seleccin posterior. Mutagnesis al azar Se trata de mutaciones en el material gentico no producidas por recombinacin. Son mutaciones que se dan de manera natural pero en una frecuencia muy baja. Se calcula que de manera natural se producira una mutacin de inters industrial cada 20.000 aos. No es nada prctico, por lo que es necesario inducirlas, para que se produzcan ms mutaciones en general, de las que podamos extraer las mutaciones prcticas. Distinguimos diferentes tipos de mutaciones. Tipo de mutacin Mutaciones puntuales de una sola base Cambios Substituciones: Transiciones AG TC Efectos Depende del codn: Diferente AA Protena no funcional Stop (mutacin non-sense) Protena incompleta Mismo AA (mutacin silenciosa) Protena normal. Mutacin de corrimiento de pauta de lectura (Frameshift)
Transversiones AT GC
Mutaciones de muchas bases
ATG GCT GTC ... ATG AGC TGT C... Microdeleciones ATG GCT GTC ... ATG CTG TC... Deleciones Prdida de muchas bases Inserciones Transposones Inversiones Cambio de sentido de un fragmento Translocaciones Cambio de lugar de un fragmento Microinsercione
Prdida de funcin de los genes Diversos efectos Prdida de funcin de los genes Diversos efectos
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Podremos aumentar la frecuencia de mutaciones mediante el uso de agentes mutgenos, que pueden ser o bien qumicos o bien fsicos, cuya presencia daa, altera o interfiere en la reparacin del DNA. Se pueden emplear diferentes tipos de agentes mutagnicos: Agente mutgeno Radiaciones Ultravioleta adiaciones ionizantes (X, ) Anlogos de bases ouracilo inopurina Agentes alquilantes onofuncionales: Etilmetanosulfonato Bifuncionales: mostazas de
mitomicina, nitrosoguanidina
Tipo de mutacin Formacin de dmeros pirimidina Rotura de cadenas del DNA ugar de T ugar de A etilacin de G Metilaciones, entrecruzamiento de cadenas n entr ina A y C Mutaciones puntuales y deleciones
La reparacin puede causar sustituciones o microdeleciones
Transiciones Transiciones
Colorantes intercalantes Acridinas, Bromuro de etidio,... Otros compuestos do nitroso droxilamina
Microinserciones y microdeleciones
Transiciones
Como se ve en la tabla, cada agente mutgeno tiene caractersticas y efectos diferentes, por lo que se deber elegir siempre el que ms se ajuste a las necesidades. Despus del tratamiento obtendremos 3 tipos de organismos: Parentales: el tratamiento no les ha afectado, no han sufrido mutacin. Mutantes no viables: organismos a los que la dosis del mutgeno ha causado tantas mutaciones que ya no son viables. Mutantes viables
Los ms numerosos suelen ser siempre los no viables, por lo que ser necesario ajustar la dosis de mutgeno que se aplica para que quede un porcentaje de viables adecuado. Una vez pasado el tratamiento, se han de hacer crecer las clulas en medio rico, para incrementar la viabilidad de los mutantes viables, para recuperarlos del tratamiento. Llegados a este punto podemos empezar a aplicar tcnicas de enriquecimiento de los mutantes. De todos los mutantes obtenidos se deber seleccionar el mutante que resulte ms ventajoso.
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Se pueden obtener muchos tipos de mutantes: Tipo de mutantes No capsulado No mvil Despigmentado Colonias rugosas Fermentacin azcares Auxtrofo nutriente de d u Causa Prdida de la cpsula Prdida de flagelos Prdida de un enzima en la ruta biosin del pigmento Prdida o cam pared Forma de deteccin Colonias pequeas y lugar de grandes y lisas Colonias compactas, en lugar dispersas Prdida o cambio de color de la colonias Colonias granulares e irregulares, lugar de lisas
Prdida de un enzima de una ruta metablica No hay cambio del color del con el azcar y el indicador de pH Prdida de un enzima en una rut biosinttica de nutrientes Alteracin de una protena esencial, que pasa a ser ms sensible a temperaturas m bajas que las ptimas Alteracin de una protena esencial que pasa a ser ms termosensible Alteracin de la permeabilidad o del enzim diana o detoxificacin de la droga Prdida del receptor del virus concentracin del virus No crece en el me correspondiente nutriente No crece a temperaturas fras, veces no crece ni a 20 C No crece a temperaturas elevadas Crece en presencia concentracin una droga o anlogo de una
Sensible al fro
Termosensible
o anlogos Resistente a virus
De todos estos, los mutantes auxtrofos pueden ser de los ms interesantes, mutantes que necesitan la adicin de un metabolito al medio, ya que no pueden sintetizarlo. En estos mutantes la va de sntesis del metabolito se puede ver afectada, lo que puede implicar la acumulacin de productos en esa va. Si deseamos uno de esos productos tenemos una mayor produccin. Otra posibilidad es que, debido a que se forma el nutriente, no se forma otra sustancia, que nosotros deseamos. Si cortamos la posibilidad de que se forme el nutriente, la sntesis se desviar hacia el producto deseado. No obstante se ha de tener en cuenta que no todos los auxtrofos para un metablitos sern de inters, puesto que dependiendo del enzima afectado puede no formarse el producto deseado. La deteccin de mutantes auxotrficos es sencilla, puesto que las bacterias que crezcan en medio rico, pero no en medio mnimo sern auxotrficas. Hasta aqu bien, pero se ha de tener en cuenta, que una vez tengamos estas bacterias, no sabremos para que nutriente son auxtrofas, por lo que deberemos ir haciendo diferentes pruebas hasta identificar el nutriente en cuestin. Otro punto que se ha de tener en cuenta es que en muchos casos habr mecanismos de regulacin en la bacteria, que no permitirn la acumulacin de intermediarios, por lo que lo que nos interesar sern mutantes desregulados, que no tengan regulacin, de manera que la acumulacin de un producto no interfiera con la sntesis final. El mtodo para aislar mutantes resistentes a anlogos consiste en determinar la concentracin inhibitoria del anlogo, para despus plaquear bacterias tratadas con el agente mutgeno, en medios con concentraciones crecientes de inhibidor. De esta manera, las bacterias que crezcan en estas concentraciones mayores, estarn desreguladas. Las causas de la desregulacins pueden ser: Se produce una mutacin en la regulacin de un gen, de manera que debido a una menor sntesis, es menos sensible a la incorporacin del anlogo. Puede tener una capacidad disminuida de incorporar el anlogo. ....
Los mutantes resistentes a anlogos suelen ser sobreproductores, pero no siempre, porque no estn sujetos a regulacin por sustrato. Si es auxotrfico puede sobreproducir intermediarios de la va en lugar del metabolito final.
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Una misma ruta metablica puede tener regulacin de diferente complejidad en diferentes cepas bacterianas, de manera que en el momento de producir una determinada sustancia, trabajaremos con el microorganismo que facilite el trabajo. Al igual que tener el tratamiento mutagnico adecuado, es necesario que tengamos un mtodo preciso para la determinacin y aislamiento del mutante. Pero en caso de que no se pueda detectar mediante ninguno de los mtodos tpicos, de podrn analizar diferentes clones en fermentaciones lquidas para ver cual de ellos sera mejor para la fermentacin deseada. Fusin de protoplastos Hasta principios de los aos 90, la mutagnesis al azar era el mtodo ms empleado, pero a partir de entonces se han introducido nuevos mtodos de modificacin gentica de microorganismos, como el de la fusin de protoplastos, que consiste en una trasferencia gnica precedida por la fusin en s. Requiere tambin requiere un proceso de seleccin posterior al tratamiento, ya que la recombinacin que se da es al azar. Los protoplastos se generan por el tratamiento de las clulas con enzimas lticos diversos, que degraden la pared. Ser necesaria la presencia de un estabilizador osmtico para evitar la lisis. La fusin es potenciada por la accin del polietilenglicol, PEG, o mediante electrofisin, y la recombinacin puede ser potenciada mediante el uso de cepas que tengan mutaciones que favorezcan este proceso. La fusin de protoplastos se usa mucho en la mejora de hongos y levaduras, ya que en muchos casos son organismos asexuales. Otra de las ventajas que presenta la fusin de protoplastos es que se pueden fusionar clulas de taxones muy alejados, aunque cuanto ms alejados, menor la viabilidad del hbrido. Tecnologa del DNA recombinante Se conoce como tecnologa del DNA recombinante al conjunto de tcnicas que permiten la manipulacin de los genes como unidades bioqumicas e incluye tcnicas como: Recombinacin in vitro Clonacin gnica Manipulacin gnica Ingeniera gentica
Permiten la introduccin de secuencias especficas de DNA en organismos procariotas o eucariotas y la posterior replicacin y expresin de estas secuencias para llevar a cabo la informacin codificada en estas secuencias. Seguimos un protocolo, como se ve a continuacin: 1. Aislamiento de la secuencia de DNA de inters para su clonacin posterior Las endonucleasas de restriccin, ER, son enzimas bacterianos que las protegen de la invasin de DNA ajeno. Cortan DNA bicatenario en secuencias especficas, generalmente palindrmicas, de 4 a 11 nucletidos, generando extremos romos o cohesivos. Cuando no conocemos la secuencia de DNA que queremos clonar, la estrategia consiste en hacer una genoteca, y posteriormente seleccionar con el mtodo adecuado los clones que presenten el carcter deseado. Si conocemos la secuencia de DNA, la podemos usar como una sonda para encontrar el clon que buscamos. 2. Incorporacin de la secuencia de DNA aislada en un vector Existe una gran variedad de vectores para la transferencia de DNA. Los ms usados son los plsmidos y los fagos, junto con los csmidos. Los plsmidos son elementos genticos: o o o o Circulares, por lo que estn protegidos contra las endonucleasas. Pequeos, por lo que pueden ser transferidos fcilmente. Tienen un origen de replicacin, por lo que se pueden replicar en el husped. Pueden codificar para numerosas funciones celulares, como resistencias o la capacidad de conjugar con otros organismos.
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Dependiendo de lo que quieras hacer con el DNA aislado, lo insertars en uno u otro tipo de vector, ya que existen diferentes tipos de vectores, como: o o De clonacin: son vectores usados para amplificar el DNA en la clula husped. De secuenciacin: son vectores que contienen un elevado nmero de lugares de restriccin, de manera que al ser cortado se generan fragmentos de tamao variable para ser secuenciados. De expresin: adems de un lugar de clonacin, el polilinker, contienen operadores, promotores, terminadores y un ribosome binding site, RBS, para permitir la expresin del DNA clonado.
La introduccin del DNA exgeno al plsmido se hace de diferente manera, en funcin de si al cortar con los enzimas de restriccin se generan extremos romos o cohesivos. Si se generan extremos romos, los extremos 5 se digerirn con una exonucleasa, mientras que los 3 se elongarn mediante una transferasa terminal, con ATP o TTP, generando una cola de poliA o poliT. Se podrn unir entonces y formar el plsmido deseado. En el caso de que se generen extremos cohesivos, cortaremos con dos diferentes enzimas, de manera que el inserto se insertar en la direccin deseada en el plsmido. 3. Incorporacin del vector con el DNA insertado en la clula husped La eficiencia de la incorporacin del DNA por la clula husped es una fase crtica en la manipulacin gentica. Dentro de las clulas husped podemos encontrar tanto microorganismos como clulas animales o vegetales. Dependiendo de la naturaleza del husped usaremos uno u otro sistema para introducir el DNA, como pueden ser pistolas gnicas, Agrobacterium,... 4. Seleccin de los huspedes que hayan incorporado el vector Es necesario distinguir los clones que han introducido el DNA exgeno, para lo que podemos examinar diferentes puntos: o La presencia del vector recombinado, mediante el anlisis de colonias. Para esto se usa la tcnica de la inactivacin del marcador, por ejemplo. Se trata de un vector con dos marcadores, pero que uno de ellos contiene la diana para la incorporacin del DNA exgeno. De manera que, si da negativo para ambos marcadores, no habr incorporado ningn vector, si da positivo en ambos, ha incorporado un vector que no tena el inserto, pero si da positivo en uno y negativo en el otro, habr incorporado el inserto con el DNA ajeno. La presencia del DNA exgeno. Se puede hacer mediante la hibridacin de las colonias. Se hace una rplica de la placa con un tampn de terciopelo sobre un filtro de nitrocelulosa, provocando la lisis de las colonias sobre el filtro y desnaturalizando el DNA. Se hace un lavado para eliminar el exceso de protenas y se fija el DNA al filtro calentndolo y se analiza la presencia mediante una sonda para la secuencia especfica. Deteccin indirecta del DNA por expresin de la protena, ya sea mediante un Northern, mRNA, o un Western, deteccin de protenas.
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Aspectos de ingeniera a considerar para una fermentacin industrial con xito

Las fermentaciones industriales se definen como procesos industriales, en los que los microorganismos son una parte muy activa del proceso productivo. El microorganismo es lo ms importante en las fermentaciones industriales y los aspectos de ingeniera siempre estn supeditados al organismo. En base a cual y como sea mi biocatalizador, y que producto quiera que sintetice, tendr que elegir, para diferentes aspectos, las condiciones que sean las ms adecuadas para mi biocatalizador. La ingeniera es por lo tanto tan solo una herramienta que facilita el proceso que realiza el biocatalizador, mientras que en otras industrias puede ser la base esencial. Existen una serie de aspectos de ingeniera que se deben considerar. Salto de escala Implica el paso en el cual un procedimiento desarrollado con xito en el laboratorio, en volmenes reducidos, es modificado para ser usado en fermentaciones de gran tamao, manteniendo las mismas condiciones. Implica la modificacin de algunas condiciones de fermentacin necesarias para mantener la productividad al variar algunas condiciones, como suelen ser dimensionales. Es necesario el salto de escala, el reajuste de algunos parmetros, cuando pasamos de laboratorio a planta industrial, debido al gran incremento en las proporciones. Tambin es necesario un reajuste, cuando implementamos el uso de una nueva cepa con un rendimiento entre un 10 y un 20% superior a la anterior, ya que el cambio en la produccin puede implicar cambios en las condiciones. El problema del salto de escalas viene dado por el hecho de que en las primeras fases se ha de comprobar el funcionamiento de la bacteria en el laboratorio, donde los objetivos son diferentes que en la planta. En el laboratorio se intentan optimizar la produccin en trminos puramente cuantitativos, mientras que en la planta es la optimizacin del rendimiento, considerando tambin los costes. Tener xito en el salto de escala querr decir conseguir la mxima produccin en la planta, en el mnimo de tiempo y con el mnimo de costes. Tipo de proceso segn la relacin del biocatalizador con el medio y el agua Dependiendo del tipo de biocatalizador que tengamos, y de las condiciones de este, ser ms rentable usar un tipo u otro de medio y una determinada concentracin de agua, as como inmovilizar el biocatalizador. Distinguiremos por lo tanto entre cultivos sumergidos o en superficie, as como tambin podremos tener el biocatalizador inmovilizado o no. Finalmente, el cultivo podr ser slido, semislido o lquido. Existen numeroso mtodos para inmovilizar clulas, como se ve en la grfica.
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Tipos de proceso segn la cintica del proceso y la entrada de medio Una vez decidido como se har, es necesario determinar la dinmica en la que realizars el proceso, lo que depende ms del producto que del microorganismo. Tambin depende del tipo de medio que haya elegido que algunas opciones parezcan un poco sin sentido. Considerando la cintica de la entrada de medio podemos clasificar 3 tipos de cultivo: Discontinuos (o batch) Discontinuos con alimentacin (Fed batch) Continuos
El hecho de decidir uno u otro tipo depende del biocatalizador y del producto que quieras conseguir. Cultivos continuos Es la aplicacin del principio del quimiostato a la industria. La solucin nutriente se aade continuamente al biorreactor a la vez que se extrae una cantidad equivalente de medio usado con organismos, una vez alcanzado el equilibrio. Se usa, o se intenta usar, porque es de difcil aplicacin, cuando el producto de inters se sintetiza en la fase logartmica del crecimiento. Por lo tanto interesa que las bacterias estn en esa fase cuanto ms tiempo mejor, para lo que requieren ms medio. Aunque en teora el funcionamiento podra ser ilimitado, normalmente se considerara un xito el pasar de las 200, puesto que conseguir mantener las condiciones en el interior del fermentador es muy difcil. Presenta una serie de ventajas e inconvenientes: Ventajas de los cultivos continuos Productividad: Si funciona bien, la productividad ser mxima el tiempo que funcione. Rentabilidad constante: El tiempo total es el tiempo entre 2 producciones consecutivas. En batch y fed-batch, aparte del tiempo de cultivo se ha aadir el de prefermentacin, por lo que la rentabilidad es menor. Aumento de beneficios: Se reducen costes, porque est todo automatizado
Inconvenientes de los cultivos continuos Poco verstil: Una vez puesto en marcha no se pueden alterar los parmetros, porque el equilibrio se destruira. Tecnologa ms cara Duracin real limitada: En muchos casos, en el laboratorio operan de 20 a 200h solo, pero para que fuese rentable tendra que funcionar entre 500 y 1000 horas, lo que no sucede. Composicin variable de medios: La entrada de medios es constante, pero la composicin de estos medios es variable, por lo que el equilibrio se ver alterado. Contaminaciones: Mantener condiciones estriles a nivel industrial durante largos perodos de tiempo Cuando se usan cepas de elevado rendimiento se pueden producir mutantes degenerados que pueden crecer ms rpido que las cepas productoras, con lo que te harn perder dinero y medio.
Cultivos fed batch Los nutrientes crticos se aaden en baja cantidad al principio, pero continan aadindose en dosis pequeas a lo largo de todo el crecimiento, de manera escalonada. Este sistema se usa a menudo para la sntesis de metabolitos secundarios, la sntesis de los cuales est sometida a represin por el catabolito, o bien cuando el inculo es problemtico.
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Cultivos discontinuos o batch Es el ms habitual. En el inicio del cultivo, el medio estril se inocula con un volumen adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentacin en condiciones ptimas. A lo largo del proceso no se aade ningn nutriente, salvo el oxgeno. Llega un momento, por lo tanto, en que los nutrientes son limitantes para el crecimiento, por lo que se dan las fases tpicas de un cultivo bacteriano. Considerando las cinticas de produccin del producto podemos clasificar en: Tipo I: el producto deriva directamente del catabolismo, pudiendo ser incluso la propia bacteria. El consumo de sustrato y el crecimiento, as como la formacin del producto se dan prcticamente de manera simultnea. La trofofase y la idiofase se solapan. Este es el caso de la SCP o del etanol. Tipo II: El producto es producido tambin durante el metabolismo primario, pero deriva de una va biosinttica lateral dentro del metabolismo primario. El consumo de sustrato y la produccin de producto estn ligeramente separados. En este tipo de fermentaciones, cuando se hacen de manera discontinua, se producen dos mximos. En un primer mximo se alcanza un elevado crecimiento y consumo de sustrato, pero la produccin de producto es baja o nula. En el segundo mximo el crecimiento es menor y la velocidad de consumo del sustrato es elevada, as como la produccin de producto. La trofofase y la idiofase existen en la fase de crecimiento celular, pero separadas la una de la otra. Es el caso del cido ctrico y algunos aminocidos. Tipo III: El producto deriva del metabolismo secundario. La trofofase y la idiofases estn en tiempos totalmente separados y en fases diferentes de la curva de crecimiento.
Esta clasificacin no puede ser aplicada a todas las fermentaciones. Segn el metabolismo, la composicin del medio y las caractersticas de la cepa usada, existen muchas formas intermedias, pero en cualquier caso, saber a cual es ms similar la fermentacin en cuestin permitir determinar que cintica de entrada deberemos usar. Tipo I Continua Tipo II Discontinua o Fed Batc Discontinua o Fed Batc Equipos Una vez tenemos el medio y conocemos la cintica de la fermentacin, necesitamos el contenedor donde se realizar la fermentacin en s. Caractersticas fsicas del fermentador El biorreactor es todo aquel recipiente donde tiene lugar un proceso industrial hecho por microorganismos. Llegado el momento de decidir o disear el fermentador a usar, se han de tener en cuenta unas caractersticas: Relaciones geomtricas: Hasta los 3000 litros los fermentadores pueden ser constituidos uniformemente, pero a partir de aqu las propiedades fsico qumicas del fermentador varan a medida que aumenta el volumen. Se ha de tener muy en cuenta para el salto de escala y en el momento de aadir equipos adicionales. Versatilidad: Generalmente no se hacen biorreactores muy optimizados para unas determinadas condiciones a no ser que se tengan las cosas muy claras desde el principio. Un biorreactor debe ser adaptable a diferentes parmetros. El biorreactor ms verstil es el fermentador aireado con agitacin. Materiales: Los fermentadores de laboratorio pueden ser de cristal o de acero inoxidable. Para volmenes grandes se hacen siempre de acero inoxidable, teniendo siempre especial cuidado en el sellado para evitar contaminaciones hacia dentro y hacia fuera. Depender de las cuestiones de regulacin,...
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Equipos auxiliares Aunque la cubeta del biorreactor es el principal foco de inters, una instalacin de han de considerar una serie de mecanismos adicionales necesarios para que el sistema funcione. Sistema de agitacin: Los biorreactores tienen un gran volumen. Es necesario un sistema para que se homogenice. Existen diferentes tipos de agitadores. El ms habitual es el agitador en disco, que consta de un disco de dimetro apropiada, del que salen de 4 a 8 palas radiales, asociadas a un motor que las hace girar. Las palas pueden tener diferente geometra y diferentes rendimientos. Sistema de aireacin: Si se trata de un proceso aerobio, ser necesario que haya oxgeno. Considerando las caractersticas del biorreactor, no podemos poner oxgeno al principio, y ya est, ya que el oxgeno se diluye muy mal. Es necesario un aporte continuado de oxgeno en el medio, que se introducir a travs de una entrada de aire. Una vez en el interior, el aire se distribuye a travs de placas difusoras, que generan burbujas, que sern destruidas por el sistema de agitacin, que influye de esta manera en la aireacin. El aire que entra debe ser esterilizado, como ya veremos ms adelante, pero se ha tener tambin en cuenta que cada minuto podemos tener que introducir el mismo volumen de aire que de medio hay en el fermentador. Sistema de eliminacin de espuma: Los medios de cultivo suelen producir espuma, ya que son ricos en materia orgnica. La espuma es un problema, porque puede interferir en la medida de los sensores. Podemos eliminar la espuma de dos maneras: o Biorreactor instrumentalizado de laboratorio - OD, T, pH, ES: sensores de O2 disuelto, temperatura, de pH y de espuma - AE, OH-, H+: recipientes con antiespumante, lcali y cido - F: Filtros de aire - M: Motor de rompeespumas y de la agitacin (inferior) - PM: Toma de muestras - B: Rompecorrientes - R: Resistencia trmica
Rompe espuma: Es el mtodo ms sencillo, consiste en un sistema similar al agitador. Tambin se puede destruir la espuma gracias a la fuerza centrfuga. Adicin de antiespumantes: Se aaden en la interfase entre aire y lquido, para que no se mezclen con el medio. Los agentes qumicos usados como antiespumantes han de ser lo ms inertes posibles, para que no interfieran con el proceso que tiene lugar en el fermentador. Suelen usarse aceites o alcoholes
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Sistemas de control: A lo largo del proceso de fermentacin necesitaremos conocer las condiciones en las que se encuentra el cultivo y el medio. Todos los sensores han de ser esterilizables y estar conectados a un sistema para conocer las condiciones internas. o Sistema de control de temperatura (Termostato): para que el rendimiento del fermentador sea ptimo, es necesario que el proceso se realiza en una temperatura constante. Dentro del fermentador hay una serie de fuentes de calor, como pueden ser el motor del agitador, de los compresores que introducen el aire y los propios organismos, con su actividad metablica. Existe una cierta prdida de calor por evaporacin y por radiacin, pero no es suficiente, y el sistema se calienta. Por lo tanto es necesario que el termostato est unido a un sistema de refrigeracin, ya sea por camisas de agua o por serpentinas de refrigeracin. Sensor pH: el pH es un factor que vara mucho como resultado del crecimiento de las bacterias. Ser necesario medir el pH, a la vez que el sensor est unido a un sistema que aade cido o base para mantener el pH. Sensor O2: es necesario determinar la velocidad de consumo de oxgeno, para permitir el crecimiento sin impedimentos. Existen diferentes mtodos de determinacin de la velocidad. Es necesario tener un sensor asociado al sistema de aireacin. Sensor CO2 producido: se trata del metabolito gaseoso ms importante que se puede producir durante la fermentacin. Su acumulacin en el medio puede tener efectos negativos, por lo que es necesario controlarlo.
Podemos plantearnos la inclusin de todos los sensores que podamos imaginar, para monitorizar mejor el proceso. Todos los sensores han de ser esterilizables, lo que impide aun el uso de biosensores, de manera que se utilizan electrodos. Toma de muestras: Es en cierta manera un sistema de control. La toma de muestras es un dispositivo que permite coger una muestra de medio para analizarla en el laboratorio. Esto implica un riesgo de contaminacin, pero es necesario debido a la necesidad de monitorizar el proceso. La toma de muestras ha de impedir siempre la contaminacin en ambos sentidos. La contaminacin hacia dentro se evita, impidiendo el contacto entre la parte interna del fermentador y la externa, mientras que la contaminacin hacia fuera se impide mediante sobrepresin
Componentes y sustratos En este aspecto, hemos de considerar: Formulacin del medio de cultivo: Tiene que garantizar el crecimiento ptimo. Desarrollo del inculo: Se ha de desarrollar el inculo en la etapa de prefermentacin. El cultivo preservado se reactiva inicialmente en cultivo lquido en agitacin o sobre medio slido, en condiciones adecuadas para la fermentacin posterior. Segn el mtodo de preservacin se requerir ms o menos tiempo para la recuperacin del cultivo. Sucesivamente se ir incrementando el volumen del recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de crecimiento adecuada. Es vital ir incrementando el volumen para que a escala industrial se alcancen los resultados ptimos. Si el nmero de clulas no est en el nmero adecuado, la produccin no ser adecuada. Adems, si crece en condiciones diferentes a como crecer despus, existir una fase de latencia en el fermentador, reduciendo la rentabilidad.
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Esterilizacin Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los procesos, ser necesario que en todas las etapas estn libres de contaminantes. Tambin depende, no obstante, del campo en que nos estemos moviendo. En el campo medio ambiental, hablar de esterilizacin no tiene mucho sentido, mientras que en el campo alimentario ser esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de esterilidad est en relacin con el valor aadido del producto. La probabilidad de que exista contaminacin a lo largo del proceso depende de las caractersticas del mismo. La probabilidad de que exista contaminacin en un cultivo mesfilo es mayor que en un cultivo termfilo. Tambin ser ms probable que exista contaminacin en un medio con pH aproximado a 7, ms que a pH cido. La probabilidad de que haya contaminacin ser mayor en los que consuman mucho oxgeno, que en los que consuman menos. Llegado a este punto hemos de plantear la optimizacin del proceso a nivel de produccin, sino a nivel de seguridad. Si se puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que ser ms seguro. Durante la fermentacin hemos de observar diferentes puntos para garantizar la esterilidad: Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara inicialmente contendr un elevado nmero de clulas vegetales y otras derivadas ingredientes del medio. Todos estos microorganismos han de ser eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculacin. Existen diferentes mtodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros. Pureza del inculo: el inculo representa entre el 2 y el 5% del volumen total del biorreactor, si el cultivo no es puro habr contaminaciones. Esterilizacin del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se dan en condiciones de agitacin vigorosa. El aire que entra ha de ser estril. El aire puede contener entre 10-105 partculas/m3. de los cuales entre 5 y 2000 sern microorganismos, principalmente esporas de hongos, bacterias Gram negativas y fagos en suspensin. La esterilizacin del aire que entra es esencial. Construccin apropiada del biorreactor, para que la esterilizacin entre fermentacin y fermentacin pueda servir para prevenir la contaminacin. Cuando decimos biorreactor queremos decir todos que contenedores usados para que tenga lugar la reaccin.
Cul ser el mtodo usado para la esterilizacin? Mediante el uso de un agente biocida que inactive los microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas. Los usados en biotecnologa se clasifican en: Agentes qumicos: existe un elevado nmero de desinfectantes qumicos lquidos y gaseosos. Pueden ser sustancias oxidantes como O3, xido de etileno,... En la prctica se usan poco, porque son difciles de eliminar y por lo tanto se corre el riesgo de inhibir el crecimiento de los microorganismos despus, en la fermentacin. Agentes fsicos: son los ms habituales. o Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o . Aunque ocasionalmente se usan en industria alimentaria, no se usan de manera habitual en fermentaciones industriales por el riesgo que suponen para el manipulador. Calor: es el mtodo ms empleado, sobre todo para el medio y para las instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para esterilizar mejor. Mtodos mecnicos: Filtracin, Centrifugacin,... La filtracin es la nica que se usa en la prctica. Es til para la esterilizacin de medios con partes sensibles a calor y para esterilizar el aire.
o o
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Tal y como ya hemos dicho, el calor es el mtodo ms empleado. Los agentes biocidas suelen tener cinticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuenta el factor CT, siendo c la concentracin o intensidad del agente biocida y t el tiempo de tratamiento. Es necesario recordar esto, puesto que se puede conseguir el mismo efecto esterilizando 2 horas a 90 C o 4 horas a 45 C. En la microbiologa industrial, cuando se habla de esterilizacin, no se considera la esterilidad absoluta, como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efecto sanitario, no resulta rentable eliminarlos. El calor destruye vitaminas y desnaturaliza protenas, de aqu la importancia del concepto CT. A partir de este concepto surgi la idea de UHT. Se alcanza la misma eficiencia de inactivacin de UHT microorganismos, pero el efecto que tiene sobre las protenas y vitaminas es mucho menor. 10 15 Segundos
Como ya hemos dicho, el propio biorreactor se esteriliza mediante vapor de agua, pero los medios no se pueden esterilizar as, porque el vapor de agua condensara, de manera que aumentara el volumen. Adems, resultara muy caro calentar tal volumen de agua, y el tiempo aumentara, porque se tendra que esperar a que se enfriase. Existen diferentes mtodos para esterilizar el medio, aparte de la filtracin. Uno de ellos es el que se conoce como esterilizacin en continuo. Consiste en ir cargando el biorreactor poco a poco con el medio, que se esteriliza por UHT. El medio va pasando por planchas de acero a 140 C. El tiempo que pase por la plancha ser similar al de UHT. El problema es que el medio que salga de aqu estar demasiado caliente, por lo que tendr que enfriarlo, ya que lo quiero a unos 30 C. La solucin es un sistema que hace que pase cerca del medio fresco, an no esterilizado, de manera que antes de la esterilizacin a 140, el medio ya est caliente. Si funciona bien se recupera el 80 90 % de la energa. Otro problema al que nos enfrentamos es el aire, que es necesario esterilizar, que se suele hacer mediante filtracin. Podemos distinguir entre los filtros de adsorcin, filtros en profundidad. En este caso, todo el volumen del filtro tiene capacidad de filtrado. Est diseado en forma de ovillo o bobina, de manera que tarde o temprano, cualquier partcula en suspensin choque y quede retenida. Los filtros por retencin tienen el tamao de poro ms pequeo, puesto que las partculas quedarn retenidas. Instrumentacin y control (y Aspectos econmicos) Desde el punto de vista industrial, la productividad es la produccin por tiempo de fermentacin. El tiempo de fermentacin es el tiempo total, desde el proceso de prefermentacin, hasta el de postfermentacin. Por esto la fermentacin en continuo puede resultar ms rentable, debido a la reduccin del tiempo total. Pero la productividad no es el nico parmetro a tener en cuenta para medir el rendimiento, la rentabilidad del proceso, tambin es necesario considerar los coeficientes de rendimiento. Se puede considerar el coeficiente de rendimiento como la cantidad de biomasa producida a partir de un nutriente expresado cuantitativamente. Clulas producidas (Masa) Y = S. Consumido (masa o concentraciones) Podemos expresar Y en base a un elevado nmero de parmetros diferentes: en base a parmetros fsicos y qumicos como consumo de oxgeno, produccin de temperatura,... en tal caso tendr inters desde el punto de vista tcnico. en base a nutrientes: Y en relacin con el metabolismo, de manera que nos informar de si se da metabolismo, catabolismo,... en relacin al ATP: nos dar una idea del estado energtico del organismo.
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Para que la productividad y el rendimiento sean mximos, ser necesario que todos los parmetros del fermentador sean ptimos y se mantengan constantes. El control de los parmetros es crucial. Existen una serie de problemas tpicos: Problema del calor: El proceso funciona a una temperatura ptima, especfica de cada proceso, si bien normalmente todos estn entre los 20 y los 45 C, rango mesfilo, o a mas de 45 C, rango termfilo. La temperatura ha de ser determinada para que de mximo crecimiento y mxima produccin. Tenemos fuentes de calor ajenas a la fermentacin, como pueden ser motores,... y fuentes internas, como pueden ser los microorganismos oxidando materia orgnica. Es necesario regular el balance para que todo funcione de manera adecuada. Problema de la agitacin y de la mezcla: Una fermentacin microbiana puede ser considerada un sistema de 3 fases: o Lquida: contiene el agua y las sales disueltas, as como los sustratos y los metabolitos. En algunos casos puede existir una segunda fase lquida, si existen sustancias inmiscibles en agua. Slida: Consiste en clulas individuales, micelio, sustrato no disuelto o productos del metabolismo que precipiten. Gaseosa: Contiene una reserva de oxgeno para la bacteria, siempre y cuando sea aerobio, claro. Tambin hay dixido de carbono y otros gases que se hayan podido formar.
o o
La fermentacin implica reacciones entre las 3 fases. El funcionamiento ptimo de la misma requerir una buena homogenizacin de las 3 fases. La agitacin asegura el transporte de nutrientes dentro del fermentador. La agitacin produce los siguientes efectos en las 3 fases: o o o o Dispersin del aire en la solucin de nutrientes. Homogenizacin de la temperatura y de otros factores en el fermentador. Suspensin de los microorganismos y los nutrientes no disueltos Dispersin de los lquidos inmiscibles.
Agitar implica transferencia de energa, por lo que requerir a su vez un coste. Es necesario optimizar la agitacin, para lo que se han de tener una serie de parmetros en cuenta. o N de Reynolds: Se trata de un nmero adimensional, que permite medir si el flujo es laminar o turbulento. F: Es caracterstico del fluido D: Dimensiones donde est contenido el fluido V: Velocidad del fluido : Viscosidad del fluido Si Re < 2000 Flujo laminar Si 2000 < Re < 3000 Flujo laminar inestable Si Re > 3000 Flujo turbulento Una buena homogenizacin viene indicada por Re. Para alcanzar el nmero de Reynolds deseado los parmetros que se han de ajustar principalmente son la velocidad de agitacin y las dimensiones. En un sistema industrial se tienen que optimizar tambin: Tiempo de mezcla: tiempo necesario para homogenizar el fermentador hasta el grado deseado, hasta el Re deseado. Ha de ser mnimo. N de potencia, Np: es la energa necesaria para alcanzar el Re. Ha de ser mnimo.
FVD Re =
Hemos de usar palas de manera que el nmero de Reynolds sea elevado, pero con tiempo de mezcla bajo y nmero de potencia reducido.
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La viscosidad puede ser tambin un problema. Una solucin puede ser de dos tipos, en funcin de su comportamiento. o Fluido newtoniano: Se trata de un fluido, la viscosidad del cual es constante e independiente de la velocidad de cizaa, a temperatura y presin constante. Todos los gases y algunos lquidos lo son. Fluido pseudo plstico: Se trata de fluidos en los cuales la viscosidad aparente es baja, pero despus pasa a ser lineal. Es el comportamiento caracterstico de mucho cultivos de floriduras y de actinomicetes. Fluido neopctico: Se trata de fluidos que al ser sometidos a tensin de cizaa constante, presentan una viscosidad aparente que baja con el tiempo.
o -
Problema de la aireacin: uno de los problemas que se presentan en una fermentacin industrial es el suministro de un flujo de gases adecuado. El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante, y el dixido de carbono el producto metablico gaseoso ms importante. Cuando una fermentacin requiere oxgeno como sustrato, normalmente este es uno de los factores ms limitantes del proceso, debido a la baja solubilidad de este gas. Tan solo 9 ppm se disuelven en un litro de agua pura a 20 C, pero la presin de solutos reduce este ndice. Existen numerosas barreras que dificultan la llegada del oxgeno del aire hasta el interior del microorganismo. Aunque insertamos mucho aire, las barreras existentes entre la fase lquida y la gaseosa, as como la membrana del organismo despus hacen difcil la llegada del gas. Es necesario que el flujo de aire insertado sea muy elevado, para que as el gas no sea limitante del crecimiento del organismo.
Recuperacin de productos Una vez realizada la fermentacin, hemos de recuperar el producto que hemos generado. Las tcnicas para recuperar el producto son similares a las usadas en la industria qumica convencional, pero con la salvedad de que nuestro producto es biolgico, por lo que no podremos usar ninguna tcnica que pueda inactivar el producto. Tambin hemos de tener presente la localizacin de nuestro producto, de manera que si queremos la clula o un producto sintetizado por ella las tcnicas variarn, igual que variarn si el producto es intracelular o extracelular. Otro aspecto que se ha de tener en cuenta y no olvidar nunca es que estamos en la industria, lo que implica que buscamos rentabilidad, de manera que no podremos usar algunas tcnicas. En general, la recuperacin puede suponer el 20% del coste del producto, pero en productos con un alto valor aadido puede llegar al 95% del total. La seleccin de las tcnicas a emplear depende de: 1. Naturaleza del producto a. b. c. 2. 3. 4. 5. Localizacin del producto: Variar si es intra- o extracelular. Caractersticas fsicas y qumicas del producto: si tiene carga, PM,... Caractersticas biolgicas: se altera con facilidad?
Concentracin en la que se encuentra Presencia de productos laterales Destino del producto: el grado de purificacin ser diferente si se trata de un producto medioambiental, alimentario o sanitario. Precio del producto: si el producto tiene un precio bajo, entonces se usarn tcnicas que no hagan encarecer los costes.
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Existen una serie de etapas en el proceso de recuperacin del producto, una vez ha concluido la fermentacin y tenemos el medio de cultivo con el producto y los organismos. Separacin de los slidos en suspensin; microorganismos bsicamente. Se ha de tener en cuenta que si el producto es intracelular deberemos lisar los microorganismos antes de eliminarlos, o bien conservar la parte slida y eliminar el medio. Extraccin, concentracin y purificacin. En este punto se tienen que considerar los diferentes mtodos de extraccin, ya que no se usarn los mismos mtodos para extraer antibiticos que para extraer alcohol. Podemos iniciar el proceso de extraccin en base al tamao del producto. Podemos tener diferentes tamaos. En funcin de cual sea el tamao se usar un mtodo u otro. Existen diferentes protocolos, basados en diferentes principios, ya sean el tamao, la carga, el peso,... Se usar uno u otro como criterio de seleccin. Veremos ahora una serie de mtodos, basados en el tamao. Estos mtodos estn ordenados en funcin de tamao, de manera que los primero sirven para partculas ms grandes que los ltimos. a. Sedimentacin: es el mtodo ms fcil y barato. Si el producto es estable, se deja sedimentar en el propio fermentador. Un problema es que la sedimentacin requiere tiempo, entre 24 y 48 horas, lo que es bastante tiempo. Centrifugacin: es un proceso ms rpido que la sedimentacin, pero ya no es gratis, sino que requiere energa a la vez que algunos aparatos adecuados. Adems no se puede usar la centrfuga de carga, sino en continuo. Se usan desnatadores westfalia. Floculacin: resulta de mucho inters en la industria, puesto que es gratis. Para sedimentar, las partculas han de ser mayores o iguales a 3m. Si son ms pequeas, se aade un floculante, provocando que aumenten de tamao y sedimenten. Se ha de ir con cuidado con el floculante que se aade, ya que si lo que sedimenta es residuo no hay problema, pero si es el producto, se ha de ir con cuidado con el floculante, que no podr ser insoluble. Filtracin: es un mtodo de mucho inters. El problema es que suele resultar caro, ya que los filtros resultan caros y que requiere energa. Se ha de optimizar el proceso. Filtracin perpendicular: se hace pasar lo que se quiere filtrar perpendicularmente al filtro. Se ha de hacer un prefiltrado para eliminar posibles residuos grandes que puedan obturar el filtro. Filtracin tangencial: es similar al anterior, pero el flujo es tangencial. Dilisis: la mezcla se introduce en un saco semipermeable adecuado, que se sumerge en agua o un tampn adecuado. Lo que pueda pasar a travs de la membrana saldr, mientras que lo que no permanecer en la bolsa.
b.
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d. e.
f. g.
Existen otras tcnicas de separacin, que cada da son ms importantes a nivel biotecnolgico. h. i. Cromatografa de adsorcin: se llena la columna de carbono activo o similar. Se vierte el producto a purificar, y por interacciones se podr purificar el producto. Cromatografa de intercambio inico: el producto tiene una carga elctrica, sea cual sea. Se llena de resina catinica o aninica, segn sea el caso, en una columna. El producto quedar retenido entonces por carga. El tipo de resina depender de la carga del producto. Cromatografa de exclusin molecular: existen ciertos polisacridos, como dextranos o sephadex, que permiten hacer columnas a la carta. La idea es que confiere una forma con receptculos para molculas de determinado tamao, ni ms grandes ni ms pequeas. Cromatografa de afinidad: es la ms fina de todas las tcnicas, pero por lo tanto, la ms cara. Se usa una columna con un sustrato muy afin al producto, como puede ser la relacin antgeno anticuerpo, o enzima sustrato,... Se buscan interacciones muy especficas entre sustrato producto.
j.
k.
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En las prximas tablas podemos apreciar los diferentes mtodos usados para la extraccin de los productos.
Las principales operaciones de recuperacin en relacin con las etapas en que son utilizadas son: SEPARACIN DE SLIDOS Por gravedad Mecnica En superficie Trmica Elctrica Sedimentacin, centrifugacin, floculacin Filtracin, dilisis Adsorcin, intercambio inico, flotacin Desecado en spray, liofilizacin Electroforesis
FRACCIONAMIENTO Dilisis, electrodilisis, ultrafiltracin, cromatografa, electroforesis, microflotacin EXTRACCIN CONCENTRACIN PURIFICACIN ROTURA CELULAR OTROS Por disolventes, intercambio inico, adsorcin selectiva Evaporacin al vaco, osmosis inversa Cristalizacin, desecado Rotura mecnica, lisis fsica, lisis qumica, lisis enzimtica Separacin magntica
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Hemos hablado de diferentes tipos de cromatografas, que se diferencian en diversos aspectos, como se ve en la tabla inferior: Tipo Cromatografa de adsorcin Cromatografa de intercambio inico Cromatografa de exclusin molecular o permeacin en gel Cromatografa de afinidad Mecanismo Unin en superficie Unin inica Difusin por poros Adsorcin / bioespecfica desorci Separacin segn Afinidad por la superficie Cargas Tamao y forma de la molculas Estructura molecular
Existen diferentes tcnicas para la rotura celular, en caso de que el producto de inters se encuentre en su interior.
Veamos unos cuantos de estos proceso: Mtodos fsicos Cambios bruscos de presin Agitacin con abrasivos Sonicacin Congelacin descongelacin Cambios de presin osmtica Detergentes Tratamiento alcalino Permeabilizacin de las clulas Bacterifagos Enzimas que digieran la pared celular Antibiticos que inhiban la sntesis de la pared celul
Mtodos qumicos
Mtodos biolgi
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Alcoholes
Fermentacin alcohlica
La produccin de etanol es un proceso industrialmente viejo. El etanol por su uso como materia primera qumica se produce por fermentacin desde los inicios de la microbiologa industrial, y para la produccin de bebidas alcohlicas desde hace miles de aos. Pero durante muchos aos se ha obtenido por procedimientos qumicos, mediante la hidratacin de etileno. ltimamente se ha retomado la produccin de etanol para su uso qumico a travs de la fermentacin. El etanol se produce por fermentacin para fabricar bebidas alcohlicas y alcohol industrial, pero el uso del etanol como combustible no es rentable, ya que es ms econmico comprar petrleo que producir etanol. Tan solo lo producen algunos pases subdesarrollados. La produccin de etanol por fermentacin de la glucosa se produce por la va de Embden - Meyerhof Parnas (EMP). A travs de esta va, el piruvato producido pasa a ser acetaldehdo por accin de la piruvato descarboxilasa. El acetaldehdo pasar a alcohol por accin de la alcohol deshidrogenasa. El 96% de la produccin de etanol la llevan a cabo hongos, diferentes especies de levaduras, principalmente:
Khuyveromyces fragilis Torulospora Los sistemas biolgicos discontinuos para la produccin de etanol se inician en aerobiosis, ara obtener la mxima biomasa posible, ya que si las condiciones anaerobias empiezan demasiado pronto, la poblacin no ser lo suficientemente grande como para obtener una buena velocidad de conversin a etanol. Distinguimos por lo tanto 2 fases: Fase aerobia: Glucosa 6 CO2, es una fase de crecimiento Fase anaerobia: Glucosa 2 Etanol + 2 CO2, es la fase de produccin de etanol
Por otro lado, incluso en la fase anaerobia ser necesaria una cierta presencia de oxgeno, ya que las levaduras lo necesitan para producir sus esteroles y sus AGs insaturados de membrana. El principal problema es que el etanol es inhibidor a altas concentraciones. La tolerancia al alcohol de las levaduras es crtica para obtener rendimientos elevados. La tolerancia al alcohol de diferentes cepas vara considerablemente. A medida que aumenta la concentracin disminuye la velocidad de crecimiento, en primer lugar, y a ciertas concentraciones, incluso la sntesis de alcohol se ve inhibida. El crecimiento generalmente se detiene al llegar al 5% de etanol, mientras que la sntesis se detiene entre el 6 y el 10 %.
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Se ha intentado solucionar este problema de 2 maneras: Desarrollo de cepas de levaduras ms resistentes al etanol. Su inters radica en la produccin de bebidas alcohlicas de baja graduacin y del alcohol industrial. Existen algunas cepas de Saccharomyces capaces de producir hasta el 12 14 %, e incluso algunas entre el 18 20%. Uso de Zymomonas fragilis. Es la nica bacteria capaz de hacer la fermentacin alcohlica. Usa una va diferente de la EMP, sino que usa la va de Entner Doudoroff, seguida de la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. Presenta una serie de ventajas que lo podran situar por encima de Saccharomyces en la produccin: o o o o o Tolera ms el azcar, hasta 400 g/l Tolera ms el etanol, hasta 130g/l Mayor velocidad de crecimiento que las levaduras La va de ED produce en anaerobiosis solo 1 mol ATP/ mol glucosa, de manera que la cantidad de glucosa que pasa a biomasa es menor. Mayor velocidad de formacin de etanol
Como sustratos para la produccin de etanol industrial se usan: Races con alto contenido en almidn (tubrculos o granos) hidrolizados Melazas o zumo de caa de azcar o remolacha (residuos agrcolas azucarados) Madera o residuos del procesado de madera. Esto ya no se usa mucho porque la industria maderera lo reaprovecha para hacer conglomerado, de manera que se aprovecha mejor, ya que como sustrato no es muy rico. Residuos agrcolas muy degradados, como paja... No se usa, porque degradar clulas hasta azcares resulta caro, con lo que disminuye el rendimiento.
Lo mejor son las melazas, son los ms ricos, y adems, generalmente, tiene buenas concentraciones de otros productos, aunque puede ser que se tengan que suplementar con P o N. La produccin de etanol se hace generalmente por fermentacin en discontinuo con almidn hidrolizado o melazas como sustrato. El volumen de inculo usado suele ser de un 3%. La fermentacin continua se ha probado en algunos casos, obteniendo un xito relativo. En lo que respecta a la recuperacin del producto, antes de la destilacin, se separa la masa celular por centrifugado o por sedimentacin. La destilacin consiste en aplicar calor e una mezcla de lquidos, idealmente con diferentes puntos de ebullicin, de manera que uno pase a vapor y se condense despus en una columna de destilacin. En lo que respecta a la destilacin, depende del destino: Si se trata de alcohol para consumo, se destila por el mtodo tradicional del alambique, inventado por los rabes. El alambique consta de un recipiente donde se caliente el lquido a destilar, de manera que los vapores se recojan y se pasen por un refrigerador o serpentn, donde condensarn. Si se trata de alcohol industrial, se usan destiladores en continuo, desde principios del siglo XIX. Estos destiladores pueden alcanzar alcohol del 96% de pureza, usado como disolvente en la industria cosmtica, qumica o farmacutica. Si se quiere alcohol 100% el 4% restante se ha de eliminar por medios qumicos. En una destilacin en continuo distinguimos una serie de etapas. 1. Destilacin primaria: El sustrato fermentado diluido se destila a travs de la primera columna, beer column en el dibujo, o columna de destilacin. En esta primera columna se concentrar hasta alcanzar el 85%, a la vez que se elimina voltiles no deseados como aldehdos. 2. Rectificacin del destilado de la primera columna. El lquido pasa a temperaturas cercanas al punto de ebullicin. Se obtiene ya el etanol al 96,5 %. Al mismo tiempo, los aceites de fusel, mezclas de alcoholes de ms de 2C, se pueden eliminar por decantacin en agua.
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3. En la produccin de etanol para formar combustible o para otros usos industriales puede ser necesaria una tercera etapa adicional, para conseguir la deshidratacin del 99,4 %o incluso superiores, mediante el uso de benceno o ciclohexanos. En todo caso, el destilado se decanta en una etapa adicional de rectificacin para recuperar el agente extractante, que podr ser devuelta a la columna azeotrpica. Los residuos se aprovechan tanto como sea posible.
Aplicacin de la fermentacin alcohlica a la transformacin de alimentos

Las bebidas alcohlicas se producen a partir de diversas materias primeras, pero principalmente a partir de cereales, frutas y productos azucarados. Entre las bebidas alcohlicas hay bebidas no destiladas, como la cerveza, el vino, la sidra y el sake, y otras obtenidas por destilacin como el whisky y el ron, que se obtienen a partir de cereales y melazas fermentadas, y el coac, que se obtiene por destilacin del vino. Otras bebidas destiladas, como el vodka o la ginebra se obtienen a partir de bebidas alcohlicas neutras, obtenidas por destilacin de melazas, cereales, patatas o suero lctico fermentado. Tambin se obtienen una gran variedad de vinos de alta graduacin mediante la adicin de alcohol destilado a vinos normales, con el fin de incrementar su contenido de alcohol, hasta el 15 o 20%, como son los casos del jerez, oporto, o madeira. Un detalle comn muy importante en estas fermentaciones es que en todos los casos se usan levaduras para la conversin de azcares en etanol.
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Elaboracin de la cerveza La cerveza es la bebida alcohlica ms consumida en el mundo. Espaa es el tercer productor de cerveza de Europa, con 6000 Ml al ao, pero tan solo somos el noveno consumidor mundial. El proceso de produccin de la cerveza es importante como tal, como sistema de produccin de la cerveza, pero tambin porque es la base de todas las bebidas alcohlicas que tengan como base la fermentacin a partir de cereales, como el whisky. 1. Materias primas y preparacin de la malta. En los granos de cereales los carbohidratos se encuentran en forma de almidn principalmente. Dado que las levaduras utilizadas en la fermentacin no tienen amilasas, es necesario hidrolizar este almidn. Este proceso se conoce como malteado. Se trata de una sacarificacin, ya que se pasa de almidn a sacarosa. Consiste en hacer germinar los granos de cebada para que produzcan los enzimas necesarios para la transformacin de protenas en aminocidos y el almidn en azcares fermentables. En el proceso de malteado, los granos se sumergen en agua a una temperatura entre 10 y 25 C entre 48 60 h. Durante este tiempo, los granos se hidratarn, pasando de un 10 12% de agua a un 44 50%. Una vez remojado el grano, la germinacin se hace entre 15 y 21 C, segn el tipo de malta. Esto se hace en unos compartimentos especiales, con el suelo perforado, donde se controla la humedad y el flujo de aire. Durante la germinacin se producen diferentes enzimas hidrolticos como - y amilasas, peptidasas, celulasas,...La -amilasa ya est presente en el grano, pero en una forma inactiva, que se activar por unin a otras protenas. Es la encargada de la mayor parte de la degradacin del almidn. Una vez alcanzado el grado deseado de germinacin, cuando los granos estn blandos, la malta se deseca hasta tener un 6% de humedad aproximadamente, a 65 C primero y despus a 80 85 C, para reducir la humedad a un 4,5%. Con esto se detienen los procesos de germinacin, de crecimiento bacteriano y se favorece la reaccin de Maillard, que contribuye a darle a la cerveza su aroma y color caracterstico. El malteado es un proceso limpio, ya que el resultado est esterilizado. En ocasiones puede ser necesario aadir amilasas de origen fngico. La malta de buena calidad tiene suficiente actividad enzimtica como para facilitar la extraccin y conversin de mezclas de maceracin que contengan hasta el 60 70% de cereales, adems de la propia malta. Los enzimas microbianos industriales pueden sustituir a la malta como fuente de enzimas para la produccin de mosto cervecero, de manera que actualmente se puede obtener una mayor variedad de bebidas alcohlicas procedentes de cereales, ya que no con todos los cereales funcionaba bien el malteado.
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2.
Maceracin y filtracin. Durante la maceracin, las materias primas se extraen con agua, con lo cual los azcares y otros nutrientes necesarios para la fermentacin, que sean solubles, se extraern del cereal. Esta fase se hace en condiciones de calentamiento controlado. Puede hacerse de dos maneras. o Maceracin por infusin: el grano se introduce en una cmara de maceracin, el fondo de la cual est constituido por una placa filtrante, parcialmente llena de agua caliente, a una temperatura de 65, para permitir la conversin enzimtica y la extraccin del mosto. Posteriormente el mosto se separa por filtracin, mientras que la parte insoluble se usa para hacer piensos,... Maceracin por decoccin: la harina se macera a unos 50 C inicialmente, pero la temperatura va subiendo. Se transfiere parte de la masa a una caldera, donde hervir y se devolver a la masa restante. Una vez macerado, el mosto se separa de la masa agotada por filtracin en una tina llamada cmara de clarificacin.
La temperatura ptima de las proteasas, amilasas,... de la malta usada dicta las condiciones de maceracin. Si al final del proceso de maceracin la extraccin de azcares ha sido insuficiente, pueden aadirse harinas ms sacarificadas de otro cereal que aporten ms amilasas. El resultado de la maceracin se mezcla con lpulo, que aporta componentes como el pirogalol, taninos, resinas y aceites, que dan la amargura caracterstica de la cerveza y adems actan como estabilizantes. 3. Coccin del mosto. El mosto clarificado mezclado con el lpulo se cuece durante 60 90 minutos, con tal de favorecer: o o o o La inactivacin de los enzimas de la malta La esterilizacin del mosto La precipitacin de las protenas y los taninos, que se separan, en la clarificacin del mosto. La extraccin de sustancias amargantes procentes del lpulo. El lpulo se pone y se elimina despus, pero deja el gusto caracterstico. Si no se pusiese, no tendra el gusto caracterstico, en cuyo caso tendramos mosto cervecero, que podra servir para muchas cosas. La produccin de color, aromas, y sabores caractersticos por la caramelizacin de los azcares, la formacin de melonoidina y la oxidacin de los taninos. Destilacin de los voltiles.
o o
A continuacin se separa el precipitado proteico, el lpulo agotado y el resto de slidos, a veces con la ayuda de un agente floculante, en un separador adecuado o mediante la combinacin de un tanque de sedimentado y un filtro o centrfuga. Una vez separados los slidos, el mosto se enfra, mediante un sistema de intercambio de calor, hasta la temperatura inicial de fermentacin. Adems se airea hasta que la concentracin de oxgeno sea entre 5 y 15 mg por litro, para favorecer la formacin de cidos grasos insaturados y esteroles que despus no se podrn producir. 4. Fermentacin de la cerveza. El mosto se inocula con levaduras, hasta que tiene aproximadamente 107 clulas por ml o ms, si es necesario para incrementar la velocidad de fermentacin. Tradicionalmente la produccin de la cerveza inglesa, ale, se haca entre 15 - 22 C, y se usaban levaduras de fermentacin alta, Saccharomyces cerevisiae, que suban a la superficie y se podan eliminar en forma de espuma, mientras que la cerveza lager, o pilsen alemana, se haca entre 8 y 15 C y con levaduras que sedimentaban al fondo del contenedor, Saccharomyces carlsbergensis, hacia el final del proceso. Con la introduccin de los grandes dispositivos fermentadores y el uso de centrfugas, esta tendencia tiende a desaparecer. En las fermentaciones para obtener lager, el recuento inicial de clulas es de 107 clulas por mililitro. Se usan levaduras seleccionadas, preparndose un inculo nuevo para cada fermentacin. La temperatura inicial es de unos 10 C. Al cabo de unos 3 das, la poblacin de levaduras se ha incrementado unas 4 5 veces. La temperatura tiende a aumentar a lo largo del proceso de fermentacin. Puede ser necesario refrigerar cuando se alcanza el mximo. Si la temperatura se mantiene entre 6 y 10, la fermentacin dura unos 10 das, pero si se hace entre 15 y 22 C, se completar en 3 das.
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Durante el proceso de fermentacin, el pH desciende aproximadamente una unidad, a partir de un valor inicial de 5,2. Contribuye a acidificar el medio el cido actico que se forma por oxidacin del aldehdo. Los azcares fermentables, que suelen constituir entre el 70 y el 80% de los carbohidratos del mosto se convierten totalmente en etanol durante la fermentacin. El resto de los carbohidratos suelen ser dextranos nos susceptibles de ser atacados por las amilasas de la malta, debido a los enlaces glucosdicos (16). En la produccin de ale, el pH baja hasta 3,8 y se requieren tan solo de 5 a 7 das. 5. Maduracin y acondicionamiento final de la cerveza. La cerveza recin fermentada, la cerveza verde, se somete a diversos tratamientos antes de ser embotellada. La maduracin implica una fermentacin secundaria por las levaduras residuales que pasan a la cerveza desde el fermentador primario. Durante este proceso se reduce la cantidad de maltotriosa residual, as como aumenta la concentracin de algunos esteres. El CO2 es producido por esta fermentacin secundaria, o es aadido posteriormente. Normalmente se aade despus, pero de hecho depende del lugar. Este dixido de carbono ayuda a eliminar el oxgeno residual, as como otros voltiles no deseados. En ocasiones se aaden aditivos para clarificar y ajustar el color, sabor y aroma de la bebida, as como para estabilizar la espuma. Posteriormente la cerveza se almacena a bajas temperaturas, entre 2 y 6 C, durante un perodo de 4 das a 4 semanas. Despus del acondicionamiento, la cerveza contiene clulas microbianas, precipitados proteicos y sustancias coloidales, que se separan por floculacin, centrifugacin o filtracin. La estabilidad microbiolgica se consigue en cervezas y latas por la limpieza del envase y posterior pasteurizacin del producto a envasar. En barriles se esteriliza el barril y la cerveza por separado, y se envasa en condiciones aspticas. De hecho es bastante que la cerveza se contamine, porque se calientan las materias primas. Pero pese a esto se puede contaminar en diferentes etapas del proceso: Durante el inculo de la cuba: Al inocular el fermentador primario, el inculo representa el 10% del volumen del fermentador y despus se aade el sustrato. En este caso, si el inculo est contaminado y te das cuenta a tiempo slo perders el inculo, pudiendo conservar el mosto. Despus del inculo: Si ya has inoculado y aadido el mosto, debers tirar todo el volumen del fermentador, con muchas prdidas. Durante la fermentacin: Es difcil que pase, porque las levaduras estn en condiciones ptimas. Durante el reposo: pueden aparecer bacterias lcticas, que producirn diacetilo,... Esto provocar un olor a mantequilla. Lo que normalmente se hace es diluir la cerveza contaminada con otras, para que no se note el olor. Durante el envasado: Para el envasado se usan mquinas envasadoras normales y corrientes que funcionan a alta velocidad, entre 25000 y 30000 botellas a la hora. Es posible que se contamine, pero total, despus se pasteurizar, por lo que no tiene sentido preocuparse en exceso. Pese a esto, en verano, con el pico de consumo es posible que se reduzcan los tiempos de pasteurizacin, con lo que los riesgos estn Puede tener un aspecto aceitoso o gelatinoso. Se ve a simple vista. Puede estar turbia y tener un olor raro. Esto es difcil de ver, porque est fra y tiene espuma. No hay mucho problema, porque las bacterias que provocan esto no suelen ser patgenas. Olor a mantequilla, debido a las bacterias lcticas Acidificacin, debida a la presencia de bacterias acticas, que provocan la oxidacin del etanol al cido actico.
Las posibles contaminaciones pueden ser: -
La cerveza se hace por fermentaciones en carga normalmente. Se ha intentado hacer fermentacin en continuo, pero la empresa que lo intent, lo hizo slo durante un ao, y despus volvi a la fermentacin en cargas. El fermentador en continuo que ms tiempo ha estado funcionando han sido 114 das, lo que es un xito. Despus se tiene que esterilizar el fermentador y volver a empezar.
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Elaboracin del vino Para muchos su importancia es menor a la de la cerveza, pero Espaa es el primer pas del mundo en superficie cultivada de vias. Tan solo somos el tercer pas productor de vino en el mundo, con 30 40 millones de hl al ao, sobre una produccin mundial de 250 a 350 millones. Delante nuestro estn Italia y Francia. De hecho entre 1/3 y de la produccin nacional de via se destina a la fabricacin de alcohol. Espaa es el noveno consumidor mundial de vino. En el sentido estricto, el vino es una bebida producida exclusivamente por el zumo fresco de la uva, al fermentar. Pero en Australia y Nueva Zelanda existen algunos productos diferentes. La calidad del vino depende en gran medida de la calidad de la uva usada. El clima ideal para la produccin de uva para hacer vino, que es casi cualquier tipo, es aquel clima que tiene una estacin de crecimiento larga, con veranos bastante clidos para que se produzcan azcares, pero no tanto para que se produzca una acidificacin natural de la via. El contenido en azcares de la uva aumenta a medida que madura, alcanzando un 60% en el momento de la cosecha, mientras que la acidez baja. Una diferencia con respecto a la cerveza es que no es necesario ningn proceso de malteado ni similar. Adems, se ha de tener en cuenta que la uva negra est pigmentada. Peridicamente se examina la uva, midindose el contenido de azcares y de acidez, buscando el momento adecuado en el que se alcance el balance deseado. Se ha de tener en cuenta que el punto de maduracin de la uva destinada a la elaboracin de vino es diferente al punto de maduracin de la uva para consumo. Si tiene mucha acidez tendr poco azcar, de manera que producir poco alcohol. La uva se paga por los gramos probables de alcohol que producir, ya que se sabe que 17 gramos de azcar equivaldrn a 1 de alcohol. Por otro lado, la uva es bastante pobre en nitrgeno y fsforo, de manera que ser necesario cuidar bien la via para que no sea necesario aadir estos nutrientes en la fermentacin. Si la uva es pobre en azcar se aadir azcar, pasas o uva parcialmente desecada como suplemento. Por otro lado, la baja concentracin de cido permite el crecimiento bacteriano, lo que puede provocar sabores extraos en el vino, de manera que no puede ser una maduracin excesiva. Un bajo contenido de cido se puede corregir por la adicin de cido tartrico, o otros como SO4o Ca3(PO4)2, aunque algunos pases no aprueben estas adiciones. El pH del mosto ha de ser cido, menor a 3, de manera que slo crezcan levaduras, bacterias lcticas o acticas. Cuando se consigue el balance de azcar cido deseado se hace la vendimia y la uva se prensa de manera que no se rompan las semillas, que daran un gusto amargo. El rendimiento del zumo es de 625 l por tonelada de uva, aproximadamente. Entonces se hace la vinificacin, que es la transformacin del zumo en vino. Este proceso es diferente para el vino blanco, para el rosado y para el tinto. Todos son tratados antes de fermentados con SO3-- para retardar el crecimiento de bacterias lcticas, acticas y de levaduras salvajes. Diferencias entre la produccin de vino y de cerveza La uva es una fruta atpica, aunque todas las frutas tienen un elevado porcentaje de azcares libres, en l uva existe una elevada concentracin de azcares en la uva en forma de glucosa directamente cambio el grano tiene almidn, por lo que para la cerveza se requiere el malteado y para el vino no. El vino hasta hace poco se haca con levaduras salvajes que existan de form cerveza siempre se ha inoculado, porque en el proceso anterior a la fermentaci organismos. En el vino hasta el 3-4% de alcohol existe una poblacin mixta de levaduras, pero a partir de este punt slo puede actuar Saccharomyces cerevisiae, mientras que en la cervezas es un cultivo puro, que inoculado. La uva o el mosto no se puede cocer o limpiar, llegan tal y como viene del campo y se tritura t Todo lo que haya en la uva pasar al vino, de manera que estar ms o menos contaminado. Esto problema, que se soluciona poniendo bisulfito, si unos 15 das antes de la cosecha hay un tiem hmero, ya que crecern hongos, que tomarn nitrgeno y que dificultarn la clarificacin del vino. En la uva puede existir dficit de N o P que puede dificultar que la le -o NH4NO3 y vitamina B.puede aadir PO
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El pH del mosto es ms cido que el del malteado, 3 contra 5. La cerveza al principio tiene que tener una cierta cantidad de oxgeno para conseguir la ma la levadura. En el vino no es necesario, porque llega ya suficientemente aireado. La fase aerobia dura entre 2 y 3 das, mientras que la anaerobia unos 8 meses.
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Vinificacin en negro (Tinto, Rouge) En la vinificacin en negro, lo que se pretende es obtener evolucionado, que pasa por 2 o 3 fermentaciones, que tenga un bouquet alto, derivado de tal madurez, del envejecimiento del producto bsicamente, ms que de la fermentacin. En cambio, en el vino blanco lo que se pretende es conservar el aroma de la uva, por lo que los procesos sern esencialmente diferentes. El vino negro se obtiene nicamente de la uva negra, mientras que el blanco se puede obtener de ambos tipos de uva. El motivo de esto es que el color de la uva est en la piel, ya que la pulpa siempre es blanca. En la vinificacin en negro se deja que el zumo macere con la piel para que las antocianinas de la piel se solubilicen en l. En cambio en el blanco se evita la extraccin del pigmento. Despus del prensado, el mosto para hacer negro se encuba y se deja macerar y fermentar para que se extraigan los pigmentos. Cuando empieza la fermentacin pierde un poco de color, de manera que para que no pierda tanto se puede aadir de nuevo mosto. Cuando tiene el color adecuado se sacas de las cubas, en el proceso de descube. La pasta que ha quedado se prensa y se hacen orujos, que pasarn a la produccin de vino a granel o a la destilacin para obtener etanol. El mosto acaba de fermentar en una fermentacin alcohlica. Mas o menos al mismo tiempo, o ligeramente despus se produce una fermentacin malolctica. La fermentacin malolctica es llevada a cabo por bacterias lcticas del gnero Leuconostoc, que usan el cido mlico producido durante la fermentacin alcohlica y algunos azcares residuales, transformndolo en cido lctico, lo que le da al vino un gusto ms suave, tpico de vinos de crianza. Como resultado de esto los vinos pierden acidez, aunque el pH no vara, sino que vara el tacto a la boca. Tambin se pierde aspereza y adquiere un gusto aejo, adquiriendo un ligero efecto efervescente. Las bacterias lcticas suelen quedar de manera residual, pero si no quedan, pues se aaden. En nuestro clima la fermentacin alcohlica y la malolctica se hacen casi a la vez, pero en climas ms fros la fermentacin se detiene en invierno, debido a que la temperatura es muy baja como para que crezca nada, y la fermentacin malolctica se da en primavera. Posteriormente se hace una clarificacin en la que se extraen casi todas las levaduras, ya que si no se extrajesen podran causar problemas. Posteriormente el vino se deja envejecer en botas de madera, en un proceso de envejecimiento oxidativo, durante el cual se producen una serie de reacciones que le dan al vino su gusto caracterstico. Tambin se pueden producir precipitados que se eliminarn por filtracin.
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Desde hace unos 10 aos se hace un proceso conocido como estabilizacin tartrica. El cido tartrico se encuentra en saturacin en el vino. Un descenso de temperatura podra provocar la precipitacin del cido en forma de cristales. Para que el consumidor no encuentre cristales en su botella el vino se lleva a temperaturas bajas, para que precipite todo el cido tartrico. Los cristales irn a la industria farmacutica, que los podr para hacer sales de frutas,... Todo se aprovecha. Antes no se realizaba este proceso, simplemente se confiaba en que hiciese fro y que precipitase. Despus de la estabilizacin tartrica se vuelve a filtrar, por un filtro de 0,45 m de dimetro, para eliminar levaduras. Despus de esto se embotella y se deja pasar por un proceso de envejecimiento reductor. Entendemos como vino de crianza aquel vino que ha estado entre 1 y 3 aos en la bodega, mientras que los vinos de reserva han estado entre 3 y 5 aos. Vinificacin en blanco Las diferencias respecto a la vinificacin en negro son: Slo se utiliza el prensado, se evita la extraccin de pigmentos. No se envejece el vino, porque en el vino blanco no queremos buscar los aromas debidos al envejecimiento, sino que queremos un aroma afrutado. Desfangado: Como no se limpia, no se desrapa, despus de exprimirlo queda como un fango, que se puede eliminar por sedimentacin o por centrifugacin. Esto hace que se pierdan algunas levaduras. Esto hace que a la fermentacin le cueste empezar. De hecho el sustrato es peor que en el caso del vino negro. Se aade SO3-- a lo largo de todo el proceso, no solo al principio Generalmente no hay fermentacin malolctica porque la uva no se coge tan madura. Generalmente se hace sin este fermentacin, pero en el caso del vino de Borgoa s que se hace.
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Con el tiempo se ha ido aplicando la tecnologa moderna a la industria del vino, pero muy poco. Algunas de las cosas que se pueden hacer son: Maceracin carbnica: Se aplica a la vinificacin en negro. La uva no se pisa, sino que se encuba directamente. Entonces se hace el vaco y se inyecta CO2. Esto provoca que los granos se aplasten por su propio peso. La ventaja que presenta es que las clulas vegetales llegan vivas a la cuba, de manera que al respirar el oxgeno se agotar ms rpidamente, de manera que se puede acortar el tiempo del tratamiento inicial. Los enlogos opinan que al hacerse el vino as no envejece tan bien, de manera que sirve para hacer vinos de crianza, pero no para hacer reservas. En Francia se hace mediante este mtodo un vino, conocido como vino del ao, que sale por Navidad, tan solo 3 meses despus de la vendimia. Es un vino normal, que no aguanta mucho tiempo, pero que se hace muy rpido. Vinificacin en caliente: Se aplica a la vinificacin en blanco. Se aplica cuando la cosecha est en malas condiciones sanitarias, ya sea por haber llovido 15 das antes de la cosecha, de manera que la uva se hinche, provocando que los granos revienten y se contaminen de hongos y bacterias lcticas, o por cualquier otra cosa. Los hongos producen enzimas que dificultan mucho la clarificacin. Se hace un pasteurizacin rpida la mosto, de unos segundos a 70 80 C, de manera que se inactiven los enzimas, pero que no se vean afectadas las levaduras ni las bacterias. El vino resultante nunca ser un vino de gran calidad, ya que las materias primas eran defectuosas y hemos tenido que aplicar un proceso para poderlas aprovechar.
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Vino Rosado Cmo se hace el vino rosado? Si se hace como dicta la ley, ser un vino de vinificacin en negro con extraccin de color muy corta Se puede hacer tambin mezclando vino de vinificacin en negro, donde la uva negra se ha mezclado con la uva blanca. A esto se la ha de llamar vino de mezcla, siendo ilegal llamarlo rosado. En algunos pases se hace as.
Se conoce como vino monovariedad al vino obtenido ntegramente al 100% de una nica variedad. Generalmente evolucionan de una manera poco predecible. A las bodegas no les interesa, porque el producto de un ao y de otro puede ser muy diferente, con lo que su producto final tambin ser muy diferente. Normalmente con poner un 25% de una variedad ya est bien. El Cavernet Sauvignon tiene un 85% de esta variedad. Vino espumoso El vino espumoso ms conocido mundialmente es el champagne. El que se hace en Catalunya, por el mtodo tradicional, es champn, pero no se le puede llamar as porque no se hace en esa regin, por lo que se le conoce como cava. La mayor parte de la produccin nacional de cava se hace entre St. Sadurni y Vilafranca, pero hay otros sitios donde tambin se produce. La produccin mundial de cava est en los 500 millones de botellas. Espaa produce unos 150 millones, Francia entre 150 y 170, mientras que el resto se produce en Amrica, pero para empresas espaolas o francesas. El descubrimiento del cava se produjo por la fermentacin secundaria de un vino de mesa seco seleccionado, al que se le aadi azcar, para que haga una segunda fermentacin, cido ctrico y una levadura especial que es capaz de sedimentar durante el embotellado. Esta fermentacin secundaria se hace en la botella, entre 15,5 y 18 C, entre 6 y 8 meses. La sedimentacin se mueve progresivamente hacia el cuello de la botella por agitacin progresivo y almacenado hacia abajo. El cabo de 6 8 meses de fermentacin la tapa de levaduras se elimina. Se congela el cuello y se quita el tapn, llevndose as las levaduras. Para reponer el volumen perdido se aade una pequea dosis de licor de expedicin, que a veces lleva azcar. Despus de esto se le pone un tapn de corcho a la botella. La presencia de CO2 se debe a la formacin de etilpirocarboteno, que proporciona las burbujas persistentes del autntico champaa. En los vinos espumosos se inyecta el CO2, dando lugar a un burbujeo ms ligero. Aparte del mtodo tradicional existen 2 mtodos ms tecnolgicos: Gran basse: La fermentacin y envejecimiento, en lugar de hacerse en botellas individuales, se hace en grandes fermentadores, y en condiciones isotrmicas. Lo que duraba unos 3 meses ahora dura unas dos semanas. Se dice que este mtodo permite reducir el tiempo de envejecimiento, sino eliminarlo directamente, porque como las levaduras han estado siempre por all, el trasvase de aromas ya se ha producido. Esto resulta en un ahorro de dinero y de espacio. El producto que sale es aceptable, aunque los expertos afirman que no es de la misma calidad, debido a que el intercambio no ha sido tranquilo.
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Mtodo transfer: Se hace en Estados Unidos. El cava por definicin no es homogneo, ya que cada botella es diferente. En Estados Unidos esto no gusta, por lo que hacen el cava por el mtodo tradicional, pero en el ltimo paso lo mezclan todo y lo vuelven a embotellar. El resultado final es ms caro, pero toda la partida es homognea. Produccin en continuo: Es un sistema de fermentadores en serie. El vino va circulando por los diferentes fermentadores. El proceso dura unos 8 das y sale un producto comparable al gran basse, pero nunca al cava tradicional. Se usa mucho en Portugal. Vino de aguja: Se hace en Espaa. No es muy famoso. El ms famoso es el vinito verde portugus. Tiene aproximadamente 1,5 atm de CO2 Sidra: Es una bebida alcohlica resultante de la fermentacin del zumo de manzana. Su contenido de alcohol es de entre 2 y 5, con excepcin de la inglesa que tiene ms graduacin porque se le aade azcar. La sidra es un producto tpico de muchos lugares, como Inglaterra o el norte de Espaa. El proceso de produccin de la sidra era muy sucio y molesto, ya que estaba poco mecanizado, con excepcin del proceso de despectinizacin. La manzana tiene un elevado contenido en pectinas, por lo que era muy difcil extraer el zumo. Por esto se produce muy poca, debido a la poca mecanizacin y al hecho de que la variedad de manzana usada es diferente a la de mesa y se cultiva muy poco. A nivel de fermentacin es similar al vino, pero es un proceso muy poco estudiado. Participan levaduras diferentes, que le dan un sabor raro. En la grfica de la derecha se pueden ver las diferencias entre el proceso tradicional a la izquierda y el moderno a la derecha. Con la modernizacin no se ha incrementado la produccin de sidra, porque est desplazada por cerveza y vino.
Existen otros vinos espumosos: -
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cidos orgnicos
Los cidos orgnicos se usan frecuentemente como aditivos en la industria alimentaria, as como aditivos qumicos en piensos. Todos los cidos del ciclo de los cidos tricarboxlicos pueden ser producidos microbiolgicamente con un elevado rendimiento. Otros cidos orgnicos derivan directamente de la glucosa como es el caso del glucnico, o ser forman como productos finales de fermentaciones a partir de piruvato o de etanol, como el cido lctico y el actico. Excluyendo al cido ctrico, producido exclusivamente por fermentacin, existe normalmente competencia entre los mtodos qumicos y los biolgicos.
cido ctrico
La produccin de cido ctrico es de aproximadamente 750000 toneladas al ao, de las cuales actualmente el 99% se producen por medios biolgicos. Los procesos de fermentacin se hacen sobre la superficie de los cultivos o en fermentadores de hasta 220 metros cbicos. El rendimiento de la fermentacin es de entre 60 y el 70% del rendimiento mximo, y el 40% de las materias primas pasan a ser cido ctrico. El cido ctrico se consume por: Industria alimentaria: aproximadamente 65%. Se usa como potenciador o preservador del sabor de zumos, caramelos, helados... Industria farmacolgica: 10 15%. Preserva la sangre. Se usa en pomadas, pastillas y cosmticos. Industria qumica: aproximadamente 25%. Se usa como agente antiespumante, ablandador, y para el tratamiento de tejidos. En la industria metalrgica los metales puros se producen a en forma de citratos metlicos.
Las cepas productoras son cepas de Aspergillus niger y A. wentii, altamente modificados. Muchas cepas de hongos excretan cido ctrico, pero para la produccin industrial se usan cepas especialmente mutadas que no produzcan productos laterales como cido oxlico, isoctrico,... de manera que entre el 30 y el 40% del producto final sea ctrico. Produccin de cido ctrico El cido ctrico es un producto del metabolismo primario, formado en el TCA. En la trofofase, parte de la glucosa del sustrato se usa para la produccin de medio y pasa a ser CO2. En la idiofase la glucosa restante pasa a ser cido orgnico, excepto una pequea parte que pasa a CO2 por la respiracin. El sustrato para la produccin de cido ctrico suelen ser sustratos azucarados. Antes se usaban muchas melazas, pero la crisis de la industria azucarera, provocada por el hecho de que cada vez se consuma menos azcar, y que cada vez se aprovechan ms los residuos, ha hecho que aumenten los posibles sustratos. Ahora se usan aguas sulfhdricas de papeleras, que es un residuo muy contaminante, o sustratos ms raros, procedentes de la industria alimentaria. Los medios usados han sido muy perfeccionados a lo largo de los aos de la produccin de cido ctrico. El cido ctrico se produce tanto en procesos en superficie como sumergidos. 1. En superficie: Los procesos en superficie puede ser divididos en funcin del estado del medio de cultivo usado: a. Medio slido: Plantas de baja produccin, muy limitadas, unas 500 toneladas al ao. Se usa sustrato slido, como mollas de pan o pulpa de almidn. El pH del medio se reduce hasta 4 o 5 antes de la esterilizacin. Despus se inocula con esporas, extendindolo sobre bandejas en capas de 3 a 5 centmetros de grosor y se incuba a 28 C. El proceso dura unas 90 horas, al final de las cuales la solucin entera se extrae con agua caliente para aislar el cido ctrico. Medio lquido: Es el mtodo ms antiguo de produccin. Actualmente se produce el 20% del total con este mtodo. Permanece en uso todava debido a la baja inversin que requiere para su funcionamiento, ya que la tecnologa es sencilla, el coste en energa para los sistemas de refrigerado es bajo. El mayor coste viene por la mano de obra, ms grande que en los reactores sumergidos, pero es mano de obra no especializada. En reactores sumergidos se requiere menos mano de obra, pero ms especializada.
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b.
En los sistemas modernos, el medio se esteriliza en continuo. La solucin nutritiva estril fluye automticamente por un sistema de distribucin sobre las bandeas. La inoculacin se hace en cmaras de inoculacin a 30 40 C, diseminando esporas secas o pulverizando una suspensin de esporas. La temperatura se mantiene constante mediante un sistema de corriente de aira. La ventilacin es muy importante, tambin para el flujo de gases. La velocidad de produccin de cido ctrico baja si la concentracin de CO2 pasa del 10%. Al cabo de 24 horas de la inoculacin, las esporas germinan y forman una fina capa de micelio sobre la superficie de la solucin. Al cabo de 30 horas empieza la idiofase. La fermentacin se detiene al cabo de 8 a 14 das. Si hay demasiado hierro se producir cido oxlico, producindose una sustancia amarillenta que dificulta el proceso de recuperacin. Durante la recuperacin se separa el micelio de los nutrientes por filtracin. En algunos casos se usan prensas metlicas para obtener ms ctrico a partir de las clulas. En los procesos en slidos se hace as. 2. Sumergidos: el 80% de la produccin mundial de cido ctrico se hace mediante procesos sumergidos. Aunque dura ms das que los otros mtodos presenta varias ventajas. o o Menor inversin en la construccin y menor inversin total. Es necesaria menos mano de obra. Mayor coste de energa La tecnologa de control es ms sofisticada, con lo que se requiere un personal ms cualificado.
Tambin presenta algunas desventajas con los anteriores mtodos. o o
Pero en resumen, sale mucho ms a cuenta, el rendimiento es mayor en la produccin sumergida. Existen 3 factores especialmente importantes para la produccin en sumergido: o La calidad del material para construir el fermentador. El fermentador ha de estar protegido de la accin de los cidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser as, cuando se alcancen valores de pH de 1 o 2, se liberarn metales de las paredes del fermentador, que podrn inhibir la formacin de cido ctrico. La estructura del micelio. Si el micelio es largo y filamentoso, la produccin de cido ctrico en la idiofase desciende. Para conseguir una velocidad ptima de produccin el micelio debe estar formado por bolas slidas muy pequeas. La relacin Cu/Fe determina la estructura del micelio. Suministro de O2. Aunque Aspergillus niger requiere poco oxgeno, es sensible a su ausencia. Es necesaria la presencia de oxgeno a una concentracin solo del 20 25% de su valor de saturacin.
La formacin de espuma es un problema al que nos enfrentamos tambin en la produccin de cido ctrico, pero se soluciona por la adicin de antiespumantes.
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cido actico
La produccin de cido actico a partir de lquidos alcohlicos es conocida desde hace tanto como la produccin de las bebidas alcohlicas. El vinagre es un producto muy viejo, y aunque por el nombre podramos pensar que es solo un subproducto de la industria del vino, es ms que eso. De hecho para hacer un vinagre de mesa no podremos partir de un vino malo. Es un subproducto de la industria del vino tan solo cuando el actico est destinado para ser de uso industrial. La produccin anual es de entre 2 y 3 millones de toneladas, que van a parar a la industria alimentaria y a la industria qumica, donde se usa para la fabricacin de plsticos. Produccin de cido actico La produccin de cido actico no es ms que la oxidacin incompleta del alcohol hasta cido actico, de manera que no es una fermentacin en el sentido microbiolgico del trmino porque el poder reductor se transfiere al oxgeno y el producto est ms oxidado que el sustrato. Es llevada a cabo por bacterias del cido actico. Existen de dos tipos: Infraoxidans: Gluconobacte Supraoxidans: Acetobacter Tiene el TCA alterado y no va ms all del Ac. Va lento, pero hace el proceso entero Azcar alcohol actico CO2
Podra parecer que Gluconobacter es el ideal para producir el cido actico, pero en realidad no es as, porque produce cetonas y otros productos que dificultan la purificacin del producto final. Se usa Acetobacter, pero vigilando que no se agote el alcohol, porque en ese caso empezara a degradar el actico. Se ha de considerar adems que la ley prohbe que el vinagre tenga ms de 0,5 de alcohol. Todos los mtodos requieren un sustrato inicial con una concentracin de etanol baja, que no sea superior al 5 6%, porque al principio es sensible al alcohol, y una cierta cantidad de azcares, porque al principio de la fermentacin se usan azcares. Las materias de partida sern vino, suero de la leche, malta o sidra, que no requerirn ningn componente adicional para ser una solucin completa de nutrientes. En cambio si usamos licores de patata o grano ser necesario aadir nutrientes en muchos casos para poder obtener el crecimiento y la produccin de actico. En la fermentacin sumergida la concentracin ha de ser 5 veces superior debido a la mayor biomasa que extraes del biorreactor con el vinagre. Existen procesos de produccin en superficie y sumergidos. 1. Procesos en superficie. Pese al xito de los procesos sumergidos, los procesos en superficie se utilizan an hoy en da de manera amplia en la produccin de vinagre y vinagres de lujo. Existen dos mtodos bsicos de produccin en superficie: a. Mtodo de Orlens o mtodo lento. Acetobacter es muy aerobia, si pasan ms de 2 minutos sin oxgeno mueren. En este mtodo, y al principio en todos, se usa Acetobacter xulium, porque produce celulosa que le permite flotar, a diferencia que la mayora de las bacterias que se hunden. No obstante, despus del crecimiento, la masa de bacterias pesa demasiado y se hunde. En este mtodo, la madre del vinagre, la masa de crecimiento, flota en la superficie de una bota, en contacto con el vino y con el aire.
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b.
Generador de goteo o mtodo alemn. Es un mtodo tradicional tambin. En este caso el biorreactor de madera tiene un volumen total de 60 metros cbicos y est lleno de cenizas de haya. El material de partida, el alcohol y el vinagre, se deja sobre la superficie y desciende goteando a travs de las cenizas hasta el contenedor situado en la base, donde se enfra y se vuelve a verter en la parte superior. Del alcohol que se aade, cerca del 90% se convierte en actico durante el proceso. El resto se gasta por el metabolismo primario o escapa en forma de gases de salida. La temperatura del sistema es de 29 C en la parte superior y de 35 C en la inferior. El tiempo necesario para la produccin de actico del 12% por este sistema es de unos 3 das.
3.
Procesos sumergidos. Los vinos de frutas, diferentes a la via, claro, y mezclas especiales con bajo contenido alcohlico total fueron usadas por primera vez en cultivos sumergidos. Los fermentadores usados para la produccin de actico son similares a otros biorreactores. Los tanques estn hechos de acero inoxidable y estn agitados desde el fondo. La aireacin es crtica, de manera que ha de estar muy regulada para que el rendimiento sea elevado. Los aparatos de aireacin consisten en un rotor de succin que introduce aire desde la parte superior del fermentador a travs de una tubera. Normalmente es necesario instalar tambin un intercambiador de calor para regular la temperatura y un eliminador de espuma. El vinagre de vinagre de boca (13% Ac.) se produce de forma discontinua en un proceso totalmente automatizado, en condiciones de aireacin y de agitacin continuas. Se trabaja a partir de un sustrato que contenga de 7 a 10 g actico / 100 ml y con un 10 15% de etanol. Se han descrito procesos totalmente continuos con rendimientos entre el 98% a 40 C. Con la produccin en cultivo sumergido, la velocidad de produccin por metro cbico es 10 veces superior que en fermentaciones en superficie y aproximadamente 5 veces superior que con el generador de goteo. Sus ventajas son: Menor inversin por cantidad producida La instalacin solo requiere el 20% de la planta. La capacidad de conversin de otros sustratos en bajo tiempo. Bajo coste en personal debido a la produccin automatizada.
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La recuperacin est facilitada por el hecho de que el cido actico cristaliza a temperaturas inferiores a 15 C, de manera que es fcil de concentrar. El producto de cristalizacin directa an puede ser llamado vinagre, ya que no est purificado. Para tener actico es necesario purificarlo ms. Las bacterias se eliminan por filtracin. Una vez obtenido el filtrado, si se desea, se puede decolorar mediante el uso de K4[Fe(CN)6]. Para que sea vinagre, es necesario que tenga residuos, ya que no es legal que una solucin de actico en agua sea llamada vinagre. El producto cristalizado se usa para eliminar los residuos ms grandes, momento en que se calienta para que se licue de nuevo, pero no se eliminan ms residuos.
cido lctico
En teora debera ser uno de los cidos ms consumidos por la industria alimentaria, porque la fermentacin lctica interviene en al fabricacin de muchos alimentos. Pero de hecho, debido a que en la mayora de los casos la fermentacin lctica se hace sobre el producto, y no se aade de manera adicional, el cido lctico es uno de los productos en los que resulta ms barato usar la sntesis qumica que la biolgica. La fermentacin para obtener litros de cido lctico no tiene mucho sentido, pero s que lo tiene la fermentacin lctica para la fabricacin de muchos productos diferentes como pueden ser: Productos lcteos Conservas crnicas. Embutidos. Conservas vegetales. En teora la conservacin de los vegetales debera hacer mediante la fermentacin lctica, pero en la prctica se aade simplemente vinagre y se pasteuriza. Se hace esto porque los materiales de partida para hacer una fermentacin lctica son muy heterogneos. Mediante el uso del vinagre se obtienen resultados ms seguro y homogneos. Fermentacin mlico lctica del vino
Productos lcteos En Espaa se consumen dos productos lcteos principalmente, entre los que no se encuentra la leche. Yogurt Queso, pero slo una dcima parte del consumo en Francia.
En el proceso de fabricacin del yogurt consiste en la inoculacin de la leche con Lactobacillus bulgaricus y con Streptococcus termophillus en una proporcin similar. Al final del proceso la proporcin de ambas bacterias es tambin similar, pero existen fases de predominio de una u otra bacteria.
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El proceso de formacin del queso es el que se indica en la grfica de la derecha. Probiticos El mercado de los productos lcteos estaba estancado hasta hace unos aos. Adems, haba un exceso de produccin de leche. La solucin apareci fcilmente, los probiticos. Estos productos provenan de la ganadera, donde haca aos que se administraban a los rumiantes para regular su flora intestinal. Existen una serie de definiciones de probiticos, que han ido variando con el tiempo: Fuller, 1989: Es un suplemento alimentario constituido por microbios vivos que afectan al husped beneficiosamente, mejorando su balance microbiano intestinal. Havenaar y cols., 1992: Monocultivo o cultivo mixto de microbios vivos que benefician al hombre y animales mejorando las propiedades de la microflora indgena. Guarner y Schaafsma, 1998: Los probiticos orales son microorganismos vivos que, tras su ingestin en cierta cantidad, ejercen una accin beneficiosa para la salud ms all de la inherente a su carcter nutritivo bsico. Prebiticos (Zoppi, 1998): Son componentes no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al husped, estimulando selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o unas pocas bacterias del colon que tienen el potencial de mejorar la salud del husped. Synbiticos: Son mezclas de pro- y prebiticos que afectan beneficiosamente al husped, mejorando la implantacin y la supervivencia en el tracto gastrointestinal de los suplementos dietticos de los microbios vivos.
De hecho distinguimos entre otros tipos de productos aparte de los probiticos: -
Los efectos de los probiticos son muchos y variados. Estos efectos estn demostrados estadsticamente, pero la fiabilidad del estudio puede no ser muy alta, ya que no se pueden aislar a todos los individuos durante el tiempo que dure el estudio. Adems, algunos efectos ya los producen los yogurts. Acciones beneficiosas exaltadas por los probiticos Interferencia con los patgenos, con antagonismo e incluso exclusin. Inmunoestimulacin e inmunomodulacin. Accin anticancerosa y antimutagnica. Alivio de la sintomatologa de la intolerancia a la lactosa. Reduccin de los niveles sricos de colesterol. Reduccin de la presin sangunea Disminucin de la incidencia y de la duracin de determinadas diarreas, como pueden Asociada a antibiticos Por Cl. difficile Del viajero Por rotavirus Prevencin de la vaginitis. Mantenimiento de la integridad de la mucosa intestinal.
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En resumen, los probiticos destinados al consumo humano no son ms que una manera de potenciar el consumo de productos lcteos, que han desarrollado las industria del sector. Adems, al no ser yogurt per se, pueden saltarse la ley que regula ese producto y usar bacterias diferentes, pH diferentes, fechas de caducidad diferentes,... Y adems se vende como un producto beneficioso y bsico para la salud.
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Produccin de aminocidos, vitaminas, enzimas y nucletidos

Produccin de aminocidos
Es un producto muy importante y que hace tiempo que se usa. La produccin se inici en los pases orientales. En estos pases se usan muchos extractos de plantas, peces,... En 1908 se dieron cuenta que todas estas sustancias tenan en comn una sustancia, que era el glutamato. Primero se intent realizar la sntesis qumica, pero se acab observando que algunas bacterias exudaban al medio glutamato. Se realiz entonces la bsqueda de las bacterias y hacia 1950 tenan listo un sistema a partir de Corynebacterium glutamicum. La produccin anual es de 750000 toneladas al ao, dividida entre una docena de empresas. Como sustrato se suelen usar melazas o almidn hidrolizado, aparte de una fuente adecuada de nitrgeno, como pueden ser sales amnicas. Se han usado mutantes sensibles a la temperatura para que la bacteria secrete el glutmico al medio. La produccin es de 50 g de glutmico por litro, con un rendimiento del 40% de la glucosa transformada en glutamato. El segundo aminocido ms producido es la lisina. Aproximadamente el 65% de los Biosntesis de aminocidos aminocidos producidos van a la industria alimentaria, el 30% van a la formacin de piensos y el 5% restante se destina a la industria qumica para fabricar cosmticos. Actualmente sera impensable la industria alimentaria sin la presencia de los aminocidos. De hecho se ha dicho que el glutamato es el quinto sabor, pero en realidad es un potenciador de los sabores. La lisina tambin lo es, pero menos potente.
Vitaminas
La produccin mundial de vitaminas se la dividen bsicamente entre 2 empresas: Roche y Ziba Henti. Slo existen 3 vitaminas diferentes, B12, vitamina c y riboflavina, que se produzcan mediante mtodos microbiolgicos a escala industrial, porque la extraccin de vitaminas de productos ricos o la sntesis qumica suelen ser mtodos ms baratos. Para la sntesis de vitamina B12, la 5 desoxiadenosil cobalamina, se usan cepas de Propionibacterium: P. freudenreichii y P. shermanii
Mtodos de produccin de aminocidos
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La ruta de sntesis de las cobalaminas es bastante compleja, como se puede ver en la grfica. Partimos de materias primas caras, como pueden ser la lisina o el succinil Coa. El proceso sigue en anaerobiosis, representado en rosa en la grfica. Despus se pasan a condiciones aerbicas, representadas en verde. Si de hecho la sntesis es compleja, el proceso de extraccin lo es aun ms. La produccin de vitamina oscila cerca de los 25 mg por litro de medio de cultivo. Existe una patente de Pseudomonas que afirma que la produccin es de 70 80 mg/l, pero no parece tener mucha consistencia.
Produccin de enzimas
El primer enzima producido industrialmente lo produjo Parker Dans, un laboratorio farmacutico, en 1894. En 1915 prcticamente todos los detergentes industriales en Estados Unidos contenan proteasas, enzimas de sntesis microbiana. Los detergentes lleva un siglo conteniendo enzimas... La mayor parte de los enzimas producidos va a la industria alimentaria, mientras que otro porcentaje va al campo analtico, pero se trata de enzimas diferentes. Existe un tercer campo muy reducido, pero de gran valor aadido, que es el que busca las aplicaciones clnicas, por ejemplo en medicacin, como pueden ser lipasas, hialuronidasas,... En el grfico de la izquierda se puede ver como se reparte el uso de enzimas en las diferentes industrias. De hecho, la industria de la produccin de enzimas es una de las mayores en el campo. Dentro de la industria del almidn se encuentran muchos tipos diferentes de enzimas. De hecho, dentro de esta industria se encuentra incluso la industria petrolera. Dentro del porcentaje que representa la industria de la alimentacin encontramos muchos enzimas diferentes, que se pueden usar con diferentes finalidades, entre ellas las de facilitar la decantacin... Aparte se ha de considerar el porcentaje que representa la produccin con destino a la parte clnica o analtica, de gran importancia.
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Produccin de microorganismos
Levaduras
La levadura es el microorganismo ms usado en la industria. Se usa principalmente en la panificacin, aunque tambin en la cervecera y en los procesos de vinificacin. Se produce a partir de aquellos sustratos con suficiente azcar y nitrgeno como para soportar el crecimiento de estos organismos. El sustrato ms tpico seran las melazas, pero cada vez ms este sustrato se usa menos, debido a que la industria azucarera est en crisis, debido a la presencia de edulcorantes. Hasta ahora, en todos los casos en los que hemos hablado de la levadura, hablbamos de ella como parte de un proceso de fermentacin. En este caso nos centraremos en ella como simplemente la masa de levaduras que ser, aunque en el caso de la panificacin sern requeridos para hacer una fermentacin. El proceso se hace totalmente de manera aerobia, para que todo el carbono que haya en el sustrato inicial pase a ser biomasa microbiana, ya que si no hubiese oxgeno, hara fermentaciones, que no es lo que buscamos en este caso. Existe un control en la fermentacin de las levaduras, que implica que no puede haber ms de un 0,2% de alcohol, ya que eso sera una seal de que habra hecho una fermentacin. Las levaduras producidas van principalmente a panificacin, aunque tambin se usan como suplemento para piensos, ya que ser la fuente de todo el nitrgeno necesario, as como aportar tambin vitaminas liposolubles, como la vitamina B.
Produccin de levaduras
La levadura en pastillas est viva, pero sin nutrientes. Es necesario que se consuma rpidamente, por lo que las fbricas de levaduras estaban hace aos cerca de las industrias a las que suministraban. Otra alternativa es la levadura son las levaduras secas y activas, totalmente deshidratadas. Se origin en Canad, y actualmente este mtodo ha tenido mucho xito. Con los procesos de desecacin se alcanzan concentraciones de 1010 levaduras por gramo. Se almacena en envases especiales, ms caros, pero que permiten la conservacin de las levaduras durante casi un ao. La industria de panificacin ahora depende ms de este mtodo que del suministro de levaduras diario. Existen unas pocas empresas que se encarguen de esto. Levaduras alimentarias y en polvo Como producto diettico se usan levaduras de cerveza, ya que no es ms que eso. No tiene mucha salida. Tambin se usa para hacer medios de cultivo, pero entonces se denomina levadura autolisada. Las industrias cerveceras aprovechan la masa de levaduras que les queda despus de la fermentacin, que aunque est medio muerta, an conserva todas las vitaminas y nutrientes. Esto no deja de ser un subproducto, no es un producto final.
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Bioinsecticidas
El segundo tipo de microorganismos en importancia son aquellos que tienen capacidades insecticidas. Se han encontrado diferentes organismos, pero los que se producen principalmente son diferentes cepas de Bacillus thuringensis, aunque se prob tambin con B. papillidae, B. lentimorbus y Pseudomonas aeruginosa, pero en todos los casos con menos xito. B. thurigensis, durante la esporulacin, produce un cristal piramidal que contiene una protena denominada - toxina, que es un gran txico para los insectos. Al principio se pens que afectaba especialmente a lepidpteros. Una de las ventajas que presenta esta bacteria, es que al morir el insecto, ella queda all, y dado que es un morador habitual del suelo, sus propiedades insecticidas se prolongan durante una temporada. Lo importante era que la bacteria quedase encima de las hojas, para que fuese ingerida por los insectos. Bacillus thuringensis se produca inicialmente por cultivos sumergidos, segn la grfica de la derecha. Despus se separaba la bacteria de la espora, con cuidado de que no se rompiese la espora. La espora se una a alguna sustancia pegajosa para que quedase unida a las hojas. En teora si lo aplicabas al principio de la temporada, podas eliminar las larvas, de manera que evitabas una buena parte de la reproduccin, y de hecho, si tenas suerte te duraba 2 aos. De hecho tena una elevada eficiencia. Se empez a usar en los aos 60 70, con gran xito, pero a causa de la competencia que ejercan estas empresas contra los Produccin sumergida de Bacillus thuringensis insecticidas qumicos, en muchos casos derivados del petrleo, las grandes empresas petrolferas compraron y cerraron casi todas las fabricas. En Europa no queda ninguna, solo en la Repblica Checa, y en Estados Unidos siguen funcionando, ya que en las hortalizas con destino humano no se pueden aplicar productos qumicos. La solucin a la que se ha llegado es que ya no se puede vender la bacteria, ni la espora, sino slo el insecticida, por lo que no se reproducir, de manera que cada ao se deber volver a aplicar el insecticida. Adems, la sntesis ahora de la toxina es ms cara. Otra opcin que se ha considerado ha sido clonarlo en Pseudomonas, pero no ha tenido xito sobre el terreno. Se ha pensado insertar la protena en Z.mays, pero no ha dado gran xito y el grano slo es apto para el forraje. Actualmente se sabe que Bacillus thuringensis afecta tambin a otros tipos de insectos como colepteros, dpteros,... adems se sabe que hay cepas que son capaces de sobrevivir a su paso por el intestino del insecto, con lo que las heces contendrn la bacteria. B. papillidae y B. Lentimorbus actan sobre un escarabajo japons, que ataca a las plantas de tipo textil, Produccin semi slida de Bacillus thuringensis como algodn o lino. Se perdi el inters por estas dos bacterias porque son parsitos obligados, de manera que para su produccin es necesaria una granja de escarabajos.
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En ocasiones se han usado hongos como bioinsecticidas, pero no son de mucha utilidad. Al cortar un rbol, el tocn queda abierto, con sus vasos al descubierto a posibles infecciones. Si las races de diferentes rboles estn en contacto, la infeccin podr pasar de uno a otro. Si se aplica un hongo incompatible con el patgeno en el tocn, se podr evitar la infeccin. No obstante, la produccin es bastante escasa, inferior a una tonelada al ao. Se ha considerado tambin el hecho de cultivar virus para usarlos como bioinsecticidas, dado que seran acciones superespecficas, pero no parece factible, ya que son difciles de cultivar y adems son parsitos obligados.
Rizobios
Se trata de organismos que actan en simbiosis con las leguminosas. Se pens que si se ponan rizobios en el suelo no sera necesario abonar. La idea se origin en la unin sovitica, pero no condujo a nada. Actualmente la produccin de rizobios es muy baja, de unas 3 toneladas al ao. Se usan para baar las semillas de las leguminosas, de manera que cada leguminosa tenga su rizobio. Los propios poseedores de las semillas son los que tienen los fermentadores para la produccin o lo compran. No da ningn problema para crecer, ya que puesto que normalmente crece en el suelo, crece sobre cualquier cosa.
SCP: Single Cell Protein

Consiste en la produccin de protena de microorganismos. Dado que el mundo cada vez requiere ms protenas, especialmente en los pases desarrollados. Cuando se Protena asociada a DNA empez a ir un poco corto de protenas, cerca de los aos 60, los 25% fabricantes de soja vieron que pronto no produciran lo suficiente Hongo 46% para cubrir las demandas, por lo que empezaron la investigacin Algas de la SCP. En este caso, los microorganismos estn formados por Levadur 6 10 % protenas caras, asociadas a cidos nucleicos. En el caso de los Bacteria 10 16 % rumiantes no hay problemas, ya que toleran sin problemas estas protenas, pero en el caso de los seres humanos no se toleran ms de un 5% de cidos nucleicos asociados a protenas, producindose diarreas, dolores de cabeza,... No se poda usar para la alimentacin humana, pero s para la alimentacin animal. Se observ que el microorganismo que mejor iba eran las levaduras, de manera que se buscaron las cepas ms rentables. Se pens en usar como sustrato hidrocarburos de cadena corta. Se usaban dos cepas que podan hidrolizarlos: Candida tropicalis y Saccharomyces lypolitica. BP fue la primera en producir protena unicelular a partir de alcanos. Estuvo en funcionamiento hasta 1978, produciendo unas 100.000 toneladas al ao. Llegados a este punto volvi a la produccin de hidrocarburos, que eran ms rentables. Se intent usar metanol para la produccin de SCP, la ICI. Se usaba Pseudomonas methylotrophus. No sala a cuenta usar melazas y otros sustratos tpicos, adems, la soja era cada vez ms productiva. Se pens en producir SCP a partir del suero de la leche, mediante el uso de Fusarium graminearum, pero no sala a cuenta. No se ha intentado mucho con aguas residuales urbanas, pero s con aguas residuales de papeleras. Se usa Candida utilis. Al agua slo se le tiene que aadir nitrgeno para poder ser utilizado. Es el nico sustrato que se usa actualmente. Se consigue recuperar el 56% del azcar de las papeleras en protenas.
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Produccin de nucletidos y biopolmeros

Mtodos de produccin de nucletidos
Los nucletidos son productos muy usados en la industria alimentaria. Se usan principalmente como saborizantes. A principios del siglo XX, en Japn se dieron cuenta de que los ingredientes activos de todos los productos saborizantes que usaban eran Glutamato, Lisina o nucletidos monofosfato de purinas ( 5-IMP, 5-GMP), por lo que desarrollaron sistemas de produccin. Por ATAQUE QUMICO O ENZIMTICO de los cidos nucleicos Hidrlisis del RNA de levaduras con enzimas microbianos Rotura del RNA celular por enzimas endgenos de la clula y liberacin de 5 mononucletidos Hidrlisis qumica del RNA de levaduras a nuclesidos, con fosforilacin qumica posterior Por FERMENTACIN DIRECTA empleando mutantes con un bloqueo en la sntesis de nucletidos Produccin de nuclesidos por fermentacin y despus fosforilacin qumica Produccin directa de 5 nucletidos por fermentacin Bioconversin de bases de nucletidos a 5 nucletidos Las cepas usadas en la produccin son B.subtilis y B.megaterium principalmente, aunque se pueden usar otras, como Micobacterium. La produccin tuvo un pico hace unos aos, pero actualmente se ha estancado mucho. La mayor parte de las empresas estn en Asia, ya que se usan principalmente all para dar sabor a los platos... En Europa se produce cada vez ms.
Produccin de biopolmeros
Se trata de un campo muy interesante para la industria. Los polmeros de ms inters actualmente son: Dextranos Scleroglucanos Pululanos cido algnico Xantano
Los biopolmero se han usado siempre como estabilizadores de los alimentos, e incluso para hacer plasma y sangre artificial. El biopolmero ms sintetizado actualmente es el xantano, del que se producen aproximadamente 104 toneladas al ao. Este producto es fabricado por Xanthomonas. Los biopolmeros son mejores que los polmeros qumicos, porque son degradables. Para que se forme el biopolmero es necesario que haya unas condiciones de saturacin de oxgeno, as como que la relacin entre C y N se decante hacia C, cuanto ms mejor. La relacin ms adecuada es de 10 a 1. Se forma el polmero unido a un nucletido, que irn atravesando la membrana hasta llegar al medio. El medio se va espesando a medida que se produce polmero, con lo que la produccin bajar. Ha de haber una gran regulacin del proceso.
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Polmeros que se producen actualmente Dextranos Fueron los primeros que se produjeron microbiolgicamente, ya que es fcil. Existen numerosas cepas productoras. Las cepas ms usadas son de Klebsiella, Acetobacter y, la que se usa en produccin comercial, Leuconostoc. Tienen una gran variedad de utilidades, dentro de la industria alimentaria, pero tambin para la produccin de plasma artificial y depiel artificial para cubrir quemaduras. La produccin de dextranos hace de manera discontinua, que de manera continua imposible, porque el medio espesara demasiado. se ya es se
Sntesis tpica de biopolmeros Se forma con un peso molecular de 50.000 Da. En todos los procesos de sntesis de dextranos, se sintetizan dextranos ms sacarosa. La sacarosa se recupera y puede ser devuelta al medio como sustrato o ser aprovechada para otros usos. El sustrato para la sntesis de dextranos puede ser cualquier cosa, lo nico necesario es la aireacin y el dficit de N. Exopolisacrido de Erwinia
Es muy usado en la industria de la pintura, como componente bsico de pinturas plsticas, porque es un estabilizador de colorantes, impidiendo que el colorante se separe de la masa. Xantanos Es producido por Xanthomonas campestris. No est relacionado con la industria alimentaria. Su monmero es un pentapolisacrido, formado a partir de glucosa, manosa, glucurnico, cido y pir. El factor espesante es el pir. La produccin no puede ser en continuo, porque se desestabiliza a media produccin y adems, pasada una viscosidad de 10.000 centipoises se pierde la capacidad de difusin del aire. La produccin es de unos 20 30 gramos por litro, lo que es un 70 80% de rendimiento. Actualmente parece ser que algunas Pseudomonas modificadas pueden producirlo, pero no tiene mucha aceptacin. Microfibrillas de celulosa Es producida por Acetobacter. La produccin actualmente es baja, unas 400 500 toneladas al ao. Es usado por la industria alimentaria bsicamente, para hacer capas de cobertura de alimentos y estabilizador de texturas de alimentos. Antes tambin lo usaba la industria petrolfera, pero no actualmente. Pululano Se produce por el hongo Aurobasidium pullulans, conocido tambin como Pullularia pullulans. Tiene un papel muy especial. Se usa como revestimiento alimentario, en sustitucin del almidn, par que las cosas tengan una determinada forma y de desmolden fcilmente. La ventaja que tiene frente al almidn es que se usa menos para conseguir el mismo efecto, y adems est ms normalizado, no tiene los problemas de heterogeneidad del almidn. Escleroglucano Es producido por hongos, ya sea por Sclerotium sp. o por Helotium sp. Va especialmente bien para eliminar productos recalcitrantes. Su utilizacin es casi total por la industria petrolfera. De hecho hay ms demanda que produccin.
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Alginato Ha llegado a la produccin industrial, pero si hay una buena cosecha de algas sale ms a cuenta extraerlo de estas que producirlo. En caso de que se produzca lo producen Azotobacter vinlandii y otros del gnero Azotobacter. En el laboratorio tiene utilidad para hacer agar, y su uso en la industria alimentaria est muy limitado. Se lleg a usar para mantener la espuma en la parte superior de la cerveza, pero ya no se usa. Espaa es un gran producto de agar. Curdlano Es producido por Alcaligenes faecalis var. myxogenes. No se usa en la industria alimentaria. Se hincha en presencia de agua, pero no es digerible. Tiene su utilidad para la industria farmacutica para la produccin de normalizantes intestinales. Dentro de la industria alimentaria se puede usar para enriquecer los productos con fibra, porque tiene el mismo efecto. Poliesteres An no estn en produccin industrial del todo, su produccin oscila entre 100 y 1000 toneladas. Son producidos por diferentes tipos de Pseudomonas. Este gnero no es un gran productor de polmeros, pero algunas especies, en presencia de C y deficiencia de N. Se trata de una mezcla de polmeros. Actualmente se intenta conseguir una muestra cada vez ms homognea, para hacer plsticos de alta resistencia. Se usan subproductos de la industrial petrolfera como sustratos. Se hacen 2 o 3 transformaciones y se consigue una muy buena materia primera. Ciclodextrina Todava est en produccin piloto. Es un polmero circular hecho por diferentes microorganismos. Cada organismo lo hace de un dimetro determinado. Se trata de un polmero estable, con un ncleo hidrfobo. El problema es que lo hacen organismos termfilos y anaerobios, por lo que el cultivo es complejo, ya que se requiere exceso de oxgeno para inducir la sntesis de polmeros, de manera que se ha de ajustar mucho. Parece tener utilidad como emulsionante. Se usa en laboratorios.
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Bioconversin
Se trata de una transformacin llevada a cabo por un microorganismo sobre una molcula preexistente para dar lugar a otra molcula diferente. Se intenta sustituir la sntesis qumica de algunos productos por la sntesis biolgica. Tiene diferentes ventajas: Especificidad de sustrato que no tiene la industria qumica. Alta especificidad topolgica de la molcula. Estereoespecificidad No daar el producto final. No sindicado, trabajo 24h al da, totalmente informatizable.
Los microorganismos harn casi cualquier reaccin que queramos hacer nosotros. El problema es encontrar el organismo que haga la reaccin deseada y ponerlo en las condiciones adecuadas para que lleve a cabo esa reaccin. Para localizarlos ser necesario seguir un proceso tpico de prospeccin, mejora, seleccin... De hecho la mayora de los que se usan estn mejorados y modificados. Generalmente el mayor problema que podemos encontrar es que la molcula a transformar sea lipfila. El problema ser que el microorganismo tenga acceso hasta la molcula. Una solucin consistir en aadir una elevada cantidad de la molcula. Este tipo de cultivos son rpidos, de 72 a 96 horas, e incluso menos en caso de bacterias, y unos pocos das en el caso de los hongos. Se han conseguido reducir enormemente los costes de produccin. El principal cliente de este tipo de procesos es la industria sanitaria y los productos antiguamente difciles de producir estn ahora al alcance de cualquiera. Algunos ejemplos pueden ser los anticonceptivos, los corticoides,... Los procesos que se siguen se desconocen, son exclusivos de las compaas que los realizan. Otras biotransformaciones son las que afectan a la vitamina C, la DHA (dihidroxiacetona fosfato) y las prostaglandinas.
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Microbiologa alimentaria
Nos centraremos en la relacin de los microorganismos y los alimentos, desde dos puntos de vista. Por un lado veremos los microorganismos como modificadores de los alimentos y por otro los alimentos como vehculos de los microorganismos. Los microorganismos viven con una nica idea, reproducirse y autoperpetuarse. Para poder hacer esto necesitarn nutrientes. Uno de los sitios de donde extraern estos nutrientes es de los alimentos. Para que esto no ocurra, deberemos tratar de conservar los alimentos. Adems, se ha de tener en cuenta que actualmente la demanda de productos frescos se incrementa. A nivel de transformacin no existen muchas normas, pero a nivel de vehiculizacin s que se han de cumplir una serie de estrictos criterios microbiolgicos. Muchos alimentos pueden ser contaminados. De hecho, casi todos los alimentos estn ya contaminados. En un ser humano hay 1013 clulas eucariotas, pero tenemos 1014 clulas procariotas de pasajeras. Desde el punto de vista tpicamente antropocntrico tan solo nos interesan aquellas bacterias que puedan ser alterantes o bien patgenas. Cada alimento ser afectado principalmente por algunos tipos de microorganismos. Los alimentos se contaminan, lo que es un hecho casi inevitable. Estos organismos contaminantes vendrn del suelo, de plantas, de agua, de utensilios, del tracto intestinal, de la piel, de animales, del aire.... Se ha de ser muy cuidadoso en la manipulacin, un campo extremadamente regulado, ya que es donde se producirn las contaminaciones, y habr que evitar aadir patgenos adicionales a los que ya pueda llevar el alimento. Los propios manipuladores pueden ser inconscientemente portadores de la enfermedad. De hecho, el 50% puede ser portador de S.aureus. Adems, dado que estn expuestos a un mayor nmero de vectores de transmisin implicar un mayor riesgo de que se conviertan en portadores. En teora, en la superficie del animal no debera haber ningn organismo cuando se le quite la piel. En la prctica s que habr organismos, entre 104 y 106. Otro de los grandes peligros estar en la eliminacin del tracto gastro-intestinal. Un factor de riesgo que se debe controlar especialmente son los piensos, ya que en estos pueden ser transportados patgenos de un grupo animal a otro. La instauracin de la normativa ISO9000 ha tenido un efecto domin en la industria, ya que un distribuidor que la cumpla deber exigirla a sus proveedores, estos a los mataderos, a los productores y finalmente a los productores de piensos, en el caso del ganado.
Alteracin de alimentos
La determinacin de cundo un producto est alterado y no es apto para el consumo depende bsicamente del consumidor, de si est dispuesto a consumirlo o no. Los alimentos se alteran debido a: Crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos ven el alimento como una fuente de carbono para crecer y como tal lo aprovechan. Los mismos alimentos pueden tener enzimas propios que los alteren. Pueden darse casos de reactividad qumica espontnea como oxidaciones,... Los insectos y los roedores pueden alterar tambin los alimentos. Las manipulaciones industriales pueden tener efectos alterantes en los alimentos.
Los alimentos se pueden clasificar en 3 grandes grupos: Estables o no perecederos. Estn en este grupo legumbres, harinas,... Con unos cuidados mnimos se mantendrn bien. Semi perecederos. Con el cuidado adecuado se pueden mantener un cierto tiempo. Es el caso de las patatas, pan... Perecederos. Son la inmensa mayora de los alimentos. Si no se va con mucho cuidado se degradan fcilmente.
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Existen una serie de factores que intervienen en la seleccin de los organismos y en la alteracin de los alimentos. pH Es determinante para el crecimiento de los organismos. En cada organismo su tolerancia oscila entre un mximo y un mnimo, entre los cuales est el valor ptimo de crecimiento. Se ha de tener en cuenta que al modificar uno de los factores ptimos se estarn variando tambin los dems. Veamos los mrgenes de crecimiento de los diferentes organismos. Organismo Hongos Levaduras Bacterias Bacterias Gram Patgenos Los valores de crecimiento ptimos estn hacia el 7. Los mismos alimentos tienen caractersticas de pH adecuadas, que en muchos casos sern cidos, para evitar su degradacin. En los vegetales es un proceso que se da mucho. En los animales puede ocurrir, debido a la glucogenolisis, que formar glucosa, que pasar a lactato. Una manera de conservar los alimentos es mantenerlos a pH bajo. Tambin se pueden combinar los cambios de pH con otros factores. Se ha de tener en cuenta que puede existir un cierto efecto tampn, de manera que cuando un organismo crece en un alimento, sus metabolitos pueden modificar el pH de ste. Margen muy estrecho Margen ms estrecho Margen de pH 0 11 1,5 8,8 Factores intrnsecos. Caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas del alimento. Condiciones medioambientales en las que se encuentra el organismo durante la conservacin. Los procesos industriales que se realizan con el alimento Las interacciones microbianas, ya sean antagonismos o sinergismos.
Factores intrnsecos
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Agua El agua es otro de los factores intrnsecos. Es un elemento bsico para la vida, de manera que todos los seres vivos, incluso los microorganismos la necesitan para vivir. Es P vapor agua en alimento bsico tener en cuenta en los alimentos lo que se conoce como AW actividad de agua (AW), que es la relacin del vapor de agua del P vapor agua pura alimento y la presin de vapor del agua pura, que es 1. La AW oscila entre 0 y 1. Cuantos ms solutos tenga el alimento, menor ser su AW. HR = AW x 100 Organismo Podemos establecer una relacin inversa entre la presin osmtica del alimento y su AW. Los microorganismos necesitan agua para poderse multiplicar. Levaduras Mohos Bacterias halfilas Mohos serfilos Levaduras osmfilas > 0,61 > 0,80 Con AW < 0,6 no podr crecer nada, tendremos un alimento estable. Son alimentos muy desecados o con una elevada presin osmtica. La mayora de los patgenos necesitar AW superiores a 0,9. Una excepcin es S.aureus, que puede crecer con AW de 0,86. Con menos de 0,7 de AW muy pocas cosas podrn crecer y muy concretas. Dependiendo de las caractersticas de cada alimento tendremos unas condiciones de AW. Los alimentos frescos tiene una AW de 0,98, y a partir de aqu la AW va bajando.
El contenido acuoso crtico es el porcentaje que tiene que tener el alimento a partir del cual sera seguro de conservar sin que se produjesen alteraciones. Este porcentaje puede variar segn las caractersticas del alimento. El contenido acuoso de un alimento se puede regular con humectantes. Potencial Oxido Reduccin Se define como la facilidad con la que un sustrato gana o pierde electrones. Se da un diferencial de potencial. Si este diferencial es positivo se oxida la sustancia. Si es negativo se reduce. Se mide en Eh. Atendiendo a este potencial distinguimos de ms Eh. a menos los siguientes tipos de microorganismos: aerobias, microaerfilos, aerbicos facultativos, anaerobios estrictos. En base al alimento crecern unos u otros organismos, pero tambin es importante la presencia de oxgeno en la atmsfera y su capacidad de penetracin en sta. Puede darse una tpica secuenciacin, de manera que en el alimento crezcan en primer lugar alimentos aerobios, pero a medida que se agote el oxgeno y los componentes del alimento aparecern otros organismos en un caso tpico de sinergismo. Contenido de nutrientes de alimentos Los organismos ven el alimento como un sustrato para su crecimiento, pero para que el alimento pueda sustentar el crecimiento microbiano, deber tener una serie de nutrientes y componentes. Los propios alimentos determinan los organismos que crecen sobre ellos. Sobre alimentos ricos en carbohidratos pero pobres en nitrgeno slo podrn crecer organismos que puedan obtener el nitrgeno de otra manera. En los productos lcteos crecen preferentemente bacterias lcticas. Los microorganismos pueden requerir vitaminas, como las del grupo B, la B12 concretamente, que es muy escasa en los vegetales, de manera que en frutas y en verduras crecern preferentemente hongos. Sobre lpidos podrn crecer bacterias lipolticas,...
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Sustancias antimicrobianas presentes en los alimentos Desempearn un papel importante en los procesos de invasin de los organismos de los alimentos. Sus dianas de efecto pueden ser muy diversas, as como sus efectos. Los clasificamos en dos tipos general. Las sustancias que matan organismos son biocidas, as como las que impiden el crecimiento son biostticas. En funcin de los organismos que afecten hablaremos de bacterio-, fungi-,... El hecho de que sea biocida o biosttica puede depender mucho de la concentracin. Muchos vegetales pueden tener sustancia antimicrobianas, aunque tambin las podemos encontrar en los animales. Algunos ejemplos de sustancias con efecto antimicrobiano son inmunoglobulinas, casena, ya que la casena y algunos cidos grasos libres pueden tener efectos antimicrobianos en determinadas condiciones, lactoferina y el lisozima, presente en huevos y leche. Para el consumidor pueden ser ms deseables los alimentos a los que no se les aadan conservantes. Por lo tanto, lo que se hace en muchos casos, es aadir condimentos, como pimienta, organo, aceites esenciales y otros, que tienen valor conservante. Actualmente existe un gran inters en el desarrollo de los conservantes naturales. Las sustancias antimicrobianas estn presentes en los alimentos, aunque es posible que no sea as cuando estn frescos, sino que aparezcan en el proceso de conservacin. Estructuras Muchos alimentos tienen envueltas naturales que los organismos deben sobrepasar para alterarlos. Es mucho ms fcil para un organismo alterar un alimento que haya visto alterada su estructura. Por lo tanto, si no alteramos su estructura el alimento ser ms seguro. Existen algunos alimentos ms seguros por su estructura. En el caso de la margarina, que es una suspensin de microgotas de lpidos en agua, es difcil que se altere, porque en cada gota no hay nitrgeno suficiente para que se multiplique el organismo, por lo que la margarina ser ms o menos estable. Factores extrnsecos Son los factores de la conservacin de los alimentos. Son 3 tpicamente T, HR y atmsfera de conservacin. Temperatura Siempre ser un factor a tener en cuenta para la conservacin de los alimentos. El margen de crecimiento de los microorganismos es muy amplio, va de 34 a 90 C. La tabla que se presenta a la derecha indica las temperaturas de cada organismo, en condiciones ptimas de los dems factores. Organismo Psicrfilos Psicrtrofos Mesfilos T. Mnima T. ptima T. Mxima -15 -5 5 10 10 15 20 30 30 37 18 20 35 40 45
Se ha de tener en cuenta que incluso en la nevera Termtrofos 15 42 46 50 podran crecer los dos primeros tipos de organismos. Normalmente se multiplican slo los Termfilos 25 - 42 50 80 60 85 organismos alterantes, pero existen algunos patgenos capaces de multiplicarse en fro, como seran Salmonella, Vibrio o Yersinia. De hecho existen organismos capaces de crecer incluso en el congelador, como los psicrfilos. Los organismos dejan de multiplicarse debido a su necesidad de agua, ya que en condiciones de fro el agua es menos biodisponible, siendo su AW menor a 0,86. Si congelamos los alimentos entre 18 y 20 C, estaremos seguros que no se produce crecimiento de los organismos, pero se podr producir actividad enzimtica. Para estar seguros que no se produce ninguna alteracin, deberemos realizar ultracongelacin, a menos de 40 C. Otro factor que se ha de tener en cuenta son los termtrofos, en los alimentos que se venden calientes.
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Humedad relativa Es de sumo inters, ya que como ya hemos dicho, la actividad del agua es la base. La HR se equilibrar con el agua del alimento, o como mnimo tiende a ello. Ser til entonces usar humidificadores o desecadores para regular el contenido de agua de la atmsfera. Adems para evitar que se equilibre, otra opcin es la de usar envoltorios alrededor del alimento, haciendo que ste tenga una atmsfera aislada. Atmsfera La atmsfera a la que se encuentra un organismo es bsica para su conservacin, sobre todo a nivel de la presin parcial de oxgeno y su capacidad de difusin. Se observ que haba algunos gases que parecan tener funciones inhibidoras del crecimiento de las bacterias. Puede ser de utilidad aadir hielo seco, dixido de carbono slido, para conservar los alimentos, como las frutas. Una atmsfera rica en CO2 inhibir el crecimiento de algunas bacterias, pero tambin beneficiar el crecimiento de otras. Controlando la atmsfera del alimento podemos alargar su vida til, pero sin alterarlo. Adems se ha de tener en cuenta que un alimento fresco es siempre ms caro que uno conservado. En el caso del pescado, donde se producen puntas de produccin, pero es uno de los alimentos que ms se altera. En atmsferas controladas, el pescado puede llegar a durar semanas, sin las atmsferas controladas no pasa de unos pocos das. Se cambian los organismos que normalmente alteraran el pescado, como Pseudomonas o Alteromonas, por otras bacterias, con tiempos de generacin ms largos, de tipo lctico. En la industria de la fruta o de las flores es bsico el controlar la atmsfera para obtener los beneficios deseados. De hecho, actualmente se usan estos mtodos en casi todos los alimentos. Normalmente ser la combinacin de la regulacin de la atmsfera con el control de la temperatura como se alargar la vida til de los alimentos Procesos industriales Los procesos industriales que se lleven a cabo pueden afectar a los organismos que crezcan en el alimento, ya sean procesos de embotellado, calentamiento, .... No entraremos en ms detalle, ya que se vern en algunos ejemplo. Relaciones entre microorganismos Una relacin que exista entre 2 organismos puede ser de dos tipos. Se puede dar antagonismo, en el que un organismo acte inhibiendo el crecimiento de otro o se puede dar sinergismo, si un organismo favorece el crecimiento del otro. Esto nos va a interesar para evitar el crecimiento de organismos alterantes o patgenos, ya que hay ciertos patgenos que pueden ser antagnicos del crecimiento de otros organismos y viceversa. Puede existir una flora autctona que impedir el crecimiento de otros organismos. Se conoce como bacteriocina a aquellas sustancias producidas por microorganismos, generalmente codificadas en plsmidos, que se secretan al exterior y tienen efectos antibiticos restringidos. Son producidas por diferentes gneros y especies bacterianos, como E.coli, Bacillus, bacterias lcticas.... Es casi un antibitico. Se ha producido en toneladas, como en el caso de la nisina, para ser utilizado como conservante. Se han aadido antibiticos y bacteriocinas como conservantes, pero no es lo ptimo. Listeria Listeria monocitogenes es una bacteria ubicua, que puede crecer en muchos lugares. Puede crecer en piensos, leche, quesos,... No puede ser eliminada si llega al alimento, por lo que se tuvo que pensar entonces qu hacer. Se lleg a la idea de que se poda insertar un plsmido que codificase una bacteriocina en el interior de las bacterias caractersticas de ese alimento. De esta manera, se puede evitar la contaminacin por Listeria, pero sin aadir ningn aditivo, lo que le da valor aadido al producto.
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Alteracin de los alimentos: Microorganismos responsables

La alteracin de los alimentos es un hecho normal, no es extraordinario. Entre el 20 y el 30 de los alimentos que se pierden es debido a los microorganismos. En algunos lugares, un porcentaje similar es debido a roedores y similares. Veremos ahora los diferentes grupos de alimentos y los organismos que los alteran. 1. Hortalizas, verduras y frutas Composicin: 90 % Agua Hidratos de carbono Protenas 0,3 % Grasas Resto Cenizas (sales minerales) En principio, con esta composicin podr crecer una gran variedad de microorganismos. Los microorganismos que alteren los vegetales debern enfrentarse en primer lugar a la envuelta que los Erwinia recubre. Para una correcta conservacin Xanthomonas ser bsico conservar ese tegumento. Se trata de alimentos de carcter cido, con escasa capacidad de tamponacin. Los gneros con ms probabilidades de afectar a estos alimentos son los que se presentan en Bacillus la tabla. Erwinia provoca la Clostridium podredumbre blanca de los vegetales.
Otros agentes con capacidad para afectar a estos alimentos son los hongos. Botrytis cinnerea provoca la podredumbre gris en los vegetales. Tiene la capacidad de crecer sobre el fruto. Puede alterar la fresa incluso aunque est integra. Proliferar igualmente si las condiciones de almacenamiento no son adecuadas. El agente causal de la podredumbre cida es Geotrichum candidum. En este caso es necesario que intervenga algn vector, para que el organismo llegue al sustrato. Es necesario que intervengan moscas u otros insectos. Rhizopus stolonifera es el agente que provoca la podredumbre blanda de los vegetales. Es necesario un vector o que el vegetal haya sufrido alguna herida o similar para que el organismo penetre el tegumento. 2. Carnes Composicin: 55 76 % Agua Hidrat 15 20 % Protenas 7 25 % Grasas Las carnes pueden verse alteradas por gran cantidad de microorganismos, ya que se trata de un gran sustrato para su crecimiento. Tienen un gran valor nutritivo y econmico. Al ser sacrificado el animal y conservada su carne, se producirn una serie de reacciones: o Deja de haber circulacin, por lo que no llega oxgeno al msculo, de manera que se acaba produciendo la rigidez muscular a causa del bloqueo del complejo actina miosina.
o o o
Se produce un descenso de la temperatura del organismo, lo que provoca la solidificacin de lpidos. Se producen en los ltimos momentos de vida del animal la glucogenolsis y la gluclisis, de manera que se producir lactato, que provocar una bajada del pH. Se produce una liberacin de catepsinas, que provocan la desnaturalizacin de las protenas.
El interior del msculo debera ser estril, pero al salir del matadero tendr unos ndices de presencia de bacterias entre 104 y 105.
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Los gneros con ms probabilidades de alterar la carne son los que se muestran en la tabla de la izquierda. Pseudomonas Acinetobacter Moraxella Alcanigenes Aeromonas Hongos Cladosporiu Mucor Rhizopus Levaduras Candida Rhodotorula Nitritos La adicin de nitritos, que tienen capacidades aditivas y conservantes, inhibir el crecimiento de un grupo de organismos, los Gram negativos. La carne sera degradada por otras bacterias, como las Gram positivas, que tardaran ms. Entre stas podramos encontrar las bacterias del cido lctico. Si combinamos la adicin de nitritos con una atmsfera rica en dixido de carbono se potenciar el efecto. 3. Pescados Composicin: 70 % Agua Hidratos de carbono 15 20 % Protenas caballa y salm Cenizas (sales minerales) Todo el nitrgeno que se podr encontrar en este tipo de alimentos ser en forma de protenas, ya que no hay urea, por ejemplo. El pescado tiene los microorganismos principalmente en agallas, escamas e intestinos. En teora, igual que en la carne, el msculo del pescado es estril. Es muy importante que se produzca una rpida evisceracin, ya que en caso contrario podran actuar las catepsinas en el intestino, que tienen una elevada actividad, y los organismos podran acabar modificando el sabor del alimento, ya que podran acabar llegando al msculo. El factor temperatura es el ms importante para regular la velocidad y el tipo de alteracin de la carne. Con ndices de 104 y 105 sern carnes no alteradas. Con 106 hay ligeros signos de alteracin, de manera que entre 106 y 107 hay grandes indicios, mientras que con 108 ya no es consumible la carne. Con 109 hablaramos ya de putrefaccin. Podemos medir los ndices de contaminacin de la carne con mediciones directas de los microorganismos, pero no es prctico, porque tardaran demasiado, de manera que deberemos buscar un mtodo que nos permita hacer mediciones a tiempo real. Se puede medir la calidad de la carne de muchas maneras: Mediante caractersticas conductividad o pH. fsicas, como pueden ser
Mediante mtodos qumicos, como la puede ser medir la concentracin de algn metabolito, ya que la concentracin de este metabolito estar en consonancia con la cantidad de organismos. Usaremos molculas fcilmente detectables y que estn en relacin con los organismos, como puede ser amonio,... y sobre todo dos diaminas, que son cadaverina y putrescina. Estas dos molculas provienen de la descarboxilacin de dos aminocidos como la lisina y la arginina, llevada a cabo por algunos microorganismos, como Clostridium.
No se aprecian diferencias entre pescados continentales y marinos, a excepcin de las bacterias halfilas detectadas en los marinos.
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Shewanella Pseudomonas Alteromonas Acinetobacter Moraxella Flavobacteriu
En la tabla de la izquierda se pueden ver las bacterias ms comnmente detectadas en pescados. Los dos primeros gneros acumulan cerca del 50% de los casos, mientras que Flavobacterium se da ms raramente. Se podran hacer recuentos para medir la calidad del pescado, pero no tiene mucho sentido, porque el pescado dura muy poco. Normalmente se buscan sustancias producidas por bacterias, como pueden ser alcoholes,... Un ejemplo es la deteccin de TMA-O. La trimetilamina oxidada est presente en el pescado fresco, pero no en el pescado alterado, ya que por accin bacteriana pasar a TMA, que se puede detectar fcilmente, ya que tiene un olor caracterstico.
En algunas especies se puede producir una acumulacin de histamina. Normalmente no hay problemas, pero por descarboxilacin de la histidina se puede pasar a histamina, debido a la accin de Morganella morganii o Hafnia. En estos casos se puede llegar a 400 mg de histamina, sobre los 40 de ingesta mxima diaria. En estos casos se suelen producir alergias y reacciones similares. Crustceos y mariscos Tienen una composicin similar a los pescados, pero con hidratos de carbono, de 0 a 1 % en crustceos y de 3 a 5 % en moluscos. Esto provocar una cierta facilidad para la alteracin. Adems de las bacterias ya mencionadas, podrn aparecer otros gneros, como Protius o Serratia. La frescura del alimento depender del pH que tenga. De 6 a 5,9 ser aceptable. Entre 5, 9 y 5,7 estar alterado. Si est por debajo de 5 estar claramente pasado. Se ha de tener en cuenta que los organismos que contaminarn un alimento sern los que se encuentren normalmente en el medio, de manera que ser muy importante si el alimento es un filtrador, porque en ese caso se convierte en un bioacumulador.
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5.
Huevos El huevo es un alimento protegido intrnsecamente, debido a su cscara. Pero adems se ha de aadir la presencia de lisozima, un pH elevado, de carcter alcalino. Debido a todos los nutrientes que tiene en su interior, el huevo es un medio de crecimiento para los organismos brutal. En teora, el interior del huevo es estril. Pero parece ser que existe la posibilidad de que se contamine el interior del huevo con Salmonella. Existen ms de 1000 serotipos de Salmonella, de algunos de los cuales el hombre es reservorio, mientras que otros viven en los animales o en la naturaleza. El problema es que los huevos se contaminan desde el mismo momento de la puesta con contaminantes fecales. Por lo tanto, el huevo que se usa a nivel industrial es pasteurizado.
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Leche Pueden crecer muchos organismos en la leche. A priori debera ser estril, si la vaca est sana. Lo normal es que al principio tenga de 104 a 105 microorganismos. Podremos encontrar microorganismos fecales debido a la proximidad, as como los organismos que crezcan en el entorno en que vive la vaca. Hemos de asegurarnos, pues, de que estos organismos no proliferen e incluso si podemos eliminarlos de la leche.
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Cereales y harinas Tienen un alto contenido en carbohidratos y bajo en protenas. Aparte de la poco agua que tienen, lo que ya puede constituir una barrera, muy pocos organismos podrn degradarlos, tan solo los que tengan amilasas, debido a la forma en que se encuentran los carbohidratos. Un gnero de riesgo es Bacillus. El tratar las harinas, hidratndolas, aumentan los riesgos.
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Anlisis microbiolgicos
Normalmente, en los laboratorios de anlisis, aparte de los servicios de anlisis que se ofrecen, se ofrece tambin otra cosa. La CALIDAD. Esta calidad la determina la propia empresa, se decide la calidad que se ofrece. La calidad ser un valor fijo que se establece y que se afirma que cumple el producto o servicio. Es necesario seguir unas pautas preestablecidas para poder garantizar una cierta calidad. En todos los laboratorios se seguirn las Buenas Pautas de Laboratorio o Good Laboratory Practices. En la industria se debern seguir las Buenas Pautas de Fabricacin, para garantizar la calidad del producto. Mediante el cumplimiento de estas prcticas se garantiza que en el laboratorio se hacen las cosas como es debido, se cumplen las normas, se alcanza un nivel de calidad. Ser importante que todos los laboratorios sigan unas normas estrictas. Se entiende como norma el hecho de que todos los laboratorios actan haciendo lo mismo, no por obligacin, sino porque as se garantiza la calidad. Actualmente, la norma a seguir por todos los laboratorios es la ISO 45001. No son ms que reglas que estas son las pautas que se deben seguir. Actualmente, debido a algunos problemas, que han surgido en su aplicacin, a finales del 2002 entrar en vigor la ISO 17025. Se conoce como normalizacin al proceso por el que se llegan a establecer las normas a seguir. Para esto es necesario que existan una serie de organizaciones que se encarguen de establecer esas normas. Internacionalmente tenemos la International Standarization Organization. En Europa existe la CEN, mientras que en Espaa existe la Asociacin Espaola de NORmalizacin. Estas organizaciones prueban, aprueban y distribuyen las normas. Hemos de distinguir entre lo que significa homologado y el concepto de acreditado, junto con el de normalizado. Normalizado: Es necesario trabajar bajo unas normas, para poder garantizar una calidad. Homologado: Funcionamiento siguiendo unas normas. Para ser homologado se requiere ser reconocido por un grupo de personas. Acreditado: Reconocimiento por parte de algn tercero, mediante algn examen o similar, en algn organismo acreditador.
A partir de la industria nuclear surgieron lo que se conoce como Procedimientos Normalizados de Trabajo. Se trata de los procedimientos que se debern seguir en los diferentes supuestos, en cualquier caso previsto. En el momento en que seguimos un procedimiento, debemos poder garantizar una calidad, para lo que estableceremos una serie de controles internos, tanto de aparatos como de procedimientos. En este punto es importante la idea del material de referencia. Permite establecer un patrn para comparar con l los controles. En un laboratorio es importante tambin tener un manual de gestin del mismo, donde ha de estar todo lo concerniente al laboratorio, desde el organigrama a los instrumentos del laboratorio, pasando por los objetivos del mismo. Todo esto lo deber escribir el director del laboratorio. Es muy importante describir y tener la unidad de garanta de calidad. Se trata de la persona o personas que se encargan de controlar que las cosas se hagan bien, mediante controles internos. Es el encargado de garantizar la calidad. Este tipo de control es tan solo una auditora de calidad interna. Dado que en algunos casos es una figura que no necesitas todo el ao, aparece la figura del auditor externo, que controlar la calidad de las empresas que quieran alquilar sus servicios. Por ltimo, se puede acudir a los rganos acreditadores para ser el encargado de acreditar a las empresas. La TRAZABILIDAD es otro concepto muy importante en la industria. Hemos de ser capaces de poder recuperar la informacin obtenida de los anlisis elaborados de una muestra, mediante informes recogidos y guardados. Es muy importante para mantener la calidad. Esto implica que se requieren datos primarios, los obtenidos directamente a partir del anlisis. Estos datos NO SE HAN DE ELIMINAR nunca. Afortunadamente actualmente, mediante los mtodos informticos es ms sencilla esta tarea.
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Indicadores de calidad e inocuidad de un alimento

Los microorganismos que usemos debern cumplir dos funciones. Por un lado han de tener funcin indicadora, ya que pueden indicar el funcionamiento de un proceso o algunos que pueden usar como trazadores, ya que pueden indicar la presencia de contaminaciones. Adems, debern ser ndices, que estn relacionado con aspectos sanitarios. Pueden estar vinculados a patgenos. En ocasiones ambas funciones se mezclan. Veremos en primer lugar los indicadores de calidad de los alimentos. Indicadores de calidad en alimentos Muchos organismos se pueden usar para medir la calidad de un alimento. Los alimentos pueden tener unos organismos creciendo sobre ellos, cuya presencia puede indicar una menor calidad del alimento. Si proliferan perjudicarn la calidad del producto. Existen una serie de caractersticas que se han de cumplir para que pueda ser un indicador de calidad. Ha de estar presente y ser detectable en los alimentos que queramos valorar su calidad La multiplicacin del organismo y su nmero deben estar en relacin alimento. La deteccin y el recuento del organismo han de ser sencillos, y a ser posible que la flora acomp interfiera en el proceso. El crecimiento del indicador no debe ser obstaculizado por el indicador. El tiempo de recuento ha de ser lo ms corto posible. Si controlamos la presencia y el crecimiento de los organismos alargaremos la vida til de los alimentos. Los indicadores de inocuidad han de seguir una serie de criterios. Fcilmente y rpidamente detectable Es esencial que se diferencia de la flora microbiana Ha de existir una relacin entre el patgeno y el indicador Siempre que est el patgeno deber estar el indicador Ha de haber relacin entre el nmero del indicador y el nmero de patgenos Los requerimientos nutricionales y la velocidad de crecimiento del indicador han de ser simila patgeno La tasa de muerte del indicador y el patgeno ha de ser similar, aunque es recomendable que el indi persista ms que el patgeno Todos los alimentos exentos del patgeno han de estar exentos del indicador, o este ha de estar en nmero muy bajo. Los primeros indicadores que se usaron fueron para las contaminaciones fecales, para evitar el clera, estos indicadores tenan una serie de criterios. Deban vivir exclusivamente en el intestino Deba haber un nmero elevado de organismos en heces a fcil de deteccin, fiable incluso en nm a en el ambiente extraintestinal
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Veamos ahora algunos indicadores que se podran usar. Coliformes Fermentan lactosa produciendo cido y gas. Se usan 4 gneros. Citrobacter Enterobacter Klebsiella Escherichia Coliformes fecales. Se usa la prueba de Eijkman, de produccin de gas y cido a 42
itrobacter sten organismos exclusivamente intestinales, y otros con distribucin mixta, como Enterobacter . stir algunas E.coli patognica, de diversos tipos: enterotoxignicas enteroinvasivas enterohemorrgicas enteropatgenas facultativas
O157:H7 es una enterohemorrgica, ya que produce una toxina, la shiga toxi poco cocinadas. Si llegase al rin podra provocar un fallo renal. Enterococos Su presencia en las heces es menor. Requieren ms nutrientes que los coliformes, como por ejemplo algunos AA y vitaminas como las de tipo B. En aguas de bajo contenido orgnico no podrn replicarse. Existir una relacin ms pareja entre enterococos y patgenos que no con coliformes. Su resistencia es superior a la de los coliformes. ecalis En humanos sobre todo, pero tambin en animales. En humanos y animales, pero principalmente animales. En humanos y animales, pero principalmente animales. linarium umbae yticus sseliflavus En aves de corral, como gallinas y pollos En pollos En palomas En aves, pero tambin en algunos mamferos En vacas En comunidades vegetales y forrajes, y en suelos.
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Bifidobacterium Se trata de bacterias Gram positivas. Pueden tener su origen en animales o en humanos, pero algunos mixtos. Su presencia en el agua denota una contaminacin fecal reciente, ya que son anaerobios estrictos y mueren rpidamente con oxgeno. Son muy abundantes en las heces. Existen ms de 25 especies. Los medios usados para su deteccin son, en orden de antigedad: Colifagos Se trata de fagos que atacan a E.coli. Se basan en que el mejor indicador para la presencia de un virus ser otro virus. Se trata de virus de morfologa similar a los de los animales y su resistencia a muchos tratamientos es tambin muy similar. Por seguridad, algunos alimentos deben pasar por algunos procesos antes de ser consumidos, como es el caso de la leche, que se ha de pasteurizar. En aves se corren riesgos de Salmonella, de manera similar a las carnes. YN6 YN17 Beerens. Se trata de agar Columbia con cido propinico.
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Anlisis microbiolgico de los alimentos

Queremos cuantificar los microorganismos, as como identificarlos. Esto no parece tener mucho problema, pero se ha de considerar que en industria se trabajar en el control de atmsferas y superficies. Las dos pueden ser focos de contaminacin a tener en cuenta. Se conoce como punto crtico de control a aqul punto en que si no se ejerce el control adecuado, se alterar el sistema. Tanto la atmsfera como las superficies son puntos crticos de control. No existe una flora autctona de las superficies o de la atmsfera. Son bacterias que estn en trnsito. Sern bacterias que estarn muy daadas, por los procesos que se puedan haber hecho para esterilizar la atmsfera o la superficie, por lo que para identificarlos deber revivificarlos. De hecho, siempre se efectuar un recuento aproximado, debido a que habr organismos muy lesionados que no podrn revivificarse. El control del aire es cada vez ms importante para muchas industrias diferentes, desde la farmacutica a la electrnica, pasando por la alimentaria. Un aire estar muy limpio cuando en l haya menos de 10 microorganismos por metro cbico. A travs del aire se pueden vehiculizar posibles factores de enfermedades. Existen diferentes mtodos para medir la cantidad de organismos en el aire. Por un lado est el sistema de placa abierta. En este mtodo dejas una serie de placas abiertas con diferentes medios, durante un tiempo determinado, en diferentes lugares. Mediante este mtodo podemos ver la presencia de organismos, pero no podemos cuantificar. Otro mtodo usado es el que consiste en el uso de colectores de aire, mediante sistemas que aspiren el aire, proyectndolo despus de manera tangencial sobre las placas de Petri, a una determinada velocidad. Mediante este mtodo s se pueden cuantificar los organismos del volumen de aire. Al hacer controles de aire se establecen protocolos de muestreo. El anlisis es importante, pero si descansa en un muestreo no vlido, no servir de nada. Se han de hacer planes de muestreos previos a la toma de muestras, de manera que no quede nada al azar Se han de controlar todos los posibles espacios en una habitacin,... El control de superficies es necesario porque a menudo ocurren problemas de limpieza, desinfeccin, esterilizacin de superficies,... Ha de haber protocolos que permitan saber si el proceso ha funcionado y una superficie es estril. EL mtodo ms usual de los que se emplean, el normalizado, es el uso de las placas RODAC, Replicate Organism Direct Agar Contact. Consiste en llenar la placa de medio y despus poner la placa con el medio sobre la superficie, arrastrando los organismos. Es el mtodo ms fcil de hacer. Adems. dada su forma rectangular, permite el control de medios lquidos por inmersin. Otro mtodo usado es el de los escobillones, SWAB. Se pasa el escobilln por la superficie y despus se pasa a la placa de Petri, de manera que las bacterias crecern en sta. El problema es que siempre se ha de hacer igual para que sea vlido. Si en lugar de ser algodn se trata de alginato se pueden hacer anlisis totalmente cuantitativos. De hecho es vlida cualquier idea que se pueda tener, con el nico requisito de que SIEMPRE se ha de usar el mismo protocolo. Otro mtodo se basa en la presencia de ATP o en su ausencia. En una superficie limpia ha de haber ATP, ya que si lo hay, no estar limpia. Usamos el complejo luciferin luciferasa, que en presencia de ATP provoca luz. Se trata de un medio muy fiable. Adems, se puede detectar la cantidad de ATP por la cantidad de luz. Las ventajas que tiene este sistema son que es rpido, en unos 10, y que tiene una elevada sensibilidad, que permite detectar ng de ATP, hasta puede detectar 300 bacterias. Si nos centramos en el anlisis de alimentos, hemos de considerar que el muestreo debe ser siempre significativo y representativo, para lo que estn los estadsticos. A travs de diferentes herramientas podrn llegar a elaborar un plan de muestreo que deber seguir. Determinados productos podrn ser ms sensibles que otros productos, por lo que debern ser controlados ms a menudo. La importancia del muestreo depende de la importancia sanitaria, del consumo del alimento y de una cierta estacionalidad. Siempre se ha de tener en cuenta que el muestreo es tan importante como el propio anlisis. La contaminacin se da al azar en el alimento y en los lotes de distribucin, por lo que se deber homogeneizar la muestra. Todo esto debe estar previsto en los planes de muestreo. Cuando el alimento es fresco, el anlisis debe hacerse enseguida, pero no debe hacerse en el laboratorio, que puede durar das y das, sino que debe hacerse a tiempo real, como mucho en una jornada de trabajo, ya que no se puede retener un producto fresco, ya que provoca prdidas. En el caso de las conservas y semiconservas el proceso no ha de ser tan rpido. Parte las muestras las analizas, mientras que las otras las almacenas entre 37 y 42 C semanas o das respectivamente. Se provoca un envejecimiento artificial del producto.
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El anlisis microbiolgico tiene 2 aspectos, la cuantificacin y la identificacin. Se valoran especialmente los procesos a tiempo real y los automatizados, ya que a travs de la rutina se puede provocar el tedio y la monotona en el operario, inducindole a error. Adems, si es un trabajo rutinario, se podr hacer una mquina que lo haga. Mtodos de cuantificacin 1. Directa Da un nmero exacto. El problema es que hasta hace poco tiempo los mecanismos usados eran 1, tan solo el recuento manual, que presentaba dos grandes defectos, por un lado la fatiga del operario, que poda provocar errores, y la baja cantidad de anlisis por unidad de anlisis que se podan hacer. Actualmente hay mquinas que se facilitan esto. La platina se mueve sola en las mquinas, facilitando el trabajo de los operarios. Adems, el uso de cmaras de video unidas a microscopios, unidos a su vez a programas informticos complejos de recuento permite acelerar el proceso. Adicionalmente, mediante el uso de marcajes, como puede ser epifluorescencia. De manera que gracias a todo esto los recuentos directos estn volviendo a usarse, porque son rpidos y la electrnica los facilita mucho. a. Existen mquinas de anlisis de imagen, que permiten con tan solo 1 ml de muestra y 1 ml de medio, en 6 horas tener resultados. Se pasa la muestra en forma de portaobjetos. La mquina buscar colonias no visibles al ojo humano, pero si observables con microscopio. No es necesario esperar tanto como en las placas normales. Mediante la citometra de flujo se pueden medir y contar componentes celulares y las propias clulas en suspensin lquida. La esencia del sistema consiste en que las clulas en suspensin son llevadas 1 a 1 a travs de un canal de flujo. Diferentes dispositivos del aparato permiten regular la trayectoria y la velocidad a la que pasan las clulas por el conducto. Segn los sensores de que dispongamos podremos medir diferentes propiedades de las clulas en suspensin, como puede ser fluorescencia, absorbancia, dispersin,... En base a estas caractersticas pueden ser divididas en grupos. Adems, se puede combinar con la tincin de las clulas, con lo que se tendrn ms combinaciones. c. Recuento de UFC. Es un mtodo de recuento directo que se basa en el supuesto de que cada clula formar una colonia en la placa. Basta contar las colonias de la placa para saber el nmero total de bacterias. La calidad de las placas es bsica para la eficacia del recuento, ya que podrn tener diferente volumen,... Adems, debido a que ser necesario hacer mucho medio ser necesario desarrollar mquinas dispensadoras. En cualquier caso ser necesario comparar los diferentes medios. Para hacer esto se hacen los tests ecomtricos. Dado que existen diferentes componentes de medios, hemos de considerar cual es el mejor. Estos tests funcionan como sigue. Se seleccionan 3 cepas que sean fciles de recuperar en ese medio y 3 cepas ms que resulten inhibida por ese medio. Se siembran 21 estras por placa, 4 grupos de 5 y una central. Despus contaremos la cantidad de grupos en los que ha habido crecimiento por placa, de manera que un medio ideal debera ser 5,5,5,0,0,0, pero de hecho normalmente son 5,3,5,2,1,0 o similar. El mtodo de las UFC presenta un gran inconveniente, que es la excesiva intervencin del operario, ya que este hace diluciones, extensiones y recuentos. Es demasiado trabajo montono para una persona, de manera que existe un mtodo normalizado. Se trata del mtodo de siembra en espiral en placa. Se trata de una mquina que distribuye el inculo lquido en la superficie de una placa en rotacin con el medio adecuado. El brazo dispensador se mueve desde el centro de la placa hacia el exterior, depositando la muestra en espiral la cnula asociada al brazo va dejando ir un volumen decreciente de muestra, de manera que en una sola placa desciende el orden de magnitud hasta en 4 grados. El recuento se hace usando una plantilla especial, junto con una mquina, normalmente equipada con lser para el recuento. Es un mtodo totalmente automatizado, el hombre no interviene.
b.
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d.
Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). Se trata de un mtodo estadstico para averiguar el nmero de organismos. Se basa en la presuncin de que independientemente del nmero de organismos que haya en la muestra, pasado un cierto tiempo, si estn los organismos que creemos, la prueba deber ser positiva. Las tablas que se usan se elaboran mediante programas informticos. De nuevo encontramos el problema de la mano humana en este proceso, aadindole el hecho de que pueden ser necesarias rplicas para ir sobre seguro, de manera que har falta mucho material. La tcnica del NMP puede ser ms precisa incluso que la de recuento de UFC. Se ha de tener en cuenta siempre que todos los tubos del NMP no pueden ser positivos, ya que en ese caso se debe volver a empezar, pero con una dilucin mayor a la empleada. Se han desarrollado blisters que permiten usar el NMP. Fluorgenos y cromgenos. La cuestin es que observando los microorganismos se ha observado que determinadas gneros, especies o cepas tienen actividades enzimticas caractersticas. Elaboraremos entonces sustratos fluorgenos o cromgenos, de manera que la actividad del enzima sobre estos provoque el desprendimiento de esta sustancia, de manera que dar color. Se usarn uno u otro tipo segn gustos. Uno de los fluorgenos ms usados es el MUG, 4-metil-umbelifenil--D-glucurnido. Detecta la actividad de la -D-glucuronidasa. Casi todas las E.coli tienen esta actividad, y prcticamente ninguna otra bacteria. Estas sustancias se aaden a los medios de crecimiento de la bacteria a detectar.
e.
2.
Indirecta Necesitas encontrar sustancias o actividades que estn relacionadas con la cantidad de microorganismos. En la industria alimentaria uno de los mtodos usados ms frecuentemente es el de la impedancia. Los mtodos indirectos no tienen la misma precisin que los directos, pero son ms rpidos en muchos casos, y estn ms automatizados. a. Impedancia. Se basa en tomar una medida elctrica relacionada con la resistividad o la conductividad del medio. Un medio estril tendr la misma impedancia en todo momento, mientras se mantenga estril. Pero con la presencia de microorganismos, se gastarn nutrientes y se producirn metabolitos, con lo que se modificar la resistividad. El parmetro de tiempo de deteccin de cambio de impedancia est relacionado con la cantidad de microorganismos en el medio. Hemos de encontrar una relacin entre UFC e impedancia, para poder as calibrar el aparato que mide la impedancia. Para poder hacer esto usaremos patrones conocidos.
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Identificacin de microorganismos
Consta de una serie de etapas. Preparacin de la muestra Enriquecimiento de la muestra, en medio lquido Se puede hacer por IMS, separacin inmunomagntica, con Dynal, por ejemplo. Se trata de bolas magnetizadas cubiertas por Ac. Las bolas capturarn los microorganismos para los que estn diseadas, de manera que con un imn podremos separar las bolas. Con un preparado cido se podr separar los organismos de las bolas. En 30 tenemos la muestra lista para lo que haga falta. Se trata de un mtodo muy especfico, por lo que es muy caro. Los protocolos que se usan estn normalizados. Aislamiento en medio slido Existen muchos tipos de medios de cultivo. Purificacin Identificacin prescriptiva Identificar consiste en asignar a un grupo desconocido un grupo taxonmico por similitud. Debemos conocer una serie de caractersticas para poderlo identificar, a la vez que necesitamos una clasificacin preexistente donde estn todos los grupos taxonmicos. Algunas caractersticas que se usan en la identificacin son: o o o o cidos nucleicos. Es el carcter ms de moda. Puedes secuenciar el genoma del organismo. Enzimas y protenas. Componentes celulares. Se conoce como quimiotaxonoma. Fenotipo. Dentro de este grupo se puede considerar movilidad, forma, pruebas BQ...
En los laboratorios, para hacer las pruebas bioqumicas se usan tests miniaturizados, en lo que se conoce como API. Son pequeas celdillas que permiten realizar una serie de pruebas bioqumicas sobre la muestra. Se trata de una marca comercial, que comercializa estos pozos, en grupos de 20 a 50. Existen mquinas que permiten hacer API de manera automatizada. Existen muchas marcas diferentes de galeras, los conjuntos de pozos, miniaturizados en el mercado actualmente, aparte de API. Estas pruebas no dan solo resultados de positivo o negativo, sino que a partir de stas podemos llegar a obtener ms informacin, incluso de utilizacin de sustrato. Identificacin definitiva Se ha de tener en cuenta que no buscamos una identificacin de la especie, sino que queremos saber si la cepa que se ha localizado es la misma que se localiz en otro momento en otro lugar y que ocasion prdidas. Queremos tipar las cepas.
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Anlisis de residuos de antibiticos

Uno de los anlisis ms importantes que se hacen en la industria alimentaria pueden ser los anlisis de la presencia residual de antibiticos. Debido al sistema ganadero actual, intensivo, actualmente, ms del 70% de la veterinaria que se aplica en ese campo son antibiticos. Se ha de tener en cuenta que los antibiticos pueden ser promotores del crecimiento, en bajas concentraciones. Su uso est autorizado en la UE, pero bajo revisin. Existen algunos riesgos a tener en cuenta. Por un lado, se pueden producir resistencias, que podran llegar a pasar al hombre por ingestin. Por otro lado, algunos antibiticos, ya sea en su forma inicial o al ser transformados por el hgado, pueden llegar a ser sustancias txicas o cancergenas. Por todo esto, el uso de antibiticos est muy regulado. Existe un listado de antibiticos autorizados para su uso en ganadera, que normalmente no se usarn en el hombre. Adems, las dosis y tiempos de administracin estn calculados para que en el momento de sacrificar al animal no queden restos del antibitico en el animal. El volumen de trabajo es muy grande, por lo que en principio slo se trabaja con mtodos cuantitativos, y en caso de ser positivo ya se harn nuevos tests en los que trataremos de identificar el tipo de antibitico. Existen 4 mtodos bsicos: 4 Placas: Se usan discos de tejido de unos 8 mm colocados sobre la placa, si se inhibe el crecimiento del organismo hay antibitico. Stop: Se usa una torunda impregnada del animal, haciendo una estra sobre la placa. De nuevo si hay crecimiento, no hay antibitico. Kundrat: Se usan discos de papel impregnados de fluido tisular sobre la placa. Tcnica del fluido: Se usa lquido tisular en un vial con medio inoculado.
Al final del proceso se deber hacer un anlisis cromatogrfico para saber el antibitico exacto que tenemos. Estos mtodos son mejorables, ya que deberamos conseguir aumentar la sensibilidad de ellos. Adems, se ha de tener en cuenta que existen algunos antibiticos que no se detectan por estos mtodos, sino que requieren protocolos especficos para ser detectados.
Bioensayos para determinar la virulencia de patgenos

Es muy importante poder determinar la virulencia de un determinado patgeno, para lo que normalmente se usar un modelo animal. Se usan los siguientes mtodos: 1. Muerte de ratones. Se usan para medir o detectar la actividad de determinadas toxinas, como puede ser la toxina botulnica. Se inyectan extractos del alimento y controles en los diferentes animales. Se mira entonces si existen sntomas y/o mortalidad. Uso de ratones lactantes. Se usan ratones acabados de nacer. Puede usarse para determinar efectos de diarreas,... Se sacrifican y se mide la relacin entre el intestino y otros rganos, como puede ser la cabeza. Estudio de diarreas. Se usan conejos o ratones. Estudio del vmito o emesis. El modelo ms usado en este caso es el gato, o incluso monos del gnero Rhesus, si puedes comprarlos y mantenerlos. Estudios epidemiolgicos. Se usan conejos o conejillos de indias. Un caso tpico es el estudio de Listeria. Se puede hacer sobre el ojo de los ratones, que suelen ser muy sanos. Existen algunas tcnicas de estudio que pueden requerir la ciruga. Se hace una operacin en el intestino y se inyecta directamente all la toxina.
2.
3. 4. 5. 6.
Normalmente los estudios de este tipo se ven muy limitados, y se hacen los justos, pero existen algunas alternativas para tratar de evitarlos. Una alternativa puede ser el uso de cultivos celulares, ya sean continuas o no. Pueden ser clulas adultas o fetales. Mediante esta tcnica se pueden ver las capacidades del organismo de causar lesiones, su adhesividad,... Aunque mediante estas tcnicas se pueden evitar algunos ensayos con animales, siempre acabar siendo necesario usar un modelo animal para ver algunos efectos.
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Conservacin del alimento

Para conservar un alimento podremos prevenir o retrasar la actividad microbiana. Existen 4 posibilidades bsicas de hacer esto. Asepsia. A travs del manipulado correcto de los organismos evitamos aadir al alimento ms microbios de los que ya tiene Fsicamente. Se puede hacer por filtracin o centrifugacin Tcnicas de conservacin. Desecacin, almacenamiento a baja temperatura, anaerobiosis,... Esterilizacin o pasteurizacin.
No obstante, siempre queda la posibilidad de la propia reactividad enzimtica del alimento. Para evitar esto tenemos las tcnicas del blanqueado o escaldado en inmersin. Se sumergen los alimentos en agua caliente, inutilizando as los enzimas propios. Si se usa agua alcalina se tratar de un blanqueado. Para evitar la reactividad qumica espontnea del alimento podremos usar diferentes sustancias, como pueden ser los antioxidantes. Eliminacin de los organismos Se puede usar el calor o la radiacin. Radiacin Csmicos + Energa < > Microonda Radio
Se trata de una esterilizacin fra. Su uso data de los aos 20. se usan radiaciones ionizantes, de mucha energa, de menos de 2000 de longitud de onda. Se pueden usar los UV, que son un potente germicida, pero tienen como inconveniente su escasa capacidad de penetracin, de manera que son ideales para limpiar atmsferas y superficies. Se pueden usar radiaciones o electrnicas para esterilizar alimentos. Son haces de electrones. Se trata de radiaciones que tienen una energa y capacidad de penetracin. Son muy manejables, siendo muy precisos en direccin e intensidad, pero son poco prcticos por su carcter de agentes mutagnicos. Los ms usados en la alimentacin son los rayos . Se trata de partculas que salen de los ncleos de Co o de Cs. Son sustancias peligrosas, pero de muy elevada energa. Son muy efectivos. Su uso requiere instalaciones muy buenas. Normalmente destruir microorganismos es un proceso caro, pero en el caso del Co o del Cs, que son basura nuclear, podra resultar econmico. Despus de esterilizar el alimento se ha de garantizar que no se volver a contaminar, mediante el uso de las protecciones adecuadas. El uso de radiaciones puede provocar la aparicin de radicales libres, por radiolisis. Estos radicales libres pueden ser peligrosos para el consumo. La aparicin de los radicales libres disminuye si reducimos la dosis o bien si eliminamos el agua o reducimos la cantidad de oxgeno. Otra opcin considerada es la adicin de sustancias que neutralicen los radicales libres. En Espaa existe actualmente la autorizacin para irradiar patatas y cebollas. En USA, la FDA autoriz su uso para la esterilizacin de hamburguesas, para evitar la aparicin de brotes de E.coli O157. Tambin en muchos productos secos est autorizada. Tambin la mayora de los pollos que comemos estaran contaminados por Salmo y Campilobacter, de no ser por la irradiacin.
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Una dosis de 103 RAD es suficiente para provocar la muerte. El uso de 104 RAD sobre los vegetales provocara la detencin de la germinacin. Entre RAD = 100 Hz / g muestr 105 y 106 RAD son los tratamientos que se usan en los alimentos para destruir las bacterias. Entre 107 y 108 RAD son los tratamientos que se usan Gy = Gray = 1J / kg para destruir virus. Una dosis de 109 permitira la inactivacin de un enzima. Existen diferentes tratamientos especficos que se aplican en los alimentos 1 Gray = 100 RAD para inactivar o destruir los microorganismos: 1 KGy = 105 RAD - Radapertizacin Equivale a una esterilizacin comercial en fro. La dosis empleada es de 30 40 KGy Radicidacin Equivale a una pasteurizacin, a la eliminacin de patgenos. La dosis empleada va de 2,5 a 10 KGy Radurizacin Tambin es equivalente a una pasteurizacin Alarga la vida del alimento por la reduccin de los microorganismos alterantes. La dosis empleada es de 2,5 7,5 KGy Microorganismos resistentes a la radiacin Existen algunos gneros de microorganismos resistentes a la radiacin, como pueden ser Deimococcus, Rubobacter, Acinetobacter,... El hecho de que posean resistencia puede ser debido a: Pared especfica: Principalmente compuesta por cidos teicoicos, como los G+ y por AG, normalmente ms del 50% de palmitoleatos Sistemas de reparacin de DNA. Pueden tener sistemas de reparacin de DNA mucho ms eficaces que otras bacterias, de manera que son ms resistentes.
Obviamente la combinacin de ambos factores incrementar la resistencia a la radiacin. Calor El calor como agente biocida va a desnaturalizar las protenas y los enzimas. Valdr cualquier temperatura superior a la temperatura mxima de crecimiento. Distinguimos 3 rangos bsicos de temperatura: menor a 100, pasteurizacin, superior a 100, esterilizacin, y de aproximadamente 100, que es la que se da al frer, cocer los alimentos y en las conservas caseras. Pasteurizacin y esterilizacin La pasteurizacin destruir a todos los patgenos o destruir un elevado nmero de organismos alterantes. Se trata de combinar la temperatura y el tiempo, en los lmites mostrados en la tabla. En el caso de la pasteurizacin es necesario un tratamiento posterior de algn tipo para conservar el alimento. 30 01
La esterilizacin destruir supuestamente todos los organismos viables presentes en la muestra. Mediante una esterilizacin comercial se destruirn casi todos los organismos viables de la muestra. El nmero que quedar es tan bajo que no se podr detectar en los cultivos normales o bien no ser significativo. Se debern seguir las normas tpicas de envasado y almacenado. La tcnica de la Ultra High Temperature, UHT, consiste en el uso de temperaturas estriles, superiores a 100 C, generalmente cercana a 140 150 C, pero durante tiempos cortos. La principal ventaja es que se preservan mucho mejor las caractersticas organolpticas del alimento.
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Termoduria Se trata de la resistencia al calor. Normalmente las esporas son termodricas. La termoduria depende del tipo de organismo, as como del estado fisiolgico de sta, de manera que la resistencia ser diferente en la fase de crecimiento que en la fase estacionaria. Tambin depender de las condiciones del medio. En condiciones ptimas, la resistencia aumentar, mientras que en condiciones no ptimas, disminuir. Tambin es muy importante la actividad de agua, de manera que a menor AW, mayor resistencia, y a mayor AW, menor resistencia. Cualquier factor que afecte a la AW intervendr en la resistencia al calor de la bacteria, al menos de manera indirecta. Se ha de tener en cuenta que se ha de conseguir la temperatura en todo el alimento, incluso en el centro. Adems, hemos de considerar dos opciones. Hemos de considerar si esterilizamos el alimento y el envoltorio a la vez, o bien si los esterilizaremos por separado, para envasarlos despus en asepsia. Los organismos que ms problemas ocasionarn sern los termodricos y las esporas de algunos gneros, como Clostridium o Bacillus. La cintica de activacin ser una cintica normal de primer orden, como la que se muestra en la grfica de la derecha, cuya pendiente depender del microorganismo, as como de las condiciones en que se encuentre, por lo que normalmente ser ms til usar condiciones desfavorables para el organismo. Ser mucho ms til que la actividad de agua sea lo ms elevada posible. Adems, se ha de tener en cuenta que hay sales que favorecen y otras que perjudican la termorresistencia. Se conoce como tiempo de reduccin decimal al tiempo necesario en unas condiciones dadas, en que el nmero de organismos se reduzca un logaritmo. De manera que 12D sera el tiempo necesario para que se reduzca 12 logaritmos. Se conoce como TDT, Thermal Death Time, al tiempo necesario para matar un nmero determinado de organismos a una temperatura determinada. Adems, existen una serie de factores, medidos en Fahrenheit. F es igual a D a 250 C. Z es la franja de temperatura necesaria para que la cantidad de viables descienda un logaritmo. Caractersticas de los organismos termfilos La principal caracterstica de los organismos termfilos es su termorresistencia. Algunos de los que podemos encontrar son de los gneros Bacillus o Clostridium, junto con arqueobacterias, pero estas ltimas no se de mucho inters para la industria alimentaria. Dentro de los enzimas de los termofilos podemos distinguir 3 categoras: Termorresistentes de por s, independientemente de la temperatura de crecimiento. Termorresistentes, si hay los nutrientes adecuados en el medio. Termorresistentes a la temperatura de crecimiento, pero no a T ms altas.
Normalmente suelen ser ms hidrofbicas que otras protenas. Los ribosomas de los termofilos parecen ms resistentes a los de los mesfilos, debido posiblemente a una mayor proporcin de G y C. Es importante, porque la temperatura mxima de crecimiento est relacionada con la temperatura de inactivacin de los ribosomas. Los lpidos de las membranas de los termfilos tienen un mayor porcentaje de cidos grasos insaturados. Como contrapartida a su resistencia a la temperatura, las bacterias termfilas tienen requisitos de nutrientes muy estrictos, de manera que si no se cumplen, el crecimiento se ver muy afectado. Las cinticas de primer orden se pueden explicar fcilmente, ya que debido a una mnima lesin en la membrana, se podr destruir la bacteria, mientras que las lesiones en otros orgnulos no explican esas cinticas.
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Conservacin de alimentos Se emplean principalmente temperaturas bajas en la conservacin de los alimentos. Los sistemas biolgicos tienen un coeficiente de temperatura de entre 1,5 y 2,5, lo que significa que en caso de que la temperatura vare 10 C, las reacciones variarn en ese factor. 0 C Tiempo de generacin 600 700 Tiempo de generacin 50 Muchos organismos pueden continuar replicndose a bajas temperaturas. Vibrio sp puede replicarse a 5 C, mientras que Yersinia enterocolitica puede hacerlo a 2 C. Su temperatura de crecimiento es de 14 C. Muchas bacterias G- pueden replicarse a temperaturas de tan solo 5 C, de hecho muchas bacterias lcticas pueden replicarse a esta temperatura. En el proceso de almacenamiento de los alimentos encontramos una serie de temperaturas: Temperatura de enfriamiento, en cmaras: Va de 7 a 12 C. Se usa para alimentos frescos que queremos que nos duren. El organismo que podr crecer ser psicrfilo. Se podr controlar la atmsfera, la humedad relativa y, en determ alimentos, podremos considerar irradiacin con UV para alargar la vida til Temperatura de nevera: Suelen ser temperaturas de 2 a 7 C. Temperatura de congelacin: Es importante la preparacin previa del alimento, por lo que existir un coste. Congelaremos sol aquello que se va a consumir, solo lo necesario. Es importante en verduras para conseguir la fijacin del color, as como la inactivacin de los enzimas. Adems, se producir marchitado, con lo que disminuir el volumen a almacenar. En estos casos siempre se produce reduccin de la cantidad del organismo en 1 o 2 logaritmos. Distinguimos 2 tipos de congelacin: Congelacin lenta: Se alcanza la temperatura de congelacin en varias horas o das. Es l congelacin que se podra dar en un congelador domstico. Congelacin rpida: Es la congelacin industrial. Se alcanza la temperatura congelacin en menos de 30. Las tcnicas usadas para esto pueden ser la presencia de flujo de aire fro, por inmersin en lquido congelante o por contacto con superficies fras.
Se ha de recordar que siempre querremos evitar la purga o fuga de descongelacin. Esto consiste al congelar un alimento se formar hielo, que formar a su vez cristales. Estos cristales podrn la perdida de nutrientes, reduciendo el valor del alimento. Esto no se da en los casos en los que se apli la congelacin rpida. La quemadura del congelador es un proceso que se da en aves y en algunos otros alimentos. Es debi deficiencias en la envuelta. Se producen migraciones de agua, especialmente a nivel superficial manera que se producen las alteraciones conocidas como quemadura del congelador. Descongelado Al descongelar quedarn muy pocos organismos viables, pues se destruirn en este proceso.
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Caractersticas de los psicrfilos Los psicrtrofos tienen dos grandes problemas para solucionar antes de poder continuar replicndose a temperaturas bajas. Problema de la solidificacin de los lpidos. A bajas temperaturas, los lpidos se solidifarn, en funcin de su grado de saturacin. La solucin es que poseen cidos grasos insaturados. Problema de la baja actividad de agua. La actividad del agua va disminuyendo a medida que baja la temperatura. En estas bacterias hay unos polisacridos extracelulares, que a altas temperaturas se inactiva, que retienen el agua alrededor de la bacteria, permitndola replicarse
Desecacin Es una antigua tcnica de conservacin. Consiste en reducir la actividad del agua, para as reducir la actividad de los microorganismos. La desecacin podr implicar la conservacin de los organismos, de manera que podr ser necesaria una pasteurizacin previa. Existen diferentes mtodos. Desecacin solar El alimento preparado se expone al sol para que lo deseque. Desecacin mecnica Existen hornos que realizan esta funcin. Permiten regular el flujo de aire y la humedad relativa. Se han de evitar las prdidas repentinas de agua. Si atomizamos un producto, la evaporacin del agua ser ms sencilla. Este mtodo se usa tambin para eliminar las aguas de lixiviacin de los vertederos. De hecho es un sistema muy comn para eliminar residuos actualmente. Liofilizacin Se trata de procesos de desecacin al vaco, como ya se vieron. Ahumado Mediante el calor y el humo de la madera quemada se puede desecar el alimento. Adems, el humo tiene sustancias inhibidoras del crecimiento de bacterias. Actualmente no se emplea ya el ahumado para conservar, sino que se usa slo por su capacidad de dar sabor. Se puede hacer la desecacin poco a poco, o bien totalmente, para despus rehidratar hasta el nivel deseado. Desecacin por presin osmtica Debido a la alta presin osmtica se puede impedir la degradacin de los alimentos. Se puede hacer con sal o con azcar, pero en el segundo caso ser necesario 6 veces ms cantidad. Actualmente podemos clasificar los alimentos en dos grupos en funcin de su humedad: Alimentos de baja humedad AW 0 0,6 No hay ningn organismo que pueda crecer. Los ms resistentes: Zygosaccaharomyces rousi 0,62 y Aspergillus rousi necesita 0,64 Alimentos de humedad intermedia AW 0,6 0,85 No resisten tanto como los anteriores, de manera que puede ser neces Tendrn humectantes para regular la AW. No podr S.aureus, que requiere 0,86. Normalmente tendrn pH bajo.
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Los alimentos desecados son alimentos estables, estn diseados para durar. Pero podemos tener problemas, ocasionados por la reactividad qumica del alimento. Oxidacin de los lpidos. Enranciamiento Reaccin de Maillard. Reaccin entre los grupos carbonilo de los azcares y los grupos amino de las protenas. Da un sabor amargo.
El primer problema se puede evitar asgurando bien el cierre del producto, o por la adicin de antioxidantes. El segundo problema es ms complejo. Se puede reducir su incidencia reduciendo la cantidad de azcares, o bien reduciendo el contenido de agua. Al reducir el contenido de agua se reducir tambin el riesgo de enranciamiento.
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Aditivos alimentarios
Un aditivo es cualquier sustancia qumica aadida expresamente al alimento. Dentro de este definicin entran tambin los condimentos usados en la cocina. Dependiendo de las propiedades de los aditivos distinguimos 31 categoras diferentes: edulcorantes, emulgentes, conservantes, colorantes,.... Nos centraremos en los conservantes, que son sustancias que se aaden para alargar el tiempo de vida til del alimento. Asumiendo una ingesta de 1000 Kg anuales, 36 Kg seran sal y azcar, los conservantes ms antiguos que se conocen, mientras que 4 Kg seran el resto de aditivos. Para poder utilizar un aditivo y aadirlo en un producto, debe estar autorizado su uso, porque podran tener efecto sobre la salud del consumidor. Los aditivos presentan una serie de ventajas e inconvenientes: Ventajas Conservan y mejoran la calidad del producto Reducen las prdidas del producto Mejoran el aspecto del producto, hacindolo ms atractivo al consumi Facilitan la manipulacin del alimento Desventajas Pueden permitir engaos al consumidor Pueden enmascarar prcticas de fabricacin fraudulentas o poco precisas Seguridad El uso de aditivos requiere una autorizacin previa. Para conseguir la autorizacin se han de llevar a cabo 3 tipos de estudios de toxicidad, generalmente en 2 modelos animales, usualmente perro y cobaya. Normalmente se mirar la toxicidad tanto bioqumica como histopatlgica. 1. 2. 3. Intoxicacin aguda. Miras la dosis letal 50, mediante el producto puro, y compruebas su toxicidad. Si no hay problemas, se pasa a 2. Intoxicacin subcrnica. Se administra el producto durante 9 semanas a diferentes concentraciones. Si no hay problemas, se pasa a 3. Intoxicacin crnica. Se administra el producto durante 2 aos, a diferentes concentraciones.
Una vez realizadas las pruebas, se pasar a calcular la ingesta mxima terica, que ser autorizada en un valor 100 veces menor. Pese a todas estas precauciones, ciertos consumidores puede presentar ciertos problemas de toxicidad y alergia a ciertos aditivos. Se han de mejorar los ensayos. En cualquier caso, sera muy difcil, si no imposible, para la industria alimentaria funcionar sin aditivos. Lo ptimo sera utilizarlos en la mnima cantidad posible, y solo cuando fuese necesario.
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Conservantes Hay cientos de conservantes autorizados. Pueden actuar a diferentes niveles, como pueden ser cidos nucleicos, membranas,... Su uso puede ser en forma de lquido, de slido,.... Los conservantes presentan una serie de requisitos. Deben ser baratos Debe usarse slo para alimentos donde no haya otra opcin Debe prolongar la vida til del alimento No debe alterar las caractersticas organolpticas del alimento Debe ser fcilmente soluble Deben ser fcilmente detectables Deben ser inocuos para el consumidor No deben interaccionar con los procesos digestivos Los productos de degradacin deben ser tambin inocuos Sal y Azcar Son los conservantes que se usan en mayor cantidad. Ambos actan por desecacin osmtica. Al subir la concentracin de los solutos, se podr provocar la plasmolisis de los organismos presentes. Para conseguir el mismo efecto har falta 6 veces ms azcar que sal. Nitritos Son usados con gran profusin, sobre todo en carnes y queso. Su aplicacin tiene una serie de efectos sobre el alimento. Fijacin del color Potenciacin del sabor Eliminacin de microorganism En medio cido, el nitrito pasar a xido nitroso, que puede pasar a cido ntrico. Este cido interactuar con la mioglobina, fijando el color. Adems, puede interactuar con algunos enzimas y con porfirinas, de manera que impedir el crecimiento de los organismos aerobios. Se observ que al combinar nitritos con el calor se formaba un inhibidor de Clostridium botulinum, que inhiba su crecimiento. A esto se le conoce como efecto Perig. El problema que presentan los nitritos es que llegan al estmago en cantidades bajas, entre 10 y 30 ppm. All se disociarn y se podrn unir a aminas, formando nitrosaminas, que son sustancias cancergenas, por lo que el uso de nitritos conlleva un riesgo. La solucin ha sido aadir sal y provocar un descenso de pH, de manera que con bajas concentraciones de nitritos se consigue el mismo efecto que antes con altas concentraciones. El problema es que se pierde sabor. cido benzoico Se usan benzoatos o parabenos, los steres. Histricamente se ha usado mucho. Su actividad depende del pH, de manera que a mayor acidez, mayor efecto. Su funcin es modificar el trnsito de la membrana. Se usan como potentes antifngicos, para evitar el crecimiento de hongos y mohos.
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cido srbico Se usan en forma de sorbatos. Se pueden usar en combinacin con los nitritos. Tienen utilidad contra gneros como Vibrio,... Impiden la germinacin de esporas. Actan a nivel de la membrana celular. Existen muchos ms conservantes, como pueden ser cido lctico, actico, propinico,... Se ha de tener en cuenta que normalmente los aditivos se usan en cantidades pequeas, de ppm. Dixido de azufre Se usa en forma de gas, con efectos conservantes. Se han usado tambien sulfito (H2SO3), bisulfito (HS2O3) y metabisulfito. El pH va ascendiendo, siendo ms bajo con el dixido de azufre y ms alto con el metabisulfito. Actan interfiriendo con los grupos tiol, actuando a nivel de los puentes bisulfuro, provocando cambios en la molcula. A altas concentraciones, 20 ppm, tienen efecto antifngico, mientras que a bajas concentraciones, 1 2 ppm, su efecto es bactericida. xido de etileno Es un gas txico e inflamable. Produce vmitos, nauseas,... Se ha de ser precavido en su manipulacin. Es un potente agente alquilante, siendo tambin txico para los microorganismos. Puede usarse para llegar donde no llegaran otros conservantes, como muchos gases. Se puede usar para en bajas concentraciones para el tratamiento y conservacin de cereales, ya que tambin matar insectos. Si se usa a la vez que el dixido de carbono, este gas lo inertizar. El xido de propileno es similar. Se puede usar en combinacin con otros gases, como ozono, cloro,... Antibiticos Durante mucho tiempo se pens en usar antibiticos como conservantes, pero actualmente es una idea en desuso. Lo que ms se ha usado es la nisina, que es una bacteriocina, sustancias actualmente de mayor inters. En general estn muy en desuso. Los aditivos son sustancias difciles de eliminar actualmente en la industria. Los consumidores quieren cada vez menos conservantes y menos aditivos en general. ptimamente hemos de buscar aditivos que aparte de su posible funcin tengan otras funciones: Antioxidantes: Potencia Especies y aceites Acidulantes Algunos tiene poder conservante, como el Muchos tienen caractersticas antifngicas Si hay romero, organo,.. tienen un potente efecto bactericida Para reducir el pH se emplearn cidos orgnicos, como el lctico.
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Problemas sanitarios de los alimentos

Los alimentos que se produzcan no deben ni pueden alterar la salud del consumidor. Como ya se vio en la pgina 68, en los indicadores de inocuidad de los alimentos. Los alimentos pueden ser vectores de sustancias patgenas para el hombre, ya sea en forma de toxinas o de patgenos enteros. Hemos de evitar estos peligros. Peligro: Riesgo: Serie de circunstancias que pueden conducir a dao. Probabilidad de que ocurra el peligro como
Tasa de incidencia Nmero de casos que ocurrirn ante la cantidad definida de peligro. Normalmente las enfermedades que se van a transmitir en los alimentos afectarn al sistema digestivo, siendo de tiempos de incubacin cortos. De la mayora de las enfermedades se pueden establecer epidemiologas, pero las epidemiologas ms precisas sern aquellas de las enfermedades ms agudas, como gastroenteritis, mientras que para las enfermedades crnicas ser ms difcil establecer epidemiologas. Existe una serie de enfermedades, unas 300, de tipo infeccioso, que es necesario declarar para las encuestas epidemiolgicas de la salud general de la poblacin. Las gastroenteritis, as como otras enfermedades, son autolimitantes, que empiezan y acaban rpidamente. Siempre se producirn ms de las declaradas. En el caso de un beb, una gastroenteritis puede provocar la prdida del 20% del peso. Deben existir programas de vigilancia que permitan el estudio de los diferentes brotes, interesndonos por diferentes enfermedades, pero yendo ms all, porque nosotros queremos saber de donde sale la enfermedad. Existen una serie pasos que se deben realizar en estos casos. Identificacin del peligro. Se tiene que responder a gen del brote. oracin de dosis respuesta Valoracin de la exposicin que ha ocurrido. oracin de riesgos. En el estudio de un brote es bsico responder a 4 preguntas. Quin? Dnde? Cundo? Causante? Hemos de saber los individuos afectados, que tienen en comn. os de conocer el lugar y las condiciones donde ha ocurrido. os de saber cuando ha ocurrido y si tiene regularidad. os de poder aislar el organismo causante tanto en el paciente como en el aliment e, garantizar que es el mismo organismo.
Se ha de tener en cuenta siempre tambin la dosis mnima infecciosa, el nmero de organismos que he de ingerir para sufrir la infeccin.
gella
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4 A nivel de virus, protozoos u otros parsitos, el nmero mnimo terico necesario ampylobacter 10 ser 1, pero en realidad sern necesarios bastantes ms. En el campo de las Salmonella 106 bacterias, la DMI es la que se indica en la tabla de la izquierda.
gunas otras
10
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Se han de hacer encuestas epidemiolgicas. Mediante las siguientes tcnicas Caso control Consiste en establecer dos grupos de personas, uno donde se de la enfermedad y otro donde no. Entonces se hacen las preguntas para enfermedad. Se trata de hacer cohortes de afectados o no por diferentes averiguar a qu se deben esas diferencias. Se emplean voluntarios, a partir de los que se realizaran los estudios.
Casos cohorte Casos controlados
A partir de esto deberemos hacer una valoracin del riesgo para ver si ste es aceptable o no. El riesgo nunca podr ser 0. El riesgo aceptable lo impone la sociedad. Existe un organismo internacional que recoge toda la informacin acerca de los brotes vinculados a los alimentos. Es lo que se conoce como cdex alimentario. En l se establecen unas normas epidemiolgicas que se han de cumplir para que el riesgo sea aceptable. En el cdex estarn todas las enfermedades consideradas, pero faltan muchas otras no declaradas o de baja incidencia.
Normas microbiolgicas
Todo lo que estamos considerando debe estar dentro de las buenas pautas de fabricacin. Se deben tener en cuenta los resultados obtenidos de los estudios epidemiolgicos. Se debe considerar en toda industria alimentaria el Anlisis de Riesgo de Puntos Crticos de Control (ARPCC). Todo se recoge en una comisin internacional para la estandarizacin microbiolgica de los alimentos, ICMSF, que es la que elabora el cdex alimentario, donde se recogen las normas microbiolgicas adecuadas. Las normas son de un alimento dado, puede haber variaciones entre ellos. La primera norma data de principios de siglo, de las hamburguesas. Ms adelante se regularon la leche y otros alimentos. Una norma puede constar de criterios preceptivos o consultivos: Preceptivos: Patrn microbiolgico que contiene criterios de importancia microbiolgica a nivel patgenos. Consultivos Los criterios son una especificacin microbiolgica del producto final destinado aumentar. La norma constar de 5 apartados: Relacin de patgenos y toxinas que puede haber en el aliment Mtodos analticos Plan de muestreo Lmites microbianos considerados adecuados N de unidades a analizar en el plan de muestreo
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El plan de muestreo es muy importante: ategora 2: n, c, m n: nmero de muestras de lote c: nmero de muestr m: mximo criterio microbiolgico ategora 3: n, c, m, M n: nmero de muestras de lote c: nmero de muestr m: mximo criterio microbiolgico M: nmero mximo de valor por individuo Siempre existe la posibilidad de que escape algn patgeno a los estudios microbiolgicos, o incluso toxinas. Normalmente no deber haber ninguna de ellas, por lo que deberemos reducir esta probabilidad al mnimo. Se ha de tener siempre presente que las marcas que se asocian a algn problema sanitario tienen graves problemas y acaban desapareciendo. La idea hace aos era asegurar que el producto es sano, realizando estudios sobre estos productos. Hemos de tener siempre en mente las BPF. Si las materias primas no tienen ningn patgeno y no se le aade en el proceso, el producto final tampoco tendr ninguno. Hemos de considerar todas las etapas hasta llegar al consumidor final. En general descansar sobre 7 postulados: Relacionar los riesgos o peligros relacionados con las etapas del proceso. Determinar los puntos crticos de control necesarios para controlar los riesgos determinados. Establecer los lmites crticos que no se deben satisfacer en los PCC. Establecer los procedimientos para controlar los PCC. Establecer las medidas correctivas a adoptar cuando exista algn error determinado. Establecer sistemas eficaces de mantenimiento de archivos y de la inform Establecer procedimiento para comprobar que el sistema funciona. Dependiendo del alimento y su consumidor final los riesgos pueden ser diferentes. Siempre hemos de considerar un diagrama con las etapas del proceso, para determinar que el alimento es seguro.
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Hemos de determinar los puntos crticos o los puntos crticos de control. Punto de control (PC): Es un punto del sistema en que la prdida de control no entraa un riesgo inadmisible para la salud. Punto crtico de control (PCC): Es un punto donde se puede ejercer un control, de manera que el riesgo se reduzca al mnimo. Lmite crtico: Tolerancias prescritas que se deben satisfacer para garantizar que un PCC realme microbiolgico para la salud. Control: La secuencia planificada de determinaciones u observaciones de un procedimiento con lmites crticos. Verificacin: Mtodos o procedimientos a seguir para asegurarse de que se cumplen los lmites. Todo esto se recoge en el ARPCC. Se ha de tener siempre en cuenta que no existe ninguna actividad humana que no comporte ningn riesgo. La cuantificacin de riesgos puede ser debida a la demanda de la poblacin. Al hacer la evaluacin de riesgos se deben considerar todas las posibilidades. Si en nuestro anlisis de riesgo se ve la evidencia de un peligro, se deben tomar todas las medidas para minimizarlo. En ocasiones el anlisis de riesgo puede dar lugar a situaciones perniciosas: Se pueden producir alteraciones de la poblacin. Puede ser que no prevenga enfermedades. Al reducirse el riesgo pueden producirse prdidas econmi Los alimentos bajo ningn concepto pueden producir enfermedades. No se puede consentir que haya un riesgo de que un alimento produzca una enfermedad. Enfermedades alimentaria Se conoce como enfermedad alimentaria cualquier enfermedad relacionada con la alimentacin. Nos centraremos en intoxicaciones e infecciones alimentarias. Puede haber enfermedades relacionadas con el sistema inmunolgico. Normalmente las enfermedades alimentarias suelen afectar al sistema digestivo, pero tambin pueden afectar a otros sistemas. Los sntomas ms comunes son: Dolor abdominal En el abdomen hay pocas terminaciones nerviosas, por lo que el dolor ser algo importante. Vmito Acto reflejo, coordinado por el cerebro. Est conectado mediante el nervio vago al estmago. Algunas toxinas pueden provocar la mesis, ya que actuarn sobre esas terminaciones nerviosas. Diarrea Prdida de agua y electrolitos, que si no se compensa puede llegar a producir la muerte. Puede ser a causa de toxinas o a causa de proliferaciones invasivas.
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Intoxicaciones alimentarias Se deber a la ingesta de algn producto txico o venenoso. En este caso no hay tiempo de incubacin. Existen de dos tipos: Qumicas Estn producidos por sustancias qumicas que por error se incorporaron al alimento que pasar al consumidor. Algunos ejemplos pueden ser las dioxinas, aceite de colza,... Existen muchos productos que pueden actuar como txicos. Cuando la sustancia est incorporada ya, ser difcil de eliminar, por lo que se acabar destruyendo. Biolgicas La sustancia txica la produce un organismo. Pueden tener diferentes orgenes: Animales Algunos animales pueden ser txicos para el consumo humano. Vegetales Existen algunas plantas que son txicas para el ser humano. Microorganismos Dentro de este grupo podemos distinguir 3 grupos ms: Algas pueden ser cianofceas, algas azules, o dinoflagelados, mareas algas toxignicas. Es muy importante la buena gestin de los embalses. Hongos Las micotoxinas son sustancias txicas de los hongos. Son me son toxignicos. Algunos hongos pueden producir sustancias toxignicas o cancerg tendrn efectos acumulativos. En alimentos en mala conservacin se puede dar la proliferacin de hongos, que a su producirn micotoxinas. Con los productos fermentados puede haber tambin problemas. A nivel industrial riesgos, pero con los quesos o embutidos artesanales puede haber tambin problemas. Bacterias Son producidas por diferentes genes bacterianos. Pueden darse intoxicaciones diferentes gneros, en funcin de las condiciones: Por Clostridium, en condiciones de anaerobiosis. Estafilococcicas, S.aureus en alimentos preparados. Por Bacillus, requiere un ambiente rico en hidratos de carbono.
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Infecciones alimentarias Se dar la infeccin y la proliferacin de los patgenos. El alimento podr ser tan solo un vector, donde no ser necesario que se replique el organismo, o bien podr multiplicarse en el alimento. Hablaremos de toxoinfecciones alimentarias cuando el organismo adems libere una toxina en el alimento. Normalmente las enfermedades alimentarias suelen afectar al sistema digestivo, pero tambin pueden afectar a otros sistemas, como pueden ser el muscular, nervioso, linftico,... Ser necesario un tiempo de proliferacin inicial. El agente causal puede ser muy variado. Virus Hay ms de 150 virus entricos diferentes que pueden usar los alimentos como vectores. Los m comunes son: Hepatitis A, en proceso de exclusin. Rotavirus, provocan las diarreas infantiles. Calicivirus
Las gastroenteritis que provocan suelen ser autolimitantes. Adems, se ha grupos de riesgo, como nios, ancianos,.... Bacterias Salmonelosis y Shigelosis enfermedades Vibriosis os el clera, porque no es alimentaria. ambiente normal de estos organismos es el mar, por lo que muchos productos marinos podrn nfectarse, de manera que al ingerir esos productos sin cocinar se correr un riesgo. Campylobacter importancia est en aumento en los ltimos tiempos, debido al consumo masivo de carne de av presente actualmente en casi el 100% de los pollos. Yersinia mportancia est aumentando actualmente. trata de un organismo psicrfilo, que vive normalmente en el medio ambiente. Su proliferaci da al aumento de alimentos refrigerados. Enterobacterias uchas bacterias nuevas, pero tambin E.coli. La diferencia en los serotipos o en los antg la enterotoxicidad. La cepa ms peligrosa es E.coli O157:H7, que crece en vacas y puede Listeriosis anera natural, pero ser a partir de la conservacin del forraje Listeria. Una vez en el establo se podrn contaminar los animales, vacas principalmente, y o leche, quesos,.... Tiene dos grupos de especial riesgo: las mu barazadas, ya que es fatal para el feto y las personas de edad. No todas las infecciones provocan la edad. Tuberculosis onada por Mycobacterium, que tiene especies muy importantes. Son bacterias muy resistentes tratamientos, como el calor. La importancia de Mycobacterium entarias est en estudio aun.
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