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EVALUACIN DEL HONGO ENTOMOPATGENO BEAUVERIA BASSIANA COMO POTENCIAL BIOCONTROLADOR DE LA HORMIGA ARRIERA Atta colombica ( G.

) EN EL MAGDALENA MEDIO SANTANDEREANO.

JHON CARLOS TRIGOS PAEZ

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BARRANCABERMEJA 2013 1

EVALUACIN DEL HONGO ENTOMOPATGENO BEAUVERIA BASSIANA COMO POTENCIAL BIOCONTROLADOR DE LA HORMIGA ARRIERA Atta colombica ( G.) EN EL MAGDALENA MEDIO SANTANDEREANO.

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL.

JHON CARLOS TRIGOS PAEZ

PROYECTO FINAL: HONGO ENTOMOPATGENO BEAUVERIA BASSIANA.

DOCENTE IRINA ALEAN CARREO Microbiloga.

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BARRANCABERMEJA 2013 2

CONTENIDO

1. 2. 3. 4, 4.1 4.1.1 4.1.2. 4.2. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 6. 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 8. 9. 10. 10.1. 10.2. 11. 12. 13.

INTRODUCCION JUSTIFICACION. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. OBJETIVOS Objetivo general. Como se produce una enfermedad. Sntomas y signos de la enfermedad. Objetivos especficos. MTODOS DE CONTROL DE LAS HORMIGAS CORTADORAS DE HOJAS. Control mecnico. Control Fisico. Control cultural. Control qumico. Control biolgico. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS. MECANISMO DE ACCIN DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS. La adhesin. La germinacin. La penetracin. Invasin y proliferacin. BIOENSAYO PARA LA EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ENTOMOPATOGNICA DE LOS HEP. ASOCIACIN DE LAS HORMIGAS CORTADORAS CON HEP. AISLAMIENTO DE BEAUVERIA BASSIANA. Materiales. Procedimiento. ALGUNAS VENTAJAS DEL USO DE MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE PLAGAS. CONCLUSIONES. BIBLIOGRAFIA

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1. INTRODUCCION.

Las hormigas arrieras o cortadoras de hojas pertenecen a los gneros Atta y Acromyrmex agrupados dentro de la tribu Attini, subfamilia Myrmicinae de la familia Formicidae, se distribuyen en todo el neotrpico (Longino 2005). Se encuentran ubicadas desde el sur de Estados Unidos hasta Argentina de los 0 a los 3000 metros de altura (Folgarait et al. 1996; Longino 2005). Las hormigas cortadoras son dependientes del cultivo de hongos (Attamyces spp.) para su alimentacin (Currie et al., 2003) al que le retribuyen proporcionando material vegetal como sustrato para el crecimiento, dispersin y produccin del hongo simbionte del cual se alimentan (Ricci et al 2005). Las hormigas son organismos polfagos en trminos de la cantidad y variedad de especies vegetales que emplean para el cultivo del hongo, del cual se alimentan (Wirth et al. 2003), ocasionando dao en las reas agrcolas cercanas al establecimiento de su nido. Por lo anterior son conocidas como una de las plagas ms limitantes en diferentes cultivos de importancia econmica para regiones como Antioquia, Amazonas, Choc y el Magdalena Medio Santandereano (Riao 2003; citado por Ricci et al. 2005). La produccin agrcola del Magdalena Medio santandereano est sustentada por cultivos de pan coger como: maz, yuca, frutales, cacao, papaya, limn, naranja, musceas, hortalizas, leguminosas forrajeras, ornamentales y algunas plantaciones forestales como el cedro, ceiba tolua, guamo, entre otras. El impacto econmico del dao causado por las hormigas arrieras (HA), depende del estado de desarrollo del cultivo y de las condiciones ambientales imperantes en el momento (Ricci et al 2005). Sin embargo, Lima (1992) ha indicado, que un hormiguero puede llegar a consumir entre 50 y 150 kilos de hojas por da y las prdidas podran exceder 1.000 millones de dlares anuales para Norte y Sur Amrica, lo que da una idea de la presin que ejerce este insecto sobre la produccin agrcola en las zonas que afecta.

2. JUSTIFICACION.

La hormiga arriera o cortadora de hojas (Atta colombica) son reconocidas como el principal limitante en la produccin agrcola, forestal y ornamentales de algunos sectores rurales del Magdalena Medio Santandereano. Una de las alternativas de manejo de esta plaga es el uso de insecticidas qumicos, pero los problemas inherentes a este mtodo, han llevado a buscar otros mtodos de manejo. A partir de esto, nace la alternativa del control microbiolgico con el hongo entomopatgeno (Beauveria Bassiana) y evaluar su accin sobre las hormigas arrieras o cortadoras de la especie A. colombica. Ante esta realidad y teniendo en cuenta lo anterior, este trabajo se justifica porque: En el Magdalena Medio Santandereano no se han realizado estudios relacionados con la bioprospeccin de la diversidad de microorganismos, en especial los hongos

entomopatgeno como una herramienta potencial para ser utilizada en las reas agrcolas de importancia en la regin. Finalmente trabajos previos han demostrado que las estrategias de control biolgico basados en los hongos entomopatgeno (HEP) son una alternativa viable para controlar y as, mitigar la presin de este insecto plaga sobre los cultivos afectados (Lpez y Orduz, 2003).

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

El Magdalena Medio Santandereano es reconocido a nivel nacional por sus altos niveles de biodiversidad de especies vegetales y animales gracias a sus condiciones ambientales. Lo anterior hace pensar que existe igualmente un amplio potencial en trminos de la biodiversidad de la Microbiota asociada a esta regin, la cual se debe estudiar con el objeto de poder darle un valor agregado a dicha biodiversidad para que deje de ser un recurso potencial y empiece a ser un recurso explotable para la regin, particularmente en el marco de la identificacin de cepas nativas de HEP para el control de insectos plagas propios de la regin. Para el control de las hormigas cortadoras de hojas se han usado principalmente insecticidas qumicos, trayendo como consecuencia de seleccin de individuos resistentes, resurgencia de nuevas plagas, contaminacin ambiental, toxicidad al hombre y la presencia de residuos qumicos en los lugares de aplicacin; situacin que ha llevado a la bsqueda de productos no perjudiciales (Caedo y Ames 2004) y considerar los programas de control microbiolgico, basados en la bsqueda de cepas entomopatogenicas capaces de infectar y causar mortalidad en corto tiempo a un grupo especfico de insectos (Lpez y Orduz, 2003; Prez, 2008).

La importancia econmica de las hormigas arrieras est relacionada con el dao que ocasionan a las plantas cultivadas y que consiste en su defoliacin parcial o total. Los daos ocasionados por la hormiga arriera en amplios sectores rurales del Magdalena Medio Santandereano son de gran importancia por su efecto negativo a la produccin agrcola.

Se deben disear estrategias y planes de gestin que permitan lograr controles efectivos, con bajo impacto ambiental y econmico.

Las acciones individuales no logran el xito que se puede obtener cuando la comunidad en general toma conciencia y se interesa en manejar y controlar la plaga.

Se requiere continuar desarrollando investigaciones conducentes al hallazgo de mtodos biolgicos que presenten una mayor eficacia en el control de la hormiga arriera.

4. OBJETIVOS.

4.1. Objetivo general.

Desde pocas inmemorables el hombre ha reconocido que en la naturaleza, existe una competencia entre las criaturas que habitan la tierra. Se conoce que las malezas compiten con los cultivos; que los pjaros buscan alimentarse de plantas como el maz; que los insectos nocivos buscan alimentarse de las plantas cultivadas o silvestres. Todas estas relaciones constituyen competencia por sobrevivir y perpetuarse.

El uso de microorganismos o microbios para el control de plagas. En este caso (hormiga arriera), se reemplazan los plaguicidas qumicos por insecticidas producidos comercialmente, llamados patgenos, o agentes microbiales de control. Se habla en este caso de control microbiano (Kuno gt d., 1982).

Realizar aislamientos y caracterizacin de cepas de hongos entomopatgenos nativos de la regin del Magdalena Medio Santandereano, con capacidad bioplaguicida sobre hormigas cortadoras de hojas de la especie Atta colombica (G) provenientes de la misma regin.

4.1.1. Como se produce una enfermedad. Cada microbio para reproducirse produce esporas, conidias o semillas. Por medio de ellas ataca el cuerpo de la vctima. Como un resultado de este dao, el insecto no puede seguir alimentndose y empieza a soportar los sntomas de su enfermedad (Abbott, s.f.). Rodrguez (1984) dice que la enfermedad puede producir prdida de la sensibilidad y de movimientos. Al final se presenta la parlisis de la plaga. Ejemplo: el hongo Beauveria Bassiana penetra la piel de la broca del caf, paraliza sus movimientos, contina su desarrollo hasta causar su muerte (Anta gt d., 1992). Rodrguez (1984) dice que el tubo o raz producida por la espora (semilla) del hongo, penetra la piel de la vctima y llega hasta la hemolinfa (sangre), en donde se multiplica, chupa la sangre y ocasiona la muerte. Bustillo (1991), citando estudios de varios cientficos afirma que Beauveria Bassiana produce en el cuerpo de su vctima una toxina llamada Beauvericin, con capacidad para debilitar y matar a las plagas infectadas.

4.1.2. Sntomas y signos de la enfermedad. El ataque de las enfermedades de los insectos produce tambin, sntomas y signos. Estas caractersticas le permiten al especialista hacer el diagnstico sobre las plagas afectadas, en la forma semejante a como lo hace un mdico de los humanos. a). Sntomas: Kuno et al (1982) dicen que son anormalidades en el funcionamiento del organismo atacado. Por ejemplo: suspensin de la alimentacin y dificultades para caminar. b). Signos: Son los cambios o anormalidades que se notan en la plaga atacada por la enfermedad (Kuno et al., 1982). Por ejemplo: cambio de color en el cuerpo, diarrea, vmito y aparicin de material, polvoso sobre el cuerpo de la vctima. Los cadveres de las plagas atacadas por Beauveria Bassiana estn cubiertos por un polvo blanco.

Figura 1. Insecto infectado con Beauveria Bassiana.

Para disminuir el impacto causado por las hormigas cortadoras es necesario desarrollar prcticas de control que sean factibles, aplicables, eficientes y en lo posible econmicas.

4.2. Objetivos especficos. Realizar aislamientos de hongos entomopatgenos nativos presentes en sistemas de produccin agroforestal y frutihorticola del Magdalena Medio Santandereano, municipio de Barrancabermeja, corregimiento el Llanito, Vereda El Rodeo, Finca Villa Melissa, a partir de los desechos de la hormiga Atta colombica (G) e individuos muertos de Atta colombica y Atta cephalotes. Determinar la actividad entomopatognica de las cepas de hongos entomopatgenos obtenidas en condiciones de laboratorio. Determinar el Tiempo Letal 50 (TL50) y la Concentracin Letal 50 (CL50) de las cepas de hongos ms promisorias con el objeto de medir su virulencia sobre individuos de hormigas cortadoras de hojas. Realizar la descripcin taxonmica a nivel de gnero de las cepas de hongos evaluadas con mayor capacidad de virulencia sobre los individuos de Atta colombica (G).

5. MTODOS DE CONTROL DE LAS HORMIGAS CORTADORAS DE HOJAS.

En general, para el manejo de insectos plagas como la hormiga arriera el mejor control es aquel que, conociendo todas las alternativas; qumica, fsica/mecnica, cultural y biolgica, las aplica en forma adecuada e integrada atendiendo a cada situacin y considerando cada ambiente particular. Dado que las hormigas cortadoras tienen un alto potencial de dao en cultivos de importancia agrcola y que poseen adems una fauna de insectos asociada a ellas, el manejo de las poblaciones de hormigas es un trabajo que requiere la integracin adecuada de estrategias y/o mtodos de control que permita mantenerlas en niveles que no causen perdidas econmicas significativas en las reas agrcolas de las zonas que afecta. Dentro de los mtodos de control se pueden mencionar los siguientes:

5.1. Control mecnico. Escobar et al., (2002) describe este mtodo de control como una prctica que se realiza de forma rutinaria por las comunidades negras e indgenas de la regin Chocoana; se programa a partir de las fechas de ocurrencia de los vuelos nupciales y la apertura del primer orificio, el cual hace presencia a los tres meses. Para este control se excava el hormiguero recin formado con una pala o pica, a una profundidad de 15 a 20 cm hasta localizar la reina, desenterrarla y

matarla. Requiere el conocimiento adecuado de las pocas de vuelo nupcial, el cual se identifica fcilmente por la cantidad de machos alados muertos en el suelo. Para este sistema de control es indispensable que toda la comunidad lo realice, de manera permanente, lo cual se logra a travs de la organizacin de la comunidad de agricultores o mingas (unin de varios agricultores vecinos), ejemplos a seguir en nuestras comunidades.

5.2. Control fsico. Es una prctica comn de algunos agricultores la cual consiste en aplicar gasolina dentro del hormiguero, encenderlo para su posterior detonacin. Este mtodo no presenta un buen nivel de control debido a que no alcanza a afectar la totalidad de las cmaras y es un hecho poco probable que se logre alcanzar y destruir a la reina (Escobar et al. 2002). 5.3. Control cultural. Consiste en la utilizacin de especies vegetales con capacidad formcida presentes en la regin y de fcil consecucin. Para el uso de esta tcnica se emplean cebos como sustrato o cultivos trampas sembrados sobre o cerca del hormiguero cuyas hojas tienen efectos txicos sobre el hongo y/o las castas obreras. Este es el caso de la higuerilla (Ricinus comunis), el ajonjol (Sesamum indicum), Canavalia (Canavalia ensiformis) y la batata (Ipomoea batata) (Escobar et al. 2002; Lpez y Orduz 2003). Una vez las hormigas utilizan estas plantas como sustrato para el crecimiento del hongo del cual se alimentan, las plantas actan como inhibidoras de la actividad de las hormigas y adems sus compuestos txicos evitan el crecimiento del hongo (Ortiz y Guzmn 2007). 5.4. Control qumico. Consiste en el uso de sustancias qumicas sintticas, las cuales son la forma ms generalizada de combatir la hormiga arriera desde dcadas atrs. En este control se emplea formulaciones con ingredientes activos como; Clorpirifs, clordano, diazinon, lindano, fenitotrin, mercaptotin, sulfluramida, fipronil y cipermetrinas (Rodrguez et al, 2008). Otros productos como acetamiprid e imidacloprid, principios activos y tratamientos que combinan un atrayente con un insecticida (cebos txicos) (Vez 2005). Los productos son aplicados de distinta formas: directamente en los nidos o al lado de los caminos de forrajeo, dispuestos en los hormigueros o alrededor de los mismos principalmente en forma de cebo granulado, en polvos secos y lquidos termo nebulizables (Escobar et al. 10

2002). Para la aplicacin se deben tener en cuenta las condiciones climticas, hora de aplicacin y el tamao de la colonia, las cuales determinan la cantidad de producto qumico a utilizar (Vez 2005). 5.5. Control biolgico. Consiste en la manipulacin de macro y microorganismos que actan como enemigos naturales de los insectos plaga, con el fin de limitar la poblacin del insecto blanco (Carrillo y Blanco 2009). Entre los enemigos naturales que afectan a las hormigas se encuentra algunos parasitoides que atacan a las obreras adultas (moscas de la familia Phoridae), las cuales pueden reducir su actividad forrajera (Bragana et al., 1998; Currie et al 2003). Sin embargo, an no est demostrada la efectividad de estos y otros parasitoides en este tipo de hormigas. A diferencia de los hongos micoparasitos como Trichoderma sp., que ataca el hongo simbionte cultivado para su alimentacin y hongos entomopatgenos de los gneros Beauveria y Metarhizium que afectan a las hormigas (Currie et al., 2003; Lpez y Orduz 2003; Carrillo y Blanco 2009).

6. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS.

Los hongos entomopatgenos (HEP), son un grupo de microorganismos que emplean artrpodos de diferentes rdenes como hospederos para desarrollar parte de su ciclo de vida: Esta interaccin generalmente termina en el desarrollo de enfermedad en el hospedero terminando en la muerte del mismo (Butt et al., 2001; Khachatourians 1991; Khachatourians y Uribe 2004; St Leger; 2007). Los HEP son utilizados en un amplio rango de grupos taxonmicos, siendo los Ascomycota, aquellos que agrupan el mayor nmero de grupos con potencial bioplaguicida; en general los hongos forman esporas microscpicas con conidias de paredes delgadas desarrolladas por los conidiforos con diseminacin por el viento, agua u otros agentes (Butt et al. 2001; St Leger; 2007). Existen un nmero importantes de reportes en la literatura de hongos entomopatgenos como enemigos naturales de la hormiga arriera, los cuales han sido propuestos como una forma natural de mantener el equilibrio de las especies vegetales de importancia agrcolas que son afectadas por este insecto (St Leger; 2007; Rodriguez et al 2008). Los hongos entomopatgenos pueden ocasionar enfermedad y propagarse en la poblacin de artrpodos, dependiendo de las interacciones y factores relacionados con: el patgeno (patognicidad, virulencia, dispersin y persistencia), el hospedero (susceptibilidad, densidad, 11

distribucin y comportamiento) y el medio ambiente (abiticos: temperatura, humedad, viento, lluvias y biticos: parsitos, depredadores, planta - husped) (Lecuona et al. 1996; St Leger; 2007). Entre los gneros de HEP se destacan: Beauveria, Hirsutella, Metarhizium, Paecilomyces y Lecanicillium (St Leger 2007). Especficamente los hongos del gnero Metarhizium y Beauveria, han sido utilizados exitosamente en el control de algunos insectos sociales, destacando los estudios con hormiga roja Solenopsis invicta, en donde se demostr que las colonias resultaron ser susceptibles a Beauveria bassiana (Brinkman y Gardner 2000). Las termitas subterrneas Heterotermes tenuis (Gutierrez 2003) y las hormigas arrieras Atta cephalotes mostraron susceptibilidad a Metarhizium y Beauveria (Lopez y Orduz, 2003; Longino, 2005). Merece mencionar que los estudios demuestran que tanto B.bassiana como M. anisopliae tienen ciclos de desarrollo similares que se diferencian solo en la forma de penetracin al insecto y en la rapidez de la mortalidad (Moino et al. 2002; St Leger 2007), lo cual puede explicar en alguna medida porque la hormiga arriera es susceptible a cepas de ambos gneros, aunque es de mencionar igualmente que existe un mayor nmero de estudios sustentando la capacidad de HEP del genero Metarhizium spp, como alternativa de control de este insecto (Currie et al., 2003; Lpez y Orduz 2003; St Leger 2007).

7. MECANISMO DE ACCIN DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS.

Los hongos entomopatgenos constituyen un grupo de microorganismos en donde la ingestin por el hospedero no es un prerrequisito para llevar a cabo el proceso de infeccin, debido a que la enfermedad puede ser desarrollada por contacto del patgeno con su hospedero, logrado una penetracin directa de la cutcula (St Leger 2007). La patognicidad y el desarrollo de la infeccin de un HEP en su insecto husped son el resultado de la interaccin entre el patgeno y el hospedero, dicha interaccin est determinada por la velocidad de germinacin, y de reproduccin del patgeno, as como la tasa y velocidad de esporulacin, el tiempo de exposicin del insecto al patgeno, la produccin de toxinas por parte del HEP y el estado de desarrollo y ciclo de vida del insecto hospedero (Kachatourians, 1991; Caedo y Ames, 2004; St Leger, 2007). El proceso de la enfermedad de los HEP sobre los hospederos se puede dividir en las siguientes fases: adhesin, germinacin, formacin de apresorios y estructuras de penetracin, colonizacin y reproduccin del patgeno. En todos los casos la unidad infectiva es la espora o el conidio que inician su proceso infectivo cuando las esporas viables son retenidas en la 12

superficie del integumento y se realiza la asociacin entre patgeno y hospederos (Khachatourians y Uribe 2004). 7.1. La adhesin. La adhesin de la espora a la cutcula del hospedero es el primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero; las caractersticas fsicas y qumicas de las superficies de la cutcula del insecto y la espora son las responsables de esta unin. En algunos hongos, la adhesin es un fenmeno no especfico, mientras en otros, esto es un proceso especfico, determinado por componentes como la glicoprotenas que pueden servir como un receptor especfico para las esporas (Brinkman y Gardner, 2000; St Leger, 2007).

7.2. La germinacin. Es el proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeos tubos germinativos, que al crecer o alargarse dan origen a las hifas (Caedo y Ames 2004; St Leger, 2007). La espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo a travs de las hifas penetrando en la cutcula del insecto, despus que las hifas penetran en el insecto forma un apresorio el cual ayuda a la adhesin de la espora (St Leger, 2007).

7.3. La penetracin. Ocurre en la cutcula del insecto como resultado de la combinacin entre la degradacin enzimtica de la cutcula y la presin mecnica por el tubo germinal. La accin enzimtica est determinada principalmente por proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan degradacin de la cutcula, lo que facilita la penetracin fsica (St Leger 2007). Esta accin depende de las propiedades de la cutcula como su grosor, esclerotizacin y la presencia de sustancias antifngicas y nutricionales, as las enzimas del HEP degradan la cutcula del insecto ayudadas por presin mecnica, algunos hongos como M.anisopliae, producen un muclago y un apresorio que asiste el anclaje de la espora a la superficie. Estructuras como estas crean focos de fuerzas hidrostticas, tan necesarias como las enzimas lticas en el sitio de penetracin (Khachatourians 1991; Khachatourians y Uribe 2004). El resultado de la germinacin y la penetracin no depende necesariamente del porcentaje total de germinacin sino del tiempo de duracin de la germinacin, modo de germinacin, agresividad del hongo, el tipo de espora y la susceptibilidad del hospedero (Samson et al. 1988; Shapiro et al 2008).

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7.4. Invasin y proliferacin. Los hongos producen cuerpos hifales que flotan libremente e invaden el hemocel hasta ocasionar la muerte. La muerte de los insectos que se produce por agotamiento de los nutrientes de la hemolinfa, bloqueo o inmovilizacin de elementos del sistema inmune y/o por toxemia, causada por metabolitos txicos del hongo (Khachatourians, 1991; St Leger, 2007). En este contexto, la habilidad de un hongo entomopatgeno para superar los mecanismos de defensa de sus huspedes se debe en gran parte a la produccin de toxinas, lo cual constituye uno de los componentes principales de patognicidad y uno de los ms difciles de establecer; dentro de estos metabolitos se destacan toxinas como Destruxinas, Citocalasina, Beauvericina y Metaricina, algunas de las cuales son especficas para algunos gneros de HEP (St Leger 2007). Algunos biotipos producen suficientes toxinas para causar la muerte del insecto antes de que los rganos estn invadidos (Hajek y St. Leger, 1994; Caedo y Ames, 2004)

8. BIOENSAYO PARA LA EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ENTOMOPATOGNICA DE LOS HEP.

Los bioensayos consisten en la realizacin de pruebas con organismos vivos, con el objeto de determinar una caracterstica de inters dentro de un grupo de estudio. En el caso de los HEP estos se desarrollan con el objeto de evaluar la capacidad bioplaguicida de un microorganismo y determinar su virulencia a travs de parmetros establecidos como el tiempo letal medio (TL50) y la concentracin letal media (CL50). Estos parmetros que son identificados bajo condiciones controladas en laboratorios especializados, permiten identificar el potencial de un insecticida microbiano sobre el insecto que se desea controlar, como una primera aproximacin en el desarrollo de una estrategia de control que involucre los bioplaguicida como componentes estructurales de la misma (Tanada y Kaya, 1993; Butt et al., 2001; Caedo y Ames, 2004). Posteriormente una vez identificadas las cepas con potencial bioplaguicida estas debern proseguir hacia una siguiente fase de bioprospeccin que involucre evaluaciones en campo, las cuales demandan periodos extensos de tiempo ya que requiere las repeticiones en el tiempo y en diferentes ambientes para determinar de forma exhaustiva el potencial biocontrolador de los microorganismos bajo estudio. La patognicidad de un microorganismo depende del aislamiento y la especie del patgeno que se desea emplear como estrategia de control. En el caso especfico de los HEP es importante que en el momento del montaje del ensayo este sea pasado o repicado (sembrado y 14

recuperado nuevamente), sobre el hospedero apropiado, esto con el objeto de mantener o mejorar patognicidad del hongo y as, lograr aumentar el grado de virulencia del HEP sobre el insecto de inters. Estas estrategias han sido ampliamente empleadas en HEP, como Metarhizium anisopliae (Fargues y Roberts, 1983), Paecilomyces farinosus (Prenevora, 1994) y Beauveria Bassiana (Wasti y Hartman, 1975) (St Leger 2007) entre otros. Uno de los elementos ms importantes en el diseo de un bioensayo reside en la cepa entomolgica que se emplea, estas deben ser en la medida de lo posible de insectos producidos en laboratorio con el objeto de asegurar la homogenidad gentica, estado de desarrollo y condiciones sanitarias similares (Caedo y Ames, 2004). Existen diversos mtodos para la inoculacin de los insectos los cuales van desde el empleo de mecanismos por aspersin mediante lluvia conidial, inmersin (mnimo por 10 segundos en la suspensin de conidias), exposicin a material vegetal previamente inoculado, inyeccin, ingesta directa, entre otros (Khachatourians 1991; Toledo et al., 2008). Sin embargo, el mtodo de contacto conidial, es el ms usado para insectos en estado larval y formas adultas para el caso de los HEP (Papierok y Hajek 1997; Shapiro et al., 2008). De cualquier forma es importante anotar que la decisin en relacin al sistema a emplear va a depender del tipo de agente biocontrolador, el insecto hospedero, la pregunta de investigacin y el material disponible este, de que haya o no ms factores, lo importante es que la decisin tomada este en concordancia con la pregunta de investigacin que se desea abordar. En el caso de los HEP, la suspensin de conidias que se desea evaluar, debe ser obtenida en una suspensin conidial partiendo de un cultivo fresco esporulado, la cual se debe preparar agregndole agua destilada estril o un agente dispersante como el tween 80 a bajas concentraciones (Caedo y Ames 2004; Toledo et al., 2008). De acuerdo con Caedo y Ames, (2004); Rodrguez y Arredondo, (2007) y St Leger, (2007) las condiciones de humedad y temperatura ambiental son factores que inciden proporcionalmente en la germinacin y proliferacin de los HEP, es por esto que una vez expuestos los insectos que han sido tratados, estos deben ser mantenidos en grupos o individualmente, dependiendo de la especie de insecto, en ambientes controlados con fotoperiodo especifico, temperatura y humedad relativa constante, de acuerdo a los requerimientos del hongo y el insecto a evaluar. As mismo se deben hacer observaciones diarias hasta que muera el 100 % de la poblacin o por un periodo suficiente e igual para todos los tratamientos, con el objeto de mantener un registro acumulado del desarrollo de la enfermedad y mortalidad del hongo y de esta manera determinar su virulencia a travs del Tiempo Letal 50 (TL50) (Caedo y Ames 2004). La mortalidad del tratamiento testigo, es decir los insectos tratados con agua destilada estril, no debe ser mayor al 10 % ni stos deben presentar signos de micosis. La mortalidad de los 15

tratamientos debe ser corregida mediante algunas de las frmulas existentes, como la de Abbott (Caedo y Ames 2004).

9. ASOCIACIN DE LAS HORMIGAS CORTADORAS CON HEP.

Son pocos los trabajos que se han llevado a cabo sobre la diversidad microbiana asociada a las hormigas y en particular, de las hormigas cortadoras de hojas. Sin embargo, se han registrado algunos estudios (Samson et al. 1988; Currie et al.,1999; Currie et al., 2001; Currie et al., 2003) sobre la presencia de entomopatgenos asociados o infectando las hormigas, como son Metarhizium anisopliae aislado de la reina de Atta sexdens rubropilosa (Alves y Sosa 1983), Beauveria bassiana en las hormigas obreras de Atta sexdens piriventris (Diehl- Fleig et al. 1992b) e igualmente fue aislado Metarhizium anisopliae de una reina de la especie Atta cephalotes Lopez et al. (1999). Las hormigas arrieras tienen como mecanismo de defensa, la limpieza permanente del hongo simbionte del cual se alimentan y del hormiguero para evitar el crecimiento de microorganismos antagnicos y/o patgenos de las hormigas que afecten la supervivencia del hongo y por ende de las hormigas cortadoras (Currie et al., 2003). Los desechos de hormigas (animal=hormigas y larvas muertas, vegetal y hongo simbionte) dependiendo de la especie de hormiga, son depositados en un basurero interno (Ej: Atta cephalotes) o externo (Ej: Atta colombica) Holldobler y Wilson (1996). Dentro de estos desechos se desarrollan una gran cantidad de microorganismos micopatgenos y entomopatgenos cuya fuente es el hongo simbionte del cual se alimentan las hormigas cortadoras. (Currie et al., 2003). Es por esto que el presente trabajo pretende aportar informacin sobre el potencial de virulencia de cepas de hongos entomopatgenos aisladas de los desechos producidos por la especie Atta colombica e individuos muertos tanto de Atta colombica como de Atta cephalotes en el Magdalena Medio Santandereano, sobre hormigas cortadoras de hojas de la especie Atta colombica provenientes de la misma regin. 16

10. AISLAMIENTO DE BEAUVERIA BASSIANA.

Este microbio ampliamente recomendado para usarlo en cafetales afectados por la broca de la cereza, se puede sembrar en arroz precocido. El mtodo desarrollado por la Federacin Nacional de Cafeteros de Colombia es muy sencillo y se puede ensayar para la multiplicacin de otros hongos como Verticillium lecanii y Metarhizium anisopliae. Los pasos que se deben seguir para la produccin del hongo en la finca, como lo recomiendan Anta 4 (1 992), son los siguientes:

10.1. Materiales. Se necesitan las botellas aplanadas, limpias, transparentes, de 375 cc de capacidad; 50 gramos de arroz, 80 cc de agua y un trozo de algodn para cada botella; la olla con un poco de agua hirviendo; la estufa o fogn para calentar la olla con el agua; la botella con el hongo completamente "maduro" (blanco) para sacar la "semilla"; la cucharita o paleta para sacar el hongo y meterlo en el arroz recin preparado; los mecheros para ayudar a hacer la siembra del hongo; la cinta pegante (cinta de enmascarar) para marcar las botellas y una mesa limpia para hacer el trabajo.

10.2. Procedimiento. a) Esterilizacin de los medios de cultivo: Las botellas con el arroz, el agua y su tapn de algodn bien apretado se colocan paradas en las ollas que estn en el fogn. El agua debe estar hirviendo y el nivel altura del agua debe estar un poco por encima del nivel del agua de cada botella. La olla debe estar tapada para aligerar la esterilizacin. Este sistema se llama "bao de mara". Desde el momento en el cual se tapa la olla se cuenta entre 20 y 30 minutos, tiempo suficiente para que se evapore el agua de las botellas y el arroz quede precocido. De esta manera quedan las botellas, el arroz y el tapn de algodn sin ninguna contaminacin por microbios. a este proceso se le llama esterilizacin. Este mismo trabajo se puede hacer con una olla a presin, pero en menor tiempo. Desde la primera "pitada" de la olla se cuentan unos 15 minutos. Luego se baja la olla y se sacan las botellas esterilizadas.

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b) Enfriado de las botellas: Despus de retirar las botellas de la olla se deben colocar acostadas sobre un material de madera, papel, cartn o tela, secos, para evitar que se revienten o estallen. Por eso no se colocan sobre mesas de cemento, baldosas o mesas humedecidas. c) La siembra del hongo: Para tener xito en la siembra se necesita tener a mano una botella con un cultivo puro del hongo. O sea, que se vea el crecimiento del hongo sobre el arroz como motas de algodn, completamente limpio. Se debe tener una mesa bien limpia en un sitio de la casa donde ventee poco y que est aislado de animales y de personas. En el momento de la siembra debe haber por lo menos 2 mecheros encendidos para limpiar el ambiente de microbios contaminantes. Se necesita una pinza o cuchara esterilizada y las botellas con el arroz precocido fro, para no matar las semillas del hongo. La siembra del hongo consiste en destapar la botella con el cultivo puro del hongo, muy cerca de los mecheros, se saca con la pinza un trocito del hongo, se pasa a la botella con el arroz recin preparado y se tapan luego ambas botellas. Cada que usa la pinza o cuchara, se debe pasar por la llama. Este proceso se llama flamear. Despus de sacar o introducir la pinza en las botellas, se flamea la boca y la mota o trozo de algodn. Todo este proceso se realiza muy cerca de la llama de los mecheros. A todas las botellas con la semilla del hongo se les coloca una cinta adhesiva, en la cual se escribe el nombre del hongo, la fecha de la siembra y otros datos que se deseen consignar. d) Rendimiento: Si de cada botella con el cultivo puro del hongo se saca un centmetro cuadrado, se calcula que su contenido alcanzara para sembrar unas 100 botellas. Todo este trabajo se debe hacer el mismo da para evitar que la botella con el hongo "maduro" se contamine con otros microbios. e) Crecimiento y maduracin del hongo: Las botellas "sembradas" con las semillas del hongo se colocan acostadas, en un lugar limpio y fresco hasta cuando se note el cubrimiento completo del arroz por una masa algodonosa blanca. Sucede a los 15 das aproximadamente. Este es el punto preciso de la maduracin del hongo y el momento

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oportuno para usarlo para conservarlo en un refrigerador en una nevera, a una temperatura de 4 grados centgrados. f) Duracin del hongo: La calidad del hongo maduro no dura mucho tiempo. Se calcula que a partir de los 10 das a temperatura ambiente, se inicia la prdida de la calidad. El hongo refrigerado puede durar unos 6 meses. g) La calidad del hongo: Posada (1996) afirma que el hongo producido en estas condiciones es de muy buena calidad, quizs mejor que los productos comerciales ofrecidos en Colombia. Este criterio indica que el producto obtenido de manos de los agricultores plenamente diestros en esta actividad, es de plena confianza. h) Aplicacin del hongo: Antes de sacar el hongo de la botella se le agregan 10 centmetros cbicos de un aceite agrcola. Entre los productos comerciales se pueden mencionar los siguientes: citroemulsin, carrier, correo y portagotas. Se le agrega agua a la botella, se sacude hasta formar una emulsin y se hace pasar por un colador, con la ayuda de ms agua. Un litro es suficiente para remover el hongo del arroz.

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Dosificacin: El contenido de una botella es suficiente para 20 litros de agua. Con una bombada se pueden asperjar 400 rboles de caf con una edad de 4 aos. Con esta dosificacin recibira cada rbol unos 50 centmetros cbicos del producto biolgico. Se debe recordar que la bomba y la boquilla deben estar calibradas, con una presin de 40 libras por pulgada cuadrada de presin de la aspersora y la boquilla debe ser de baja descarga.

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11. ALGUNAS VENTAJAS DEL USO DE MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE PLAGAS. Son productos naturales y con su uso no se aadira nada nuevo al ambiente. Son microbios especficos. No atacan a otros seres vivos; no afectan los insectos benficos ni los que no son plagas en el momento de la aplicacin.

No afectan la vida de los mamferos como los animales domsticos y los seres humanos. Hay que recordar que los plaguicidas si son productos txicos. No dejan residuos contaminantes en las cosechas.

Puedan sobrevivir en el medio sobre los cadveres de los insectos muertos, despus de la aplicacin en los cultivos.

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12. CONCLUSIONES.

Los basureros de A. colombica (residuos del hongo y residuos del material vegetal cortado para el cultivo del hongo) e individuos muertos de la misma especie e individuos de A. cephalotes, son una fuente importante y especifica de aislamientos de HEP, destacando la presencia del gnero Metarhizium. De acuerdo a este estudio se logr mantener y establecer las condiciones de un hormiguero de Atta colombica en laboratorio y la importancia de la yuca (Manihot esculenta Crantz) como especie forrajera para el cultivo del hongo simbionte.

Los aislamientos de Beauveria Bassiana mostraron un 80% de mortalidad destacando su actividad biocontroladora sobre individuos de A. colombica.

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13. BIBLIOGRAFIA.

BUSTILLO P., A.E. uso potencial del entomopatgeno Beauveria bassiana en el control de la broca del caf. m: Miscelnea No. 18 (1 991); p.91-105.

KUNO, G.; MULETT, J. y DE HERNANDEZ, M. Patologa de insectos. 2ed. Cali: Universidad del Valle, 1982. 212p.

POSADA F., F.J. El hongo Beauveria bassiana en el control de la broca del caf. En: Memorias II Curso de Actualizacin sobre Manejo Integrado de la Broca del Caf. SIADA-Comit Departamental de Cafeteros de Antioquia, 1996. 162p.

MADRIGAL C, A.;YEPES R, F.C.; ACEVEDO, D.P. 1997. Evaluacin de 3 hongos y dos especies vegetales para el control de la hormiga arriera Atta cephalotes (Hym: Formicidae). En: Memorias Seminario Aconteceres Entomolgicos. Medelln. Editora Jurdica. p.9-19.

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