Gentica bacteriana

a) Mutacin y recombinacin:
La mutacin es un cambio hereditario en la secuencia de bases del cido nucleico que constituye el genoma de un organismo. La recombinacin gentica es el proceso por el que los elementos genticos contenidos en dos genomas separados se juntan en una unidad: genes enteros, grupos de genes, o incluso cromosomas enteros pueden ser transferidos entre organismos.

Mutaciones y mutantes:
Una mutacin es un cambio hereditario en la secuencia de bases del cido nucleico genmico de un organismo. Una cepa que lleva este tipo de cambio se denomina un mutante. Por definicin, un mutante difiere de su cepa parental en el genotipo, es decir, el conjunto de genes del organismo. Pero, adems, las propiedades observables del mutante, su fenotipo, pueden estar tambin alteradas en relacin con la cepa parental. Normalmente, una cepa aislada de la naturaleza se considera una cepa silvestre. Dependiendo de la mutacin, un mutante puede o no mostrar un fenotipo diferente al de su cepa parental. Aislamiento de mutantes: Una de las tcnicas ms usadas es la rplica en placa, por la cul se pueden detectar mutantes nutricionales. A partir de una placa original, y con el uso de terciopelo o de filtro de papel estril, se hace una impresin en otra placa de agar que carezca del nutriente en cuestin. Las colonias del tipo parental crecern normalmente, mientras las del mutante no. Por tanto, la incapacidad de una colonia para crecer en la placa rplica es una seal de que es un mutante. Un mutante nutricional que tenga un requerimiento por un factor de crecimiento se suele denominar auxotrofo, y la cepa parental de la que deriva se denomina prototrofo. Un mtodo ingenioso y ampliamente utilizado para aislar auxotrofos es el mtodo de seleccin con penicilina. Por lo general, los mutantes que requieren factores de crecimiento tienen desventajas competitivas respecto a las clulas parentales, y no existe un mtodo directo para aislarlas. Sin embargo, la penicilina mata solamente a las clulas que estn creciendo, y si se aade a una poblacin que est creciendo en un medio que carece del factor de crecimiento requerido por el mutante deseado, morirn las clulas parentales sin que resulten afectadas las clulas de mutante, que no crecen. Las poblaciones seleccionables son las que confieren al mutante una ventaja en su crecimiento bajo determinadas condiciones ambientales, y son especialmente tiles en investigacin gentica.

Tipos de mutaciones:
Las mutaciones, espontneas o inducidas, surgen por cambios en la secuencia del cido nucleico del genoma de un organismo. Una mutacin puntual, surgida por cambio en un solo par de bases, puede ocasionar diferentes consecuencias: Mutacin por cambio de sentido: Ocasiona un cambio en la secuencia de aminocidos del polipptido resultante, por lo cul la protena producida podra ser inactiva o tener actividad reducida. Mutacin sin sentido: Se forma un codn de stop, que causa la terminacin prematura de la traduccin, originando una protena incompleta que, casi seguro, no sera funcional. Mutacin silenciosa: Aunque se haya producido mutacin, el triplete sigue codificando para el mismo aminocido, por lo cul se origina la misma protena.

Las deleciones e inserciones causan efectos ms notables en el DNA, incluyendo mutaciones por desfase de lectura y, con frecuencia, una prdida completa de la funcin gnica.

 Mutagnesis:
Los mutgenos son agentes qumicos, fsicos o biolgicos que incrementan la frecuencia de la mutacin. Los mutgenos pueden alterar el DNA de muchas y diversas maneras. Sin embargo, las alteraciones en el DNA no son mutaciones a menos que sean heredadas. Algunos daos en el DNA conducen a la muerte celular si no se reparan. Mutgenos qumicos: Existen varias clases. Algunos son anlogos a las bases ya que se parecen estructuralmente a las bases pricas y pirimidnicas del DNA pero muestran propiedades errneas de apareamiento. Radiacin: Uno de los efectos es la induccin de dmeros de pirimidina en el DNA, un estado en el que dos bases pirimidnicas adyacentes (citosina o timina) se unen covalentemente, de manera que se incrementa en gran medida la probabilidad de que durante la replicacin del DNA, la DNA polimerasa inserte un nucletido incorrecto en posicin.

El test de Ames emplea un sistema de ensayo bacteriano para determinar mutgenos qumicos en el ambiente. Consiste en determinar si el mutgeno sospechoso aumenta la frecuencia de mutaciones hacia atrs en cepas bacterianas que son auxotrofas para algn nutriente.

Recombinacin gentica:
La recombinacin gentica comprende un intercambio gentico entre secuencias homlogas de DNA de dos orgenes diferentes (aunque tal recombinacin puede ocurrir entre secuencias homlogas en el mismo cromosoma). La recombinacin es un importante proceso evolutivo, y las clulas tienen mecanismos especficos para asegurar que ocurre recombinacin. Los mecanismos de recombinacin que tienen lugar en procariotas implican transferencia de DNA durante los procesos de trasformacin, transduccin y conjugacin.

b) Tcnicas de gentica bacteriana

Transformacin:

in vivo :

La transformacin gentica es un proceso por el que el DNA libre se incorpora en una clula receptora y lleva a cabo un cambio gentico. El descubrimiento de la transformacin gentica en bacterias fue uno de los acontecimientos ms destacables en biologa, ya que condujo a experimentos que el DNA es el material gentico. Puesto que el DNA de los procariotas est presente en la clula como una gran molcula nica, cuando la clula se lisa en condiciones suaves, el DNA sale y se extiende. Normalmente, una clula incorpora solo uno o unos cuantos fragmentos de DNA, de modo que, en un nico suceso de transformacin, slo se puede transferir de una clula a otra una pequea cantidad de genes. Una molcula que es capaz de tomar una molcula de DNA y ser transformada se dice que es competente.

Transduccin: En la transduccin, el DNA se transfiere de una clula a otra mediante un virus. La trasferencia gentica de genes del husped por virus puede ocurrir de dos maneras:
Transduccin generalizada: Partculas virales defectivas incorporan al azar fragmentos de DNA celular; prcticamente cualquier gen del donador puede ser transferido, pero la eficacia es baja. Transduccin especializada: El DNA de un virus atemperado se escinde incorrectamente y se lleva con l genes adyacentes del hospedador; slo se introducen genes cercanos al punto de integracin, pero la eficacia puede ser alta.

 Conjugacin:
Los plsmidos son generalmente elementos que se replican independientemente del cromosoma hospedador. A diferencia de los virus, los plsmidos no tienen forma extracelular y existen dentro de las clulas como cidos nucleicos. La informacin gentica que llevan los plsmidos no es esencial para clula en todas las condiciones, pero puede representar una ventaja selectiva para el crecimiento bajo ciertas condiciones. Los ejemplos incluyen la resistencia a los antibiticos, enzimas para la degradacin de compuestos orgnicos, y rutas metablicas especiales. Algunos plsmidos se transfieren de clula a clula por un mecanismo llamado conjugacin. La conjugacin es un mecanismo de transferencia de DNA en procariotas que requiere contacto clula a clula, lo que se lleva a cabo mediante el denominado pili sexual. La conjugacin est controlada por genes localizados en ciertos plsmidos y, generalmente, consiste en la transferencia del plsmido desde una clula donadora a una receptora. Sin embargo, a veces se pueden movilizar y transferir otros elementos genticos, incluido el cromosoma de la clula donadora. La transferencia del cromosoma del hospedador es rara vez completa pero puede utilizarse para mapear el orden de los genes en el cromosoma. La transferencia horizontal de genes consiste en la transmisin del genoma o parte de ste de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia. Por el contrario, el tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproduccin sexual. Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugacin bacteriana, descubierto a mediados del siglo pasado, en la que una clula transfiere informacin gentica a otra diferente con la mediacin de plsmidos. Estos procesos son muy importantes como fuente de variacin gentica, equivalentes en cierto modo a la recombinacin cromosmica de los organismos con reproduccin sexual. Sin embargo, la HGT en bacterias ira ms all, dado que tambin se produce transferencia gentica entre especies alejadas filogenticamente, lo cual permite la formacin de genomas extraordinariamente heterogneos y dinmicos.

Transposicin:
El orden exacto de los genes en un cromosoma no est permanentemente fijado de modo necesario; algunos genes pueden moverse bajo ciertas condiciones. El proceso por el que cul un gen se mueve de un sitio a otro se llama transposicin. Adems, no todos los genes son capaces de transposicin. Ms bien, la transposicin de los genes est unida a la presencia de elementos genticos especiales llamados elementos transponibles. Las secuencias de insercin son el tipo ms simple de elemento transponible y no llevan otra informacin gentica que la requerida para desplazarse a nuevos lugares. Las secuencias de insercin son segmentos cortos de DNA que pueden insertarse en sitios especficos del genoma. Los transposones son ms largos que las secuencias de insercin y llevan otros genes, algunos de los cules confieren propiedades importantes al organismo que lo lleva. stos incluyen con frecuencia marcadores de resistencia a drogas y otros genes fcilmente seleccionables. Hay transposones conjugativos que tienen genes que les permiten no slo moverse de un sitio a otro del genoma bacteriano, sino tambin transferirse de una bacteria a otra. Si el sitio de insercin de un elemento transponible est dentro de un gen, la insercin del transposn dar como resultado la prdida de la continuidad lineal del gen, originando una mutacin. Los transposones representan, por tanto, un medio fcil de crear mutantes a lo largo del cromosoma. El elemento ms adecuado para la mutagnesis por transposn es el que contiene un gen de resistencia a un antibitico.

c)

Tcnicas de gentica bacteriana in vitro :

Enzimas de restriccin:
Los procariotas tienen enzimas de restriccin y modificacin cuyas funciones parecen proteger a las clulas de DNA extrao, tal como DNA viral. Las enzimas de restriccin son enzimas celulares que reconocen secuencias especficas cortas en el DNA y producen un corte en cada una de las cadenas sencillas, tan cercanos entre s, que el resultado es un corte en la doble cadena del DNA. Los productos de la digestin con una enzima de restriccin pueden separarse mediante electroforesis en gel.

Secuenciacin del DNA:

El DNA puede secuenciarse por el mtodo de Sanger, que implica copiar el DNA que se va a secuenciar, pero utilizando dideoxinucletidos que terminan la cadena. Los productos finales se separan por electroforesis y se leen las secuencias. Los iniciadores de DNA cortos requeridos por este mtodo pueden sintetizarse qumicamente.

Clonacin molecular:
La clonacin molecular est en la base de la mayora de los procedimientos de ingeniera gentica. Su finalidad es aislar grandes cantidades de genes especficos o fragmentos cromosmicos de forma pura. El aislamiento de un gen especfico o regin de un cromosoma por clonacin molecular se hace generalmente usando un plsmido o virus como vector de clonacin (elemento gentico en el que los genes pueden replicarse y recombinarse). Las enzimas de restriccin y la DNA ligasa se utilizan en un proceso de recombinacin in vitro para producir la molcula de DNA hbrido. Una vez introducido en un hospedador adecuado, el DNA diana puede ser producido en grandes cantidades bajo el control del vector de clonacin.

Los plsmidos como vectores de clonacin:

Los plsmidos como vectores de clonacin son tiles porque son fciles de aislar y purificar, y son capaces de multiplicarse en un nmero de copias alto, en las clulas bacterianas. Los genes de resistencia a antibiticos de los plsmidos se utilizan para identificar las clulas bacterianas que contengan el plsmido.

Amplificacin del DNA: PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa, un procedimiento para amplificar el DNA in vitro, hace uso de la DNA polimerasa estable al calor de procariotas termoflicas. El calor se utiliza para desnaturalizar el DNA en dos molculas monocatenarias, cada una de las cules es copiada por la polimerasa. A partir de un pequeo oligonucletido que acta de iniciador para amplificar el DNA diana, la polimerasa copia el DNA completo al que se asocia el iniciador. Tras un nico ciclo de copia, las dobles cadenas formadas se separan de nuevo mediante el calor, y se permite un nuevo ciclo de copia. Tras cada ciclo termal, la cantidad de DNA diana se duplica.