Brucelosis bovina

Dra. Silvia Marcela Estein, Laboratorio de Inmunologa, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del centro de la Pcia. de Buenos Aires, Tandil, E-mail: silmares@vet.unicen.edu.ar

La brucelosis y las bacterias que componen el gnero Brucella La brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa de distribucin mundial que afecta a diferentes especies de animales domsticas, de vida silvestre y al hombre; cuyos agentes etiolgicos son las bacterias del gnero Brucella. Dentro del gnero se reconocen seis especies clsicas, cada una de las cuales tiene un hospedador principal: B. abortus (bovinos), B. canis (caninos), B. melitensis (caprinos), B. neotomae (rata del desierto), B. ovis (ovinos) y B. suis (porcinos). En los ltimos aos, han sido identificadas nuevas especies lisas: B. pinnipedialis, B. ceti, B. microti y B. inopinata aisladas de pinnpedos, cetceos, topillos campesinos y de implantes en humanos, respectivamente. Dentro del gnero de las seis especies clsicas, cuatro son patgenas para el hombre. ste adquiere la infeccin a partir de los reservorios animales principales; por ello la brucelosis es considerada una enfermedad zoontica. Las especies no zoonticas son: B. ovis y B. neotomae. En el caso de las bacterias aisladas de mamferos marinos se ha informado su transmisin al hombre por el contacto con material infeccioso en el laboratorio y no se puede descartar un posible contagio por el consumo de carne cruda de mamferos marinos. Brucelosis bovina La brucelosis bovina es una enfermedad infectocontagiosa que provoca importantes prdidas econmicas en la produccin pecuaria debido a problemas reproductivos que ocasiona en los bovinos (placentitis, abortos, nacimiento de neonatos dbiles, metritis e infertilidad), con menores rendimientos en kg de carne y litros de leche que ello conlleva. Epidemiologa Los bovinos infectados eliminan Brucella al medio, contaminando el ambiente (pastos, aguas, establos). La eliminacin es particularmente importante durante el aborto o los partos 14 infecciosos, habindose numerado cifras tan altas como 10 UFC Brucella/g. de tejido cotiledonario de vacas. En estos casos, los loquios, la orina, la leche y los fetos estn infectados. La eliminacin de la bacteria es importante durante los 45 das post-parto. La leche tambin constituye una va de eliminacin importante, y fuente principal de infeccin para el hombre. En el medio, Brucella sobrevive por periodos relativamente largos. En suelo hmedo y el estircol usado como abono, se registran tiempos de sobrevida de hasta 80 das. En el polvo, segn la humedad ambiente, entre 15 a 40 das. Esto hace que Brucella pueda diseminarse eficientemente de un medio infectado a uno indemne; los recipientes de leche o agua, las camas, los instrumentos contaminados, los zapatos, perros y aves le sirven de vehculo. Adems hay numerosas especies salvajes (liebres, zorros, que pueden infectarse, mantener y transmitir la infeccin a los animales domsticos. Los neonatos pueden adquirir la infeccin in utero o al nacer. En algunos casos, las hembras pueden contraer una brucelosis latente, la cual, epidemiolgicamente es de especial peligrosidad ya que, siendo indetectable por las pruebas de diagnstico habituales, pueden terminar abortando en su primera gestacin. 1

La enfermedad en el hombre es un reflejo de la situacin en los animales, ya que l mismo interviene como un husped accidental. Se pueden distinguir dos casos; en la poblacin general, la infeccin sobreviene en general por consumo de productos lcteos contaminados. En la poblacin de alto riesgo, la infeccin se produce por estrecho contacto con el animal infectado, siendo el caso de los veterinarios, criadores, empleados de mataderos y laboratoristas; estos ltimos tambin pueden infectarse al manipular cultivos de Brucella. Por este motivo,la brucelosis es pues considerada legalmente como una enfermedad profesional. Estructura antignica de Brucella Los microorganismos del gnero Brucella son cocobacilos Gram negativos, no esporulados, acapsulados, carentes de pilis o flagelos. Poseen una envoltura celular caracterstica: la membrana externa (ME), la membrana interna y un espacio periplsmico intermedio. Antgenos de la membrana externa En la membrana externa existen dos grupos de molculas bien caracterizadas: el lipopolisacrido (LPS) y las protenas de la membrana externa. Las especies de Brucella pueden ser clasificadas como lisas (smooth, S) o rugosas (rough, R) en base al aspecto de las colonias obtenidas por cultivo en medio slido. Las especies patgenas para el hombre son: B. melitensis, B. abortus y B. suis, las cuales poseen fenotipo liso; constituye la excepcin B. neotomae que siendo lisa es totalmente avirulenta. Las especies rugosas estables o naturalmente rugosas son: B. canis y B. ovis, las cuales son virulentas para sus hospedadores habituales y en el caso de la primera tambin para el humano. En cepas salvajes de B. abortus al igual que en la vacuna B. abortus S 19, el LPS-S presenta una estructura polisacardica expuesta: la cadena O (polisacrido O: PSO). Esta cadena se encuentra ausente en el LPS-R de las especies rugosas. El PSO es el antgeno (Ag) inmunodominante de superficie, capaz de inducir una respuesta humoral (Ac) en la mayora de los animales en contacto con especies lisas de Brucella. Por otro lado, el PSO posee epitopes compartidos con otras especies bacterianas como Yersinia enterocoltica O:9, Vibrio cholerae, Salmonella landau, Escherichia coli O:157 H7 responsables de reactividad cruzada en las pruebas serolgicas que se basan en la deteccin de Ac contra este Ag. Las OMPs de Brucella se clasifican en mayores y menores de acuerdo con su abundancia relativa, hallndose ambas intercaladas en la membrana y estrechamente unidas al LPS por fuerzas hidrofbicas. A travs de diferentes estudios se ha confirmado la inmunogenicidad de las OMPs y su posible empleo como antgenos candidatos a la constitucin de vacunas subcelulares. Respuesta inmunitaria La respuesta inmunitaria del husped a la infeccin por Brucella es variable, dependiendo de varios factores, a saber: (i) del husped (idiosincrasia, edad, sexo, estado reproductivo (gestacin o vacuidad)), (ii) estado inmunitario (exposicin previa, vacunacin) y (iii) del agente (dosis infectante, virulencia de la cepa). Luego de la infeccin por B. abortus, la respuesta serolgica se manifiesta de cuatro a diez semanas o ms tardamente. La infeccin crnica se caracteriza en el bovino por la sntesis prolongada de Ac de clase o isotipo IgG1. Los niveles de Ac IgG2 pueden variar de acuerdo adems con el individuo, en tanto que los de Ac IgG1 sufren una disminucin en el perodo prximo al parto, debido a la derivacin suero-calostro propia de esta Ig en el vacuno. En los animales infectados, en la leche pueden aparecer Ac de origen srico (IgG1) as como de origen local (IgM e IgA).

Por otro lado, tras la vacunacin de las terneras a los 3-8 meses con Brucella abortus S19, la serologa se vuelve positiva a la primera o segunda semana, con un predominio de Ac de clase IgM durante las primeras dos semanas. La respuesta a IgG comienza tambin tempranamente, antes de que la IgM llegue a su pico, pudiendo alcanzar su mximo entre la tercera semana y el mes. En general, tras la vacunacin de las hembras prepberes sanas, los niveles de Ac declinan hasta niveles no significativos en el trmino de tres a seis meses, es decir, para el momento de su entrada en servicio. Los Ac residuales de la vacunacin son en general de clase IgM. De acuerdo a lo expuesto, los isotipos de Ig generados por la infeccin o la vacunacin son los mismos pero la persistencia en ambos casos es diferente. Esto ha permitido establecer en nuestro pas un programa de control mdico-sanitario con vacunacin y descarte de reactores serolgicos. Por lo tanto la presencia de IgG en el animal no vacunado es indicativa de infeccin, en tanto que en el vacunado debera considerarse: el tiempo transcurrido entre la vacunacin y la sangra, la edad del animal en el momento de la vacunacin y la presencia de Brucella en el rodeo. Los microorganismos como Brucella, capaces de establecer una infeccin intracelular persistente, son potentes inductores de respuestas inmunitarias mediadas por clulas. Estas han sido estudiadas utilizando pruebas in vitro e in vivo. Estas respuestas son detectables antes de la aparicin de los Ac sricos. Sin embargo, el empleo de este tipo de pruebas no ha permitido diferenciar animales vacunados de infectados, ni resolver el problema de las reacciones cruzadas. Patogenia En los bovinos la infeccin se adquiere mayormente por va oral, nasal o conjuntival. Luego de haber atravesado las mucosas (o la piel lesionada) Brucella se localiza en los linfondulos regionales (retrofarngeos, parotdeos y submaxilares entre los ms frecuentes) para de all diseminarse hacia otros rganos linfoides como el bazo, los ganglios iliacos y los retromamarios. El perodo de incubacin est relacionado con el estado fisiolgico de la hembra. En la hembra no gestante, la infeccin permanece localizada en los ganglios retromamarios; durante la gestacin, Brucella invade el tero en donde se multiplica masivamente. All provoca una endometritis con ulceracin de los espacios intercotiledonarios y compromiso del alantocorion, de los cotiledones placentarios y de los lquidos fetales. Los fetos desarrollan hiperplasia linfoide, deplecin tmica y neumona hematgena. En el caso de una primoinfeccin, el proceso culmina de modo caracterstico por el aborto durante el ltimo tercio de la gestacin. La retencin de placenta y la metritis son secuelas frecuentes. El aborto es menos observado en gestaciones subsiguientes, aunque las hembras quedan infectadas, eliminando Brucella con cada parto. Los neonatos pueden infectarse in utero, originando las denominadas brucelosis "latentes". En el macho, la enfermedad se caracteriza por orquitis y/o epididimitis y a menudo tambin prostatitis y seminovesiculitis. En ocasiones se producen artritis y sinovitis no supurativas. Aspectos clnicos En los bovinos, la enfermedad pasa desapercibida, siendo el nico signo clnico el aborto, el cual se produce durante el ltimo trimestre de la gestacin. Las cras pueden nacer prematuramente muertas o dbiles. En general hay retencin de secundinas, con los signos asociados a una metritis. En los machos, suele estar afectado el tracto reproductor, con orquitis unilateral o bilateral y frecuente compromiso de la prstata y vesculas seminales. Adems, pueden observarse sinovitis y artritis, en especial del miembro posterior. Control de la brucelosis bovina El Programa Nacional de Control y Erradicacin de la brucelosis bovina que lleva cabo SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria) se basa en la deteccin de los

animales infectados a travs de la serologa (y/o bacteriologa), eliminacin de los reaccionantes y vacunacin de los animales indemnes. Diagnstico de laboratorio Diagnstico serolgico - Extraccin y envo de las muestras de sangre A continuacin se detallan algunos requisitos a cumplir para la remisin de una muestra de buena calidad: - los tubos para la extraccin deben estar limpios, secos y bien tapados. Adems, deben estar adecuadamente rotulados (nmero de identificacin del animal muestreado) en el cuerpo mediante el empleo de marcador indeleble o cinta de enmascarar. - una vez extrada la muestra (un volumen de 4 ml.), la sangre se dejar coagular hasta que se produzca la exudacin del suero durante una 6-8 h. sta se conservar en heladera (no congelar) hasta su envo al laboratorio en un plazo no mayor a las 18 h. - las muestras debern ir acompaadas con un formulario que deber ser completado en letra de imprenta. - Pruebas serolgicas Las pruebas serolgicas dan una evidencia indirecta de la infeccin por Brucella. Cuando stas se efectan en forma uniforme y se las interpreta con criterio epidemiolgico constituyen la herramienta ms prctica para el diagnstico. Todas las pruebas serolgicas no detectan los distintos isotipos de Ig con la misma eficiencia. La Tabla 1 presenta en forma resumida la participacin de las Ig en las distintas tcnicas consideradas pruebas oficiales dentro del Plan Nacional de Control y Erradicacin de la Brucelosis Bovina. Estas tcnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organizacin para la Alimentacin y la Agricultura (FAO), Organizacin Internacional de Epizootias (OIE) y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Tabla 1. Actividad de los Ac segn isotipo en distintas pruebas serolgicas que utilizan como antgeno suspensiones de Brucella abortus en fase lisa

Isotipos Prueba BPA SAT 2-ME FC PAL IgM +/+ IgG1 + + IgG2 + + IgA -

+/-

Notas: (+) activa, (+/-) poco activa, (-) inactiva.

La semejanza antignica, a nivel del LPS-S entre las vacunas y las cepas salvajes explican en parte las respuestas sricas similares provocadas en el animal por la vacunacin o por una 4

infeccin. Esto complica la diferenciacin por serologa de los animales infectados y los sanos vacunados. Es por ello que en brucelosis existe una variedad importante de pruebas destinadas no solo a detectar el mayor nmero de animales infectados (sensibilidad) sino, al mismo tiempo, de hacer la distincin entre los animales infectados y los vacunados as como con las reacciones cruzadas (especificidad). Las pruebas de la Tabla 1 son las llamadas pruebas convencionales y adoptadas por SENASA. stas utilizan antgenos celulares constituidos por suspensiones de Brucella abortus inactivadas en fase lisa. La prueba del BPA ("buffered plate antigen") es una prueba de aglutinacin rpida en placa cuyo antgeno tiene pH 3,65-3,8. En esas condiciones, son esencialmente detectados los Ac de clase IgG1. Esta prueba se emplea como tamiz o criba, dada su alta sensibilidad, bajo costo operativo y sencillez. Dentro de las pruebas complementarias, la prueba de seroaglutinacin lenta en tubo (SAT) es una prueba semi-cuantitativa, que se desarrolla a pH neutro, muy sensible a Ac de clase IgM detectando tambin IgG2. Su especificidad y sensibilidad son relativamente bajas. Esta prueba se realiza en forma pareada con la prueba del 2-mercaptoetanol que est orientada a neutralizar la actividad aglutinante de los Ac de clase IgM, los cuales predominan tras una vacunacin, mediante la despolimerizacin reductora de esta Ig. La prueba de Fijacin de Complemento (FC) aparece como la menos afectada por los Ac residuales post-vacunacin. En este sentido puede considerarse como la ms especifica, y sigue siendo "la prueba" de referencia en brucelosis a nivel internacional y por otro lado es la prueba confirmatoria en nuestro pas. La Prueba del Anillo en Leche (PAL o ring-test) es utilizada para la vigilancia de los rodeos sanos y para el diagnstico en medio infectado. Cuando se la realiza frecuentemente en leche mezcla -leche de tanque-, permite la deteccin de un gran nmero de animales positivos y, lo que es tambin muy importante, con una precocidad superior respecto de las pruebas realizadas en suero. Evidentemente, esta prueba est restringida a las hembras en lactancia. Puede ser tambin usada individualmente con el fin de identificar las vacas positivas. En la actualidad hay un gran nmero de pruebas serolgicas disponibles para el diagnstico de la brucelosis y se siguen agregando nuevas tcnicas a medida que avanza la investigacin. En los ltimos aos se han validado las pruebas inmunoenzimticas que emplean LPS como antgeno (ELISA indirecto y ELISA competitivo) y la polarizacin fluorescente que poseen mayor sensibilidad y especificidad en relacin a las pruebas convencionales antes mencionadas. Estas tcnicas han sido incorporadas desde el ao 2006 al Plan Nacional de Brucelosis por el SENASA. - Cules son los animales que deben examinarse? Deben sangrarse las hembras mayores de 18 meses y los machos enteros mayores de 6 meses. A continuacin se presentan las tablas de decisin de acuerdo a la reglamentacin vigente en Argentina. Tabla 2. Tabla de decisin (Hembras vacunadas mayores de 18 m) BPA + + + + + + + WRIGHT/SAT NSH 50UI 25 a 50 UI I 100UI 100 UI I 200 UI 200 UI I 50 UI 2ME NSH I25 UI I 50 UI CONDICIN Negativo Negativo Negativo Sospechoso Sospechoso Sospechoso Positivo Positivo 5

Tabla 3. Tabla de decisin (Machos mayores de 6 m) BPA + + + + Referencias I = Incompleto NSH = No se hace UI = Unidades Internacionales + = Positivo = Negativo Un animal SOSPECHOSO debe ser sangrado nuevamente a los 30 das, luego de lo cual se definir la categora de POSITIVO O NEGATIVO, segn los resultados obtenidos. De no definirse el diagnstico deber considerarse como POSITIVO y someterse a pruebas confirmatorias (fijacin de complemento) en el Laboratorio Central de la Direccin de Laboratorios (DILAB). Diagnstico bacteriolgico El diagnostico bacteriolgico, a travs del aislamiento de Brucella de lquidos o tejidos orgnicos, constituye el nico diagnstico de certeza. Sin embargo, este mtodo no se presta para su empleo en gran escala como se requiere en un Programa de Control. Este tipo de diagnstico es til cuando se producen abortos en un rodeo sin historia conocida de brucelosis o para el examen de toros reproductores cuyo semen se emplear para inseminacin artificial. - Toma y remisin de muestras para bacteriologa Las muestras a remitir deben ser enfriadas inmediatamente luego de su extraccin, y en caso de enviarse a sitios alejados (12 h. o ms de viaje) deben congelarse. stas deben transportarse en recipientes impermeables en el que ir la muestra envuelta, rodeado de un material absorbente y todo acondicionado en un recipiente slido apto para su transporte. Las principales muestras para cultivo y aislamiento a partir de animales vivos son: leche, flujo vaginal, membranas fetales, placenta, lquido de higroma y semen. En el caso de fetos abortados, las muestras de eleccin son el contenido abomasal, pulmn y bazo. En la necropsia de las hembras se tomarn muestras de linfondulos craneales, bazo, hgado, tero, mamas, linfondulos retromamarios, testculos, epiddimos, vesculas seminales y linfondulos inguinales en los machos. Una vez en el laboratorio se realizar la observacin de los frotis o improntas por coloracin y la siembra de los homogenatos de los tejidos slidos o la siembra directa (lquidos) en medio de cultivo slido adecuado para el crecimiento de Brucella. Vacunacin En el ao 1966 comienzan en Argentina las acciones contra la brucelosis bovina a travs de la obligatoriedad de la vacunacin de las terneras. En nuestro pas, la vacuna oficialmente WRIGHT/SAT NSH 25 UI 50 UI 100 UI 25 UI 2ME NSH 25 UI CONDICIN Negativo Negativo Sospechoso Positivo Positivo

aprobada para el control de la brucelosis bovina es una cepa viva atenuada: B. abortus S19. sta se aplica en forma simultnea con la vacuna contra fiebre aftosa. La cepa 19 tiene baja patogenicidad y buena inmunogenicidad. Con el fin de reducir la probabilidad de reacciones serolgicas post-vacunales prolongadas, esta vacuna se administra obligatoriamente a las terneras entre los 3-8 meses de edad, una sola vez en la vida. Esta vacuna confiere proteccin relativa contra el aborto y la infeccin y no protege a los animales en perodo de incubacin. El empleo de esta vacuna tiene algunos inconvenientes ya que carece de inocuidad para las hembras gestantes (posibles abortos) y para los machos (puede provocar infecciones genitales crnicas). Por otro lado, la inmunizacin del bovino con B. abortus cepa 19 induce la formacin de Ac que pueden confundir el diagnstico en el caso de que la vacuna sea aplicada fuera de las edades establecidas. Adems, esta cepa puede potencialmente infectar al hombre en el que puede provocar un cuadro clnico similar al provocado por la infeccin con una cepa patgena de campo. Debido a estas desventajas existen diferentes lneas de investigacin orientadas a la bsqueda de nuevas vacunas (vacunas subcelulares o vacunas atenuadas por ingeniera gentica). Aplicacin y precauciones en su uso Dado que la vacuna es una cepa viva atenuada, sta debe conservarse y trasladarse manteniendo una adecuada cadena de fro. Una vez reconstituida debe homogeneizarse adecuadamente y aplicarse inmediatamente. Los frascos vacos deben incinerarse o esterilizarse por ebullicin durante 10 minutos. Se recomienda el uso exclusivo de jeringas para la vacunacin de las terneras con cepa 19 o la correcta desinfeccin y lavado de las mismas en caso de ser utilizadas para otra vacunacin o administracin de frmacos (Ej: hipoclorito de sodio al 10%, amonios cuaternarios al 0,5%, iodados al 1%, o hervido de jeringas). Tratamiento Debido a las caractersticas del control de la brucelosis en los rumiantes, al costo y a la dificultad en diagnosticarla con certeza y evaluar la eficacia (aislamiento del germen), el tratamiento antibitico no se realiza en dichas especies. En el hombre, son utilizados varios antibiticos, solos o en forma combinada, de acuerdo, esencialmente, al tiempo y grado de evolucin de la enfermedad. El tratamiento en el hombre busca reducir la morbilidad, acortar la duracin del proceso y disminuir la incidencia de complicaciones. En los casos agudos, se utiliza el cloruro de tetraciclina o la doxiciclina, agregndose adems la estreptomicina. Otra prescripcin combina el trimetoprim con el sulfametoxazol. En todos los casos, se recomienda un mnimo de tres semanas de tratamiento. En las complicaciones propias de la evolucin crnica, como las osteomielitis, se pueden utilizar los mismos antibiticos, prolongando su administracin (en algunos casos, por un mnimo de 6 semanas). Bibliografa Alton G.G., Jones L.M., Angus R.D. and Verger J.M., 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. INRA, Paris. Bowden R.A., Baldi P.C., Cassataro J., Comerci D.J., Estein S., Fossati C.A., Giambartolomei G.H., Goldbaum F.A., Wallach J.C.Brucella, In: Microbiologa Veterinaria. 2007. Editor Jefe: Nestor Oscar Stanchi. Editores: Pablo Eduardo Martino, Elida Gentilini, Enzo Hugo Reinoso, Mara Gabriela Echeverra, Edgardo Nosetto, Enrique Peninmpede, Nlida Leardini, Julio Copes. Editorial Intermdica, Buenos Aires. Captulo 39, p. 281-293. Segunda Edicin.Estein, S.M. 2006. Brucelosis: Inmunidad y vacunacin (revisin bibliogrfica). Revista Electrnica de Veterinaria (REDVET). Vol. VII, N 5. 1-25.

Garcia-Carrillo, C., 1987. La brucelosis de los animales en Amrica y su relacin con la infeccin humana. O.I.E., Paris. Nielsen K.H. and Duncan J.R. (eds.), 1990. Animal brucellosis. C.R.C. Press, Boca Ratn. Manual diagnsotico serolgico de la brucellosis bovina 2009. SENASA.