CAPTULO 2.1.9.

LEPTOSPIROSIS

RESUMEN
La leptospirosis es una enfermedad transmisible de los animales y de los humanos causada por cualquiera de los miembros patgenos del gnero Leptospira. El diagnstico de laboratorio de la leptospirosis puede ser complejo e implica pruebas que se dividen en dos grupos. Uno de los grupos de pruebas est diseado para detectar los anticuerpos antileptospiras, el otro est diseado para poner en evidencia las leptospiras, antgenos de leptospiras o cidos nucleicos de leptospiras en tejidos animales o en fluidos corporales. El conjunto de pruebas concretas seleccionadas depende del objetivo de la prueba (por ejemplo, los estudios de rebaos o el diagnstico en un animal aislado) y de las pruebas o de la experiencia de la que se disponga en la zona. Identificacin del agente: El aislamiento y la deteccin de las leptospiras en: a) los rganos internos (como el hgado, el pulmn, el cerebro y el rin) y en los fluidos corporales (la sangre, la leche, los fluidos cerebroespinal, torcico y peritoneal) de los animales infectados clnicamente proporciona un diagnstico definitivo de la enfermedad clnica aguda o, en el caso de un feto, de la infeccin crnica de la madre. el rin, la orina o en el tracto genital de animales sin sntomas clnicos solo es un diagnstico de un estado de portador crnico.

b)

El aislamiento de leptospiras a partir de material clnico y la identificacin de los aislamientos constituyen procesos de larga duracin, y se realizan los laboratorios de referencia especializados. El aislamiento seguido de la tipificacin a partir de portadores renales es muy til en los estudios epidemiolgicos para determinar qu serotipos estn presentes en un grupo concreto de animales, en una especie animal o en una regin geogrfica. La demostracin de la presencia de leptospiras mediante pruebas inmunoqumicas (inmunofluorescencia e inmunohistoqumica) se adapta ms a la mayora de las condiciones de laboratorio. Sin embargo, la eficacia de estas pruebas depende del nmero de microorganismos que estn presentes en el tejido y carecen de la sensibilidad de un cultivo. A menos que se utilicen reactivos especialmente elaborados, las pruebas inmunoqumicas no identifican el serotipo infectante, y sus resultados deben interpretarse en conjunto con los resultados serolgicos. Los reactivos para inmunofluorescencia se elaboran mejor con sueros antileptospira con un ttulo alto de IgG, que no estn disponibles comercialmente. El suero de conejo o los anticuerpos monoclonales para la tipificacin de leptospiras pueden utilizarse para las pruebas inmunohistoqumicas y estn disponibles en los laboratorios de referencia de leptospiras. La presencia de material gentico de leptospiras en los tejidos o en los fluidos corporales se puede demostrar empleando diversas pruebas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), bien sea en tiempo real o en formatos clsicos. Los ensayos de la PCR son sensibles, pero los procedimientos de control de calidad y el procesamiento de las muestras para la PCR son cruciales y deben adecuarse al tejido, al fluido y a la especie que se est analizando. Al igual que ocurre con las pruebas inmunoqumicas, con las pruebas de la PCR no se identifica el serotipo infectante. Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas constituyen el medio ms ampliamente utilizado para el diagnstico de la leptospirosis, y la prueba de aglutinacin microscpica (MAT) es la prueba serolgica estndar. Los antgenos seleccionados para su utilizacin en la MAT deben

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incluir las cepas representativas de los serogrupos que existen en la regin concreta, adems de aqullos que se sabe que persisten en otra regin en la especie hospedadora objeto de estudio. La MAT se utiliza principalmente para diagnosticar la enfermedad en individuos y en rebaos. Como prueba en un animal individual, es muy til para diagnosticar una infeccin aguda: el incremento de cuatro veces en los ttulos de anticuerpos en los sueros pareados de animales con infeccin aguda o convalecientes constituye un diagnstico claro. Para la obtencin de informacin til, se deben examinar al menos diez animales o el 10% del rebao, el que mayor sea, y documentar el historial de vacunacin de los animales. La MAT tiene limitaciones en el diagnstico de la infeccin crnica en los animales aislados y en el diagnstico de las infecciones endmicas de los rebaos. Los animales infectados pueden abortar o ser portadores renales y genitales mostrando ttulos de MAT por debajo del ttulo mnimo significativo ampliamente aceptado de 1/100 (dilucin final). Los enzimoinmunoensayos (ELISA) tambin pueden ser tiles para la deteccin de anticuerpos contra las leptospiras. Se han elaborado numerosos ensayos que se utilizan principalmente para la deteccin de infecciones recientes y para la seleccin de animales experimentales que se emplean en los estudios de infeccin. Los animales que han sido vacunados frente al serotipo pertinente pueden dar resultados positivos en algunos ELISA, dificultando de esta manera la interpretacin de los resultados. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Las vacunas para uso veterinario son suspensiones de uno o ms serotipos de Leptospira spp. inactivadas de tal forma que la actividad inmungena se conserva. Aunque se ha probado una gama de vacunas experimentales basadas en extractos celulares, las vacunas comerciales son, con pocas excepciones, productos con clulas completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo adecuados que contienen a menudo suero o protenas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las protenas del suero deben retirarse de los productos finales. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.

A. INTRODUCCIN
La leptospirosis es una enfermedad transmisible de los animales y del hombre producida por la infeccin con la espiroqueta Leptospira. Todas las leptospiras patgenas se clasificaron anteriormente como miembros de la especie Leptospira interrogans; sin embargo, el gnero ha sido reorganizado recientemente y las leptospiras patgenas ahora se clasifican en 17 especies y cuatro genomoespecies de Leptospira (14, 61, 71, 105). Hay ms de 200 serotipos diferentes de leptospira reconocidas que se clasifican en 23 serogrupos (52, 98). El uso, la interpretacin y el valor de los procedimientos de diagnstico de laboratorio para la leptospirosis varan segn la historia clnica del animal o del rebao, la duracin de la infeccin y el serotipo infectante. Debe sospecharse de leptospirosis aguda en los siguientes casos: aparicin repentina de agalactia (en el ganado lechero adulto y ovino); ictericia y hemoglobinuria, especialmente en los animales jvenes; meningitis; y fallo renal agudo o ictericia en los perros. La leptospirosis crnica debe considerarse en los siguientes casos: aborto, mortinatos, nacimiento de animales dbiles (pueden ser prematuros); infertilidad; fallo renal crnico o hepatitis crnica activa en los perros; y casos de oftalmia peridica en los caballos. La localizacin y la persistencia de leptospiras en el rin y en el tracto genital de los machos y las hembras son dos secuelas microbiolgicas crnicas importantes de la infeccin por leptospiras que presentan problemas de diagnstico concretos. Los animales infectados crnicamente pueden ser portadores durante toda la vida y servir de reservorios de la infeccin para otros animales y para los humanos.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

La demostracin de la presencia de leptospiras en la sangre y la leche de los animales que muestran signos clnicos que sugieren leptospirosis aguda tiene un valor diagnstico. Sin embargo, el aislamiento a partir de la sangre no es siempre satisfactorio, porque la bacteriemia es pasajera y no siempre se acompaa de sntomas clnicos. Con frecuencia, los perros se tratan con antibiticos antes de tomar las muestras para analizar la presencia de Leptospira, lo que despus disminuye la probabilidad de identificar el agente en la sangre. Tambin tiene valor diagnstico la deteccin de una infeccin generalizada por leptospira en una serie de rganos

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tomados en la necropsia. Sin embargo, si el animal vive lo suficiente o se le ha tratado con antibiticos, puede resultar difcil la deteccin sistmica de microorganismos intactos; en estos casos la inmunohistoqumica puede ser particularmente til en la identificacin del antgeno residual de leptospiras. La demostracin de la presencia de leptospiras en el tracto genital, los riones o la orina solo debe interpretarse considerando en conjunto los sntomas clnicos y los resultados serolgicos, ya que puede que estos hallazgos solo indiquen que el animal era portador. El fallo en la demostracin de la presencia de leptospiras en la orina de un animal no es suficiente para descartar la posibilidad de que este sea portador renal crnico; solo indica que el animal no excretaba cantidades detectables de leptospiras en el momento del examen. La toma de orina despus del tratamiento de los animales con un diurtico aumenta las posibilidades de detectar el microorganismo (63). En los casos importantes en los que estn implicados animales aislados (por ejemplo, la autorizacin para que un caballo semental vuelva a utilizarse como reproductor), las pruebas negativas de muestras de orina de tres semanas consecutivas se considera una buena demostracin de que el animal no elimina leptospiras por la orina. La demostracin de las leptospiras en los fluidos corporales o en los rganos internos (normalmente en el rin, el hgado, el pulmn, el cerebro o en las glndulas adrenales) de fetos abortados o nacidos muertos tiene valor diagnstico de la leptospirosis crnica de la madre, y es una evidencia de la infeccin activa del feto. El aislamiento de leptospiras por personal experimentado es el mtodo ms sensible de la demostracin de su presencia, siempre que no haya residuos de antibiticos, que no haya autolisis avanzada del tejido, que los tejidos se manejen con rapidez para realizar cultivos despus de su recogida y, en el caso de la orina, que tenga un pH adecuado. Si los tejidos o los fluidos no se pueden enviar al laboratorio inmediatamente para la realizacin de un cultivo de leptospiras, la muestra se conservar a 4-5C para impedir el crecimiento excesivo de otras bacterias y la autolisis de las muestras de tejido. Como medios de transporte para el envo de las muestras, deben emplearse un medio de cultivo lquido o una solucin al 1% de albmina srica bovina (BSA) con 5fluorouracilo a una concentracin de 100200 g/ml. El cultivo debe realizarse en un medio semislido (0,10,2% agar) con BSA o bien con Tween 80 (por ejemplo, medio Tween 80/BSA o EMJH) (44) o con BSA y una combinacin de Tween 80 y Tween 40 (30). La contaminacin se puede controlar aadiendo una serie de agentes selectivos, por ejemplo, 5-fluorouracilo (48), cido nalidxico (49), fosfomicina (64) y una mezcla de rifamicina, polimixina, neomicina, 5-fluorouracilo, bacitracina y actidiona (1). Sin embargo, el uso de agentes selectivos puede reducir las posibilidades de aislamiento cuando solo haya un nmero pequeo de leptospiras viables, y algunas cepas de leptospiras no crecern en los medios selectivos que contengan mltiples antibiticos. La adicin de suero de conejo al 0,41% a un cultivo semislido aumenta las posibilidades de aislar serotipos de leptospiras exigentes. Los cultivos deben incubarse a una temperatura de 29 1C al menos durante 16 semanas y, preferiblemente, durante 26 semanas (30). El tiempo que se requiere para la deteccin de un cultivo positivo vara con el serotipo de leptospira y el nmero de microorganismos presentes en la muestra. Los serotipos menos exigentes (por ejemplo, Pomona y Grippotyphosa) pueden dar resultados positivos muy pronto, entre 710 das despus de la inoculacin; otros serotipos (por ejemplo, Hardjo y Bratislava) pueden tardar mucho ms tiempo. Los cultivos deben examinarse con un microscopio de campo oscuro cada 12 semanas. Es importante utilizar una fuente luminosa de 100 vatios y un microscopio de campo oscuro de buena calidad. La presencia de leptospiras se puede demostrar tambin mediante una serie de tcnicas de tincin inmunoqumicas, por ejemplo, la inmunofluorescencia (10, 31) y diversas tcnicas inmunohistoqumicas (5, 33, 79, 81, 99, 106). Estas tcnicas son tiles para diagnosticar la infeccin en material patolgico que es inadecuado para la realizacin de cultivos o donde se requiere un diagnstico rpido. Puesto que el xito de estas tcnicas depende del nmero de microorganismos presentes, son menos apropiadas para diagnosticar el estado de portador crnico, donde el nmero de microorganismos puede ser muy bajo o localizado. Las leptospiras no se tien bien con los colorantes de anilina, y las tcnicas de tincin argntica carecen de sensibilidad y especificidad, aunque constituyen un complemento til para el diagnstico histopatolgico (7). Los ensayos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se emplean en la actualidad en algunos laboratorios de diagnstico y en la mayora de los laboratorios de referencia para la deteccin de leptospiras en tejidos y fluidos corporales. Se han descrito diferentes juegos de cebadores para la realizacin de ensayos de la PCR (3, 6, 13, 37, 39, 44, 50, 51, 54, 59, 60, 66, 84, 93, 97, 103), con algunos cebadores especficos para el gnero Leptospira y otros diseados para identificar solamente las especies patgenas. Estos ensayos no sirven para identificar el serotipo infectante, aunque algunos juegos de cebadores pueden permitir la identificacin de especie o de serotipo si se secuencian los amplicones de la PCR. Este anlisis adicional no es un mtodo de diagnstico rutinario. Muchos de los cebadores se han diseado y evaluado para emplearlos en los humanos en vez de en animales y se carece de un acuerdo generalizado respecto a los cebadores de la PCR que se deben utilizar para las pruebas con muestras animales. Por tanto, cada laboratorio es responsable de la validacin particular de la prueba usada para el tejido, el lquido y la especie analizada. Los ensayos de PCR pueden ser bastante sensibles, pero la carencia de especificidad (es decir, resultados positivos falsos) puede representar un

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problema. La presencia en las muestras clnicas de inhibidores de la amplificacin puede originar falsos negativos, especialmente en muestras de animales alteradas por la contaminacin con heces o autolisis. El control de calidad de los ensayos de PCR utilizados para el diagnstico de la leptospirosis requiere una atencin especial en lo que se refiere al diseo y al volumen de trabajo del laboratorio para prevenir la contaminacin de los materiales y al uso de muestras control apropiadas (29, 57). Adems, el procesamiento de la muestra para PCR es decisivo y debe ser adecuado para el tejido, el fluido y la especie que se est analizando. Un procedimiento para la preparacin de las muestras de orina para PCR en el que se emplean perlas magnticas recubiertas de anticuerpos antileptospira implica un aumento en la deteccin de leptospiras patgenas en la orina (88). La identificacin de los aislamientos de leptospiras es un cometido de los laboratorios de referencia especializados. Para realizar una identificacin completa, debe utilizarse una combinacin de procedimientos que determinen: 1) si el aislamiento es un patgeno o un saprofito; 2) la especie de Leptospira a la que pertenece el aislamiento y 3) el serogrupo y el serotipo del aislamiento. Un cultivo puro de leptospiras puede identificarse como perteneciente a una especie patgena o saprofita mediante pruebas diferentes como la capacidad de infectar animales, la resistencia relativa a la 8-azaguanina, la actividad lipasa, la tolerancia a la sal y a la temperatura (46, 47), la amplificacin del ADNr de 23S mediante PCR (102) y el contenido de G+C del ADN (46). Se han identificado nuevas especies de leptospiras basndose en el anlisis de hibridacin de ADNADN (14, 71, 105). En estos anlisis se utiliz, en la mayora de los casos, la cepa tipo para cada serotipo; para unos cuantos serotipos se han examinado tambin los aislamientos clnicos para determinar las designaciones de nuevas especies. Los diferentes aislamientos pertenecientes a un nico serotipo normalmente pertenecen a la misma especie, pero este no siempre es el caso. La identificacin de especies a partir de aislamientos de campo todava es engorrosa, pero puede hacerse mediante el anlisis de secuencias del ADNr de 16S o mediante el anlisis gentico de los genes de ARN ribosmico de 16S o 23S (17, 53, 61, 68, 70, 100, 101), por secuenciacin de varios loci gnicos (4, 77), mediante la secuenciacin del gen que codifica la subunidad B de la ADN girasa (82), o por PCR usando cebadores ompL1 que son especficos de especie (73). El serogrupo de las cepas pertenecientes a Leptospira puede diferenciarse mediante reacciones de aglutinacin cruzada (28). La diferenciacin posterior del serotipo se realiza tradicionalmente mediante la absorcin por aglutinacin cruzada, aunque para la mayor parte de los aislamientos esto se realiza ahora utilizando mtodos que requieren menos tiempo como son: el anlisis del factor (28), los anticuerpos monoclonales (MAbs) (89, 90), el anlisis con las endonucleasas de restriccin (43, 56, 91, 92), y diversas estrategias con PCR (17, 21, 26, 38, 61, 69, 70, 72, 75, 77, 78, 82, 83, 107, 108). Sin embargo, las pruebas basadas en la gentica puede que no den siempre los mismos resultados que la prueba de la absorcin por aglutinacin cruzada.

2.

Pruebas serolgicas

Las pruebas serolgicas constituyen el procedimiento de laboratorio utilizado con ms frecuencia para confirmar el diagnstico clnico, para determinar la prevalencia en el rebao y para realizar los estudios epidemiolgicos. Los anticuerpos de las leptospiras aparecen a los pocos das del comienzo de la enfermedad y persisten durante semanas o meses y, en algunos casos, aos. Desafortunadamente, los ttulos de anticuerpos puede que desciendan hasta niveles indetectables mientras los animales permanecen infectados crnicamente. Para superar este problema, se necesitan mtodos sensibles que detecten el microorganismo en la orina o en el tracto genital de portadores crnicos. Se ha descrito una amplia variedad de pruebas serolgicas que muestran grados variables de especificidad de serogrupo y de serotipo. La prueba de la aglutinacin microscpica (MAT) y el enzimoinmunoensayo (ELISA) contribuyen al diagnstico veterinario.

a)

Prueba de aglutinacin microscpica

La prueba MAT en la que se emplean antgenos vivos es la prueba serolgica ms ampliamente utilizada. Constituye la prueba de referencia frente a la que se evalan todas las otras pruebas serolgicas y se utiliza en las comprobaciones para la importacin/exportacin. Para obtener una sensibilidad ptima deben emplearse antgenos representativos de todos los serogrupos conocidos que existen en la regin en la que se han encontrado los animales y, preferiblemente, cepas que representen a todos los serogrupos conocidos. La presencia de un serogrupo normalmente viene indicada por la reaccin frecuente en la seleccin serolgica pero solo puede identificarse definitivamente por el aislamiento de un serotipo procedente de animales afectados clnicamente. Se puede mejorar la sensibilidad de la prueba utilizando aislamientos locales en vez de cepas de referencia, pero las cepas de referencia ayudan en la interpretacin de los resultados entre los laboratorios. La especificidad de la MAT es buena; normalmente los anticuerpos frente a otras bacterias no dan reaccin cruzada con Leptospira de manera significativa. Sin embargo, existen reacciones serolgicas cruzadas significativas entre serotipos y serogrupos de Leptospira y es probable que un animal infectado con un

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serotipo tenga anticuerpos frente al serotipo infectante que d una reaccin cruzada con otros serotipos (normalmente a un nivel ms bajo) en la MAT. Por tanto, la serologa no puede utilizarse para identificar definitivamente la identidad del serotipo infectante en una infeccin individual o en un brote, y requiere el aislamiento del agente. Sin embargo, en reas donde los serotipos de Leptospira presentes se han descrito bien mediante estudios de aislamiento, el examen serolgico de los animales infectados puede sugerir, aunque no definitivamente identificar, el serotipo infectante. Adems, los animales que han sido vacunados contra la leptospirosis pueden tener anticuerpos frente a los serotipos presentes en la vacuna utilizada. Por tanto, es especialmente importante considerar el historial de vacunacin de los animales objeto de estudio. Los dos mtodos para la realizacin de la prueba se han descrito detalladamente (36,62). Las estirpes seleccionadas deben cultivarse en Tween 80 BSA o en otro medio adecuado a 29 1C y el cultivo debe tener al menos 4 das, pero no ms de 8. Como antgenos se usan cultivos con densidades aproximadas a 2 108 leptospiras por ml. La densidad del cultivo puede estimarse contando directamente las clulas en una cmara de recuento de bacterias en un microscopio de campo oscuro. Alternativamente, la densidad celular se puede establecer midiendo la transmitancia en un espectrofotmetro con filtro a 400 nm o por nefelometra. Si se emplean mtodos indirectos, se debera correlacionar el nmero de clulas bacterianas con las lecturas del instrumento especfico empleado. El nmero de antgenos que se utilizan es determinado, y se puede realizar una seleccin con una dilucin del suero de 1/50 (o una dilucin de inicio diferente basada en el objetivo de la prueba). A cada pocillo se aade un volumen de cada antgeno, igual al volumen del suero diluido, para hacer una dilucin final del suero de 1/100 en la prueba de seleccin. Las placas de microtitulacin se incuban a 29 1C durante 24 horas, y se examinan mediante microscopa de campo oscuro. El ttulo de punto final se define como la dilucin de suero que muestra un 50% de aglutinacin, dejando libres un 50% de las clulas en comparacin con un cultivo control diluido 1/2 en tampn fosfato salino. El resultado de la prueba puede indicarse como el punto final de la dilucin del suero (por ejemplo, como 1/100 o 1/400) o como un ttulo que es el inverso de la dilucin del punto final del suero (por ejemplo, 100 o 400). Muchos laboratorios realizan una prueba de seleccin a una dilucin final del suero de 1/100 y despus vuelven a probar el suero con ttulos de 100 para determinar un punto final mediante diluciones dobles del suero, empezando con 1/100 hasta 1/12,800 o mayor. La identidad de los antgenos es un factor crucial al realizar la MAT. Los antgenos deben evaluarse respecto a su identidad utilizando sueros hiperinmunes de conejo, MAbs, o un mtodo molecular que confirme los pases a lo largo del tiempo, preferiblemente cada vez que se realiza la prueba, pero al menos dos veces al ao. El suero de conejo hiperinmune para este fin puede prepararse utilizando un protocolo como el ofrecido por la Subcomisin de Taxonoma de Leptospira (45). Brevemente, se seleccionan conejos sanos con un peso entre 34 kg que no tengan anticuerpos antileptospiras detectables. A cada conejo se le administra una inoculacin intravenosa de un cultivo vivo que haya crecido bien o de un cultivo clonado y tratado con formalina con una densidad aproximada de 2 108 leptospiras/ml en una vena marginal de la oreja. El cultivo debe hacerse en medio Tween 80 BSA o en otro medio apropiado. Se administran cinco inoculaciones de 1, 2, 4, 6 y 6 ml a intervalos de 7 das. Una semana despus de la ltima inoculain, se determina el ttulo del anticuerpo homlogo mediante la MAT. Si el ttulo es 1/12.800, se anestesia el conejo y se sangra mediante puncin cardiaca 7 das ms tarde (es decir, 14 das despus de la inyeccin final). Si el ttulo es <1/12.800, se administra otra inoculacin de 6 ml de cultivo; 7 das despus de esta se determina de nuevo el ttulo homlogo. El procedimiento debe repetirse con otro conejo a no ser que el ttulo sea 1/12.800. Para la preparacin de cada antisuero se utilizan dos conejos. Si los ttulos son satisfactorios en ambos conejos, los sueros se pueden mezclar. Para mantener la potencia es preferible liofilizar el antisuero en volmenes de 2 ml y conservarlo a 25C. Alternativamente, el suero se puede conservar en volmenes de 2 ml a 20. Todas las inoculaciones a los animales deben ser aprobadas y realizadas conforme a las normas establecidas para el bienestar animal. Se pueden considerar otros protocolos de inmunizacin basados en el uso del antisuero concreto. Debe comprobarse de forma regular la pureza de los antgenos utilizados en la MAT mediante el cultivo en agar sangre y en caldo de tioglicolato. Los cultivos base de antgenos se pueden almacenar a 70C o a 80C o en nitrgeno lquido. Puede que despus de la liofilizacin haya una tasa de supervivencia baja de leptospiras. El pase repetido de antgenos en medio de cultivo da lugar a una prdida de antigenicidad. En este caso, se debe hacer un nuevo cultivo lquido a partir del cultivo base. Como prueba en un animal aislado, la MAT es muy til en el diagnstico de la infeccin aguda; tiene valor diagnstico la demostracin de un aumento de cuatro veces en los ttulos de anticuerpos en muestras de pares de sueros procedentes de animales enfermos agudos y convalecientes. Adems, un diagnstico de leptospirosis puede basarse en el hallazgo de ttulos muy elevados en un animal con un cuadro clnico bien definido. La prueba tiene limitaciones en la diagnosis de la infeccin crnica en animales individuales, tanto en el diagnstico de abortos (32) como en la identificacin de portadores renales o genitales (30). Esto es particularmente cierto en las infecciones por leptospiras adaptadas al hospedador, como por ejemplo en la infeccin de ganado vacuno por el serotipo Hardjo. Cuando se toma como significativo un ttulo de 1/100 o

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superior, la sensibilidad de la prueba solo es del 41%, e incluso cuando el ttulo significativo mnimo se reduce a 1/10, la sensibilidad de la prueba solo es del 67% (30). Sirve de diagnstico la demostracin de anticuerpos en la sangre fetal pero los ttulos son con frecuencia muy bajos, por ejemplo 1/10, y se requiere un procedimiento modificado de la prueba en la mayora de los laboratorios. Puesto que la leptospirosis es un problema de rebao, la MAT tiene un uso mucho mayor como una prueba de rebao. Para obtener informacin til, Cole et al. (17) sugirieron que se tomaran muestras de al menos diez animales o del 10% del rebao, la que mayor sea. En un estudio de la infeccin por Hardjo en el ganado vacuno, Hathaway et al. (42) encontraron que normalmente una muestra de diez vacas indicaba la presencia o ausencia de infeccin en un rebao. El incremento en el tamao de la muestra mejoraba notablemente la informacin epidemiolgica, las investigaciones de la enfermedad clnica y los rastreos retrospectivos de salud pblica. Al hacer un diagnstico serolgico de la leptospirosis, deben tenerse muy en cuenta el serotipo infectante y el estado clnico implicado. En el caso del aborto inducido por el serotipo Pomona en el ganado vacuno, normalmente se encuentra un ttulo alto en el momento del aborto, debido a que el incidente clnico tiene lugar relativamente pronto despus de la infeccin. El aborto en el ganado vacuno debido al serotipo Hardjo es un hecho crnico; en este caso, la respuesta serolgica en el momento del aborto es ms variable, apareciendo algunos animales seronegativos y otros que muestran ttulos altos. El ganado vacuno puede experimentar una cada en la produccin de leche durante la fase aguda de la infeccin por Hardjo, y este sntoma clnico est asociado con ttulos altos. Tambin debe tenerse en cuenta el historial de vacunacin al interpretar los resultados de la MAT, pues la vacunacin extendida contribuye de forma importante al nmero de animales seropositivos y puede enmascarar la presencia de infecciones crnicas en el rebao, en particular por el serotipo Hardjo.

b)

Enzimoinmunoensayo
Los ELISA para la deteccin de anticuerpos antileptospira se han elaborado empleando una serie de preparaciones antignicas diferentes, protocolos de ensayo y programas de ensayo que incluyen pruebas en placa y pruebas con tiras reactivas. La informacin sobre los antgenos superficiales de Leptospira ha sido revisada (25). En general, los ELISA son bastante sensibles, pero no tienen la especificidad de serotipo de la MAT. En Europa se ha elaborado y evaluado un ELISA que cuantifica la IgG y la IgM caninas frente a varios serotipos de leptospira (40, 41). En este ensayo se detecta IgM antileptospira tan solo 1 semana despus de la infeccin, antes de que estn presentes los anticuerpos aglutinantes. Los anticuerpos IgG se detectan en los perros infectados, comenzando 2 semanas despus de la infeccin, y persisten durante largos periodos de tiempo. Por tanto, los perros con leptospirosis aguda tienen ttulos de IgM altos y ttulos de IgG relativamente bajos; los perros que estn vacunados o han tenido una infeccin previa por leptospiras tienen ttulos altos de IgG, pero bajos de IgM. Se han elaborado tambin ensayos similares para la deteccin de anticuerpos bovinos, porcinos y ovinos antileptospira (2, 19, 24, 58, 74, 8587, 94, 104). El papel ms importante asociado a ELISA en el ganado es la utilizacin de un ELISA de la IgM para la identificacin de infecciones recientes (24) y para la seleccin de rebaos en las regiones donde no se practica la vacunacin para la leptospirosis. Un ELISA de Ig total es til en la identificacin de animales muy susceptibles que es conveniente para el trabajo de infeccin experimental (34). Se han elaborado tambin ensayos ELISA para la deteccin de anticuerpos del serotipo Hardjo en la leche de vacas aisladas o en un tanque de almacenamiento de leche. Estas pruebas han sido tiles en la identificacin de rebaos infectados por Hardjo. Sin embargo, los rebaos que estn vacunados frente al serotipo Hardjo tambin darn resultados positivos en estos diferentes ELISA disminuyendo su utilidad en las regiones donde la vacunacin es una prctica rutinaria. Se han elaborado nuevas pruebas de ELISA basadas en la deteccin de anticuerpos contra protenas superficiales o lipoprotenas de Leptospira (12, 27, 55, 65, 67) pero estas pruebas no estn todava ampliamente disponibles.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Las vacunas contra la leptospirosis para uso veterinario son suspensiones de una o ms cepas patgenas de Leptospira inactivadas de tal manera que se conserva la actividad inmungena. Aunque se han probado vacunas experimentales basadas en extractos celulares (9), las vacunas comerciales son, con pocas excepciones, productos que contienen clulas completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo apropiados, que pueden contener suero o protenas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las protenas del suero deben eliminarse del producto final. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados. Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el captulo 1.1.8 son de carcter genrico y pueden complementarse mediante requisitos nacionales o regionales.

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1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Para la produccin de vacunas es de suma importancia la seleccin adecuada de las cepas. La inmunidad inducida mediante la vacunacin es en gran medida especfica de serotipo (18). Una vacuna debe formularse para su uso en una especie concreta de animal de una regin geogrfica concreta. Solo debe contener aquellos serotipos y preferentemente aquellos genotipos que causen problemas en la especie animal, o que se transmitan de una especie animal a otra en la regin. Las cepas seleccionadas para utilizarlas de cultivo de inculo original deben clonarse en un medio slido para asegurar la ausencia de contaminantes saprofitos de Leptospira y la uniformidad del cultivo. Posteriormente, deben seleccionarse las cepas adecuadas por su capacidad para crecer con alto rendimiento en las condiciones de cultivo de lotes.

b)

Mtodos de cultivo
Cada cepa componente que se incluye en la vacuna final debe cultivarse por separado en medio lquido, preferiblemente en medio libre de protenas (8, 80) o bajo en protenas (8). El volumen de cada cultivo de inculo original debe amplificarse mediante el crecimiento durante 210 das a 29 1C en una serie de subcultivos hasta que se alcance un volumen suficiente para su uso como un cultivo de inculo de produccin. Los cultivos deben airearse y agitarse cuando sea necesario. En cada subcultivo del cultivo de inculo original debe comprobarse su pureza y su crecimiento adecuado. La pureza puede comprobarse mediante la inoculacin del contenido de un asa del cultivo en placas de agar sangre o en caldo de tioglicolato para su incubacin a 37C durante 25 das, y mediante el examen de una extensin de precipitado del cultivo teida con Gram. El crecimiento se puede examinar con un microscopio de campo oscuro. Para garantizar la pureza y la homogeneidad, cada cultivo de inculo de produccin tambin debe comprobarse frente a su antisuero de conejo homlogo (28). Los MAb tambin se pueden utilizar para este fin.

c)

Validacin como vacuna

Hay una gran cantidad de informacin sobre la eficacia de las vacunas contra la leptospirosis. En la mayora de los casos, las vacunas proporcionan una proteccin importante frente a la enfermedad producida por una infeccin homloga en las condiciones de campo. Las vacunas son menos eficaces en la prevencin de la infeccin en animales, y un porcentaje de los animales vacunados se infectarn con el serotipo pertinente, y pueden eliminar el microorganismo en la orina a pesar de no presentar sntomas clnicos de la enfermedad. Los ensayos de eficacia y la validacin de vacunas deben llevarse a cabo en la especie a la que se destina la vacuna. La vacuna debe administrarse como se indica en la etiqueta, y debe comprobarse la inmunidad mediante la infeccin con cepas de campo virulentas de cada serotipo por vas las naturales de infeccin, es decir, mediante la infeccin conjuntival y/o vaginal. Los estudios de validacin se han llevado a cabo con frecuencia provocando la inmunidad mediante inoculaciones intravenosas o intramusculares de leptospiras. Las vacunas validadas de esta forma no siempre han ofrecido proteccin frente a la infeccin de campo, que tiene lugar por la exposicin de las mucosas del ojo, la boca y el tracto genital a las leptospiras. Las vacunas comerciales contra la leptospirosis que contienen el serotipo Hardjo no siempre protegen al ganado de la infeccin conjuntival o de campo con el serotipo Hardjo (11). Se ha publicado un mtodo para la comprobacin de la eficacia de las vacunas con serotipo Hardjo que especifica el uso de vas de infeccin ms naturales (35).

2.

Mtodo de produccin

La produccin se lleva a cabo mediante el cultivo de lotes en fermentadores de tamao apropiado. Estos deben estar equipados con tomas para la adicin estril del cultivo de inculo, aire y medio de cultivo. Deben contar tambin con tomas para el muestreo de forma que puedan supervisarse la pureza y el crecimiento del cultivo de produccin. Para la produccin, se emplean preferentemente los medios bajos o libres de protenas. Sin embargo, algunas cepas requieren la presencia de una protena animal para alcanzar rendimientos adecuados; esta se suministra normalmente como BSA. Todos los componentes de los medios que no se degraden por el calor deben

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Captulo 2.1.9. Leptospirosis

esterilizarse por calor. Esto reduce el riesgo de contaminacin por las leptospiras saprofitas que lleva el agua, que no son eliminadas mediante la esterilizacin por filtracin. Despus de la adicin del cultivo de inculo, se puede supervisar el crecimiento del cultivo de produccin a intervalos frecuentes en relacin al inicio de la fase logartmica del crecimiento. Una vez observado esto, entonces se agita y se airea el recipiente. El rendimiento final puede mejorarse con frecuencia mediante la adicin de ms Tween 80 al cultivo cuando se observe por primera vez la ralentizacin en el crecimiento logartmico. Un crecimiento adecuado puede requerir hasta 10 das de incubacin a 29 1C. La inactivacin se hace normalmente mediante la adicin de formalina, pero tambin se ha utilizado el fenol, el mertiolato y la inactivacin por calor. Despus de un periodo adecuado de inactivacin, el cultivo puede concentrarse y el material proteico superfluo puede eliminarse mediante ultrafiltracin. Despus se pueden mezclar volmenes iguales de las diferentes cepas que se van a incluir en la vacuna final y aadir el adyuvante y el conservante, si se considera oportuno.

3.

Control del proceso

Durante el proceso de produccin, deben tomarse submuestras de forma diaria o dos veces al da y supervisar el crecimiento de las leptospiras y la ausencia de contaminantes. El crecimiento se supervisa contando leptospiras en una cmara de recuento en un microscopio de campo oscuro o mediante un nefelmetro. La ausencia de contaminacin se puede establecer mediante el examen microscpico de preparaciones teidas con Gram de un cultivo centrifugado. Inmediatamente antes de la inactivacin, debe tomarse una muestra para su comprobacin frente a sus anticuerpos homlogos con una MAT. Debe comprobarse que el cultivo inactivado est libre de leptospiras viables. Esto se lleva a cabo inoculando alcuotas de cultivo inactivado en un medio de crecimiento apropiado como el medio de Jonson & Harris (47), incubndolo a 29 1C durante al menos 4 semanas y examinndolo semanalmente mediante microscopa de campo oscuro para detectar la presencia de leptospiras viables. Despus de realizar la mezcla, los niveles de agentes inactivantes libres, de minerales presentes en los adyuvantes (como el aluminio) y conservantes (como el tiomersal) deben estar dentro de los lmites prescritos.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las muestras seleccionadas de la vacuna completa deben examinarse para detectar la ausencia de bacterias viables y de hongos (16, 22, 23, 95). En el captulo 1.1.9 pueden encontrarse las pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los materiales biolgicos.

b)

Inocuidad
Debe comprobarse la inocuidad de muestras procedentes del producto acabado. Los mtodos para realizar esto se han descrito en otro lugar (15, 22, 96). La prueba debe llevarse a cabo para cada va de inoculacin indicada en la etiqueta y en dos animales sanos de cada categora (por ejemplo, animales en gestacin y en ganado joven) a los que va dirigida la vacuna. Los animales deben ser susceptibles a los serotipos contenidos en la vacuna y sus sueros deben estar libres de anticuerpos aglutinantes para esos serotipos. A cada animal se le administra la vacuna a travs de la va recomendada con el doble de la dosis recomendada, conforme se indica en la etiqueta. Los animales se observan durante 14 das y no deben mostrar efectos adversos locales o sistmicos atribuibles a la vacuna.

c)

Potencia
Debe examinarse la potencia de las muestras de la vacuna completa en hmsteres o cobayas. La potencia se mide normalmente por la capacidad de la vacuna para impedir la muerte del animal cuando se infecta con 10--10.000 LD50 (dosis letal 50%). Con algunos serotipos que no son letales para el hmster o el cobaya, como el serotipo Hardjo, la potencia se mide frente a la resistencia a la infeccin renal cuando los animales se infectan con 10--10.000 ID50 (dosis infecciosa 50%) o mediante la induccin de un ttulo de anticuerpos adecuado en conejos. Un ejemplo de protocolo consiste en inocular un 1/40 de la dosis de perro de la vacuna a diez hmsteres sanos de no ms de 3 meses. Despus de 1530 das, cada hmster vacunado y diez sin vacunar de la misma edad, se inocula intraperitonealmente con una cantidad adecuada de un cultivo virulento de leptospiras del serotipo utilizado para elaborar la vacuna (o una suspensin de tejido de hgado o rin

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Captulo 2.1.9. Leptospirosis

tomado de un animal infectado experimentalmente). En el caso de las vacunas bivalentes, cada serotipo se examina por separado. Para que la vacuna supere la prueba, al menos 8/10 animales vacunados deben permanecer con buena salud durante 14 das despus de la muerte de los controles. Otros protocolos pueden referirse a vacunas para ganado vacuno y porcino que contienen cinco o seis componentes. Las pruebas in-vitro de potencia para las vacunas contra la leptospirosis se estn elaborando basndose en la cuantificacin del antgeno protector de la vacuna utilizando MAb en un ELISA de captura (76). Estos ensayos se estn estandarizando empleando vacunas de referencia y la correlacin con ensayos de potencia existentes en hmsteres o basados en anticuerpos y los datos de la eficacia dianahospedador.

d)

Duracin de la inmunidad
La duracin de la inmunidad debe determinarse en la especie animal a la que la vacuna est dirigida, empleando las vas naturales de infeccin (11). La inmunidad vacunal debe persistir al menos durante 6 meses o ms, dependiendo de la indicacin de la etiqueta.

e)

Estabilidad
Cuando las vacunas se almacenan en las condiciones prescritas, se espera que estas retengan su potencia durante 12 aos. La estabilidad debe evaluarse mediante la determinacin de la potencia despus del almacenamiento a 4C, a temperatura ambiente y a 37C.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Vase la seccin C.4.b.

b)

Potencia
Vase la seccin C.4.c.

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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la leptospirosis (vase el cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la pgina Web de la OIE para conseguir la relacin ms actualizada: www.oie.int).

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