Mecanismo de cultivos de Hongos En lneas generales, todos los medios de cultivo utilizados en micologa han de contener los nutrientes

suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc). El pH ha de ser ligeramente cido para facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se aadirn antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los ms usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se aade tambin actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprofitos ambientales (aunque tiene el inconveniente de que inhibe tambin el crecimiento de Cryptococcus neoformans). Generalmente utilizaremos varios medios de cultivo diferentes, ya sea en en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja de ofrecer una gran superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratacin durante el largo perodo de incubacin a que van a ser sometidos (un mes o ms), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml). Son ms peligrosos a la hora de su manipulacin y fciles de contaminar. Por contra, los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho ms pequea, pero ofrecen mxima seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. En el momento de la siembra, y aun sabiendo que ninguna combinacin de medios de cultivo va a cubrir totalmente el abanico de posibilidades, han de seleccionarse adecuadamente los medios a utilizar en funcin del tipo de muestra y de los microorganismos fngicos sospechados. Si la muestra procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida). Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben manipularse, para mayor seguridad del tcnico y para evitar contaminaciones ambientales, en campana de flujo laminar. Han de rotularse adecuadamente, con el n de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las placas se precintan con cinta de Parafilm, en la que se realizan un par de aberturas, y los tubos se dejan con el tapn de rosca a medio cerrar (para mantener la aerobiosis) Medios para aislamientos primarios: Medio Sabouraud dextrosa (SAB)

Es el medio SAB clsico con la incorporacin de los antibiticos Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayora de bacterias. Se utiliza en tubo o en placa. Medio BHI y 10% de sangre de carnero:

El gar BHI (Brain-Heart infusion) es un medio enriquecido que facilita la recuperacin de Criptococcus neoformans (sobre todo en muestras estriles como LCR) y que se utiliza para la conversin hongo-levadura de hongos como Sporothrix sp y Paracoccidioides sp. BHI sangre C+G+C:

Los antibiticos aadidos inhiben el crecimiento de la mayora de las bacterias y hongos saprofitos (aunque tambin de algunos hongos patgenos). La incorporacin de sangre de carnero mejora el crecimiento de hongos dimrficos. Medios de Cultivo: Es donde se ponen a crecer los hongos. Se pueden usa los siguientes medios: Agar Sabouraud Agar Neopeptone-glucose-rose Bengal-aureomycin Agar Czapek (para Aspergillus, penicillium y hongos relacionedos Agar Yeast extract-malt extract-glucose Agar Diamalt (para levaduras) Preparacin y diluciones: Una vez recolectada las muestras en el campo se deben hacer diluciones de las mismas antes de sembrar en placas. Cuando se procesan muestras de agua de quebradas se deber hacer diluciones de 1/10 de la muestra original. Para muestras de agua con gran material orgnico se debern hacer diluciones de 1/100 o 1/1,000. Para muestras de suelo, utilizar diluciones de 1/1,000 o 1/10,000. Para realizar diluciones de las muestras se deber usar agua esteril y toda la cristalera tambin esteriles. Cultivo en placas: Preparar placas para cada dilucin a ser examinada. Transferir 10 ml de medio a 45 0C a placas petri de 9 cm. Aadir 1 ml de la muestra diluda y mezclar mediante rotacin de la placa. Solidificar el agar lo ms rpido possible. Tapar de inmediato las placas para evitar contaminacin. Incubacin: Incubar las placas sin invertirlas a temperatura de saln (20-24 0C) en luz, pero evitar que sea directa. Examinar y contar las colonias en las placas luego de 3, 5 y 7 das. Conteo e inventario: El conteo de hongos en una placa proveer la base para comparaciones cuantitativas entre muestras tomadas en distintas localidades. El inventario nos hablar de la abundancia de especies de hongos en la zona. Descartar placas con ms de 300 colonias. Se puede calcular el nmero de hongos por volmen de agua en las muestras y as comparar varios sitios muestreados.

El gar Sabouraud dextrosa, modificado por Emmons, contiene un 2% de glucosa y es ligeramente cido (pH=6.9), se considera el medio estndar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden aislarse en el laboratorio de micologa clnica. Es el medio estndar para observar la morfologa tpica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulacin. Este medio permite el crecimiento de actinomicetos aerobios, pero el SAB original (4% de glucosa), dificulta la recuperacin de algunos hongos, sobre todo de Blastomyces dermatitidis. Se utiliza indistintamente en tubo o en placa. Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:

# de hongos/ ml de muestra = suma del nmero de colonias en las 5 placas X dilucin de una misma dilucin. Para realizar un inventario se deber utilizar el microscopio para ver morfologa y estructuras reproductivas que ayuden en la clasificacin de las especies. Mecanismo de Cultivo de Bacterias: Tipos de medio de cultivo: Para fines practicos se puede hacer una clasificacin de los medios de cultivo de acuerdo a las siguientes caractersticas: 1. POR SU COMPOSICION QUIMICA a. Medios de cultivo empricos: Cuando sus ingredientes no tienen una formula qumica conocida. Los medios que tienen como ingredientes el extracto de carne, la peptona, las infusiones de tejidos, o productos semejantes, son empricos. Ejemplo: El caldo nutritivo: Formula Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 3g 10g 5g 1000cm3

c.

Medios Semislidos: Cuando la proporcin del ingrediente gelante es muy baja, que no permite la completa solidificacin del medio.

3.

POR SU USO a. Medios Basicos: Cuando todos sus ingredientes son sustancias nutritivas para la mayora de microorganismos. Generalmente estn constituidos por un extracto de carne, una infusin simple, peptona, sal y agua. Ejemplos: El agar nutritivo, el caldo nutritivo.

EL AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA) Triptona Soytona Cloruro de Sodio Agar Agua destilada 15g 5g 5g 15g 1000 cm3

b. El agar nutritivo: Formula Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio agar Agua destilada 3g 10g 5g 10-15g 1000cm3

Medios Enriquecidos: Son aquellos medios bsicos que han sido complementados con liquidos corporales, vitaminas especificas, aminocidos, protenas y otros nutrientes claramente definidos como tales. Ejemplo, el agar sangre, el agar chocolate, etc.

El Agar Sangre.- se prepara agregando cualquier medio bsico, a base de agar, entre 5 a 10% de sangre desfibrinada estril a una temperatura inferior a los 56C ( para que no se hemolisen los glbulos rojos) El Agar Chocolate.- es prcticamente lo mismo que el agar sangre, pero la adicin de sangre se hace a 80C, para que se lisen los glbulos rojos, se precipiten las protenas y la hemoglobina se convierta en hematina, haciendo a los nutrientes ms accesibles para el crecimientos de los microorganismos.

b.

Medios de cultivo sintticos: Cuando todos sus ingredientes son compuestos qumicos conocidos. Tambin se les conoce como medios qumicamente definidos. Solo los medios de cultivo nutricionalmente pobre, o sea que favorecen el crecimiento de los microorganismos menos exigentes, tienen su composicin qumica conocida. Son ejemplos comunes: El Agar Citrato de Simmons, el Caldo Malonato, los medios para la determinacin de vitaminas, entre otros.

c.

Medios Selectivos: Son los medios bsicos, o los enriquecidos, a los cuales se les ha aadido ciertos compuestos qumicos que impiden el crecimiento de la mayora de bacterias pero que son toleradas por aquellas especies que se pretenden seleccionar.

2.

POR SU CONSISTENCIA: a. Medios Lquidos: o caldos, cuando se presentan como soluciones, o sea que todos sus ingredientes estn disueltos en el agua. Medios Slidos: o agares, cuando a temperaturas ambiental gelifican, debido a que tienen un ingrediente gelante que hace cambiar de estado la solucin. Los ingredientes gelantes ms comunes son: El agar, la gelatina, la albumina de huevo, el suero, entre otros. d. Medios Diferenciales: Son los medios bsicos o enriquecidos, a los cuales se les ha aadido ciertos reactivos que reaccionaran con algunos tipos especficos de bacterias que tienen una conducta fisiolgica particular y darn alguna caracterstica observable. La mayora de medios de cultivo son selectivos y diferenciales a la vez. Ejemplo:

b.

El agar EMB ( Eosina Azul de Metileno) para direfenciar coliformes de otras Enterobacterias). El agar de Baird Parker, para seleccionar estafilococos. El agar de Lowenstein Jensen, para microbacterias. El agar TCBS ( Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa), para vibrios. El caldo glucosado a la Azida, para estreptococos, etc.

OTROS 1. Supervivencia del virus en las heces y en la orina: El virus es estable en las heces (y en la orina) a temperatura ambiente por al menos 1 a 2 das. El virus es ms estable (hasta 4 das) en las heces de pacientes con diarrea (que tienen un pH ms elevado que las heces normales). 2. Desinfectantes y fijadores (para su uso en laboratorios): El virus pierde su capacidad de infectar despus de su exposicin a diferentes fijadores y desinfectantes generalmente empleados en el plasma sirven de huspedes para el desarrollo del virus, pero al ser ste liberado se difunde a travs de la membrana al lquido circulante libre de clulas. As el virus se obtiene apartado de las clulas huspedes que son demasiados grandes para pasar por las perforaciones en colodin. OTROS 1. Supervivencia del virus en las heces y en la orina: El virus es estable en las heces (y en la orina) a temperatura ambiente por al menos 1 a 2 das. El virus es ms estable (hasta 4 das) en las heces de pacientes con diarrea (que tienen un pH ms elevado que las heces normales). 2. Desinfectantes y fijadores (para su uso en laboratorios): El virus pierde su capacidad de infectar despus de su exposicin a diferentes fijadores y desinfectantes generalmente empleados. 3. Supervivencia del virus en el sobrenadante del cultivo de clulas: Reduccin mnima solamente en la concentracin del virus despus de 21 das a 4C y a -80C. Reduccin en la concentracin del virus mediante un log slo a temperatura ambiente estable durante dos das. Esto podra indicar que el virus es ms estable que los coronavirus humanos conocidos en estas condiciones. El calor a 56C inactiva el coronavirus del SARS en alrededor de l0000 unidades por l5 minutos (reduccin rpida) 1. Se utilizan los huevos de gallina incubados de 5 a 12 das. Los embriones contienen diferentes tipos de clulas donde pueden duplicar diferentes tipos de virus. Esta tcnica ha servido para el desarrollo de vacunas, ya que se pueden obtener grandes cantidades de virus en poco espacio. 2. El cultivo de tejido o cultivo de clulas se utiliza tambin para multiplicar virus. Las clulas cultivadas pueden ser de varios tipos, dependiendo del virus que queremos duplicar. Entre las ventajas de utilizar esta tcnica tenemos las siguientes: es econmica ya que no hay que mantener animales vivos, se observan efectos citopticos (clula) y se puede escoger el tipo de clula que se desee. 3. Animales cuando el virus no puede cultivarse en ninguno de los anteriores se utilizan ratones, conejos y primates para este propsito. Entre las ventajas tenemos: se pueden ver sntomas y determinar herramientas para diagnstico y se pueden hacer secciones de tejido para ver el efecto microscpico de los virus. Protozoos: Los protozoarios necesitan luz moderada, temperatura de 15 a 21 grados C y un pH de neutral a un poco alcalino. Sise utiliza un medio artificial, ste puede contener arroz, granos de trigo, leche descremada y lechuga. Si es un medioespecfico, contiene glucosa, protenas, minerales y extracto de levaduras. Algunos necesitan microorganismos comoalimentos. Por otro lado, los parsitos se cultivan en preparaciones de cultivo de tejido. Regulacin osmtica en animales acuticos Osmoconformes: en equilibrio osmtico con el ambiente Estenohalino: toleran gama limitada de salinidad Osmoreguladores: no estn en equilibrio osmtico con el ambiente Eurihalino: toleran una gama amplia de salinidad

e.

Medios Especiales: Son aquellos que no se pueden agrupar fcilmente en ninguno de los grupos anteriores. La mayora de ellos sirven para comprobar una o mas consecuencias bioqumicas. Ejemplo: El agar TSI ( agar con hierro y tres azucares) El medio MR-VP ( Medio de Rojo de Metilo y Voges Proskauer) El agar con fenilalanina. El caldo nitrato. El caldo malonatom etc.

Virus: En casi todos los trabajos inciales, los virus se desarrollan en huspedes virus. El primer mtodo. Y uno de los ms tiles para cultivarlos en el laboratorio y obtenerlos en cultivo puro, fue la tcnica del embrin de pollo, huevos de gallina fecundados e incubados 5-12 das. se incubados quitando aspticamente un trocito de la cscara e introduciendo por ese orificio el material que contiene el virus. La abertura se tapa con cera parafinada y el huevo se incuba a 36C por todo el tiempo necesario para que el virus se desarrolle. El embrin se inocula en la membrana orioalantoidea, en donde algunos virus, tambin se utiliza el saco vitelino. La tcnica de cultivo en embrin de pollo se ha utilizado para la produccin de los virus para vacunas contra la viruela, fiebre amarilla, influenza y otras enfermedades, as como para pruebas inmunolgicas y otros estudios. Cogulos De Plasma En esta tcnica se deja coagular el plasma alrededor de trasplantes de tejido y los virus se inoculan en el plasma que contiene fragmentos de tejidos vivo. Una modificacin de este mtodo consiste en encerrar el cogulo en un saco de colodin perforado. Las clulas incluidas en el plasma sirven de huspedes para el desarrollo del virus, pero al ser ste liberado se difunde a travs de la membrana al lquido circulante libre de clulas. As el virus se obtiene apartado de las clulas huspedes que son demasiados grandes para pasar por las perforaciones en colodin.

 Hiperosmtico o fluidos corporales ms concentrados que en el agua que los rodea Hiposmtico o fluidos corporales menos concentrados que en el agua que los rodea Regulacin osmtica en animales terrestres Prdida de agua evaporacin; excrecin; heces fecales Reposicin de agua bebida; comida; agua metablica Excrecin disponibilidad de agua amoniaco urea cido rico