La Tcnica del DNA Recombinante

La Tcnica del DNA Recombinante. Las endonucleasas de restriccin Los vectores de clonacin molecular Vectores derivados de plsmidos Vectores derivados del bacterifago Csmidos Los fagmidos Vectores de expresin Construccin de bibliotecas de DNA quimricos Hibridacin de colonias Transferencia e hibridizacin de DNA en Southern Aplicaciones de la Tcnica de DNA Recombinante

La estructura que conocemos hoy como DNA (cido desoxirribonucleico) fue descrita por Watson y Crick en el ao 1953. A partir de esta propuesta, confluyeron ideas y nuevos enfoques experimentales que condujeron a lo que ha sido denominado como dogma central de la biologa molecular, en el que la informacin gentica fluye del DNA al ARN (cido ribonucleico) y de este a la protena; por tanto propone que es el DNA el material que almacena la informacin gentica en unidades de informacin hereditaria denominadas genes. Aun cuando este enunciado es cierto para la mayora de los seres vivientes; se ha comprobado que en determinados virus la informacin gentica se almacena en forma de ARN y esta puede ser transferida del ARN al DNA a travs de un proceso de transcripcin inversa. Desde la propuesta de la doble hlice para la molcula del DNA, el conocimiento producido durante ms de cuarenta aos de investigacin en la biologa molecular, ha hecho posible el avance de las metodologas que permiten la manipulacin del material gentico de los organismos a la vez que ha suscitado una de las mayores revoluciones en el pensamiento biolgico como es la de poder entender, de manera ms integral, la vida en nuestro planeta. En este contexto, tal vez uno de los mayores logros de la biologa molecular en el siglo XX, fue el poder, de manera dirigida, manipular la informacin gentica de los organismos incluyendo el hombre. Este enfoque tecnolgico denominado tecnologa del DNA recombinante, ha permitido un avance fundamental en la manera como se entiende actualmente el funcionamiento de los genes, en la posibilidad de corregir defectos genticos y en la produccin de nuevas alternativas teraputicas, todo ello con el fin de mejorar la salud mundial. Sin embargo y a pesar de los grandes avances en estas reas, existen riesgos potenciales que nos llevan a cuestionarnos cmo estos avances deben utilizarse y regularse para tener una bioseguridad en los protocolos y adems de poder darles a todos los habitantes del planeta iguales oportunidades de utilizacin. En 1973 A. C Chang, Stanley Cohen y Herber Boyer, hicieron pblico el primer experimento de DNA recombinante al unir un fragmento producido por la digestin con una enzima de restriccin de un plsmido bacteriano de la bacteria Escherichia coli en el sitio de restriccin homlogos de un plsmido completo. Un ao ms tarde, A C Chang y Stanley Cohen aislaron fragmentos de DNA del cromosoma bacteriano de Staphylococcus y los ligaron covalentemente a un plsmido de E. coli, produciendo plsmidos quimricos no conjugativos. Cuando estos plsmidos recombinantes se introdujeron en la bacteria E. Coli, lograron que los genes contenidos en los fragmentos de DNA de Staphylococcus se replicaran correctamente en este nuevo sistema gentico de E. coli. Los resultados obtenidos en ese entonces, abrieron las puertas para el estudio detallado de la estructura y funcionamiento de genes tanto eucariticos como procariticos. Podemos concluir que la tecnologa de la manipulacin de la molcula de DNA ha avanzado dramticamente en muy pocos aos, llegando a tener una influencia no solo en la ciencia bsica si no en las aplicaciones biotecnolgicas que han revolucionado la industria y la economa mundiales. La Tcnica del DNA Recombinante. La metodologa que permite reconstruir molculas de DNA por unin de secuencias de nucletidos de una gran variedad de organismos a un sistema gentico de replicacin autnoma denominado vector, se describe como Ingeniera Gentica o Tcnica del DNA Recombinante (el trmino ingeniera gentica es coloquial siendo ms apropiado describirlo como DNA recombinante). El desarrollo de la tcnica del DNA recombinante fue posible gracias a los estudios previos efectuados durante 30 aos en la exploracin molecular de los procesos genticos y celulares, por esta razn se ha convertido en una serie de metodologas que tienen como objetivo poder manipular de manera parcial la informacin gentica de los organismos. Sin embargo como cualquier tecnologa, la ingeniera gentica, requiere del empleo de una serie de procesos biolgicos controlados y de herramientas moleculares para poder llevar a cabo experimentos en este campo. Por esta razn decimos que la tcnica del DNA recombinante necesita para su aplicacin de una caja de herramientas, dentro de las que se incluyen molculas de DNA vectoras, enzimas que hidrolizan el DNA (Endonucleasas de Restriccin), enzimas que polimerizan del DNA (DNA polimerasas), aquellas que ligan covalentemente molculas de DNA (DNA ligasas) y otras que tienen como objetivo completar los procesos de clonacin

molecular. A continuacin haremos una descripcin general de esta caja de herramientas moleculares y cmo se pueden obtener resultados aplicables tanto a la investigacin bsica como a aquella que involucra una mejora en el funcionamiento de los organismos especialmente en los humanos. Endonucleasas de restriccin los escalpelos para cortar el DNA La tcnica del DNA recombinante utiliza de manera exitosa las endonucleasas de restriccin; stas son enzimas bacterianas cuya expresin es inducida por la infeccin de ciertos bacterifagos a cepas especficas de bacterias. Este proceso definido como restriccin/modificacin tiene como resultado la sntesis de una endonucleasa de restricci n que ataca y fragmenta el DNA infectante. Por otro lado, una enzima de modificacin, generalmente una que adiciona grupos metilo a ciertas bases nitrogenadas denominada DNA metilasa, protege el DNA bacteriano de ser destruido por su propia endonucleasa de restriccin. Todas las endonucleasas de restriccin reconocen secuencias especficas de nucletidos sobre un sustrato que es una molcula de DNA de cadena doble. Existen tres clases principales de estas enzimas denominadas ER I a III: Las endonucleasas de restriccin de las clases I y III son enzimas que reconocen una secuencia especfica larga de ocho o ms nucletidos, pero su accin hidroltica endonuclesica se realiza algunos nucletidos externos a este sitio de reconocimiento. Todas las enzimas del tipo I requieren para su actividad nuclesica, de la hidrlisis de una molcula de ATP, adems de S-adenosilmetionina (SAM) y Mg++ como cofactores. Debido a que su mecanismo de corte es bastante amplio, este grupo de endonucleasas no son tiles para las experiencias de DNA recombinante. En este sentido, las endonucleasas de restriccin de la clase II son, por su especificidad, las empleadas en todos los experimentos de clonacin molecular. Las endonucleasas de clase II, se convierte en una especie de bistur molecular que corta el DNA en sitios especficos los cuales contienen secuencias de nucletidos que varan de cuatro a seis pares de bases. La secuencia del sitio blanco, determina la especificidad de reconocimiento de la correspondiente endonucleasa de restriccin; actualmente se conocen aproximadamente 350 diferentes enzimas de restriccin que poseen especificidades de secuencia muy variables. Para la clasificacin y sistematizacin de las ER, su denominacin taxonmica contiene caractersticas de la especie bacteriana o cepa de la cual fue aislada. Por ejemplo Eco RI es una enzima de E. coli que contiene el plsmido R. Tal como hemos descrito anteriormente las endonucleasas de restriccin del tipo II siempre reconocen secuencias de 4 a 6 nucletidos; en la tabla 1 se presentan las caractersticas ms importantes de algunas de las endonucleasas de restriccin ms comunes. Aquellas enzimas de restriccin que tienen secuencias de reconocimiento de 4 pares de nucletidos generan, en la mayora de las DNAs analizados, fragmentos cortos, mientras que las que reconocen sitios de 6 pares de nucletidos generan fragmentos largos (es necesario aclarar que estadsticamente una secuencia de 4 nucletidos est ms representada en una genoma que una de 6 nucletidos). Al analizar la informacin consignada la tabla 1, se observa que una caracterstica importante de las secuencias de reconocimiento de stas y otras enzimas de restriccin, es su simetra. Por ejemplo: En la secuencia GAA TTC CTT AAG que corresponde al sitio de unin de la EcoRI, existe un eje imaginario de simetra a partir del cual la secuencia se lee lo mismo en ambas cadenas en la direccin 53. Este arreglo de secuencias es lo que se define como un palndrome.

Tabla 1. Nombre, denominacin taxonmica y secuencias de nucletidos reconocidas por algunas endonucleasas de restriccin del tipo II empleadas en experimentos de DNA recombinante. Enzima EcoRI BamHI HindIII TaqI NotI HinfI Sau3A PovII* Origen Bacteriano Escherichia coli Bacillus amyloliquefaciens Haemophilus influenzae Thermus aquaticus Nocardia otitidis Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Sitio de Reconocimiento 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'TCGA 3'AGCT 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'GANTC 3'CTNAG 5'GATC 3'CTAG 5'CAGCTG 3'GTCGAC Resultado del Corte 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---3' 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'

SmaI* HaeIII* AluI* EcoRV* KpnI PstI SacI SalI SphI XbaI

Serratia marcescens Haemophilus egytius Arthrobacter luteus Escherichia coli Klebsiella pneumonia Providencia stuartii Streptomyces achromogenes Streptomyces albue Streptomyces phaeochromogenes Xanthomonas badrii

5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'GGCC 3'CCGG 5'AGCT 3'TCGA 5'GATATC 3'CTATAG 5'GGTACC 3'CCATGG 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'GTCGAC 3'CAGCTG 5'GCATGC 3'CGTACG 5'TCTAGA 3'AGATCT

5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5' 5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

* = DNA queda con extremos romos Para todas las enzimas de restriccin del tipo II, la regin de reconocimiento es una secuencia palindrmica, si se detallan las secuencias de nucletidos a los lados del eje de simetra, se encontrar que ellas son complementarias pero de manera invertida, sto es lo que previamente se ha definido como un palndrome. Algunas enzimas de restriccin cortan en la mitad del sitio de reconocimiento y producen extremos romos (flush ends), tal es el caso de Hae III, Alu I, Sma I y Pov II descritas en la tab la presentada y representadas grficamente en la figura 1. En otras el corte no se produce enele centro del palindrome si no que la hidrlisis de los enlaces fosfodiester ocurre 3 a 5 nucletidos mas all; el efecto es la generacin de segmentos muy cortos de DNA de una sola cadena, que pueden aparearse entre s (figura 1). Estos extremos denominados " pegajosos" (sticky ends) son susceptibles de unirse a cualquier otro fragmento de DNA que hubiese sido cortado por la misma enzima o un isoesquismero de ella, constituyndose as en un instrumento ideal para la ingeniera gentica.
Endonucleasa de Restriccin

Extremos Cohesivos
Endonucleasa de Restriccin

Figura 1. Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede generar dos tipos de extremos. En el primer caso, el corte genera nucletidos de cadena nica protuberantes llamados extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la DNA ligasa. En el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos tambin pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa en condiciones fisicoqumicas especiales

Los sitios de reconocimiento para las diferentes endonucleasas de restriccin que se localizan en distintas molculas de DNA, pueden ser Extremos empleados como marcadores moleculares. En este sentido el DNA Romos obtenido de una fuente especfica se somete a sucesivas digestiones por diferentes endonucleasas. Despus de esto, los fragmentos generados pueden ser separados, de acuerdo con su tamao molecular, mediante electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida; a partir de estos patrones de restriccin, es posible construir un mapa del ordenamiento lineal de ellos. Los mapas de restriccin fueron en su momento instrumentos muy utilizados tanto para reconocer sitios de corte de endonucleasas de restriccin especficas como para diferenciar a nivel molecular distintos genomas principalmente los de virus y bacterias. Este mismo principio lo utiliza el procedimiento denominado anlisis de polimorfismos de tamao de fragmentos de restriccin (RFLP), pero aprovechando el hecho de la existencia de variaciones en la constitucin gentica de la poblacin (polimorfismo gentico), que hace que se observen diferencias entre los individuos en cuanto al nmero y tamao de los fragmentos producidos. La existencia de los RFLPs es la base de la tcnica que se ha denominado huellas digitales del DNA y que permite establecer con altsima confianza la relacin padres e hijos, entre algunas de sus aplicaciones en las ciencias forenses. Los vectores de clonacin molecular Un hecho fundamental en la manipulacin de la informacin gentica es la necesidad de separar un trozo de DNA de un genoma y poderlo insertar en otro sistema gentico. En este sentido es posible definir que un vector de clonacin, es un sistema gentico replicante cuya replicacin es autnoma e independiente de la de otros sistemas coexistentes. As pues, la definicin de vector restringe a ciertas molculas de DNA como plsmidos, virus o derivados de ellos, la gama de vectores que se emplean actualmente

para los experimentos de DNA recombinante. Como cualquier sistema replicante, un vector debe poseer un origen de replicacin que le permita su duplicacin autnoma del DNA cromosmico de la clula que lo aloja y tambin debe contener marcas genticas que permiten la seleccin de la clula que los contiene. La clonacin de un fragmento de DNA en un vector permite producir cantidades DNA recombinante a partir de una molcula original. Se define un clon como una poblacin de molculas o clulas todas idnticas con relacin a una molcula o clula ancestral original, por esta razn a la tcnica de DNA recombinante tambin se le denomina clonacin molecular. La clonacin de DNA se puede realizar gracias a la capacidad que poseen los plsmidos bacterianos y fagos para continuar sus estilos de vida usuales" una vez que se les han insertado secuencias de DNA forneo a sus genomas. Una insercin de DNA genera un plsmido o fago hbrido o quimrico que consiste en parte de DNA del genoma original y una parte de secuencias adicionales o "forneas". Estos elementos quimricos replican en bacterias de forma similar a los plsmidos o fagos iniciales, de esta forma se pueden obtener grandes cantidades de un fragmento forneo clonado en estos vehculos. Con muy raras excepciones, las propiedades de las especies quimricas no son afectadas por la presencia de la secuencia clonada; as, virtualmente cualquier fragmento de DNA de cualquier organismo puede ser clonado mediante este protocolo general. Cuando un fago o plsmido es empleado para "portar" un DNA extrao como un componente inherente del genoma, ste se refiere como un vector de clonacin. El enfoque ms simple es emplear una enzima de restriccin que realice un slo rompimiento en el DNA vector. El procedimiento de insercin genera slo una pequea fraccin de genomas quimricos, por esto es importante tener algn medio para seleccionar el plsmido quimrico del vector original. Una de las caractersticas fundamentales de un vector de clonaje, es que posea un(os) sitio(s) de restriccin en los cuales se ligue el DNA a clonar y que la localizacin de estos sitios en el momento de la clonacin no afecten las funciones esenciales del vector. Para clonar DNA existen una serie de vectores, los cuales han sido objeto de manipulacin, que incluyen una gama muy amplia de plsmidos bacterianos derivados y modificados de contrapartes naturales, bacterifagos dentro de los que se incluye una amplia de modificados del bacterifago Lambda, del M13 y de otros. Adems una serie muy importante de vectores de clonacin contienen elementos genticos derivados de sistemas eucariticos, que permiten la manipulacin y expresin de genes bajo condiciones de expresin eucariticas. Finalmente se han desarrollado vectores derivados de virus de animales y plantas, los cuales se emplean para producir organismos transgnicos y en la terapia gnica que revisaremos mas adelante. Vectores derivados de plsmidos Los plsmidos son molculas circulares de DNA que se replican de manera independiente al cromosoma de la clula hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaos que van desde 5,000 hasta 400,000 pb. Existen dos tipos generales de sistemas de control de replicacin del plsmido: Aquellos de copia nica son mantenidos a niveles de 1 plsmido por bacteria en contraste con los multicopia que se encuentran en niveles mucho mayores, tpicamente de 10 a 20 genomas por clula. Algunos plsmidos estn bajo un control de replicacin relajado por lo cual se acumulan aproximadamente 100 genomas por clula cuando la bacteria detiene su crecimiento. Estos ltimos son los ms usados en experiencias de clonacin molecular, pues son de alto rendimiento. Un nico rompimiento del DNA circular de un plsmido convierte el genoma en una molcula lineal. As, si los dos extremos son cohesivos complementarios, pueden ser ligados a un DNA forneo lineal regenerando un plsmido quimrico circular. Este plsmido quimrico puede ser perpetuado indefinidamente en una bacteria. Este puede ser aislado de acuerdo a su tamao y circularidad; por ejemplo, mediante electroforesis en geles. El plsmido pBR322 es uno de los ms clebres que existen, por ser el primer plsmido diseado y utilizado en biotecnologa. Aunque se basa en un andamiaje natural, le fueron agregados genes para realizar las funciones que el investigador requera. Construido por Francisco Bolvar y Raymond Rodrguez de la Universidad de Stamford, se convirti en una de las primeras herramientas para la introduccin de genes especficos en una bacteria. Los genes que se encuentran en este plsmido, que son su riqueza informacional, fueron introducidos de acuerdo con un diseo previamente planificado, usando tcnicas de ingeniera gentica, pudiendo obtenerse por esta va otros vectores con muchas aplicaciones, partiendo del mismo original. En el caso del pBR322 cuyo tamao es de 4361 pares de bases, posee un gen en particular de resistencia a la ampicilina que le confiere a la clula portadora del plsmido la capacidad de crecer en un medio bacteriolgico con dicho antibitico, esta resistencia se destruye cuando el ste se somete a tratamiento con EcoRI; de esta forma si un DNA es clonado en este sitio, el recombinante es sensible al tratamiento con este antibitico pero conserva al resistencia a tetraciclina (figura 2). Este doble juego permite establecer un sistema muy rpido y sencillo de seleccionar clones recombinantes cuyos fragmentos de DNA clonados han sido ligados en este sitio. Este procedimiento se denomina seleccin negativa, porque se busca que la colonia de bacterias o levadura pierda una funci n; en este caso, la de resistir a la ampicilina.

EcoR I

BamH I Sal I

Figura 2. Mapa gentico y de restriccin del plsmido vector pBR322. Como vector de clonacin este plsmido desarrollado por Francisco Bolvar y Raymond Rodrguez contiene un solo sitio para el corte con EcoRI que separa el gen de resistencia a Ampicilina Amp R y BamHI cuya accin inactiva el gen de resistencia a tetraciclina TetR. Adems contiene un sitio de origen de replicacin OriC que le permite una replicacin autnoma. El tamao total del plsmido es de 4361 pb siendo su capacidad de clonacin de aproximadamente 10.000 pares de bases

pBR322
Se han construido muchos plsmidos para ser usados como vectores de clonacin. La gran mayora de ellos renen varias caractersticas genticas bacterianas o de sistemas virales eucariticos, stas permiten desarrollar estrategias de tamizado (screening) de secuencias especficas clonadas. Como se ha descrito antes, tal vez, la estrategia ms comn es el uso de plsmidos vectores que portan genes que especifican por resistencia a antibiticos. Esta caracterstica fue exitosa en el diseo de un sistema de clonacin. Sin embargo no es la nica manera de tener un sistema de tamizado. A partir de la introduccin de genes que codifican por enzimas cuya actividad puede ser fcilmente monitoreada, se han construido una serie de vectores que expresan la beta- Galactosidasa. Esta enzima hidroliza la lactosa en sus dos monosacridos glucosa y galactosa. La actividad enzimtica puede ser trazada utilizando un sustrato artificial acoplado a una molcula que da una reaccin coloreada (azul). As pues, si el DNA forneo es clonado cerca de un sitio de restriccin que inactiva la enzima, los clones recombinantes dan una reaccin negativa que se traduce en una colonia blanca en contraposicin a las no recombinantes que expresan un color azul. Vectores derivados del bacterifago Otro tipo de vectores de clonacin son los bacterifagos. Generalmente un fago como el posee una molcula de DNA linear, la cual contiene dos grupos de genes: Los del establecimiento del ciclo ltico, en el que el virus se replica dentro de la bacteria y genera mas progenie viral que promueve la lisis bacteriana y otra porcin del genoma que codifica por genes que permiten el establecimiento de un estado lisognico, en el que la bacteria contiene una copia del DNA viral integrada en su genoma. En este caso no se producir la replicacin ni la generacin de mas virus. Las propiedades y la estructura gentica del bacterifago Lambda, hace posible el diseo de vectores en los que se les ha retirado hasta 22% de su genoma correspondiente a la Procin genmica que codifica por aquellos genes del establecimiento de la lisogenia; la remocin de este segmento produce virus que conservan la capacidad replicativa y de generacin de nuevas progenies virales. Una sola quiebra, en el DNA del bacterifago vector, con una enzima de restriccin genera dos fragmentos. Estos son ligados extremo a extremo con un fragmento de DNA forneo generando de esta manera un fago quimrico tal como se muestra en la figura 3. El DNA recombinado puede ser empaquetado dentro de cpsides en el tubo de ensayo y producir viriones infecciosos que al ser infectados en una clula permisiva rinden un progenie de fagos recombinantes. Los fagos quimricos pueden ser convenientemente aislados despus de infeccin en una bacteria hospedera recuperando la progenie viral. Cuando se tiene una coleccin de fragmentos forneos provenientes de un genoma digerido con alguna enzima de restriccin y estos se clonan en sitios correspondientes del vector, se obtiene una coleccin de genomas quimricos cuya totalidad representa un genoma completo forneo. Dicha coleccin puede ser amplificada por infeccin a una bacteria permisiva o por empaquetamiento in vitro obtenindose de esta forma un banco DNA del fago (50Kb) gnico o geneteca.
Remocin de la porcin media por digestin con ER

Origen de Replicacin

Brazo derecho

Brazo Izquierdo

20 a 22 Kb

DNA Ligasa

Partcula de fago quimrico infecciosa

Un requisito importante en la clonacin en fagos, es que el segmento extrao no debe ser insertado en una regin vital del genoma que controle el funcionamiento del vector. El rango de vectores existente en la actualidad permite la insercin de fragmentos de DNA extrao de hasta 22 Kb. Es importante destacar que el total de DNA empaquetado dentro de una cpside del fago es de 50 Kb, DNAs quimricos de mayor tamao no son viables pues no producen partculas funciona Figura 3. El bacterifago como vector de clonacin. El genoma viral tiene un tamao de 50.000 pb de los cuales

quimrico DNA de

Empaquetamiento in vitro

aproximadamente el 45% contiene genes que no son esenciales para la replicacin y formacin de progenies virales. Este tipo de vectores se denomina de reemplazo. Reemplazando la porcin no replicativa del genoma por un DNA forneo de aproximadamente 22 Kpb, se pueden obtener bacterifagos recombinantes. Estos vectores se denominan de reemplazo.

Al igual que los plsmidos vectores, se han diseado fagos vectores de expresin, en estos casos el esquema de construccin es muy semejante al empleado con los plsmidos toda la gama de los Lambda ZAP que tienen un promotor de lactosa. La utilidad de este tipo de vectores derivados de DNA de bacterifagos se ha incrementado por el desarrollo de sistemas para empaquetar el DNA dentro de partculas virales in vitro. Csmidos Un intento para combinar las ventajas de plsmidos y fagos llev a la construccin de los csmidos. Estos son plsmidos dentro de los cuales se han insertado unas secuencias de DNA especiales (sitios cos por sitios cohesivos) necesarias para el empaquetamiento del DNA del bacterifago en su cpside. Estos vectores pueden ser perpetuados en bacterias como plsmidos, pero son purificados por empaquetamiento in vitro en fagos. En los csmidos todava existe la limitacin de tamao impuesta por la cpside, pero no es necesario que el genoma porte los genes para el desarrollo ltico. A pesar de su potencial utilizacin como vectores en los que se puede clonar pedazos de DNA de gran tamao (45Kbp), existen algunos inconvenientes de trabajo con estos vectores principalmente su inestabilidad replicacional. Este hecho impone limitaciones al sistema. Vectores con elementos genticos eucariticos Excluyendo los plsmidos de levaduras no existe ningn otro sistema, de tipo plsmido en eucariotes, que pueda ser empleado como vector de clonaje. Algunos genomas virales de insectos y mamferos han sido empleados como vectores de clonacin tal es el caso del virus de simio SV40, que presenta una serie de ventajas en el sentido de poder expresar genes clonados en sistemas de cultivo de clulas de mamfero un vitro. Otros vectores importantes en eucariticos son los derivados de genoma retrovirales. Estos ha sido denominados vectores Neo (portan el gene de resistencia a neomicina) y contienen secuencias LTR capaces de integrar el DNA clonado dentro de la clula hospedera (figura 4). Actualmente existe una amplia gama de vectores de introduccin en clulas eucariticas. Todos ellos se pueden diferenciar por el tipo de regiones reguladoras y de inicio de expresin se hayan introducido durante el proceso de construccin del correspondiente vector. Figura 4. Esquema en el desarrollo de un construido en el que se ha empleado un vector retroviral derivado del Virus de la Leucemia Murina MLV. El vector MT contiene las terminaciones repetidas largas del provirus (LTR). Adems de una porcin del DNA proviral X. En el construido MIN se ha incluido dos nuevas regiones genticas como el gen de resistencia a Neomicina (Neo) como marca de seleccin negativa por la susceptibilidad de crecer en medios de cultivo suplementados con este antibitico y el elemento IRES que es una secuencia de unin al ribosoma que facilita la traduccin del gen clonado. MINEI contiene adems de los elementos anteriores un sitio de splicing de intrones que asegura la expresin completa de un transcrito primario. Bacterifagos de cadena nica Dentro de los bacterifagos de cadena nica, M13 un bacterifago filamentoso que infecta E. coli, ha sido el ms utilizado. Su genoma es un DNA de una sola cadena circular de aproximadamente 7200 nucletidos que codifica por las protenas de la cpside adems de la DNA polimerasa del fago; M13 se considera un fago que infecta solo aquellas bacterias que portan el plsmido F o factor de fertilidad, ya que utiliza el pilus F (cuyas protenas se expresan en el plsmido F), como puerta de infeccin (figura 5). Tal como se muestra en la figura 5, de la cpside el genoma viral dentro es de cadena nica, el cual se circulariza una vez ha entrado al citoplasma de la bacteria infectada. Esta forma conocida como banda infecciosa de polaridad +, se duplica para dar lugar a un intermediario de replicacin de cadena doble el cual se replica continuamente mediante el mecanismo de circulo rodante; de esta forma se producen muchas molculas de cadena nica circulares que son las bandas progenies +. A partir del fago M13 salvaje se han desarrollado, mediante modificaciones genticas, un grupo de vectores derivados que dieron origen a la serie de los vectores diseados especialmente para ser utilizados en la secuenciacin de DNA mediante el mtodo de terminacin prematura de cadenas utilizando los didesoxirribonucleosidos-5trifosfato (ddXTP) como terminadores de la elongacin por parte de la DNA polimerasa bacteriana.

Bacteriofago M13 Progenie de M13 Pilus F

Infeccin Maduracin y Gemacin de M13 Etapas de Replicacin del DNA de M13

Figura 5. Ciclo replicativo del bacterifago M13, del cual se derivan una serie de vectores de clonacin denominados los M13mp+ utilizados para la secuenciacin de fragmentos de DNA clonados. La utilizacin de los recombinantes M13mp7+ permiti la aplicacin del mtodo de secuenciacin de terminacin prematura de la elongacin desarrollado por Fred Sanger. Este mtodo de secuenciacin de DNA, utiliza los didesoxiribonucletidos como terminadores de la polimerizacin por parte de la DNA polimerasa bacteriana. Se toma ventaja de la clonacin en un poliadaptador que contiene sitios de restriccin de varias enzimas, as la digestin de la forma replicativa de doble cadena, permite la insercin de DNA forneo. De esta forma se obtienen M13mp recombinantes que pueden ser utilizados para infectar bacteria de E. coli F+ Los fagmidos

Banda Infectante +

Un fagmido o fsmido es un tipo de vector de clonacin desarrollado como un hbrido de porciones del genoma del bacterifago M13 y plsmidos. Este tipo de vectores puede ser replicado como plsmido pero se pueden empaquetar dentro de cpsides virales como un DNA de cadena Banda Circulo nica. Los fagmidos contienen un origen de replicacin Ori para la Forma Progenie + Rodante Replicativa replicacin de molculas de DNA de doble cadena y tambin el origen de replicacin F1 del fago M13. Al igual que los plsmidos, un fagmido puede ser introducido dentro de una bacteria mediante un amplio rango de mtodos de introduccin de molculas de DNA en bacterias. Dentro de la bacteria este tipo de vectores puede replicarse como formas virales cuyo de DNA es de cadena nica. Para ello requieren de un bacterifago ayudador que facilita la replicacin de cadena nica y el empaquetamiento de stas dentro de cpsides virales. Dentro de los vectores ms utilizados de este tipo, estn los de la serie pUC (plsmidos de la Universidad de California), los pEMBL (de los laboratorios de EMBO en Heidelberg) entre otros. La capacidad de clonacin de estos vectores es baja. Entre los mas empleados se encuentran aquellos plsmidos derivados de M13, Fd y mas recientemente el p-BlueScript que contienen la regin de replicacin del fago, lo que permite tener un estilo replicativo que produce copias de cadena nica. La generacin de recombinantes de cadena nica increment la eficiencia del mtodo de secuenciacin de terminacin prematura de cadenas empleando los dideoxirribonuclesidos trifosfato (ddXTP) (figura 6) Figura 6. Esquema que muestra un fagmido utilizado tanto para la expresin de genes como para la secuenciacin de fragmentos de DNA clonados. Adems de las secuencias derivadas de plsmidos, el fagemido tiene el origen de replicacin F1 del fago M13 que le permite la replicacin de molculas de DNA de cadena nica para ser empaquetadas dentro de cpsides virales. Tambin tiene el fragmento LacZ que codifica por la beta-Galactosidasa de E. coli, lo que permite la seleccin mediante color. Tiene una marca de resistencia a Ampicilina que facilita la seleccin por crecimiento en medios suplementados con este antibitico y un origen de replicacin bacteriano (ColE1), para la replicacin de molculas de DNA de cadena doble. MCS es un poliadapatador que contiene mltiples sitios de restriccin. Vectores de expresin Uno de los objetivos de algunos experimentos de clonacin molecular es poder expresar la informacin gentica de la protena que est codificada en el fragmento de DNA clonado. Para que un gene sea transcrito, requiere de elementos promotores que controlen su transcripcin. En este sentido un vector de expresin es aquel que permite la transcripcin del gen clonado. Inicialmente los vectores de expresin fueron muy simples, puesto que solamente contenan secuencias promotoras de genes bacterianos los cuales se introducan dentro del plsmido vector, sin embargo a medida que se perfeccion la tecnologa de produccin de protenas recombinantes, los vectores de expresin se hicieron cada vez ms complejos. El principal promotor empleado para la construccin de los primeros vectores de expresin, fue el del operon de lactosa. Lac p fue clonado junto con una porcin de los primeros 15 aminocidos de la -galactosidasa o pptido X, a este construido se le adicion en fase un poliadaptador con mltiples sitios de clonacin. La secuencia del DNA clonado, queda en registro abierto de lectura para promover la sntesis de una protena mixta que contiene la porcin del pptido X y la especificada por el gene clonado (figura 7), este

tipo de protenas producidas por estos vectores de expresin se les denomina protenas de fusin. Lgicamente una protena de fusin tiene caractersticas tanto de la protena producto del gen clonado como del pptido X de -galactosidasa. Cuando analicemos la tecnologa de produccin de protenas recombinantes se ampliar ms en detalle la informacin sobre otros vectores de expresin.

Figura 7. Esquema de un vector de expresin bacteriano que contiene el promotor de opern de lactosa Plac adems de una porcin del gen de la beta-Galactosidasa. Estos vectores contienen una marca de resistencia a ampicilina que facilita su seleccin como clon recombinante. En este tipo de vectores se expresan protenas recombinantes fusionadas en E. coli con una porcin de LacZ.

Construccin de bibliotecas de DNA quimricos Uno de los principales usos de la tecnologa del DNA recombinante es el aislamiento de genes individuales directamente del genoma. Cualquier gene en particular representa slo una muy pequea fraccin de un genoma eucaritico. Por ejemplo, el tamao del genoma de un mamfero es alrededor de 10 9 bp, as que un gene que en promedio tenga un tamao de 5000 bp, representa solamente el 5.0 x 10 -6 % del DNA nuclear total. La ligacin de un fragmento de DNA extrao en un vector de clonacin requiere una reaccin entre los extremos del fragmento y el DNA del vector. Esto puede lograrse generando secuencias complementarias en el fragmento y en el vector, para lograr in vitro la recombinacin en un DNA quimrico cuando se alinean y se ligan covalentemente. El primer paso hacia la identificacin de un gene en particular es digerir el genoma que lo contiene en fragmentos manejables de acuerdo con el vector escogido. Lo deseable es que el gene se encuentre localizado en uno de estos fragmentos. La capacidad de clonacin de un vector la cual se define como el tamao mximo que se puede ligar en un vector sin alterar su capacidad replicativa vara dependiendo del sistema de clonacin utilizado. El tamao manejable oscila, de acuerdo al sistema, de 4000 nucletidos para los fagmidos hasta 45.000 pares de bases en los csmidos. En algunos casos no es posible obtener el gene en un solo segmento, en esta situacin su estructura debe ser determinada juntando la informacin obtenida de varios fragmentos. Debido al tamao relativamente grande de los genomas de muchos organismos, el DNA a clonar se fragmenta en pedazos de tamao aceptable (10 a 20 Kb para fragmentos que van a clonarse en vectores de ), esta coleccin de fragmentos se liga a vectores apropiados con el objetivo de construir una biblioteca de clones recombinantes o geneteca. Dentro de la coleccin de vectores quimricos habr uno que tendr el fragmento que contiene el gene que se quiere aislar. El problema se centra en la metodologa a utilizar en la seleccin del clon recombinante correspondiente. Para tal fin se han desarrollado varios enfoques experimentales, dentro de los cuales el ms comnmente utilizado es la hibridizacin de colonias de bacterias recombinantes o de placas de lisis de bacterifagos recombinantes que han crecido sobre superficies slidas de agar. El protocolo de clonacin molecular ms sencillo es emplear una endonucleasa de restriccin que produzca cortes que generan extremos cohesivos tanto en el vector como en el DNA forneo. El ejemplo clsico es la enzima EcoRI tal como ya ha sido explicado en las secciones anteriores. Posteriormente las secuencias complementarias de los dos extremos de cada DNA se alinean, (puesto que estos extremos son homlogos); despus del alineamiento, en las molculas recombinantes se sellan los huecos dentro del vector quimrico con DNA ligasa de T4 (figura 8). Una ventaja de este procedimiento es que no se pierde el sitio de EcoRI, sirviendo como referencial para el estudio y estimacin de tamao del fragmento clonado. Otra forma de producir extremos complementarios es por adicin de homopolmeros o poliadaptadores ( polylinkers). De esta manera las dos molculas de DNA quedan con extremos homopolimricos complementarios (ejemplos poli A-poli T). Estos se alinean y sellan con DNA ligasa para producir molculas hbridas. Una desventaja de este protocolo es la prdida del sitio de restriccin al cual se adiciona el homopolmero, por lo tanto, es importante conocer otro sitio referencial dentro del vector. El RNA mensajero puede ser copiado a cDNA Con el fin de obtener una secuencia de DNA que represente el codificado de una protena particular, el enfoque ideal es comenzar con su correspondiente mRNA el cual despus de todo, es el molde empleado para la traduccin en la protena in vivo. La existencia de la transcripcin reversa (por la transcriptasa reversa AMV, del virus de la mieloblastosis aviar, enzima que copia una cadena de DNA a partir de un molde de RNA), es una opcin que se emplea para resolver esta clase de problemas en la clonacin de secuencias de DNA. La transcripcin reversa es extremadamente fcil para mRNAs que posean colas de poli (A) en su extremo 3 (al igual que otras

enzimas que sintetizan DNA, la transcriptasa reversa no puede iniciar la formacin de una cadena polinucleotdica sin un extremo cebador) (figura 9). El producto de reaccin de la transcriptasa reversa, es una molcula de DNA de doble cadena complementaria al mRNA que se utiliz como molde. El nico problema prctico es la tendencia que tiene la transcriptasa reversa in vitro a detenerse en varios puntos antes de alcanzar el extremo 5. Otra caracterstica importante de esta enzima es que cuando alcanza el terminal 5, se desliza de 10 -20 bp por fuera del molde, generando un gancho. Este puede ser empleado para iniciar la sntesis de la banda de DNA complementaria. En esta unin el RNA se degrada por tratamiento con lcali, para producir un DNA copiado (cDNA) de una cadena complementaria al mRNA molde usado. Posteriormente la misma transcriptasa o la DNA polimerasa I de E. coli convierte el cDNA de simple cadena en un DNA dplex. El producto final es un DNA de doble cadena que contiene el "g ancho" del extremo 5. ste se degrada por el tratamiento in vitro con la enzima nucleasa S1 (que hidroliza especficamente DNA de cadena nica), as se restablece la estructura de doble hlice con los extremos 5 libres.

Figura 8. Construccin de un DNA quimrico. Esquema del flujo de procesos moleculares utilizados para obtener mediante la tcnica de DNA recombinante clones quimricos a partir de un DNA forneo. En los primeros pasos se somete a digestin con la misma Endonucleasa de restriccin tanto el DNA forneo como el plsmido vector. Una vez linearizado el plsmido vector, se mezclan las dos poblaciones de molculas digeridas que tienen extremos cohesivos complementarios y se incuban con la DNA ligasa del bacterifago T4. La reaccin de ligacin produce plsmidos recombinantes conteniendo porciones de genoma forneo utilizado. A partir de estas bacterias recombinantes que conforman una biblioteca de DNA recombinante, se seleccionan clones recombinantes que son propagados en medios de cultivo apropiados. Posteriormente mediante utilizacin de una sonda de DNA especfica, se busca el clon recombinante que contenga el fragmento homlogo a la sonda. De esta manera se purifican y estudian los plsmidos quimricos.

Figura 9. Sntesis de DNA complementario (cDNA) a partir de molculas de RNA mensajero (mRNA) mediante la utilizacin de la Transcriptasa Reversa del Virus Mieloblastosis Aviar (AMV). Para que la Transcriptasa inicie la sntesis de una cadena de DNA, es necesario la adicin de oligonucletidos cebadores repetidos (dT)15. Estos forman porciones homologas con las colas 3de poliadenosinas que tienen los mRNA eucariticos; de esta manera la transcriptasa reversa completa la sntesis de una molcula de cDNA complementaria. Posteriormente la DNA polimerasa de T4 completa la sntesis de la segunda cadena para producir un sustrato de DNA de doble cadena a ser clonado en vectores apropiados.

Hibridizacin de colonias Una de las metodologas ms usadas para la seleccin de clones recombinantes, es el empleo de sondas o rastreadores que tengan alguna homologa de bases con el gene a seleccionar. En este punto se ve la importancia de los clones de cDNA, pues si previamente se ha caracterizado el producto de transcripcin del gene en cuestin, es posible sintetizar y clonar su cDNA. As, empleando la metodologa de hibridacin de secuencias homlogos, se puede "pescar" de la geneteca el clon recombinante que porte el gen. En trminos prcticos la seleccin de clones recombinantes se realiza por tcnicas de plaqueo de la coleccin de recombinantes (bacteria o bacteriofagos). En resumen esta metodologa consiste en: 1. crecimiento una densidad de colonias apropiadas para individualizarlas en la caja de Petri, 2. transferencia del DNA de cada colonia a filtros de nitrato de celulosa o de Nylon previa desnaturalizacin en condiciones alcalinas y posterior neutralizacin. El DNA de cada colonia es sometido a hibridizacin con la correspondiente sonda previamente marcada, bien sea radiactivamente o por procedimientos no radioactivos, en condiciones fisicoqumicas apropiadas para que ocurra el apareamiento de porciones de nucletidos de la sonda con el DNA clonado en el recombinante. Despus de una serie de lavados, en condiciones de sal necesarias para retirar los hbridos inespecficos, (este efecto se denomina astringencia), los filtros son sometidos a procedimientos de revelado con el fin de localizar las colonias que contienen DNA complementario a la sonda empleada (figura 9). Figura 10. Descripcin del mtodo de hibridizacin en colonias empleado para seleccionar clones recombinantes a partir de una coleccin inicial de recombinantes. El objetivo es identificar clones recombinantes que tengan fragmentos de DNA complementarios a sondas de DNA especficas ms utilizadas. El revelado en la membrana de Nylon, permite volver a la placa con las bacterias y obtener el clon recombinante bacteriano.

Transferencia e hibridizacin de DNA en Southern Una de las tcnicas ms utilizadas para identificar y estudiar estructuralmente genes que han sido clonados, es la tcnica de transferencia e hibridizacin en Southern desarrollada por Southern en 1968. Esta metodologa combina la separacin electrofortica de molculas de DNA en geles de agarosa con la posterior transferencia de stas a membranas de Nitrocelulosa (NC) o de Nylon. Es importante destacar que solamente el DNA de cadena nica se une a la membrana de manera estable, por lo cual hay que tratar los fragmentos con soluciones desnaturalizantes que permitan la generacin de fragmentos de cadena nica. Al transferir los fragmentos, separados de acuerdo con su tamao molecular, a membranas NC es posible hibridizarlos utilizando para ello una sonda de DNA que tenga secuencias complementarias al gene que se desea estudiar. Las condiciones son muy semejantes a las previamente descritas para la hibridizacin de colonias (figura 10).

Figura 11. Representacin esquemtica del flujo de procesos que se desarrollan en el mtodo de transferencia de DNA e hibridizacin con sonda especfica. La metodologa se denomina hibridizacin en Southern.

Recientemente se han desarrollado varias metodologas de transferencia de otras molculas que tienen casi el mismo principio del Southern. El Northern es la tcnica de transferencia de poblaciones de RNA a membranas de NC o de Nylon. El Western es la forma de transferir protenas de geles de poliacrilamida a membranas de NC, protenas de geles de poliacrilamida a membranas de NC. A medida que se van perfeccionando las tcnicas de deteccin, se hace ms fcil aislar y estudiar genes. En los ltimos aos ha sido perfeccionada una de las metodologas ms potentes, la sntesis de secuencias de oligo-nucletidos in vitro. Empleando este enfoque, es posible sintetizar cualquier sonda, pues basta conocer parcialmente la secuencia de aminocidos de una determinada protena. Esta sonda sirve de base para aislar el gene de una geneteca. Aplicaciones de la Tcnica de DNA Recombinante Aunque las aplicaciones de la ingeniera gentica cubren casi la totalidad de los procesos en plantas y animales, la medicina y la salud humana, son quiz los campos de aplicacin ms beneficiados con el descubrimiento y la implementacin de la tecnologa de DNA recombinante, puesto que sta ha permitido descubrir y buscar alternativas y tratamientos para numerosas enfermedades, la deteccin temprana de enfermedades genticas, la produccin de sustancias y medicamentos revolucionarios y como complemento a todo esto se ha desarrollado tambin terapias gnicas para algunas de las enfermedades que aquejan diariamente a miles de personas. Es importante resaltar que aunque existe una gama muy importante de productos de DNA recombinante que tienen usos benficos para la especie humana y el planeta, se vislumbra una posibilidad real de que algunas de las aplicaciones generen productos nocivos o destructivos para el hombre y el planeta. Nos referimos a una realidad que existe en el armamento biolgico almacenado en algunas de los laboratorios de investigacin y aplicacin en muchos de los pases desarrollados y que son ms peligrosos que las mismas armas nucleares de destruccin masiva. Por esta razn y desde 1976, ao en que se llev a cabo la Conferencia de Asilomar en California, existen lineamientos bioticos y de seguridad biolgica obligatorios para desarrollar experimentos de DNA recombinante. Produccin de Protenas Recombinantes La ingeniera gentica ha abierto la posibilidad de emplear bacterias y otros microorganismos para producir protenas de importancia econmica, mdica e industrial. Esto ha posibilitado el desarrollo una de las ms nuevas fronteras de conocimiento en la gentica y la biologa molecular. Una protena recombinante es aquellas que se expresa como parte de un construido generado por clonacin molecular en un sistema biolgico. Generalmente estas protenas se expresan en sistemas biolgicos en los que naturalmente no existe su sntesis, por lo que es una informacin gentica nueva que se expresa empleando la maquinaria biosinttica de la clula que contiene el construido. La produccin de protenas recombinantes ha abierto una gran frontera para la obtencin de organismos biofbricas que sintetizan protenas recombinantes de inters biotecnolgico. Recientemente se ha documentado la clonacin de genes de protenas de importancia mdica como la insulina, la somatostatina y la eritropoyetina, entre otros, lo que ha permitido el inicio de una nueva era de la industria farmacutica en la que los frmacos, protenas recombinantes, se producen por sistemas de crecimiento de organismos biofbricas. Con esta visin la industria farmacutica actual ve la importancia de implementar procesos menos contaminantes y con costos de produccin menores. Adems uno de los problemas ms importantes de la agricultura moderna, es el empleo de insecticidas y controladores de plagas, pues la utilizacin de estos compuestos adems de incrementar costos de produccin tambin aumenta el peligro de contaminacin del ecosistema y por ende trae consecuencias importantes para la salud humana. Una de las alternativas viables para resolver esta problemtica es la introduccin de genes de fijacin de nitrgeno y otros genes como los de resistencia en bacterias que habiten en las races de plantas no leguminosas con lo que se eliminara el uso de fertilizantes nitrogenados o de pesticidas y controladores de plagas. Uno de los elementos centrales en la implementacin de los procesos biotecnolgicos antes mencionados, es el desarrollo de sistemas de expresin modulada de genes, los denominados vectores de expresin. Tal como habamos descrito en secciones anteriores, lo vectores de expresin son un aspecto fundamental para la produccin de protenas recombinantes. De acuerdo con lo que se muestra en la tabla 2 existen varios elementos genticos que hacen parte de l este

grupo de os vectores de expresin tanto en los sistemas procariticos como el los eucariticos. stos son requisitos mnimos que debe tener un vector de expresin. En general las funciones algunos de ellos son similares, lo que cambia es su capacidad para expresar la protena recombinante en un husped procaritico (bacteria) o en uno eucaritico (clulas en cultivo). El uso de productos recombinantes tiene ventajas importantes en comparacin con el empleo de material extrado de tejidos, especialmente en lo que se refiere a protenas humanas. Con frecuencia la fermentacin de bacterias en biorreactores produce cantidades importantes de protena a bajos costos y con relativa pureza. Se obvian pasos en la sntesis qumica o en la extraccin que utilizan reactivos potencialmente nocivos para la salud. Este aspecto es fundamental en el control de calidad, el cual es ms fcil y seguro para la produccin de un agente teraputico va DNA recombinante. Hasta el momento, la clonacin muchos genes eucariticos en vectores de expresin bacteriana ha trado problemas tecnolgicos pues las protenas recombinantes producidas no parecen expresarse en forma correcta. Este hecho ha impulsado la construccin y desarrollo de nuevos vectores de expresin que contienen promotores de origen eucaritico presentes en virus animales o en genes humanos aislados previamente. Con la utilizacin de vectores de expresin eucariticos ha sido posible la expresin y produccin comercial de la Insulina humana recombinante y de la Somatostatina humana de origen recombinante entre muchas de las protenas recombinantes utilizadas actualmente en el tratamiento de enfermedades humanas. La tabla 3 consigna las caractersticas de algunas protenas que se emplean hoy como agentes teraputicos. Muchos de ellos ya se encuentran en fase de produccin comercial mediante la clonacin molecular y su expresin, a gran escala. Tabla 2. Caractersticas de los vectores de expresin procariticos y eucariticos Caracterstica Marcadores seleccionables Resistencia a tetraciclina Triptofano o lactosa Del fago T7 Nir B Vector Procaritico Resistencia a ampicilina Vector Eucaritico Resistencia a Neomicina Dihidrofolato reductasa Glutamina sintetasa Timidin kinasa (TK) -actina Citomegalovirus PI Temprano de SV40 Metalotioneina Alto nivel de expresin Modificaciones postraduccin Secrecin Actividad biolgica y plegamiento proteico correcto

Promotores

Ventajas

Alto nivel de expresin Rapidez de sntesis Facilidad de manejo Econmico

Desventajas

Poca capacidad de secrecin. Modificaciones postraduccin ineficientes.

Relativamente lento Altos costos de produccin

Nuestros conocimientos moleculares sobre las enfermedades hereditarias son mucho ms recientes. En stas el defecto gentico ocasiona la funcin anormal de una protena especfica. Con todo el incremento en las investigaciones que ha ocurrido en los ltimos veinte aos, ha sido posible el entendimiento al nivel molecular de muchas enfermedades, incluyendo las no genticas. En este sentido la caracterizacin de ciertas protenas que aparentemente faltan o no funcionan correctamente, ha abierto el camino para una potencial estrategia teraputica en el tratamiento de algunas enfermedades en las que estas protenas juegan un papel importante. Las nuevas vacunas En todo el mundo, desde principios de la dcada de 1980, laboratorios y cientficos investigan el desarrollo de nuevas vacunas que, se espera reemplazarn en un futuro a las tradicionales actualmente empleadas. Estas nuevas vacunas son producidas por ingeniera gentica, basadas en la molcula de DNA y en las secuencias de aminocidos que contienen la informacin gentica con la cual el organismo patgeno produce la enfermedad. La primera vacuna recombinante para uso en humanos fue la vacuna contra la hepatitis B. Actualmente, las investigaciones se centran en mejorar las vacunas ya existentes para lograr respuestas inmunitarias ms eficaces, nuevas vas de administracin y en la aplicacin de vacunas combinadas (varias vacunas en una sola dosis) para reducir el nmero de inyecciones. El descubrimiento y decodificacin de los genomas de bacterias y virus patgeno llevado a cabo en los ltimos aos, ha abierto una enorme esperanza en el desarrollo de estas nuevas vacunas. Actualmente existen una gama de protocolos para obtener vacunas. As las vacunas con base en la tcnica del DNA pueden incluirse en una de las siguientes estrategias:

Tabla 3. Algunas protenas teraputicas usadas hoy en da en la clnica y producidas va DNA recombinante. Producto Insulina humana Somatotrofina Activador del plasmingeno textural - interfern -interfern - interfern Eritropoyetina Factor de crecimiento epidrmico Factor VIIIc y IX Anticuerpo anti-CD3 Glucocerebrocidasa Interleucina 2 Usos Diabetes mellitus insulino dependiente Enanismo hipofisiario Infarto agudo del miocardio Leucemia mieloide crnica, mieloma, hepatitis B, Sarcoma de Kapossi Ensayo en esclerosis mltiple Como agente antineoplsico Anemia en pacientes anfricos o con insuficiencia renal Quemaduras Hemofilia A y B Transplantes Enfermedad de Gaucher Inmunoterapia del cncer

Vacunas atenuadas: Mediante tcnicas de ingeniera gentica, se pueden eliminar los genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la habilidad de provocar una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genticamente puede usarse como una vacuna viva sin riesgo a que revierta al tipo virulento. En la actualidad, se encuentra en fase de ensayos clnicos una vacuna de cepas estables del agente del clera (Vibrio cholerae). El mismo, est desprovisto del gen que codifica para su potente enterotoxina que provoca la enfermedad. En el caso de Salmonella se ha ensayado quitarle ciertos genes que aunque no estn relacionados con la virulencia, al desaparecer convierten la cepa en atenuada (disminucin de su virulencia en un milln de veces). Se ha demostrado su efectividad en ovejas, bovinos, pollos y, ms recientemente en humanos. Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: Estas, utilizan microorganismos no patgenos (virus o bacterias) a los cuales se les incorporaron, mediante ingeniera gentica, genes de agentes patgenos que codifican para los antgenos que desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores recombinantes ms utilizados en este tipo de vacunas, ya que tiene un genoma grande, totalmente secuenciado y permite acomodar varios genes forneos en su interior. De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma de este virus, un gen del virus rbico; este construido provoca la respuesta inmune en el organismo hospedador. Tambin se han ensayado las expresiones de genes que codifican para antgenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes simple. Mediante este mtodo, se podran desarrollar vacunas que inmunicen simultneamente para varias enfermedades, al insertar en el virus recombinante varios genes de distintos organismos patgenos al mismo tiempo. Virus vivos recombinantes. Los Paramyxovirus son una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes como sarampin, paperas y parainfluenza. La estructura genmica de estos virus es tal que se le podran insertar genes adicionales que codificasen una amplia variedad de protenas de fuentes diferentes. As el virus del sarampin ofrece varias ventajas como portador de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo. Con tecnologas recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que una sola cepa atenuada del virus puede conferir inmunidad. Vacunas de subunidades: Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, es posible aislar los genes que codifican para las protenas que provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las protenas de las cpsides). Mediante ingeniera gentica, esos genes se pueden clonar y expresar en huspedes alternativos tales como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) o lneas celulares de mamferos. Luego de insertado el gen de inters, la bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de protenas en grandes cantidades, las cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la primera vacuna puesta en el mercado producida por este mtodo. Esta vacuna se desarroll aislando el gen del virus que codifica para el antgeno HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen que produce esta protena se introdujo por clonacin en plsmidos de expresin de levaduras ( S. cerevisiae). Una vez construido, el antgeno se produjeron en grandes volmenes en fermentadores industriales y de un modo seguro. En la actualidad, se est avanzando en vacunas de subunidades frente al virus del herpes simple (HSV), y la fiebre aftosa. Vacunas de DNA: Son las vacunas actualmente en experimental que suscitan mucha expectativa. stas consisten en plsmidos en los que se introduce tan slo la pequea fraccin del material gentico del patgeno contra el que se pretende inmunizar (los genes que codifican la produccin de uno o varios de sus antgenos). Cuando se inyecta el plsmido en el msculo o en la piel, ste penetra dentro de la clula y llega al ncleo, para comandar desde all la produccin de los antgenos del patgeno que desencadenarn la respuesta inmune. De esta forma lo que se hace es trasladar la fbrica de la vacuna a los tejidos de la misma persona. Actualmente, se estn realizando ensayos de varias vacunas de este tipo -para la hepatitis B, la malaria, la gripe, el herpes simple y el SIDA/VIH. Vacuna de DNA desnudo: En este tipo de vacunas se utiliza directamente una porcin del DNA purificado que contenga el gen de la protena que produce la respuesta inmune. Esta fraccin de DNA se inserta en un plsmido. Las clulas del paciente vacunado captan

ese plsmido y lo incorporan en su ncleo, permitiendo la expresin del gen forneo y produciendo la protena recombinante. Esta protena es secretada al exterior de la clula, por lo cual el sistema inmune puede reconocerla de la misma manera que durante una infeccin natural, induciendo una respuesta inmune. Como se vio anteriormente, para el diseo de las nuevas vacunas se parte del conocimiento detallado del genoma del patgeno. Con esta base, se inactivan selectivamente slo aquellos genes no deseados implicados en virulencia, o se potencian aquellas caractersticas de inmunogenicidad favorables para la preparacin de la vacuna. Al conocer en detalle la composicin molecular de la vacuna, se garantiza su seguridad y estabilidad, eliminado los posibles riesgos de introducir microorganismos vivos atenuados. Otras ventajas incluyen la ausencia de riesgos en su produccin a escala industrial, ya que no se trabaja en ningn momento con organismos patgenos. En la actualidad se estn llevando a cabo investigaciones en vacunas contra el virus del papiloma Humano HPV (algunos subtipos podran vincularse con el cncer de cuello de tero), la malaria (enfermedad que mata a casi 3 millones de personas por ao), el citomegalovirus (que provoca un sndrome similar a la mononucleosis), la Shigella una bacteria que produce diarrea, el herpes y enfermedades parasitarias como la toxoplasmosis. Tambin se estn probando vacunas contra el HIV (virus que causa el sida), y contra el clera o el dengue, y varios tipos de cncer. Adems del desarrollo de nuevas vacunas, tambin se estn mejorando algunas ya existentes, como la vacuna contra el neumococo (causante de neumona y meningitis), que abarcar ms serotipos de este microorganismo que las vacunas actuales. Al mismo tiempo, se estn estudiando vas de administracin nuevas, como la nasal (a travs de las mucosas) o intradrmicas (en la piel, aunque sin pinchazo). Otra opcin muy interesante la constituyen las vacunas que podran ingerirse con los alimentos o vacunas comestibles. Organismos Transgnicos Las tcnicas de manipulacin gentica de la biotecnologa moderna han hecho posible modificar la informacin gentica de una serie de organismos animales, apelando a diferentes tcnicas y con diferente propsito y resultados. Un organismo transgnicos es aqul que ha sufrido la alteracin de su material hereditario (genoma) por la introduccin artificial (manipulacin gentica) de un gene exgeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Los organismos transgnicos muestran que aparentemente no existen barreras para mezclar los genes de dos especies diferentes. A mediados de los aos sesenta se comenzaron a desarrollar bioherramientas moleculares con las cuales se poda componer y descomponer al DNA, lo que permiti intercambiar fragmentos especficos de DNA de distintas especies e incluso transferirlos a microorganismos como las bacterias. Despus se descubri que esta prctica la vena haciendo la naturaleza desde hace millones de aos con los vegetales a travs de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens Animales Biofbrica Un animal biofbrica es aquel al cual se le ha introducido una informacin gentica que le permite sintetizar una determinada protena por transgnesis. Lgicamente la expresin del gene se efecta clonndolo en vectores de expresin que contengan promotores y elementos de control de la transcripcin que puedan controlar la expresin del gene en un determinado rgano. Tal vez uno de los retos ms grandes en la construccin de animales biofbricas es conseguir la expresin de la protena en tejidos que produzcan secreciones que estn enriquecidas con la protena expresada por el gen introducido. Un animal biofbrica es en si, por lo tanto, un organismo transgnico que ha recibido el transgene y que lo va a expresar en un rgano definido de acuerdo con el elemento promotor que contenga el construido del transgene introducido. Varias especies comerciales han recibido transgenes y han logrado expresarlo en un tejido u rgano determinado. La primera oveja transgnica fue Tracy que vivi entre 1991 y 1998. Tracy produca a1-antitripsina en la leche, un medicamento empleado para tratar la fibrosis qustica, una enfermedad que afecta los pulmones. En los mamferos una de las secreciones ms abundantes es la leche. Este liquido es una suspensin que contiene una serie de protenas cuyos genes estn controlados por promotores regulados intrnsecamente en la glndula mamaria, adems de lactosa y sales. La composicin relativamente simple de la leche permite tener un sistema en el que la protena expresada por el transgene pueda ser purificada con una elevada eficiencia. Experimentalmente se han introducido transgenes de importancia teraputica en promotores de genes que se expresan normalmente en las clulas de las glndulas mamarias (figura 12).

EXPRESIN DE GENES DE INTERES BIOTECNOLGICO CORRECCIN DE DEFECTOS GENTICOS

DNA

Figura 12. Introduccin de construidos de DNA en ovejas con lo que se obtiene un animal biofbrica que expresa genes de inters biotecnolgico y produce las protenas teraputicas en la leche

PRODUCCIN DE POTENCIALES PROTEINAS TERAPETICAS

Hormona de crecimiento humana producida en leche

La tabla 4 presenta algunos ejemplos de transgenes que se han expresado en tejido mamario utilizando promotores de genes que codifican para protenas de la leche. Los Organismos Genticamente Mejorados A pesar de la gran discusin mundial con relacin al riesgo potencialmente que puedan tener muchos de los desarrollos de organismos genticamente modificados (OGM), es innegable que tienen un gran futuro en la biotecnologa molecular y en su aplicacin a muchas de las actividades productivas humanas. Actualmente los OGM producidos por transgnesis se emplean para diversas aplicaciones tanto en el campo biotecnolgico en salud como en la alimentacin y en la agricultura.

Tabla 4. Transgenes de glndulas mamarias, secuencias promotoras y organismos receptores Transgene Activador del plasmingeno Antitripsina 1 Factor IX de coagulacin Protena CD4 soluble Lactoferrina Uroquinasa CFTR Interleucina 2 Promotor Protena acdica del suero lactoglobulina lactoglobulina Protena acdica del suero s 1-Caseina s 1-Caseina -Casena -Casena Especie transgnica Cabra Oveja Oveja Ratn Ganado Ratn Ratn Conejo

Modelos de investigacin: En la actualidad es el principal uso en la actualidad de los OGM animales. Se producen animales transgnicos con el fin de estudiar en modelos de laboratorio el funcionamiento gentico, el metabolismo y conocer la causa y posible cura de anomalas hereditarias (fibrosis cstica, diabetes, esclerosis mltiple), infecciones virales y cncer. El principal organismo utilizado es el ratn, del cual se desarrollan actualmente decenas de miles de variedades transgnicas. La mayora de ellas corresponde a variedades knock out (ratones con genes apagados) o a ratones humanizados (transgenes humanos). En la actualidad la investigacin en transgnesis aplicada a la produccin animal est siendo abordada en tres temas principales: i) modificacin de la calidad de la leche a travs de la incorporacin de protenas forneas; ii) mejoramiento de respuesta inmunitaria a ciertas enfermedades, y iii) mejoramiento de ciertas funciones biolgicas de importancia. Aplicaciones biomdicas: implican la utilizacin de animales transgnicos con el fin de obtener beneficios para la salud humana. A modo de ejemplo, se han generado salmones modificados con altos contenidos de cidos grasos omega-3, con los beneficios que estos compuestos tienen para la salud humana. Los xenotrasplantes (insercin de clulas o tejidos de una especie cualquiera en otra) constituyen una posible aplicacin de las tcnicas de manipulacin gentica en el uso medico. Se pretende modificar artificialmente las caractersticas antignicas de ciertos animales para permitir el transplante de sus rganos en humanos. Un problema del xenotransplante es el rechazo que el sistema inmunolgico del receptor hace de los tejidos del donante. El cerdo ha sido el animal ms estudiado con este propsito por su relativa facilidad de cra y su posicin filogentica con respecto al hombre (lo suficientemente cerca como para ser funcional, lo suficientemente lejos para disminuir el riesgo de transmisin de enfermedades). Biorreactores: Implica la elaboracin de productos inters farmacutico o industrial incorporando los genes que contienen la informacin para dichos productos en animales, generalmente de granja, para extraerlos de sus tejidos o de la leche. Los animales funcionaran as como fbricas vivas o biorreactores. Hasta el momento el uso de organismos transgnicos como biorreactores se limitaba al uso de microorganismos modificados; existen bacterias que producen insulina o vanilina (el componente aromtico de la vainilla). Actualmente una serie de empresas experimentan la extraccin de productos proteicos de importancia farmacutica a partir de la leche u otras secreciones de animales genticamente modificados. Una de estas empresas se encuentra en Argentina y experimenta con vacas transgnicas productoras de Insulina y factores de coagulacin.

Modificacin gentica de insectos vectores de enfermedades: Se estudia la modificacin de animales vectores de enfermedades virales y parasitarias, para que rechacen a los agentes causantes de la enfermedad en su organismo. Existe una investigacin en curso en los mosquitos Anopheles, transmisor de la malaria o paludismo y Aedes aegypti vector del dengue. Aplicaciones agroalimentarias: Un grupo importante de las aplicaciones de estas tcnicas involucran la generacin de animales con un mejor rendimiento en carne, leche o lana, e inclusive con resistencia a ciertas enfermedades y virosis como la tan conocida Encefalitis espongiforme (enfermedad de las vacas locas). Estas aplicaciones tambin han sido exploradas en piscicultura en China generando peces con un ritmo de crecimiento mayor a las variedades no modificadas, que le permite alcanzar la etapa de comercializacin en un tercio del tiempo de las especies originarias; adems algunos de los peces transgnicos presentan mejor eficiencia de conversin del alimento (salmones transgnicos). Tambin se estn desarrollando ovejas con cambios en su lana, vacas con mayor rendimiento de leche y cerdos que pueden digerir ciertas formas de fsforo vegetal (fitatos) que les permite crecer ms con raciones de menor calidad y con una eliminacin menor de fsforo en sus excretas (lo que representa menor contaminacin hdrica). En esta misma lnea se han investigado gusanos de seda que producen seda modificada o abejas resistentes a enfermedades. Otro grupo de investigaciones se propone modificar la calidad de los alimentos producidos, incorporndole nuevos nutrientes a alimentos ya conocidos o eliminando sustancias que provocan alergias. Controladores biolgicos modificados: Se investiga la mejora de invertebrados depredadores o parasitoides que han sido tradicionalmente usados como agentes de control biolgico. El departamento de Agricultura de los Estados Unidos tiene varios permisos de liberacin pendientes que involucran a caros depredadores, gusanos, nematodos, etc. Otras aplicaciones: Corresponden a propsitos ornamentales o estticos. Se han incorporado protenas fluorescentes de medusa en peces de acuario o incluso en conejos, para hacerlos ms atractivos o generar hechos artsticos (arte transgnico). Lecturas recomendadas Chang AC, Cohen SN. Genome construction between bacterial species in vitro: replication and expression of Staphylococcus plasmid genes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 1974 Apr;71(4):1030-4 Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB. (1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A.70:3240-4 Domnguez M C, Garca-Vallejo F. 2004. La epidemiologa genmica. Hacia un nuevo paradigma de la investigacin en salud pblica. Colombia Ciencia y Tecnologa. 22:14-25. Garca Vallejo F. y Domnguez M. C. (2003). Las Hlices Paralelas. Una visin crtica de la era genmica y postgenmica. Programa Editorial. Universidad del Valle. Pp 181. ISBN 958-670-251-0. Garca Vallejo F. (2000). Biologa Molecular y Biotecnologa en Medicina. Editorial Catorse. Cali. pp 386. ISBN 9589481-37-X Garca Vallejo F. (2004). El Nmada Molecular. Programa Editorial. Universidad del Valle. ISBN 958-670-262-0. Garca-Vallejo F, Barrera LA. (2001). La Terapia Gnica. Innovacin y Ciencia Volumen IX, No. 3 y 4: 88-97. Garca-Vallejo F. (2001). Cmo descifrar el genoma?. Innovacin y Ciencia Volumen IX, No. 3 y 4: 42-51 Garca-Vallejo F. (2004). Los alimentos genticamente modificados y la salud humana. Colombia Ciencia y Tecnologa. 22:5-15. Garca-Vallejo F.(1990). Aplicaciones de la ingeniera gentica en biologa y medicina. En La nueva Biotecnologa. ICA. pp199-206. Garret, R. H. & Grisham, C. M. (2000), Biochemistry, Saunders College Publishers, ISBN 0030758173. Ordoez P, Cern F, Garcia-Vallejo F. (2002). Construccin y expresin de una protena recombinante del Virus Linfotrpico Humano tipo I (HTLV-I). Colombia Mdica. 33:52-57 Paul Berg and Maxine F. Singer. (1995). The recombinant DNA controversy: Twenty years later. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92:9011-9013. Paul Berg, David Baltimore, Sydney Brenner, Richard O. Roblin III, and Maxine F. Singer. (1975). Summary Statement of the Asilomar Conference on Recombinant DNA Molecules. Proc. Nat. Acad. Sci. 72:1981-1984. Pourzand C, Cerutti P. Genotypic mutation analysis by RFLP/PCR. Mutat Res. 1993 Jul;288(1):113-21. Sandy MS, Chiocca SM, Cerutti PA. Genotypic analysis of mutations in Taq I restriction recognition sites by restriction fragment length polymorphism/polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Feb 1;89(3):890-4. Van Damme P, Van Herck K (2007). "A review of the long-term protection after hepatitis A and B vaccination". Travel Med Infect Dis 5 (2): 7984.