CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA PRECISIN Mediante el uso de materiales de soporte de tamao pequeo y uniforme, se pueden obtener reas de superficie

permitiendo separaciones cromatogrficas en columna altamente eficientes, pero las columnas empacadas con esos materiales ofrecen gran resistencia al flujo de lquidos, por lo que se requieren altas presiones para forzar las fases mviles que pasen de un extremo a otro. En los ltimos 10 aos los fabricantes de instrumentos cientficos han hecho posible disponer de columnas y empaques para columnas adecuados, sistemas de bombas a presin elevada con liberacin ininterrumpida y detectores sensibles. Estas unidades se pueden comprar en forma separada o como sistemas completos. Generalmente, las unidades son compatibles, cualquiera que sea el fabricante. En consecuencia la CLAP (que tambin se utiliza como abreviatura de cromatografa de lquidos de alta presin) se ha convertido en una tcnica muy usada, complementaria a la cromatografa de gases. Es particularmente valiosa para determinar compuestos no voltiles, y permite la estimacin rpida de aditivos, contaminantes y componentes naturales de los productos alimenticios. La teora de la CLAP ha sido comentada y revisada extensamente (Knox, 1973, 1975; Laird y cols., 1974). En la Fig. 3 7 se muestra un diagrama esquemtico de un sistema de la CLAP. INSTRUMENTACION Los detectores de la CLAP deben posibilitar la deteccin de cambios muy pequeos en la concentracin de compuestos orgnicos disueltos en la fase liquida mvil y por tanto, deben tener sensibilidad relativamente baja a la fase mvil. En uso general hay tres tipos de detectores que satisfacen estos requisitos. La absorcin UV es el sistema de deteccin mas til y de dispone de fotmetros adecuados con longitudes de onda fijas, usualmente 254 o 280 nm o bien, espectrofotmetros de longitud de onda variable. Debido a que es necesario detectar cantidades muy pequeas de compuestos que se eluyen por separacin con volmenes pequeos estos detectores estn fijos a celdas a travs de las cuales fluye un pequeo volumen (8-20/d). Algunos espectrofotmetros pueden medir la absorcin a longitudes de onda inferiores a 200 nm, a las cuales la mayor parte de los disolventes orgnicos absorben fuertemente. Esto es muy til desde el punto de vista analtico pero se necesitan disolventes ultra puros para la fase mvil. Muchas de las sustancias orgnicas absorben a longitudes de onda entre 250-300 nm; otras con absorbancia limitada o sin ella en esta regin pueden tener un cromforo apropiado que se le introduce formando derivados qumicos. Los fotmetros de fluorescencia o espectrofotmetros se han diseado tambin como detectores de la CLAP. El uso de la fluorescencia mejora la sensibilidad y por seleccin de las longitudes de onda de excitacin y emisin, la tcnica puede ser selectiva para compuestos de ciertos tipos. Los compuestos no fluorescentes se pueden detectar con gran sensibilidad por conversin en derivados fluorescentes, antes de de pasarlos por la columna (Lawrence y Frel, 1976).

Fig. Representacin esquemtica de un sistema de cromatografa de lquidos de alta precisin.

Los refractrnetros sensibles proporcionan mi sistema general de deteccin midiendo en una celda a travs de la cual se hacen fluir la diferencia en el ndice de refraccin entre el disolvente puro de la fase mvil y el eluyente de la columna que contiene la cromatografa de los compuestos separados. La diferencia se amplifica electrnicamente y se registra en un cromatograma. Para tener una buena estabilidad y la mayor sensibilidad, es necesario un control preciso de la temperatura y esto limita ahora el uso de tales detectores para la medicin de los componentes menores de los alimentos. La deteccin por IR no es conducente, ya que vara la composicin de la fase mvil (gradiente de elusin) durante la corrida cromatogrfica. Se han desarrollado mltiples tipos de columnas y empaques de columna; en el anlisis d alimentos slo son de uso generalizado tres tipos bsicos (Gray, 1978). Todos ellos estn basados en el gel de slice ce micropartculas, totalmente porosa, de forma esfrica o irregular, pero graduada finamente sea a 5 o 10 n de dimetro. Los tres tipos de slice para cromatografa de adsorcin invierten la cromatografa de fase y de fase asociada. La cromatografa de adsorcin en CLAP es la ms til para la Reparacin de compuestos no polares, mezclas de ismeros y de compuestos con diferentes grupos funcionales. Los empaques de fase inversa

estn compuestos ce slice con cadenas hidrocarbonadas, generalmente en C18 unidas qumicamente a la superficie por sililacin; sin embarg, requieren fases mviles ms polares que los empaques adsorbentes. Se pueden usar diferentes mezclas de disolventes polares que contienen agua y alcoholes, lo qu da mayor flexibilidad analtica. Las fases inversas tienden a eliminar sustancias orgnicas de los extractos de alimentos para formar depsitos y bloqueos en la parte superior de la columna. Los empaques adsorbentes no retienen los contaminantes, que pasan a travs de la columna y pueden interferir con el anlisis. Las fases asociadas, como las sustancias de fase inversa son slice sililizada, pero tienen grupos funcionales seleccionados unidos qumicamente y tienen aplicaciones especficas. Las fases asociadas a nitrilo y amino se usan con amplitud, Parecen tener efectos de adsorcin, y de particin. Hay fases con grupos funcionales ms polares, las cuales tienen propiedades intercambiadoras de iones. Se utiliza tubera de acero inoxidable de 100 -300 mm de longitud y con 3.0, 4.6 o preferiblemente 5.0 mm d dimetro interno para todos los tipos de empaque de micropartculas. Las columnas preempacada pueden adquirirse en el comercio, pero teniendo experiencia se pueden preparar en el laboratorio. Para tener una buena separacin y picos simtricos en el cromatograma, la Solucin de la muestra se debe aplicar cerca de la cabeza del empaque de la columna sin interrupcin, en el centro, lejos de las paredes de la columna a fin de hacer mnimos los efectos de difusin a las paredes. La inyeccin se puede hacer mediante varios dispositivos: una divisin o vlvula. Una caracterstica til de la CLAP es qu el flujo de la fase mvil puede detenerse durante la inyeccin, y a un si es necesario, durante el cordimiento cromatogrfico, sin que se altere la operacin. Se puede construir o comprar eficaces ajustes para la inyeccin, pero se prefieren aditamentos anulares para la muestra, dada su conveniencia, su facilidad de uso y alta reproducibilidad. Se cuenta con dos tipos de bombas: mecnica y por desplazamiento de gas. Las bombas mecnicas trabajan a una velocidad de flujo constante y la presin depende de la resistencia columna. Las bombas por desplazamiento de gas trabajan a una presin constante, la velocidad de flujo est determinada por la resistencia en la columna. La eficiencia de la columna depende, en parte, de la velocidad de flujo que se selecciona. Las columnas de alta precisin estn operadas comnmente a velocidades de flujo d 10-60 ml/h. Para obtener tal flujo usualmente se generan presiones de 500-5000 Ib/plg 2 (33-333 kg/cm2). La presin es dependiente de la permeabilidad de la columna, la viscosidad d la fase mvil del dimetro d la partcula y la longitud de la columna. CONSIDERACIONES PRCTICAS El sistema de disolventes que se va usar en una columna en particular, s escoge para proporcionar una resolucin adecuada con tiempos de retencin convenientes. La eleccin puede ayudarse por los datos d cromatografa en capa fina, si s dispone de ellos. La solubiliada elevada es importante tanto en el proceso cromatogrfico como en el aseguramiento de que el soluto no se precipitar en la cabeza de la columna despus de ser inyectado. La cromatografa con un nico disolvente mvil es inadecuada cuando s van a separar compuestos con tiempos de retencin muy diferentes. El uso de un sistema de disolventes en gradiente, en

los cuales la composicin cambia gradualmente, desde una adecuada para los componentes con tiempo de retencin breve a una que causa una. Elusin rpida de los componentes con tiempo prolongado d retencin, origina en un menor tiempo de anlisis y mejora la sensibilidad para los componentes de corrimiento lento. Sin embargo tiene la desventaja que se necesita tiempo para reacondicionar la columna d nuevo a la composicin inicial de la fase mvil y el gradiente de elusin normalmente no puede usarse con algunos detectores, de un modo notable con el refractmetro. Se pueden tener algunas alteraciones en la lnea de arranque en todos los detectores, a menos que sea adecuadamente compensada. El equipo para la CLAP ha sido revisado por Chandler y McNair (1973), y McNair (1974). Se dispone de varios textos prcticos (por ejemplo, Knox, 1978; Bristow, 1976) y Saxby (1978) han descrito aplicaciones recientes de la CLAP en el anlisis de alimentos.

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA PRECISIN

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN (HPLC) Elucin por alta presin (hasta 500 atmsferas) Alta resolucin, rapidez y reproducibilidad Purificacin de molculas biolgicas de gran variedad de Propiedades y tamaos.

http://www.uv.es/~salgado/medicina/.files/Practica3.pdf La cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) es, dentro de las tcnicas cromatogrficas, la mas utilizada. El proceso de separacin cromatogrfica puede definirse como la transferencia de masas entre una fase estacionaria y una mvil. La mezcla que contiene los compuestos a separar es disuelta e inyectada en una columna rellena de fase estacionaria a travs de la cual es forzada a pasar por una fase mvil impulsada por la bomba de alta presin. Dentro de la columna la mezcla se separa en sus componentes en

funcin de su interaccin entre las dos fases. Esta separacin puede ser modificada eligiendo adecuadamente tanto la fase mvil como la estacionaria, el flujo de la fase mvil o la temperatura de la separacin. De esta forma la tcnica de HPLC adquiere un alto grado de versatilidad difcil de encontrar en otras tcnicas, siendo capaz de separar los componentes de una gran variedad de mezclas.

http://www.unav.es/organica/tecnicas/pagina_6.html CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA Este captulo trata los cuatro tipos bsicos, de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido: (1) la eromatografa de reparto; (2) la cromatografa de adsorcin, o cromatografa lquido-slido; (3) la cromatografa inica; y (4) cromatografa de exclusin por tamao, o cromatografa en geles. La mayor parte de este captulo tiene relacin con las aplicaciones de estos cuatro importantes tipos de cromatografa en columna. Sin embargo, el ltimo apartado presenta una breve descripcin de la cromatografa de lquidos en plano, dado que esta tcnica proporciona una forma simple y barata de obtener informacin acerca de las condiciones ptimas ms probables para llevar a cabo las separaciones en columna. En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm; en este tipo de columnas realiz Tswett sus trabajos originales. Para asegurar anos caudales razonables, el dimetro de las partculas de la fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200 mm. Incluso as, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separacin eran largos, a menudo de varias horas. Sin embargo, los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de vaco o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en las grficas de la altura de plato frente al caudal (vase Figura 26-7a) y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se dieron cuenta que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue hasta males de los anos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y utilizar rellenos de tamao de partcula tan pequeos como los del orden de 3 a 10 mm. Esta tecnologa

requiere una instrumentacin sofisticada para poder trabajar a altas presiones, lo que contrasta notablemente con las simples columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica cuyo caudal se debe a la gravedad. Para distinguir estos procedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan confines preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC). Este captulo trata exclusivamente de la HPLC1.

CAMPO DE APLICACIN DE LA HPLC La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de mil millones (10 9) de dlares. Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una variedad de sustancias inorgnicas. La Figura 28-1 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10.000, a menudo se utiliza la cromatografa de exclusin por tamao, aunque ahora tambin es posible tratar estos compuestos con cromatografa de reparto en fase inversa. Para especies inicas de masa molecular mas pequea, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico. Los mtodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no inicas. Adems, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una serie homloga. La cromatografa

de adsorcin se elige con frecuencia para separar especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos. EFICACIA DE LA COLUMNA EN LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS La discusin sobre el ensanchamiento de banda del Apartado 26C-3, por lo general, es aplicable a la cromatografa de lquidos. En esta seccin se ilustra el importante efecto del tamao de partcula del relleno que forma la fase estacionaria y se describen otras dos causas adicionales del ensanchamiento de zona, que a veces son de notable importancia en cromatografa de lquidos. EFECTOS DEL TAMAO DE PARTCULA DEL RELLENO Un examen del coeficiente de transferencia de masa de la fase mvil en la Tabla 26-3 (pgina 742) revela que C M en la Ecuacin 26-19 est relacionada directamente con el cuadrado del dimetro d P de las partculas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de partcula. La Figura 28-2 es una demostracin experimental de este efecto, y en ella se observa que una reduccin del tamao de partcula de 45 a 6 mm origina una disminucin de diez o ms veces de la altura de plato. Obsrvese que ninguna de las grficas de esta figura presenta el mnimo que predice la Ecuacin 26-19. Estos mnimos se observan en la cromatografa de lquidos (vase Fig. 26-7a), pero por lo comn a caudales que son demasiado bajos para la mayora de las aplicaciones prcticas.

ENSANCHAMIENTO DE BANDA EXTRACOLUMNA EN CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS En cromatografa de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna propiamente dicho. El as llamado ensanchamiento de banda extra-columna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de las diferencias en la velocidad de flujo de las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con ms rapidez que la periferica. En cromatografa de gases la difusin compensa la dispersin extra-columna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente.

Se ha demostrado que la contribucin a la altura total de plato de los efectos extra-columna Hex, viene dada por2

(28-1) donde m es la velocidad lineal de flujo en cm/s, r es el radio del tubo en cm, y DM es el coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil en cm 2/s. Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extra-columna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna a valores inferiores a 0,10 pulgada (2,5 mm). EFECTO DEL TAMAO DE MUESTRA EN LA EFICACIA DE LA COLUMNA La Figura 28-3 muestra el efecto de la cantidad de muestra (feg de muestra/g de relleno) sobre la eficacia en diversos tipos de cromatografa de lquidos. Obsrvese el mejor comportamiento de los rellenos de fase unida qumicamente en fase inversa (Seccin 28D-1) comparados con otros tipos de rellenos. INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 2 y 10 mm que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kg-fuerza por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La Figura 28-4 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta eficacia tpico; cada uno de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin3. RECIPIENTES PARA LA FASE MVIL Y SISTEMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES Un aparato moderno de HPLC est equipado con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene de 200 a 1.000 mL de un disolvente. Los recipientes, a menudo se equipan con un sistema

para eliminar los gases disueltos -en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas en la columna y en los sistemas de deteccin. Estas burbujas provocan ensanchamientos de banda y a menudo interfieren en el funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 28-4, sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin en los disolventes para evitar que estas partculas daen la bomba o los sistemas de inyeccin u obturen la columna. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 28-4. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos a vaco a travs de un filtro (millipore) de tamao de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases, as como la materia en suspensin.

Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficacia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos o tres sistemas disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez que comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.

La Figura 28-5 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de una mezcla de clorobencenos. La Figura 28-5b corresponde a la elucin isocrtica con metanol/agua, v/v, 50:50). La Figura 28-5a muestra la elucin con gradiente, que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentracin de metanol un 8 por 100/min. Obsrvese que la elucin con gradiente acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la resolucin de los primeros picos. Obsrvese tambin que la elucin con gradiente produce unos efectos similares a los producidos por la programacin de temperatura en cromatografa de gases (vase Fig. 27-5). SISTEMAS DE BOMBEO Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen (1) la generacin de presiones por encima de 6.000 psi, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min, (4) el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0,5 por 100 relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o Tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo

supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio. Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. BOMBAS RECPROCAS Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90 por 100 de los sistemas de HPLC comerciales, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor de arrastre (vase Fig. 28-6). Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. El disolvente est en contacto directo con el pistn. Tambin se puede comunicar la presin al disolvente mediante un diafragma flexible, el cual a su vez se bombea hidrulicamente por un pistn de vaivn. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo pulsado, que se ha de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base del cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 10.000 psi), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente.

BOMBAS DE DESPLAZAMIENTO Las bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cmaras como una jeringa, equipadas con un mbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamiento tambin producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresin. Adems, el flujo que resulta est libre de pulsaciones. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada ( 250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes.

BOMBAS NEUMTICAS En las bombas neumticas ms simples, la fase mvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en un vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y estn exentas de impulsos; aunque tienen una limitada capacidad y presin de salida, y adems el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin de la columna. Adems, no son utilizables en la elucin con gradiente y estn limitadas a presiones menores de unos 2.000 psi. CONTROL DEL CAUDAL Y SISTEMAS DE PROGRAMACIN Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. La mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada. Por ejemplo, el instrumento que se ha mostrado en la Figura 28-4 contiene una vlvula proporcional que permite mezclar hasta cuatro disolventes en una forma previamente programada y variable continuamente. SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se acenta por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500mL. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El medio ms simple y antiguo para la introduccin de las muestras implicaba la inyeccin con una jeringa a travs de un elastmero (septum) que cierra hermticamente. Con esta finalidad se utilizaron microjeringas capaces de resistir presiones de hasta 1.500 psi. En las inyecciones aflujo detenido, el flujo del disolvente se detiene momentneamente, se retira el conector de la cabeza de la columnna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la columna despus se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar. La ventaja de esta tcnica es su sencillez. Desafortunadamente, la reproducibilidad de la inyeccin con jeringa rara vez es mejor de un 2 o un 3 por 100 y con frecuencia es considerablemente peor. En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que aparece en las Figuras 28-7 y 27-4. Estos dispositivos son normalmente una parte integrada del equipo cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 mL. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 7.000 psi con una

precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 mL.

COLUMNAS PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas ltimas slo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi. Se comercializan por distintos fabricantes cientos de columnas rellenas que difieren en el tamao y el relleno y su coste oscila, por lo general, de 200 $ a 500 $ 4. COLUMNAS ANALTICAS La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 mcm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. En algunas ocasiones se pueden encontrar columnas configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta prdida de eficacia. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 5 0 10 mm. Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, y rellena con partculas de 5 mm. Este tipo de columnas tiene de 40.000 a 60.000 platos/metro. Recientemente, se han empezado a fabricar columnas de alta eficacia, ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas5. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de tamao de 3 0 5 mm. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Estas columnas tienen hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros. La Figura 28-8 ilustra la rapidez con la que se puede realizar una separacin con este tipo de columnas. As, ocho componentes distintos se separan en unos 15 s. La columna es de 4 cm de longitud y un dimetro interno de 4 mm; est rellena con partculas de 3 mm.

PRECOLUMNAS En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna que elimina no slo la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes sino tambin componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debera ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. Cuando la precolumna se contamina se vaca y se rellena de nuevo o se remplaza por otra nueva del mismo tipo. As, la precolumna se sacrifica para proteger a la columna analtica, ms cara. COLUMNAS TERMOSTATIZADAS En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 100 o 150 C. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante TIPOS DE RELLENOS DE LA COLUMNA En crornatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o

de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 mm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina, de una resina sinttica de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas. Los tpicos rellenos de partculas porosas para cromatografa de lquidos estn formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 Mm y con la menor dispersin posible con respecto a un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina, de una resina sinttica de poliestirenodivinilbenceno o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material de relleno ms comn en cromatografa de lquidos. Las partculas de slice se preparan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrometro en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes. Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie. DETECTORES 6 A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica descritos en el Apartado 2713-4. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. TABLA 28-1. CARACTERSTICAS DE LOS DETECTORES DE LC LOD de LOD de masa disponible masa Detector LC (detectores comercialmente (estado comerciales)a actual)b Absorbancia Sc 100 pg-1 ng 1 pg Fluorescencia Sc 1-10 pg 10 fg c Electroqumica S 10 pg-1 ng 100 fg ndice de 100 ng-1 S 10 ng refraccin **fig** Conductividad S 500 pg-1 ng 500 pg Espectrometra d S 100 pg-1 ng 1 pg de masas FT-IR S 1 **fig** 100 ng Dispersin de S 10 **fig** 500 ng la luze Actividad ptica No 1 ng

a)

b) c) d) e)

Selectivo de No 10 ng elementos Fotoionizacin No 1 pg-1 ng El LOD de masa se calcula para la masa inyectada que proporciona una seal iguala cinco veces la s del ruido, empleando un compuesto de masa molecular 200 g/mol e inyectando 10 mL en LC convencional y 1 mL en LC microcaplar. La misma definicin que en a, pero el volumen inyectado es por lo general menor Disponible comercialmente tambin para LC microcapilar. Disponible comercialmente, todava muy caro. Incluyendo la dispersin de la luz de ngulo bajo y la nefelometra. (Reproduccin autorizada de E. S. Yeung y R. . Synovec, Anal. Chem., 1986, 58, 1238.)

CARACTERSTICAS DE UN DETECTOR IDEAL Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades relacionadas en la pgina 765, para la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda (Apartado 2813-2). TIPOS DE DETECTORES Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores que se basan en la medida de una propiedad de la disolucin responden a una propiedad del efluente, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente lmite, que no son inherentes a la fase mvil. En la Tabla 28-1 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes. Una revisin de 1982 sobre 365 artculos publicados en los que la cromatografa de lquidos tena un papel importante, revel que el 71 por 100 utilizaban la deteccin de la absorcin UV, el 15 por 100 la fluorescencia, el 5,4 por 100 el ndice de refraccin, el 4,3 por 100 empleaba medidas electroqumicas y el 4,3 por 100 restante otras medidas'. De los detectores de absorcin UV, el 39 por 100 utilizaban una de las lneas de emisin del mercurio, el 13 por 100 la radiacin filtrada de una lmpara de deuterio y el 48 por 100 la radiacin despus de pasar por un monocromador de red.

DETECTORES DE ABSORBANCIA

La Figura 28-9 muestra el esquema de una celda de flujo en forma de Z para las medidas de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 ML y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida, en la mayor parte de los casos, a presiones no mayores de unos 600 psi. En consecuencia, a menudo es necesario un dispositivo para reducir la presin. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos contrastados. Alternativamente, en combinacin con un solo fototubo se utiliza un sistema de corte haz semejante al mostrado en la Figura 9-13b. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin del logaritmo del cociente de las dos seales detectadas en funcin del tiempo. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.