Cintica Microbiana Crecimiento microbiano Para los microorganismos, el crecimiento es la respuesta ms inmediata al medio fisicoqumico.

El crecimiento es el resultado de la replicacin y cambio en el tamao de la clula. Los microorganismos pueden crecer bajo una gran variedad de condiciones fsicas, qumicas y nutricionales. En un medio ideal, los microorganismos extraen nutrientes del medio y los convierten en compuestos biolgicos. Los nutrientes, entonces, se emplean para la produccin de energa y para la biosntesis y formacin de productos. Como resultado la masa microbiana aumenta con el tiempo y puede ser descrita como: Sustrato + clulas productos + clulas nuevas El crecimiento microbiano es un excelente ejemplo de una reaccin auto cataltica. La tasa de crecimiento est directamente relacionada a la concentracin celular, y la reproduccin celular es un resultado de dicha reaccin. La tasa de crecimiento microbiano se caracteriza por una tasa especfica de crecimiento () definida como:

Donde X es la concentracin msica celular (g/L), t es el tiempo (h) y es la tasa especifica de crecimiento (h-1). El crecimiento se puede ilustrar a travs de una curva que representa la relacin entre el nmero de microorganismos y el tiempo, como se observa en la figura 1. La curva de crecimiento microbiano tiene seis etapas claramente diferenciables.

Figura 1. Curva de crecimiento microbiano y sus distintas fases

I.

II.

III.

Fase Lag: Durante esta etapa la razn de crecimiento es nula. La fase lag ocurre inmediatamente despus de la inoculacin y es un periodo de adaptacin de las clulas a su nuevo ambiente. En esta etapa, la clula puede llegar a crecer un poco, sin incrementar en lo absoluto el nmero de clulas. Cuando el inoculo es pequeo y tiene una fraccin numrica celular viable baja, puede existir una fase pseudo-lag, la cual no se debe a la adaptacin sino al mal estado del inoculo. Bajas concentraciones de algunos nutrientes y la falta de factores de crecimiento pueden prolongar la fase lag. As mismo, la edad del inoculo tiene una gran repercusin en la duracin de la fase lag: generalmente, a mayor edad del inoculo, mayor ser el tiempo de la fase lag. La fase lag no ocurre cuando el inoculo se encuentra en un estado metablico de crecimiento exponencial durante su transferencia. Fase de crecimiento acelerado: En esta etapa, la tasa de crecimiento aumenta gradualmente, alcanzando un mximo nivel al final de la etapa. Los factores que afectan esta etapa, son comnmente, los mismos que afectan a la fase lag. Fase de crecimiento exponencial: Durante esta etapa, las clulas se han adaptado al nuevo entorno. Despus del periodo de adaptacin, las clulas pueden multiplicarse rpidamente y la masa y la densidad celular aumentan exponencialmente con el tiempo, es un periodo de crecimiento balanceado en el que todos los componentes celulares crecen a la misma velocidad. Durante este crecimiento balanceado, la tasa especfica de crecimiento determinada por el nmero de clulas o masa celular ser igual. Como la concentracin de nutrientes es elevada en esta, la tasa de crecimiento es independiente de la concentracin de nutrientes, el crecimiento exponencial se vuelve de primer orden:

IV.

V.

VI.

Fase de crecimiento retardado: Esta fase empieza cuando uno de los sustratos esenciales se vuelve limitante o se acumulan subproductos txicos generados durante la etapa de crecimiento. Durante esta etapa, la tasa de crecimiento especfico depende de la concentracin del sustrato limitante. En esta etapa de desaceleramiento se produce un crecimiento desbalanceado. Fase estacionaria: En esta etapa el crecimiento neto es cero o igual a la tasa de muerte. A pesar de que el crecimiento sea cero, durante sta las clulas continan metabolizando activamente y produciendo metabolitos secundarios en etapas de no crecimiento. La produccin de metabolitos secundarios, en procesos biotecnolgicos especficos, se estimula voluntariamente durante esta etapa. Durante la fase estacionaria, las clulas catabolizan reservas celulares para la construccin de nuevos bloques y generacin de energa (metabolismo endgeno). La razn para la culminacin del crecimiento es por abatimiento de nutrientes y/o acumulacin de sustancias toxicas; si productos inhibidores se acumulan a cierto nivel, el crecimiento cesar por inhibicin. Fase de declinacin o muerte: Inicialmente despus de la fase estacionaria, ocurre la fase de muerte; debido a que ya en la etapa estacionaria existe muerte celular, las

distincin precisa del momento en el que sucede la fase de declinacin no es clara. La tasa de muerte usualmente ocurre como una cintica de primer orden:

Durante la fase de muerte, las clulas pueden o no efectuar lisis, y el restablecimiento del cultivo puede ser desarrollado durante una etapa temprana de la fase de decline, si las clulas son transferidas a un medio rico en nutrientes. Metabolitos primarios y secundarios El metabolismo es el conjunto de procesos y reacciones qumicas anablicas (requieren energa) y catablicas (liberan energa); por los cuales un microorganismo obtiene la energa y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metablicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las caractersticas metablicas especficas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel ecolgico, su responsabilidad en los ciclos biogeoqumicos y su utilidad en los procesos industriales. Metabolitos primarios. Se producen en el curso de las reacciones metablicas anablicas o catablicas que tiene lugar durante las fases decrecimiento y que contribuyen a la produccin de biomasa o energa por las clulas. Se producen principalmente en la tropofase o fase de crecimiento. Son necesarios para el crecimiento del m.o que los produce Se producen como productos nicos Son producidos por todos los microorganismos (son universales) La produccin no puede perderse fcilmente por mutacin espontanea Los ms importantes desde el punto de vista industrial son 1- Componentes esenciales y productos formados por los microorganismos: protenas, cidos nucleicos, polisacridos (dextranos, alginatos, gelanos, xantanos) y polisteres (PHB y plsticos), cidos grasos (saturados e insaturados), esteroles (ergosterol) 2- Derivados del metabolismo intermedio: azucares (fructosa, ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconico, cido lctico, ctrico, actico, propionico, succnico, fumarico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (carotenos, B2, B12), nucletidos saborizantes (cidos inocinico y guanilico), polisacridos y polisteres de reserva. Metabolitos secundarios. Se producen por rutas anablicas especializadas cuando no hay crecimiento. Significado evolutivo controvertido por ser imprescindibles. Pueden ser una estrategia para mantener en funcionamiento los sistemas metablicos cuando no hay crecimiento; tambin sirven como indicativos de diferenciacin y se producen durante la idiofase de los cultivos. Entre sus caractersticas comunes; tienden a producirse cuando el crecimiento est limitado (cultivo continuo); se forman por enzimas especficos a partir del metabolismo central; no son esenciales para el crecimiento o para el metabolismo central y son especficos para cada especie, y a veces, de cada cepa.

Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados qumicamente entre si La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontanea Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos

Clasificacin de los productos que se pueden obtener de los microorganismos (segn que funcin cumplan dentro del metabolismo) I. Productos finales del metabolismo energtico. Son ejemplos de este grupo el etanol, cido lctico, actico, butrico, butanol, y otros compuestos asociados a procesos anaerobios. Su formacin es consecuencia directa de la degradacin de la fuente de carbono para obtener energa Productos intermedios de metabolismo primario. Pertenecen a este grupo los aminocidos, los nucletidos, las vitaminas, los cidos orgnicos, y pueden incluirse tambin biopolmeros como enzimas. Los procesos de obtencin son aerobios y la formacin de estos productos ocurre principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso lo que se pretende es lograr una regulacin anormal del metabolismo tal que la fuente de carbono y energa se derive hacia la formacin del producto deseado. En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo, no existe una relacin directa entre la generacin de energa y la sntesis de los productos de este grupo. Productos de metabolismo secundario. Pertenecen a este grupo los antibiticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas. Histricamente se ha considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de los metabolitos primarios, aunque tal afirmacin se encuentre actualmente en revisin. Cualquiera sea el caso, existen algunas caractersticas que diferencian a este grupo del anterior. Frecuentemente los precursores especficos para la biosntesis de estos productos son obtenidos por modificacin de metabolitos primarios. Por otra parte estos precursores suelen ser limitantes de la biosntesis. El cultivo continuo y el batch alimentado son sistemas de cultivo que permiten regular la velocidad de crecimiento, y por tanto muy apropiados para obtener este tipo de productos. Los productos de este grupo comparten con el anterior la necesidad de un adecuado suministro de oxgeno para su formacin. Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen

II.

III.

Medidas del crecimiento celular El crecimiento de una poblacin se mide a travs de: Mtodos directos: Numero de clulas Peso de la biomasa Mtodos indirectos: Consumo de nutrientes Formacin de productos Calorimetra ATP La seleccin del mtodo para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de: Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos) Propiedades del medio de cultivo Sensibilidad requerida Confianza del mtodo Velocidad necesaria Mtodos directos Medida del numero de clulas: o Cuenta directa (microscopio): conteo total de clulas cmaras especiales

o Cuenta en placa: conteo solo de clulas viables

Medida de la masa celular o Peso seco: Filtracin (<0.2 m) de la suspensin de bio masa peso del filtro + biomasa. Centrifugacin o Turbidez: cuantificacin de la densidad ptica de una suspensin de clulas curva patrn con numero conocido de clulas o Volumen celular empacado: para clulas empacadas

Cintica Microbiana El crecimiento microbiano es un fenmeno totalmente complejo debido al nmero y tipo de reacciones llevadas a cabo a lo largo de su desarrollo, as como su dependencia a factores externos que pueden ejercer influencia sobre el mismo. Por ello, el entendimiento de la dinmica de crecimiento microbiano se clarifica en trminos de una descripcin cintica. Definiciones Crecimiento: incremento ordenado de los constituyentes qumicos de los microorganismos. Aumento en el nmero de clulas o en la masa celular.

Tasa de crecimiento: cambio en el nmero de clulas o masa celular por unidad de tiempo Tiempo de duplicacin (td): tiempo necesario para que a partir de una clula se formen dos (para que se duplique) Numero de generaciones (n): numero de divisiones celulares en un determinado tiempo. Crecimiento exponencial Durante la fase exponencial incremento de la poblacin en el que el nmero de clulas se duplica cada cierto tiempo

Representando lo anterior en forma grafica

Obtener informacin sobre la tasa de crecimiento a partir de curvas aritmticas es difcil escala logartmica (lnea recta)

Tiempo de duplicacin El numero de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por:

Donde n= numero de generaciones; t= tiempo del cultivo; td= tiempo de duplicacin La concentracin de biomasa despus de cierto tiempo de crecimiento exponencial puede cuantificarse, en funcin de la biomasa inicial, a travs de:

Donde x= numero final de clulas; x0= numero inicial de clulas Con base en las ecuaciones anteriores, si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos calcular el nmero de generaciones (n) y el tiempo de duplicacin

Velocidad especifica de crecimiento ()

Tasa especifica de crecimiento () Velocidad a la cual una poblacin microbiana se duplica en un tiempo determinado (fase exponencial)

Velocidad especifica de crecimiento A pesar de que el crecimiento de las clulas es un fenmeno complejo, a menudo se puede obtener una descripcin global buena del mismo a travs de ecuaciones relativamente sencillas. Entre ellas la ms usada es la ecuacin de Monod, esta ecuacin describe el crecimiento celular en funcin de la disponibilidad de un sustrato limitante y se puede expresar de la siguiente manera: Sustrato (S) + Clulas (X) mas clulas (X) + Producto (P)

Donde rx es la velocidad de crecimiento de clulas, max es la velocidad especfica mxima de crecimiento y KS es la constante de Monod (constante de afinidad por el sustrato). KS es el valor de la concentracin del nutriente limitante a la que la velocidad especfica de crecimiento es la mitad de la mxima. Para valores de S inferiores a Ks, la velocidad de crecimiento depende de una forma lineal de S, mientras que para valores superiores, el valor de se hace independiente de S.

Figura 2. Dependencia de la velocidad especfica de crecimiento respecto a la concentracin de sustrato limitante segn la ecuacin de Monod. Rendimientos Los rendimientos se definen como la relacin entre el producto obtenido y el sustrato consumido, usualmente referidos a la fuente de carbono y energa. El rendimiento celular se define a travs del concepto de nutriente limitante. Un nutriente limitante es aquel sustrato cuyo consumo controla la velocidad de produccin de biomasa, es decir, que la velocidad de crecimiento celular es funcin de tal nutriente. En muchos casos existen ms de un nutrientes u otros factores que intervienen en dicha velocidad, pero para simplificar se considera siempre que uno es esencial y el ms importante.

El sustrato normalmente es la fuente de carbono. El consumo de sustrato no est dedicado slo a la produccin de biomasa, este tiene tres usos: asimilacin de los microorganismos como material celular, provisin de energa para la sntesis celular y energa para el mantenimiento celular

El rendimiento terico se define como que es el sustrato empleado en la asimilacin de los microorganismos como material celular, tambin se llama el rendimiento del crecimiento, este rendimiento permanece constante si la composicin celular se mantiene constante. Sin embargo el rendimiento global depender de la fraccin de sustrato consumido en cada una de las actividades celulares. Existen otros rendimientos referidos a otros parmetros del proceso o en funcin de otras variables. Estos pueden ser como los que siguen a continuacin:

Con todo esto se puede escribir la siguiente ecuacin:

Donde rs es la velocidad de desaparicin de sustrato, rx es la velocidad de aparicin de biomasa, rp es la velocidad de aparicin de producto y rc es la velocidad de aparicin de CO2. Cintica del consumo de sustrato

El sustrato es consumido por el microorganismo tiene como finalidad el crecimiento celular, mantenimiento de las actividades vitales y la generacin de producto, para el caso donde la formacin de producto no est asociada de forma directa al metabolismo energtico. Para modelar la variacin de la concentracin de sustrato con el tiempo se proponen diversas ecuaciones.

La ecuacin cintica global ser:

Cintica de formacin de producto De manera anloga al modelo cintico de consumo de sustrato se plantean diferentes ecuaciones para modelar la formacin de producto.

Y mediante el uso de las dos condiciones anteriores se obtiene el modelo de Luediking-Piret, parcialmente asociado al crecimiento