Trabajo cientfico

Recogida de muestras para el laboratorio Qu, cmo, cul, cunto?

Paloma Chaves Sanz
Directora tcnica del laboratorio APG Rodriguez San Pedro 10 28015 Madrid

Obtencin
La primera pregunta que nos planteamos cuando tenemos que hacer un anlisis de sangre es qu tipo de aguja debo emplear, en que tipo de tubo tengo que recogerlo, qu cantidad de sangre se necesitar? El uso de palomillas o agujas y el distinto calibre de las mismas, lo mismo que el volumen de las jeringuillas y la eleccin de la vena depender en ocasiones del tamao del animal al que vamos a extraer la sangre. La cantidad de sangre extrada depender tambin de las pruebas que solicitemos al laboratorio. La aguja rosa es de 18G (la ms gruesa), la amarilla de 20G, la verde de 21G, la azul de 23G y la naranja de 25G de insulina (la ms fina). (Fig. 1)

Figura 2 Qu tubo elijo?

Figura 3 Cdigo Internacional de colores para recogida de tubos (Norma ISO 6740)

Figura 1Qu calibre de aguja, que jeringuilla, qu cantidad? Depender del tipo de animal.

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Anticoagulante

Modo de accin

Cantidad/ ml sangre

Ventajas

Inconvenientes

Utilizacin

Color tapn

EDTA Na o K Quelante Calcio Inhibe paso protrombinatrombina 1-2 mg/ml

Conserva morfologa clulas sanguneas Conserva pH sanguneo

Interfiere determinaciones bioqumicas

Hemograma Parsitos hemticos

LILA

Heparina Na,K, Li, Li,NH4

20 U/ml

Desaconsejable hematologa Conserva factores lbiles coagulacin algunas horas Desaconsejable en otras determinaciones bioqumicas

Perfiles bioqumicos

VERDE

Citrato sdico

Quelante calcio

Sol. 3,8%: 1vol.citrato/ 9 vol. sangre

Hemostasia

Coagulacin

AZUL

Fluoruro Sdico

Inhibe gluclisis

2-4mg/ml

Conservador de la glucosa

Deter. de la glucosa

GRIS

Sin anticoagulante

Bioqumica Inmunologa

ROJO

En cuanto a los tubos, existe un Cdigo internacional de colores para recogida de tubos (norma ISO 6740), (Figura 3). Dependiendo del color del tapn el anticoagulante ser diferente y se utilizar para distintos fines. Tubo de tapn lila lleva EDTA sdico o potsico se usa para la realizacin de hemogramas y estudio de clulas y parsitos hemticos. Tubo de tapn verde lleva heparina sodio, potasio, litio y amonio se utiliza para perfiles bioqumicos. Tubo de tapn azul lleva citrato sdico y se utiliza para pruebas de coagulacin. El tubo de tapn gris lleva fluoruro sdico y se utiliza para determinacin de glucosa. Tubo de tapn rojo no lleva ningn tipo de anticoagulante. Con l obtenemos suero para pruebas de bioqumica, hormonas e inmunologa.

Hemograma
El tapn lila corresponde al anticoagulante EDTA (etilendiaminotetra-actico) en forma de sales de sodio o potasio (Fig.4). El EDTA es el anticoagulante que mejor conserva las clulas sanguneas. Acta como anticoagulante por ser quelante del calcio de la muestra. La concentracin de la muestra debe ser de 1-2 mgr/ml de sangre. Esto lo conseguimos aadiendo la cantidad de sangre que nos indica el tubo.

Fig.4 Tubos de EDTA

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Excepcionalmente podemos hacer un hemograma en tubos con otro tipo de anticoagulante como por ejemplo Heparina litio pero conserva peor la morfologa celular y se producen con ms frecuencia todava agregados plaquetarios.

Se puede hacer un hemograma con 0,5 a 1 ml de sangre. Mirad en el tubo siempre la seal hasta donde hay que llenarlo de sangre. En caso de usar tubos Tapval podemos quitar la aguja e introducir en mbolo por el orificio superior (Fig. 8), es muy cmodo pero si lo vamos a remitir al laboratorio, la sangre puede salirse y no os podis imaginar lo que cunde una gota de sangre (Fig. 9) en un sobre y no podis imaginaros como llega el tubo o tubos que le acompaan al laboratorio pues sigue goteando.

Mtodos
Una vez obtenida la muestra de sangre quitamos la aguja de la jeringuilla y solo con esta introducimos la sangre en el tubo correspondiente. (Figuras 5 y 6). Tapamos con el tapn e invertimos suavemente varias veces (cinco o seis) para que la sangre se mezcle bien con el anticoagulante. Nunca bruscamente como si fuera una coctelera.

Figura 9

Figura 5

SI

Figura 6

Figura 8 NO

Si aadimos un volumen distinto de sangre al indicado en el tubo tendremos problemas. Si el volumen de sangre es mayor al del tubo se nos coagular la sangre. Si el volumen de sangre es menor se nos producirn: Hemlisis, crenacin de los hemates, falsas disminuciones del hematocrito, VCM y falsos aumentos de CCMH. Figura 7 El tubo de la izquierda tiene poco volumen de sangre y el de la derecha demasiada por lo que se ha formado un cogulo. Figura 10 Por favor quitad el tapn, os llevar unos segundos ms y hacedlo como si fuera un tubo de tapn hermtico (Fig.10).

Identificacin
Es importantsimo identificar los tubos con los datos del animal al que realizaremos el anlisis antes incluso de depositar la sangre en l. Evitaremos as un posible error preanaltico que puede complicarse en el laboratorio. (Figura 11) Si adems acompaamos a las muestras identificadas de un protocolo facilitaremos mucho el trabajo al laboratorio, indicando: Los datos del animal: Nombre, raza, sexo, edad. Datos de la clnica o veterinario que la remite. Tipo de muestra. Breve historia clnica. Tratamientos empleados. Determinacin que se solicita.

NO

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La contaminacin con un exceso de antisptico puede producir hemlisis debido al alcohol. La extraccin de sangre extravasada puede producir hemlisis y agregacin plaquetaria (Fig. 13 y 14)

Figura 10 SI

Fig.13. Agregados plaquetarios. Fig. 14. Hemlisis NO La contaminacin con el lquido de fluidoterapia producir una dilucin de la muestra e incluso contaminacin de la misma si el fluido lleva potasio produciendo hiperkalemia (Fig. 16).

Conservacin:
Lo ideal son dos horas desde la obtencin de la muestra a temperatura ambiente o 24 horas en nevera a 4 C para no alterar los valores del hemograma. JAMS introducir en el congelador. Las plaquetas deben determinarse lo antes posible para evitar agregados. Los frotis sanguneos deben realizarse como mximo dos horas despus de haber obtenido la muestra y fijarlos en metanol durante dos minutos una vez secos. Hay una serie de factores a considerar Un animal estresado puede presentar Hperglucemia, neutrofilia madura y/o linfocitosis. Produciremos hemlisis si usamos agujas de bajo calibre y jeringas de alto volumen (Figura 12). Figura 12

Fig. 15. Crenacin de hemates

Figura 16

NO

Si el volumen de sangre es mayor al del tubo se nos coagular la sangre. Si el volumen de sangre es menor se nos producirn: Hemlisis, creacin de los hemates (Fig. 15), falsas disminuciones del hematocrito, VCM y falsos aumentos de CCMH.

NO

Pruebas de bioqumica
Las podemos hacer prcticamente todas en suero, en plasma tambin siempre que el anticoagulante no interfiera en la prueba.

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Los tubos de suero no llevan ningn tipo de anticoagulante y el tapn es de color rojo, segn las norma ISO 6710 (Fig.17). En el mercado hay tubos sin anticoagulante que no siguen esta norma y hay tapones de todos los colores. Tenemos que asegurarnos que el tubo elegido para suero no lleve anticoagulante de ningn tipo. Para inmunologa el tubo de eleccin es el de suero lo mismo que para la determinacin de hormonas. Las pruebas de bioqumica tambin pueden hacerse en plasma recogido en un tubo con heparina litio, tubos con tapn verde (Fig. 17) pues no interfieren los resultados sin embrago en EDTA interfieren las pruebas enzimticas (fosfatasa alcalina) y los iones Ca y K.

Lo ideal es separarlos antes de las dos horas de recogida de la sangre. Si la sangre la recogemos en tubo de heparina litio podemos centrifugarla inmediatamente despus para la obtencin del plasma.

Diferencias entre el suero y el plasma

Suero Riesgo de hemlisis mayor que en suero Centrifugacin tras coagulacin Muestra idnea para la mayora de pruebas: bioqumicas e inmunolgicas No contiene fibringeno Plasma Riesgo de hemlisis menor que en suero Centrifugacin inmediata En pruebas bioqumicas posible interferencia con anticoagulante (mnimas con heparina Litio) Contiene fibringeno

Fig. 17. Tubos de Heparina Li y sin nada

Manejo de las muestras

Si recogemos la sangre en tubo de suero, tenemos que dejarlo en posicin vertical y a temperatura ambiente Fig. (18 y 19). No debemos refrigerarlo antes de su coagulacin y retraccin del coagulo (de treinta minutos a una hora despus de la recogida) pues produciramos hemlisis.

Conservacin de suero o plasma

Se conserva 3 das a 4 C y congelado a 20 C durante mucho tiempo

Conservacin de las muestras

Compuesto Albmina ALT (GPT) AST (GOT) Bilirrubina total Calcio Colesterol Creatinina Fosfatasa alcalina Fsforo inorgnico GGT Glucosa (en FlNa) Potasio Protenas totales Urea 20 25 C 6 das 1 da 3 das Solo muestra reciente 10 das 6 das 1 da 4 C 6 das 7 das 7 das 10 das 6 das 1 da -20 C Varios meses 1 mes 1 mes 8 meses 4 meses Varios meses 1 mes Varios meses 1 mes Varios meses 6 meses

10%actividad 7 das en 7 d.

Fig. 18 Fig.19 El microtubo de la Fig. 18 se dej en posicin horizontal el de la Fig. 19 en posicin vertical, en los dos se ve el coagulo y su retraccin. Si la sangre no desuera bien, esto suele ser lo habitual, centrifugaremos a 2.500-3000 rpm durante 5-10 minutos.

2 das 5 das 1 da 7 das 1 da

7 das 10 das 2 das 1 mes 3 das

2 semanas 2 semanas Varios meses

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Determinacin de glucosa
La sangre la podemos recoger en un tubo de suero, en cuyo caso la deberemos centrifugar en el momento que se haya coagulado o en un tubo con Heparina Litio en cuyo caso deberemos centrifugar inmediatamente o en un tubo de Fluoruro sdico, tubo de tapn gris (Fig. 20), que inhibir las enzimas de la gluclisis y conserva el valor de glucosa durante 24 horas a temperatura ambiente o 48 horas a 4 C. Si no lo hacemos siguiendo este protocolo no podremos valorar la glucosa pues se produce un consumo de esta por parte de los hemates.

miccin espontnea, sonda o cistocentesis y especialmente cuando se trate de urocultivos, en cuyo caso el frasco o tubo deber ser estril. Se conservan perfectamente de 12 a 24 horas a 4 C.

Anlisis de heces
Lo ideal son los anlisis seriados de 3 a 5 das en caso de diagnstico de giardias por ejemplo. Se conservaran a 4C excepto la ltima muestra que se enviar a temperatura ambiente y lo ms fresca posible. Usar recipientes adecuados NO USAR BOLSAS DE PLASTICO o PAPEL DE ALUMINIO para remitir las muestras. Para coprocultivos los frascos debern ser estriles.

Coagulacin
Fig. 20 Tubos de fluoruro Na La sangre se recoger en un tubo de citrato sdico, tubo de tapn azul (Fig. 21). Las cantidades de sangre sern las correspondientes al volumen de anticoagulante, (9 partes de sangre por 1 de anticoagulante). Centrifugar antes de los 30 minutos de extraccin de la sangre a 3.000 rpm durante 15 minutos. Refrigerar un mximo de 2 horas o congelar a -20 C.

Lquidos orgnicos
Se remitirn en dos tubos, uno con EDTA para el recuento de clulas y la citologa y otro de suero para pruebas bioqumicas en caso de que se soliciten. Para el cultivo bacteriolgico se emplear un tubo estril o la propia jeringuilla de extraccin. Los portas con las extensiones para las citologas deben ir fijadas en metanol.

Fig. 21 Tubos de Citrato sdico

Citologas y biopsias
Citologas
Materiales: Agujas, jeringuillas y portas.

Urianlisis
Recomendamos NO USAR frascos de orina para remitir la muestra al laboratorio, a no ser que sean hermticos es preferible remitirla en tubos. Durante el transporte suelen ser frecuentes los accidentes. Para el urianlisis solo son necesarios 5 10 ml de orina. Conviene indicar la forma de recogida de la muestra:

Mtodos: Podemos realizarla de dos formas: Puncin con aguja fina o puncinaspiracin con aguja fina.

Fig. 22

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Fig. 22

Las dos tcnicas son muy similares. La primera es ideal para ganglios pues al ser estos muy frgiles asegura la integridad de las clulas y en tejidos muy vascularizados para minimizar la contaminacin sangunea. Mtodos:

Fig. 24

Fig. 25

No tomaremos muestras de zonas ulceradas pues solo reflejara el proceso inflamatorio. En lesiones de gran tamao la zona central suele estar necrosada/inflamada por tanto debemos ir a los bordes. Introducimos la aguja y aspiramos con una jeringuilla de 10 ml. Sacamos la aguja y la volvemos a introducir en otra direccin y aspiramos de nuevo. Una vez realizada la aspiracin, separamos la aguja y llenamos la jeringuilla de aire. Ponemos la aguja de nuevo y vaciamos la jeringa en un porta (Fig. 22). Hacemos la extensin inmediatamente por el procedimiento de squash o aplastamiento (Fig. 23). Es decir, ponemos sobre el porta que contiene la gota otro porta formando una cruz con el anterior y lo deslizamos suave y rpidamente. Dejamos secar y fijamos con metanol. Lo remitimos al laboratorio sin teir. Se enviarn en porta- preparaciones de plstico o envueltas en papel absorbente para acolcharlas. Si lo visualizamos nosotros se teir con tcnicas Romanowsky.

Tamao
El tamao ideal de la muestra seria de 1cm x 1cm aproximadamente. En caso de muestras de mayor tamao deberemos hacer cortes cada 1,5 cms perpendiculares al eje mayor o tomar varias muestras incluyendo los mrgenes de extirpacin (Fig. 25).

Fijacin
La fijacin de las muestras para oncologa se hace por mtodos qumicos (fijadores). El ms comn es el formol al 10%. Formol al 10%: Se prepara con 1 parte de formaldehdo al 40%, 9 partes de agua (tambin puede substituirse el agua por solucin salina fisiolgica al 9%). Hay otras frmulas pero esta es la ms comn.

Recipientes
Existen distintos tipos de recipientes, la nica condicin es que sea hermtico y adecuado para la muestra (Fig. 26 y 27). Deber ir perfectamente identificado.

Biopsias
Materiales: Bistur, tijeras, pinzas, punch, frascos hermticos, fijador (Fig.24). Fig. 26

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Fig. 27

Volumen de fijador
Deber superar el volumen de la muestra en una proporcin 20:1 o 40:1 Se debe sumergir el material en el fijador y no a la inversa para evitar el contacto de esta con las paredes y el fondo del recipiente, evitando que se adhiera. Si la muestra flotara (pulmn) la sumergiremos totalmente en el fijador. Figura 28 NO Figura 29 NO

Duracin de la fijacin
Generalmente las muestras estn fijadas a las 24-36 horas de haberlas introducido en el fijador. En formol las muestras no se alteran en semanas o meses.

El volumen del fijador no es el adecuado. La muestra no est fileteada en porciones de 1,5 cms, est entera. No est etiquetado o identificado el frasco

Protocolo
Las muestras debern ir acompaadas de un protocolo con: Los datos del animal: nombre, raza, sexo, edad. Datos de la clnica o veterinario que la remite. Historia clnica. Localizacin: Da y hora de la extraccin y fijacin. Tratamientos empleados y respuestas a estos. Analticas si las hubiera.

Figura 29 El frasco es de plstico y hermtico pero demasiado pequeo para la muestra. La muestra no est fileteada en porciones de 1,5 cm. No hay fijador en el frasco, est vaco.

Bibliografa
1. 2. 3. 4. 5. Bush B.M.: Manual del Laboratorio Veterinario de Anlisis Clnicos. Ed. Acribia BE Powers The Pathology of Neoplasia Small Animal Clinical Oncology 2.001-WD Saunders Co Cowell RL,Tayler RD: Diagnostic Cytology of dog and cat. Ed. American Veterinary publications, Inc 1.989 CowellRL, Tayler RD, Meinkoth JH: Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. Ed. Mosby 1.999 Davidsohn I. Henry J.B.: Diagnstico clnico por el laboratorio. Ed. Salvat 6 edicin 6. Martnez de Merlo, E.: Atlas de citologa clnica del perro y el gato. Ed. Servet 2.008 7. Steven E. Weisbrode: The Histopathology laboratory in Diagnosis of Neoplasia

Por favor recordad que enviis la muestra a un citlogo o a un patlogo no a un adivino.

Errores
Figura 28 No es aconsejable el uso de frascos de cristal pues durante el transporte pueden ocurrir accidentes.

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