MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

Proposta de Projeto de Mestrado - Seleo PPGCTA UTFPR 2012-2013

Ttulo do Trabalho: Avaliao do potencial de biodegradao de polmeros plsticos por fungos endofticos do gnero Pestalotiopsis

Linha de Pesquisa: Biotecnologia Ambiental, Fotocatlise e Macromolculas

Nome do candidato: CHRISTIANO DE OLIVEIRA BRUNOW VENTURA

___________________ Assinatura do Candidato

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- Ttulo do Projeto: Avaliao do potencial de biodegradao de polmeros plsticos por fungos endofticos do gnero Pestalotiopsis

- Resumo: O impacto ambiental causado por resduos plsticos persistentes est aumentando o interesse global, particularmente pelas limitaes dos mtodos para disposio destes resduos. O gnero Pestalotiopsis vem sendo alvo de um grande nmero de pesquisas de sua patogenicidade sobre plantas tropicais e tambm o homem, mas tambm por propriedades antimicrobianas, atividade antitumoral, fungicida, antioxidante, dentre outros. Os estudos do potencial de biodegradao deste fungo sobre polmeros so recentes, como por exemplo na degradao de poliuretano. O presente estudo realizar uma investigao do potencial de biodegradao de filmes das blendas de Poli(caprolactona/poli(etileno tereftalato) e Poli(caprolactona/amido, quando em contato com os microrganismos do solo, e em solo com inculo de isolados endofticos de Pestalotiopsis spp, atravs da evoluo de CO2, da perda de massa e da anlise morfolgica por MEV. Com os resultados/produtos do trabalho buscamos: (i) gerar subsdios para a viabilizao econmica de materiais biodegradveis. (ii) aprimorar os estudos referentes ao potencial de degradao de polmeros convencionais e biodegradveis por espcies de fungos do gnero Pestalotiopsis e (iii) aprofundar investigaes a de mtodos sustentveis para a degradao de plsticos persistentes em aterros sanitrios. - Palavras chaves: Polmeros, biodegradao, PET, PCL, Pestalotiopsis

1. TTULO Avaliao do potencial de biodegradao de fungos endofticos do gnero Pestalotiopsis

2. INTRODUO O impacto ambiental causado por resduos plsticos persistentes est aumentando o interesse global, particularmente pelas limitaes dos mtodos para disposio destes resduos. Devido a algumas aplicaes dos plsticos, como por exemplo, seu uso em embalagens, descartabilidade muito rpida, associado a grande dificuldade de degradao destes materiais no ambiente, os plsticos tm despertado grande preocupao LIMA, (2001). A sua incinerao pode gerar poluio atmosfrica txica, as reas de aterro so limitadas, e, segundo BRANDRUP (1996, apud ESPNDOLA, 2004) nem sempre possvel se obter um material vivel atravs da reciclagem a partir de uma mistura aleatria de plsticos. A mistura reduz a qualidade dos produtos [2]

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reciclados, primeiramente devido incompatibilidade termodinmica entre os materiais e em segundo devido incompatibilidade de aplicao, como por exemplo, devido s vrias faixas de processamento. Com a crescente preocupao mundial em no agredir o meio ambiente, o problema da poluio ambiental causada pelos plsticos criou uma necessidade urgente de desenvolver novos materiais biodegradveis que tenham propriedades comparveis e um custo equivalente aos materiais polimricos

convencionalmente utilizados pela indstria (AVEROUS, 2000). Os polmeros degradveis podem ser diferenciados em naturais ou sintticos, conforme a origem. Os polmeros naturais, tambm denominados biopolmeros, so produzidos por sistemas vivos e atuam como colaboradores nos processos naturais alm de fazerem parte de inmeras vias metablicas (SOUZA, 2007). Um plstico biodegradvel definido pela Norma ASTM D6400 como um plstico degradvel no qual a degradao resulta da ao de microrganismos de ocorrncia livre na natureza (BUCKLEY, 2011). Podem ser definidos tambm como aqueles que so degradados e catabolizados pela atividade biolgica enzimtica de microorganismos, tendo como produtos finais biomassa renovada, CO2, e gua, em condies aerbias, ou metano, em condies anaerbicas (AVROUS, 2012). Atualmente, a utilizao de polmeros biodegradveis vem sendo muito estudada como uma alternativa para minimizar os impactos ambientais causados pelos plsticos convencionais de origem petroqumica, sendo que diferentes fontes de polmeros podem ser utilizados para produzir tais materiais. Dependendo da origem das matrias primas e das vias de sntese, existem duas possibilidades para produo de materiais biodegradveis: a prpria indstria petroqumica ou a partir de recursos renovveis. (BARBOSA, 2009; SAADI, 2008). Entretanto, o termo popular plsticos biodegradveis, usado para referncia a polmeros de diferentes famlias e com potenciais de

biodegradao variados. Uma conhecida classificao das famlias de polmeros biodegradveis pode ser visualizada no esquema a seguir: [3]

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Figura 01: Famlias de biopolmeros, com suas matrias primas. PHA: Poli(hidroxialcanoato); PHB: Poli(hidroxibutirato); PHH: Poli (hidroxihexanoato); PHV: Poli(hidroxivalerato); PLA: Poli(cido ltico); PCL: Poli(caprolactona); PBS: Poli(butileno succinato); PBSA: Poli(succinato de butileno adipato); AAC: Copolister Aliftico-Aromtico; PET: Poli(tereftalato de etileno); PBAT: Tereftalato de polibutadieno adipato; PTMAT: Poli(tereftalato de metileno adipato). PACIA (2002, apud VIVI (2011).

O custo elevado de produo dos plsticos biodegradveis em comparao aos plsticos convencionais ainda constitui um problema a ser resolvido. A ttulo de exemplificao, o polietileno apresenta custo de produo mdio da ordem de 0,9 a 1 US$/kg, enquanto os polmeros biodegradveis apresentam custo mdio de produo de 5 a 8 US$/kg, As blendas polimricas usando o amido, e a celulose so os dois materiais mais empregados na fabricao de embalagens, possuindo a vantagem de serem materiais polimricos, de origem renovvel e de baixo custo (GOMES,1997, apud ROSA, 2002; AMASS 1998, apud CAMPOS, 2004). Desta forma, as blendas polimricas usando o amido, e a celulose, dentre outros polmeros de origem natural, em mistura com os polmeros biodegradveis e polmero sinttico, surgem como uma alternativa para minimizar os custos dos polmeros biodegradveis, bem como aumentar a biodegradao dos polmeros sintticos. De acordo com BRITTO (2011) os polmeros biodegradveis mais conhecidos provenientes do petrleo so as Policaprolactonas PCL, as Poliesteramidas, os Copolisteres Alifticos e os Copolisteres Aromticos.

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A biodegradao, segundo GHEM (2006) uma das variedades da quimiodegradao, sendo que os compostos quimicamente ativos (as enzimas) so neste caso, produzidos por microorganismos. A produo de CO2 durante a biodegradao do polmero um parmetro importante do processo. Desta forma, quanto maior a quantidade de CO2 gerado maior o potencial de biodegradao (ROSA, 2002). Dentre os polmeros sintticos biodegradveis, a Poli(caprolactona tem despertado especial interesse na substituio de polmeros no biodegradveis, pois apesar de sua lenta biodegradabilidade e custo elevado, apresenta caractersticas fsicas interessantes para sua aplicao em polmeros como alta flexibilidade, biodegradabilidade, biocompatibilidade com outros materiais e facilidade no processamento (MARIANI, 2010). Alguns estudos sobre a biodegradao do tereftalato de polietileno (PET) foram realizados utilizando os microorganismos Bacillus subtilis e Phanerochaete chrysosporium (JARA, 2007) linhagens do fungo Pleurotus SP (SILVA, K. R., 2009), pelo actinomiceto Thermobifida fuscae (MLLER, 2005), pela bactria Burkholderia xenovorans (BAINS, 2012), dentre outros autores. Estudos de desenvolvimento, caracterizao e biodegradao de blendas de PET e PCL tem sido realizados por autores tais como FAI (1995), CHIELLINI (1996) e ZHANG (2000), sendo que apesar das dificuldades encontradas os recentes avanos apontam para compatibilidade da blenda entre os dois polmeros. Pestalotiopsis sp. Espcies de fungos do gnero Pestalotiopsis so encontradas como parasitas ou endfitos, presentes no solo ou em ramos, folhas, pecolos e sementes, respectivamente. So anamrficos pertencentes ordem

Melaconiales, famlia Amphisphariaceae (FIGUEIREDO, 2006). O fungo da espcie Pestalotiopsis microspora um dos endfitos mais comumente isolado associado com florestas tropicais (LI et al., 2001 apud WORAPONG, J, 2002). Espcies do gnero Pestalotiopsis vem sendo alvo de um grande nmero de pesquisas de sua atividade como importante patgeno de plantas tropicais e tambm do homem (SUTTON, 1999; GUBA, 1961, apud

MAHARACHCHIKUMBURA, 2011) mas tambm por suas propriedades [5]

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antimicrobianas

tais

como,

atividade

antitumoral,

agente

antifungico,

antioxidante, dentre outros usos (SILVA, M. S., 2009; HARPER, 2003). Os estudos do uso deste gnero fungos na biodegradao de polmeros so recentes, como por exemplo na degradao de poliuretano pela ao da

enzima serina hidrolase utilizando o poliuretano como substrato e fonte de carbono degradando o mesmo em poucos dias (RUSSELL ET al, 2011; ). A espcie Pestalotiopsis microspora representa uma grande

oportunidade para a pesquisa do potencial de espcies do gnero Pestalotiopsis na biorremediao de aterros sanitrios, onde atravs de sua atividade biodegradadora os resduos plsticos poderiam ser degradados naturalmente por este fungo endfito que utiliza o plstico como fonte primria de alimento mesmo em condies anaerbicas (ANANDA, 2012).

3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral O objetivo deste trabalho foi realizar uma investigao do potencial de biodegradao de filmes das blendas de Poli(caprolactona/poli(etileno tereftalato) (PCL/PET; 1:1) e Poli(caprolactona/amido (PCL/Amido anftero); 1:1), quando em contato com os microrganismos do solo, e em solo com inculo de isolados endofticos de Pestalotiopsis spp, atravs da evoluo de CO2, da perda de massa e da anlise morfolgica por MEV atravs de metodologia adaptada de (CAMPOS, 2010).

3.2 Objetivos especficos a) Avaliar o potencial de biodegradao de microorganismos de solo e em solo com inculo isolados endofticos de Pestalotiopsis spp na degradao de Poli(tereftalato de etileno (PET), e blendas de PCL/PET e PCL/Amido. b) Quantificar a perda de massa das blendas pela biodegradao. c) Determinar a influncia dos tipos de polmeros nas propriedades finais das blendas. d) Determinar a influncia da adio do inoculo de Pestalotiopsis spp nas propriedades finais das blendas.

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4. MATERIAIS E MTODOS 4.1 Local de realizao O presente experimento foi desenvolvido em condies de laboratrio nas dependncias da Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Municpio de Curitiba, PR. 4.2 Materiais 4.2.1 Polmeros Os polmeros, utilizados na forma de p, foram: Poli(tereftalato de etileno PET). Poli(caprolactona) ou PCL; e Amido Anftero. Os polmeros de Poli(tereftalato de etileno (PET) foram fornecidos pela M&G Ricerche e a Poli(caprolactona pela Union Carbide do Brasil. O amido do tipo Anftero (Foxhead 5901) foi fornecido pela Corn Products do Brasil. 4.2.2 Preparo dos filmes Os filmes de PCL e PCL/amido(1:1 w/w) foram obtidos por moldagem de compresso por prensa universal hidrulica, utilizando-se presso hidrulica de 89,10 kgf.cm1, a 180 C, durante 5 minutos (CAMPOS, 2010). Os filmes de Poli(tereftalato de etileno PET) e a blenda de PET/PCL foram obtidos pela metodologia descrita por CHIELLINI (1996). Os homopolmeros em p foram pesados (0,2 g no total) e colocados entre pelculas de teflon, obtendo filmes cerca de 100 m de espessura. As blendas foram obtidas a partir de 0,1 g de cada polmero.

4.2.2 Preparao do solo O solo amostrado ser obtido em rea de floresta prxima ao Departamento de Cincia e Tecnologia Ambiental da UTFPR, Campus Ecoville, Curitiba, PR, com caractersticas prprias de solo rico em matria orgnica. Aps coleta o material ser peneirado em peneira de 2 mesh. A capacidade de campo do solo utilizado nos experimentos deve ser ideal para o crescimento microbiano. O solo utilizado no deve ser esterilizado, com a finalidade de manter os microrganismos vivos e possibilitar sua atuao sobre os filmes polimricos. O solo ser analisado quimicamente de acordo com metodologia de anlise de solo de EMBRAPA (1997) visando verificar se as caractersticas do solo so favorveis ao crescimento microbiano. [7]

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4.2.3 Preparo das colunas de solo As amostras de filmes, em duplicatas, devem ser incubadas em colunas de solo (garrafas PET transparentes para a entrada de luz), com altura de 25 cm e dimetro de 13 cm e dois furos na base. Estes furos permitiro a umidificao do sistema, mantendo a umidade durante os 120 dias de experimento. Amostras de 8 cm de dimetro, sero enterradas no topo da coluna, contendo 17 cm de solo mido e cobertura de 2 cm de terra, para permitir a ao dos microrganismos aerbios. As colunas devem ter aproximadamente 40 furos distribudos uniformemente, nas suas paredes, para oxigenao de seu interior. As amostras de filmes devem ento ser enterradas nas colunas de solo para posterior inoculao do fungo Pestalotiopsis sp, nas mesmas condies experimentais. Os filmes sero removidos do solo para anlise aps 30, 60, 90 e 120 dias de tratamento. Aps o tratamento microbiano, os filmes devem ser lavados com gua destilada, secos com papel filtro e mantidos por 48 horas em dessecador vcuo.

4.3 Metodologia 4.3.1 Testes respiromtricos De acordo com metologia adotada por CAMPOS (2010) os filmes de PET, PCL, PET/PCL, PCL/Amido 1:1, de cerca de 100 m de espessura e 0.2 g em massa, sero enterrados no solo comum e no mesmo solo comum inoculado com o fungo Pestalotiopsis sp, dentro de um respirmetro Bartha (em triplicata) 28 C durante 120 dias, seguindo a norma tcnica NBR 14283 ABNT (1999). Uma descrio detalhada dos testes de biodegradao utilizando o mtodo respiromtrico, dada por CAMPOS et AL (2007).

4.3.2 Medidas de massa Medidas de perda de massa dos filmes devem ser obtidas em escala analtica aps os biotratamentos. A degradao microbiana pode ser expressa como porcentagem de perda de massa (Equao 1) : Equao (1) onde W0 e W1 so massas dos filmes antes e aps o biotratamento, respectivamente (CAMPOS, 2010). [8]

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4.3.3 Microscopia eletrnica de varredura (MEV) A morfologia dos filmes ser examinada em um da marca JEOL, modelo JSM-6360, com magnificaes de 1000x e 7500x (UTFPR-Curitiba). Os filmes originais e aps o tratamento microbiano sero recortados e acoplados nos stubs com fita dupla face de carbono e recobertos com ouro, em cmara de vcuo, utilizando um metalizador Balzers modelo SCD 030, com sputtering. (CAMPOS, 2010).

4.3.4. Microrganismos As linhagens de microrganismos a serem utilizadas so do gnero Pestalotiopsis sp, as quais foram obtidas por isolamento dos fungos

endofticos de folhas de espinheira santa (Maytenus ilicifolia) e posteriormente preservadas na coleo de culturas do acervo de fungos do Laboratrio de Microbiologia, do Departamento de Tecnologia em Alimentos da Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Campus Ponta Grossa. O Isolamento dos fungos endofticos foi obtido de folhas de espinheira santa atravs da metodologia descrita por adotada por FIGUEIREDO (2006), descrita

anteriormente por PETRINI (1986).

4.3.5 Manuteno das linhagens de fungos As culturas da espcie Pestalotiopsis spp sero cultivadas em meio de cultura Meio gar-Dextrose-Folha de espinheira santa (BDAES)

(FIGUEIREDO, 2006).

4.3.6 Preparao da suspenso do fungo O fungo Pestalopsis sp. ser repicado e semeado em tubos de ensaio inclinados, a temperatura ambiente, para crescimento. A suspenso foi obtida adicionando-se 9,0 mL da soluo salina 0,85% (m/v) e em seguida filtrada com auxlio de um funil com l de vidro. O filtrado obtido, contendo esporos do fungo, foi utilizado como inculo (CAMPOS, 2010).

4.3.7 Tratamento microbiano em meio lquido O meio de cultura Saboraud, com malte lquido foi colocado em erlenmeyers de 50 mL, que foram esterilizados. Em seguida, foi adicionado o [9]

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inculo do fungo em suspenso, que cresceu durante 7 dias, em uma estufa a 32C. Depois, as amostras em duplicatas dos polmeros descritos, foram adicionadas neste meio de cultura, contendo suspenso dos fungos de solo, previamente crescidos, formando um biofilme microbiano, mantendo um filme no meio lquido sem fungo, como controle e um erlenmeyer com o fungo crescido sem o filme, tambm como controle. As amostras devem permanecer mantidas em estufa a 32C, durante 4 meses. Aps este tratamento, os filmes so retirados, lavados rigorosamente com gua destilada, secos em papel filtro e em seguida colocados em dessecador a vcuo por 24 horas. Finalmente, os filmes sero submetidos aos diferentes mtodos de anlises estruturais e morfolgicas e comparados com o filme original (CAMPOS, 2010).

5. Cronograma de execuo
N 1 2 3 4 5 6 7 8
o.

ATIVIDADES Reviso bibliogrfica Elaborao de instrumentos de pesquisa Realizao dos ensaios de biodegradao Encontros de orientao pedaggico-terica Processamento de dados Sistematizao e anlise dos dados coletados Elaborao da dissertao Preparo de artigo para publ. em peridico

Meses 6 7 8

9 10 11 12

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6. Oramento (Planilha de custos)

TABELA 01: Oramento para o projeto de pesquisa Avaliao do potencial de biodegradao de fungos endofticos do gnero Pestalotiopsis. Preo un. ITEM Descrio (R$)* - Vidraria / Materiais Ala de Drigalski, Erlenmeyers, Escova p/ lavar vidraria, Frasco p/ reagentes, Funil de vidro, Pipetas de vidro graduadas, Placas de petri, Tubos de ensaio c/ tampa, Liquidificador, Garrafas PET, Gaze, L de vidro, Papel filtro (pacote c/ 100 um.) Peneira 2 mesh - Polmeros Amido anftero, Pelculas de Teflon, Poli(tereftalato de etileno (PET), Poli(-caprolactona) ou PCL - Reagentes gua destilada (5 litros), Fita dupla face de carbono, Soluo NaOH 1N e/ou HCl 1N, Ouro coloidal para MEV - Material bitico Amostras de solo, Folhas de Maytenus ilicifolia), Cepas de Microorganismos, Pestalotiopsis SP - Meios de cultura gar, gua destilada, Dextrose, Meio de cultura Saboraud* - Equipamentos Balana analtica, Cmara de vcuo, Dessecador vcuo, Equipamento de extruso de polmeros, Estufa Metalizador Balzers, Microscpio Eletrnico de varredura (MEV) Prensa universal hidrulica, Respirmetro Bartha - Anlises Lab.o de Anlise de solo do Depto Acad. de Qumica e Biologia da UTFPR Curitiba - Campus Centro Bolsa de Iniciao Cientfica Bolsa de Mestrado Total em Material de Consumo Total em Material Permanente / Anlises Total em bolsas

(1) Materiais consumo

(2) Material Permanente/ Anlises (3) Bolsas

* 526,00 1350,00 79595,00 1500,00 1876,00

TOTAL GERAL 82971,00 Observaes: *As quantidades estimadas de materiais de consumo e seus preos unitrios, assim como horas de anlise em Microscpio Eletrnico de Varredura (MEV), e despesas com manuteno de equipamento foram itemizados e calculados em planilha Excel parte. Fontes utilizadas para elaborao do oramento: Polmeros: Material de laboratrio: http://www.polymersource.com http://lojalab.com.br http://www.sabresafety.com.br http://www.goodfellow.com http://www.bio-plastics.org http://www.lojasynth.com http://www.adrialaboratorios.com.br http://www.polysciences.com http://www.cequimica.com.br

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7. Resultados e/ou Produtos Esperados: a) Scio-econmicos: desenvolver pesquisa que fornea subsdios

na viabilizao econmica de materiais biodegradveis. b) Tcnico-cientficos: aprimorar os estudos referentes ao potencial

de degradao de polmeros convencionais e biodegradveis por espcies de fungos do gnero Pestalotiopsis. c) Ambientais: aprofundar investigaes a respeito de mtodos

sustentveis para facilitar a degradao de plsticos persistentes encontrados em aterros sem prejuzos ao meio ambiente.

8. REFERNCIAS: ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas, NBR 14283. Resduos em solos Determinao da biodegradao pelo mtodo respiromtrico,1999. AMASS, W.; et al. A review of biodegradable polymers: uses, current, developments in the synthesis and characterization of biodegradable polyester, blends of biodegradable polymers and recent advances in biodegradation studies. Polym. Internat., v.47, p. 89-144, 1998. ANANDA, R. Jungle fungus eats plastic and beats cancer. Biblioteca Pleyades: The Future and Beyond. (2012). Disponvel em: <http://www.bibliotecapleyades.net/ciencia/ciencia_futurebeyond21.htm>. Acesso em: 17 out. 2012. AVROUS, L; et al Blends of Thermoplastic Starch and Polyesteramide: Processing and Properties. Journal of Applied Polymer Science, Vol. 76, 11171128 (2000) 2000 John Wiley & Sons, Inc. 1999. AVROUS, L; POLLET, E.; Environmental Silicate Nano-Biocomposites. Series: Green Energy and Technology. VI, 447 p. 157. (2012) BAINS, J.; WULFF, J.; BOULANGER, M.; Investigating Terephthalate Biodegradation: Structural Characterization of a Putative Decarboxylating cis-Dihydrodiol Dehydrogenase. Journ. of Mol. Biol. V.423. p.284293. 2012. BARBOSA, J. C.; Avaliao da cintica de crescimento de Alcaligenes eutrophus para a produo de Polihidroxibutirato. TCC (graduao) Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Curso Superior de Tecnol. em Qumica Ambiental, Curitiba, 2009. BRANDRUP, J.; BITTNER, M.; MICHAELI, W.; MENGES G. Recycling and Recovery of Plastics. Mnchen: Ed. Carl Hanser Verlag, 893p.1996. [12]

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