UNIDADE VII RESPIRAO

RESPIRAO 1 INTRODUO A respirao aerbica comum em todos os organismos eucariotos, sendo que a respirao nas plantas apresenta algumas diferenas em relao respirao de animais. A respirao um processo biolgico no qual compostos orgnicos reduzidos so mobilizados e subseqentemente oxidados de maneira controlada. Durante a respirao, energia livre liberada e parte incorporada em forma de ATP, uma fonte de energia que pode ser prontamente utilizada na manuteno e no crescimento da planta. A equao geral que define a respirao inversa utilizada para descrever a fotossntese: C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O

Go = - 2.872 kJ/mol (-686 Kcal/mol) Neste caso, glucose oxidada at CO2 e O2 reduzido para gua. Parte da energia livre, liberada por esta reao, utilizada para sntese de ATP, a funo primria da respirao. Alm disso, muitos intermedirios envolvidos nas reaes da respirao so utilizados como fontes de carbono para a sntese de muitos outros compostos de planta (por exemplo, aminocidos). importante destacar, que a energia proveniente da oxidao de glucose no liberada de uma nica vez. Para evitar danos na estrutura da clula, a energia resultante da oxidao de glicose, liberada passo a passo, mediante uma srie de reaes em seqncia. Estas reaes podem ser divididas em trs fases: a Gliclise, o Ciclo do cido Tricarboxlico (Ciclo de Krebs) e a Cadeia de Transporte de Eltrons.

2 A RESPIRAO CELULAR a) Os Substratos da Respirao Embora a glucose seja geralmente citada como o substrato da respirao, o carbono, na realidade, derivado de diversas fontes: polmeros de glucose (amido), sacarose, polmeros contendo frutose (frutanas) e outros acares, lipdios (trialcilgliceris), cidos orgnicos e, ocasionalmente protenas (a degradao das macromolculas ser estudada na Unidade XIII, Dormncia e Germinao). O tipo de substrato que est sendo respirado pode ser indicado, medindo-se as quantidades relativas de CO2 liberado e O2 consumido. Isto permite calcular o quociente respiratrio (QR), que dado pela seguinte frmula: QR = Moles de CO2 liberado Moles de O2 consumido O valor do QR funo do estado de oxidao do substrato. Note que, quando carboidrato est sendo respirado (ver equao geral da respirao) o valor terico de QR 156

igual a um (6 CO2/6 O2). Experimentalmente, os valores obtidos variam de 0,97 a 1,17. Como os lipdios e protenas se apresentam em um estado mais reduzido que os carboidratos, mais O2 requerido para sua completa oxidao e os valores de QR ficam em torno de 0,7. Por outro lado, os cidos orgnicos, como citrato e malato, so mais oxidados que os carboidratos, e os valores de QR ficam em torno de 1,3. Veja os exemplos abaixo: Frutose ou Glucose C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O cido Palmtico - C16H32O2 + 23O2 16CO2 + 16H2O cido Mlico - C4H6O5 + 3O2 4CO2 + 3H2O QR = 1,00 QR = 0,69 QR = 1,33

Embora o valor do QR seja til em alguns casos, deve-se ter cuidado quando da sua interpretao. Por exemplo, possvel que mais de um substrato esteja sendo respirado ao mesmo tempo e, neste caso, o QR representa um valor mdio. Alm disso, quando a clula est realizando a fermentao nenhum O2 consumido e o valor do QR torna-se bastante elevado. Finalmente, importante destacar que os principais substratos da respirao so os carboidratos. Assim, valor de QR em torno de 1,0 parece ser o mais comum. Valores de QR menores que 1,0 podem indicar deficincia de carboidratos (fome), sendo associados ao consumo de protenas. b) Gliclise A gliclise ocorre em todos os organismos vivos e, evolucionariamente, o mais velho dos trs estgios da respirao. As enzimas que catalisam as reaes da gliclise esto localizadas no citosol, e em plantas, tambm nos plastdios, e nenhum oxignio requerido para converter glicose a piruvato. Isso sugere que a gliclise deve ter sido, provavelmente, o processo fornecedor de energia nas clulas primitivas, que realizavam a respirao anaerbica, antes do aparecimento do O2 na atmosfera e da fotossntese. Na gliclise (glico = acar; lise = quebra), uma molcula de glicose (um acar de 6 carbonos) quebrada e produz duas molculas de acares de trs carbonos (trioses). Estas trioses so, ento, oxidadas e re-arranjadas para produzir duas molculas de piruvato. Os carboidratos estocados na forma de amido, frutanas ou sacarose devem ser, portanto, hidrolisadas para liberar os monossacardeos (glucose e frutose). A degradao do amido pode ocorrer atravs de duas vias: uma hidroltica e outra fosforoltica (Figura 1). Na degradao Hidroltica, o amido degradado liberando glucose, mediante a ao de quatro enzimas: -amilase, -amilase, Enzima desramificadora e a -1,4glucosidase. Na via Fosforoltica o amido degradado liberando glicose 1-fosfato, pela ao da enzima fosforilase do amido (Figura 1). importante destacar que o amido estocado e degradado dentro dos plastdios, porm, a etapa inicial da respirao, ou seja, a gliclise, ocorre no citosol. Assim, o produto da degradao do amido deve atravessar a membrana do plastdio, por meio de carreadores especficos, para ter acesso maquinaria respiratria. A glucose, produto da degradao hidroltica, pode deixar o plastdio atravs de um transportador de hexoses. A glucose-1fosfato, o produto da via fosforoltica, primeiro convertido para triose-fosfato (gliceraldedo3-fosfato), a qual deixa o plastdio atravs de um transportador que troca uma triose-fosfato (para o citosol) por um fosfato inorgnico (entra no plastdio) A sacarose, outro importante substrato para a respirao vegetal, degradada por ao de duas enzimas: sintase da sacarose e a invertase (invertase alcalina e a invertase cida). A 157

sintase da sacarose e a invertase alcalina so localizadas principalmente no citosol, enquanto a invertase cida encontrada associada s paredes celulares e aos vacolos (locais em que o pH fica prximo de 5,0). As equaes catalisadas so: Sintase da Sacarose - Sacarose + UDP Frutose + UDP-Glucose Invertase - Sacarose + H2O Frutose + Glucose A importncia destas enzimas depende do local onde a sacarose est sendo metabolizada. Algumas evidncias indicam que a sintase da sacarose a principal enzima que degrada sacarose em rgos que estocam amido (semente em desenvolvimento, tubrculos) e em tecidos em rpido crescimento, os quais precisam utilizar a sacarose translocada no processo de respirao (produo de energia e de esqueletos de carbono). No entanto, quando o descarregamento do floema ocorre via apoplasto, a invertase cida presente na parede celular pode converter a sacarose em hexoses (frutose e glicose) antes que elas entrem na clula. No caso de clulas maduras, a invertase citoslica pode ter importncia na degradao de sacarose, fornecendo glicose e frutose para a respirao. Na via glicoltica, os monossacardeos gerados so primeiramente convertidos para Frutose-1,6-bisfosfato, com gasto de energia na forma de ATP (Figura 1). Em geral, so consumidos 2 ATP/molcula de hexose (glucose ou frutose), que entra nesta etapa da gliclise (Figura 1, reaes 1 ou 3 e 4). No entanto, apenas um ATP requerido quando o amido degradado pela via fosforoltica. Isto ocorre porque o produto da via fosforoltica glicose-1fosfato.
Starch (Phosphorolytic) Starch (Hidrolytic) Glucose Glucose-1-P ATP ADP Glucose-6-P 2 Fructose-6-P ATP 4 ADP 1 3 Fructose ATP ADP Starch

Fructose-1,6 BP

Figura 1 Primeira etapa da gliclise, produzindo Frutose-1,6-bisfosfato. Enzimas: (1) hexoquinase, (2) isomerase da hexosefosfato, (3) frutoquinase e (4) fosfofrutoquinase (Hopkins, 2000). OBS: Clulas de plantas possuem uma Fosfofrutoquinase dependente de pirofosfato, que, ao contrrio da Fosfofrutoquinase dependente de ATP, permite que a reao 4 (Figura 1) 158

seja reversvel. Isto pode ser importante na converso de lipdios em glucose (gluconeognese). Na etapa seguinte da gliclise, a frutose-1,6-bisfosfato inicialmente clivada e produz duas molculas de trs carbonos, Dihidroxiacetona-fosfato e Gliceraldedo-3-fosfato (Figura 2). A molcula de dihidroxicetona-fosfato prontamente convertida para gliceraldedo-3fosfato e vice-versa. Isto indica que uma molcula de frutose-1,6-bisfosfato (6 C) poder produzir duas molculas de piruvato (3C), considerando que as molculas de dihidroxicetonafosfato so convertidas para gliceraldedo-3-fosfato, que continuam no ciclo. Uma importante funo da gliclise a produo de energia, que pode ocorrer de duas maneiras. A primeira a formao de poder redutor na forma de NADH. Na reao 3 (Figura 2), duas molculas de NADH so produzidas quando gliceraldedo-3-P oxidado para 1,3bisfosfoglicerato. Esta oxidao parcial no requer O2 e tambm no resulta na liberao de CO2. O NADH gerado pode ser usado como poder redutor para a sntese de outras molculas (principalmente na fermentao) ou, na presena de oxignio, pode ser metabolizado na mitocndria para produzir ATP (respirao aerbica).
P = phosphate group = PO3HFructose -1,6 - bisphosphate

1 Dihydroxyacetone - P 2 Glyceraldehyde 3 P Pi NAD3 NADH

1,3 - Biphosphoglycerate ADP 4 ATP 3 - Phosphoglycerate 5 3 - Phosphoglycerate 6 Phosphoenolpyruvate ADP 7 ATP PYRUVATE

Figura 2 A segunda etapa da gliclise, convertendo Frutose-1,6-bisfosfato em piruvato. Enzimas: (1) aldolase, (2) isomerase da triosefosfato, (3) desidrogenase do gliceraldedo-3-fosfato, (4) Quinase do fosfoglicerato, (5) mutase do fosfoglicerato, (6) enolase e (7) quinase do piruvato (Hopkins, 2000).

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A energia contida nas molculas de hexoses tambm conservada na forma de ATP, nas reaes 4 e 7 (Figura 2). A formao de ATP ocorre em um tipo de reao referida como FOSFORILAO AO NVEL DO SUBSTRATO, por que envolve a transferncia direta de um grupo fosfato da molcula substrato para o ADP. Os compostos 1,3-bisfosfoglicerato e fosfoenolpiruvato armazenam energia livre suficiente para gerar uma molcula de ATP. Em geral, para cada molcula de hexose que entra na gliclise, 4 ATP so formados (dois para cada triose). Como na fase inicial da gliclise ocorre o gasto de 2 ATP, o SALDO de 2 ATP para cada molcula de hexose convertida para duas molculas de piruvato. Este saldo poder ser de 3 ATP se o amido for degradado pela via fosforoltica, visto que, o gasto inicial neste caso de apenas 1 ATP. OBS: No final da gliclise, em adio Quinase do Piruvato, as plantas apresentam duas vias alternativas para o metabolismo do fosfoenolpiruvato (PEP): Carboxilase do PEP Desidrogenase PEP + CO2 Pi + Oxaloacetato Malato (vai para a mitocndria) OBS 1: Estas reaes so chamadas de Anaplerticas ou de Suplementao (ver item g) OBS 2: Pi (fosfato inorgnico) Fosfatase do PEP PEP + H2O Piruvato + Pi (a enzima se localiza nos vacolos e sua atividade aumenta sob condies de deficincia de fsforo) O destino do piruvato formado na gliclise depende das condies em que as clulas ou o organismo esto crescendo. Sob condies aerbicas, o piruvato passa do citosol para a mitocndria onde completamente oxidado at CO2 e H2O (Figura 3).
Aerobic Anaerobic - Fermentacion

Figura 3 O destino do piruvato produzido pela gliclise. Enzimas: (1) descarboxilase do piruvato, (2) desidrogenase alcolica, (3) desidrogenase do lactato (Hopkins, 2000). importante destacar que embora as plantas superiores sejam organismos aerbicos obrigatrios, seus tecidos ou rgos podem, ocasionalmente, estar sujeitos a condies anaerbicas. Situaes tpicas ocorrem quando as suas razes esto submetidas a condies de 160

solo alagado com gua, no incio do processo germinativo de sementes grandes, na mobilizao e sob condies de estresse hdrico e salino. Nestes casos, ocorre uma mudana no metabolismo e o processo respiratrio predominante a fermentao (Figura 3). Nas plantas predomina a fermentao alcolica, em que as enzimas descarboxilase do piruvato e desidrogenase alcolica convertem o piruvato em etanol e CO2 e o NADH (produzido na reao 3 da Figura 2) oxidado, regenerando o NAD+. Na fermentao lctica (comum em animais e tambm presente nas plantas), a enzima desidrogenase do lactato usa o NADH para reduzir piruvato a lactato, regenerando o NAD+. Acredita-se que o etanol um produto menos txico do que o lactato, pois o acmulo deste ltimo promove acidificao do citosol. OBS: Note que as reaes da fermentao (lctica ou alcolica) regeneram o NAD+. c) Ciclo do cido Tricarboxlico (Krebs) A quebra de uma molcula de glicose produzindo duas molculas de piruvato libera menos de 25% da energia total da glicose. A energia restante permanece estocada nas duas molculas de piruvato. Os dois prximos estgios da respirao (ciclo de Krebs e CTE) que completam a oxidao da glucose ocorrem em uma organela circundada por uma dupla membrana, a mitocndria. As mitocndrias possuem duas membranas: uma externa (sem invaginao) e outra interna que se apresenta completamente invaginada, formando as conhecidas cristas mitocondriais (Figura 4). A fase aquosa contida dentro da membrana interna conhecida como matriz e a regio entre as duas membranas conhecida como espao intermembranar. Estes compartimentos possuem composies diferentes, o que se deve aos diferentes graus de permeabilidade das membranas externa e interna. A membrana externa permite a passagem de ons e molculas com tamanho abaixo de 10.000 Da. A membrana interna restringe a entrada de ons e pequenas molculas e possui carreadores especficos que promovem a troca de ons e de molculas entre a matriz mitocondrial e o espao intermembranar.

Figura 4 Um diagrama mostrando os diferentes compartimentos da mitocndria (Taiz & Zeiger, 1998). 161

Para que o piruvato formado na gliclise (citosol) seja utilizado na respirao aerbica necessrio, portanto, que ele seja transportado para a matriz mitocondrial. Isto ocorre atravs de um translocador localizado na membrana interna da mitocndria, o qual catalisa uma troca eletroneutra de piruvato por OH-. Na matriz mitocondrial, o piruvato oxidativamente descarboxilado pela enzima desidrogenase do piruvato e produz NADH, CO2 e acetil-CoA. O acetil-CoA combinado com um cido de 4 carbonos (Oxaloacetato), reao catalisada pela sintase do citrato, produzindo um cido tricarboxlico de 6 carbonos (cido ctrico). Esta reao inicia a srie de reaes conhecida como ciclo do cido ctrico ou ciclo do cido tricarboxlico ou ciclo de Krebs (Figura 5). Este ciclo de reaes representa o segundo estgio da respirao e ocorre na matriz mitocondrial.

Figura 5 As reaes do ciclo do cido ctrico (Taiz & Zeiger, 1998) 162

O ciclo de Krebs mostrado anteriormente apresenta algumas diferenas entre a respirao dos vegetais e a dos animais. Por exemplo, na etapa em que o composto SuccinilCoA convertido para Succinato, ocorre produo de ATP em plantas (Figura 5), enquanto que nos animais ocorre inicialmente a produo de GTP. Outra feio caracterstica do ciclo de Krebs de plantas a atividade da enzima mlica dependente de NAD+. A atividade desta enzima permite a completa oxidao de cidos orgnicos, na ausncia do substrato normal do ciclo, o piruvato. Por exemplo, o fosfoenolpiruvato no citosol pode ser convertido para oxaloacetato e fosfato inorgnico (Pi) por ao da carboxilase do PEP. Ainda no citosol, a desidrogenase do malato converte oxaloacetato em malato, consumindo NADH (As reaes mostradas abaixo so chamadas de Reaes Anaplerticas). O malato transportado para a matriz mitocondrial atravs de um translocador de dicarboxilatos, na membrana interna da mitocndria. Na mitocndria, por ao da enzima mlica dependente de NAD+ (presente nas plantas), o malato convertido para piruvato, o qual pode ser oxidado no ciclo de Krebs (ver reaes abaixo). No citosol: Fosfoenolpiruvato + CO2 Oxaloacetato + Pi + NADH Na Mitocndria: Malato + NAD+ enzima mlica Piruvato + CO2 Malato + NAD+

Em resumo, o ciclo de Krebs consiste de oito etapas catalisadas por enzimas, comeando com a condensao do acetil-CoA (2C) com o oxaloacetato (4C) para formar o cido ctrico (6C). Os carbonos derivados do acetil-CoA so liberados na forma de CO2. O ciclo inclui ainda quatro reaes de oxidao, as quais produzem trs molculas de NADH e uma de FADH2 (por molcula de piruvato). Uma molcula de ATP formada pela fosforilao ao nvel do substrato. Finalmente, o oxaloacetato regenerado, permitindo a continuao do ciclo. As funes do ciclo de Krebs so: Reduo de NAD+ e FAD, produzindo as formas doadoras de eltrons NADH e FADH2, as quais so posteriormente oxidadas na CTE para formao de ATP; Sntese de ATP pela fosforilao ao nvel do substrato (produz um ATP por molcula de piruvato); Formao de esqueletos de carbono que podem se utilizados para a sntese de muitos compostos da planta. Por exemplo, o -cetoglutarato usado para sntese de glutamato, o qual produz alguns outros aminocidos (famlia do glutamato); o oxaloacetato usado na sntese de aspartato, o qual d origem a outros aminocidos (famlia do aspartato). d) Cadeia de Transporte de Eltrons Visto que a fosforilao a forma de energia usada pelas clulas para realizar os processos biolgicos, os eltrons ricos em energia capturados na gliclise (NADH) e no ciclo de Krebs (na forma de NADH e FADH2), devem ser convertidos para ATP. Este processo dependente de O2 ocorre na parte interna da membrana interna da mitocndria e envolve uma srie de carreadores de eltrons, conhecida como cadeia de transporte de eltrons (CTE). Para cada molcula de glicose oxidada, duas molculas de NADH so geradas no citosol (gliclise) e oito molculas de NADH + duas molculas de FADH2 so geradas na 163

mitocndria (ciclo de Krebs). A CTE catalisa o fluxo de eltrons do NADH (e FADH2) para o oxignio, o aceptor final de eltrons da respirao, regenerando o NAD+ e FAD+. FADH2 + O2 FAD+ + H2O G o = - 169 KJ/mol NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O Go = - 220 KJ/ mol O papel da CTE a oxidao de NADH e FADH2 e, no processo, utiliza-se parte da energia liberada para gerar gradiente eletroqumico de H+ atravs da membrana interna da mitocndria, o qual utilizado para sintetizar ATP. As protenas transportadoras de eltrons so organizadas em quatro complexos multiproticos, localizados na membrana interna da mitocndria (Figura 6):

Figura 6 A organizao da cadeia de transporte de eltrons de mitocndrias de plantas (Taiz & Zeiger, 1998). Complexo I: Desidrogenase do NADH (NADH:ubiquinona xido - redutase) Este complexo recebe eltrons do NADH e transfere-os, via cofatores especficos (flavina mono nucleotdeo FMN e protenas Fe-S), para uma molcula de ubiquinona (Q). Esta molcula de ubiquinona move-se dentro da membrana interna, no estando associada a nenhum complexo protico. A atividade deste complexo inibida pela Rotenona. Complexo II: Desidrogenase do succinato (Succinato: ubiquinona xido - redutase) Este complexo composto pela desidrogenase do succinato. Os eltrons derivados da oxidao do succinato so transferidos, via FADH2 e um grupo de protenas FeS, tambm para molculas de ubiquinona. Este complexo competitivamente inibido pelo malonato.

Como se v, as atividades dos complexos I e II produzem um pool de ubiquinol (QH2), que transferir os eltrons para o complexo III. 164

Complexo III: Complexo do Citocromo bc1 (Ubiquinol:citocromo c xido redutase) Este complexo oxida ubiquinol e transfere os eltrons via uma centro FeS, dois citocromos b e um citrocomo c1 ligado membrana, para o citocromo c. O citocromo c uma protena da CTE que no integral, e serve como um carreador mvel que transfere os eltrons do Complexo III para o Complexo IV. Complexo IV (oxidase do citocromo c) Este complexo oxida o citocromo c e reduz o O2 para H2O. Ele contm duas protenas contendo dois tomos de cobre e os citocromos a e a3. O complexo IV transfere 4 eltrons para o O2, formando duas molculas de H2O. Este complexo fortemente inibido por cianeto, monxido de carbono (CO) e azida.

Em adio a estes quatro complexos, as mitocndrias de plantas possuem alguns componentes no comumente encontrados em mitocndrias animais (Figura 6): I) Desidrogenase do NAD(P)H Externo

Protenas perifricas encontradas na face externa da membrana interna. Estes componentes podem facilitar a oxidao de NADH e NADPH produzidos no citosol. II) Desidrogenase do NAD(P)H Resistente Rotenona Protenas perifricas encontradas na face interna da membrana interna. Estes componentes, ao contrrio do complexo I, so resistentes rotenona. III) Oxidase Alternativa Este complexo protico permite a reduo de O2 com pequena produo de ATP. Esta oxidase alternativa, ao contrrio do complexo IV, pouco afetada pelos inibidores, cianeto, monxido de carbono (CO) e azida. Quando uma soluo de cianeto (1 mM) fornecida a tecidos animais que esto respirando ativamente, o complexo citocromo oxidase inibido e a taxa respiratria cai para menos de 1% do valor inicial. No entanto, em tecidos de plantas, a respirao resistente ao cianeto pode representar de 10 a 25% e, em alguns tecidos, pode corresponder a mais de 100% do controle. A enzima ou o complexo responsvel por este consumo de O2 tem sido identificada em mitocndrias de plantas, como um complexo conhecido como oxidase alternativa. A oxidase alternativa resistente ao cianeto (CN-), monxido de carbono (CO) e azida, porm, ela inibida especificamente por alguns compostos, particularmente o cido salicilhidroxmico (SHAM). Este complexo recebe eltrons diretamente do pool de ubiquinona, reduzindo o O2 para H2O (ver figura 6). Com isso, dois pontos de conservao de energia, nos complexos III e IV, no so utilizados e a energia passa a ser perdida como calor. Esta produo de calor parece ser importante em rgos reprodutivos de algumas espcies (famlia Araceae), favorecendo a volatilizao de certos compostos que atraem insetos polinizadores. Sob condies de estresse, o aumento da atividade da oxidase alternativa pode contribuir para evitar o sobrefluxo de energia e a formao de radicais livres, efeitos que poderiam ser txicos maquinaria mitocondrial.

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e) Sntese de ATP acoplada ao fluxo de eltrons A transferncia de eltrons para o O2, do Complexo I at o Complexo IV, acoplada sntese de ATP, sendo que o nmero de ATP formado depende da natureza do doador de eltrons. Para o NADH, que doa os eltrons ao Complexo I, a relao ADP:O (nmero de ATP formados para cada dois eltrons transferidos para o oxignio) em torno de 2,5. Isto indica que uma molcula de NADH pode produzir at 2,5 ATP. Para o FADH2, que efetivamente doa eltrons ao Complexo III, a relao ADP:O em torno de 1,5. Para o ascorbato, que doa eltrons ao Complexo IV, a relao ADP:O em torno de1. Resultados como os descritos acima tm levado concluso que existem trs locais de conservao de energia, nos Complexos I, III e IV (Figura 6). Como esta conservao de energia representa uma conexo entre o fluxo de eltrons mitocondrial e a sntese de ATP, ela tem sido denominada de FOSFORILAO OXIDATIVA. Este tipo de fosforilao, de maneira similar a fotofosforilao (ver fotossntese), explicada pelo Mecanismo Quimiosmtico proposto por Mitchel (1961). O princpio bsico da quimiosmose que diferenas na concentrao de ons e de potencial eltrico entre os dois lados de uma membrana so fontes de energia livre que podem ser utilizadas pela clula. Como a membrana interna da mitocndria impermevel para H+, um gradiente eletroqumico de H+ pode ser formado. Assim, nos pontos de conservao de energia (ver complexos I, III e IV, na figura 6) o transporte de eltrons est acoplado ao transporte de H+ para o espao intermembranar, gerando um gradiente eletroqumico de prtons (H+). Os H+ ao retornarem para a matriz mitocondrial, a favor do seu gradiente, liberam energia que utilizada para a sntese de ATP. O processo de sntese de ATP catalisado por um complexo enzimtico transmembranar, localizado na membrana interna da mitocndria, conhecido como Fo-F1 sintase do ATP (representado na figura 6 como o complexo V). A poro hidrofbica do complexo, Fo, parece formar o canal atravs da membrana, o qual favorece o retorno do H+ para a matriz mitocondrial. O stio cataltico, a poro F1, uma protena perifrica localizada na face interna da membrana interna, ou seja, no lado da matriz, onde ocorre a sntese de ATP a partir de ADP e Pi. A teoria quimiosmtica tambm explica o mecanismo de ao dos desacopladores, um grande nmero de compostos qumicos (dinitrofenol, detergentes, NH3, dentre outros) que tornam a membrana interna permevel a H+ (Figura 7).

Figura 7 Esquema mostrando a dissipao do gradiente de H+ atravs da membrana, promovida pela NH3 (Taiz & Zeiger, 1998).

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Estes compostos dissipam o gradiente eletroqumico de prtons. Desta forma, o fluxo de eltrons pode continuar ocorrendo sem concomitante sntese de ATP. Isto explica por que as plantas no podem acumular NH3 em suas clulas (Figura 7). O gradiente eletroqumico de prtons tambm executa um importante papel no movimento de substratos e de produtos do ciclo de Krebs e da fosforilao oxidativa, para dentro e para fora da matriz mitocondrial. Embora o ATP seja sintetizado na matriz mitocondrial, a sua utilizao pela clula ocorre fora da mitocndria, sugerindo a necessidade de um mecanismo eficiente de transporte de ATP para fora desta organela. Este mecanismo envolve uma protena transportadora na membrana interna, a qual catalisa a troca de ATP por ADP (este ltimo necessrio para a sntese de ATP na mitocndria). O gradiente de potencial eltrico gerado durante o transporte de eltrons (negativo dentro da matriz), favorece a sada da ATP4- em troca por ADP3-. O gradiente eletroqumico de H+ tambm facilita a troca de fosfato inorgnico (Pi-) e de piruvato, ambos para dentro da matriz mitocondrial, em troca por OH-. Lembre-se que Pi-1 necessrio para a sntese de ATP e piruvato o substrato para o ciclo de Krebs. Portanto, a existncia de transportadores especficos na membrana interna garante o funcionamento normal da respirao. Considerando-se as relaes ADP:O de 2,5 para o NADH e 1,5 para o FADH2 podemos dizer que uma molcula de glucose, ao ser completamente oxidada para CO2, produz em torno de 30 molculas de ATP. Gliclise 2 ATP (fosforilao ao nvel do substrato) 2 NADH = 3 ATP (desidrogenase do NADH que aproveita o NADH citoslico no aproveita o primeiro ponto de conservao de energia. Por isso, cada NADH produzido no citosol produz apenas 1,5 ATP) Matriz mitocondrial - 2 NADH 5 ATP Ciclo de Krebs - 2 ATP (fosforilao ao nvel do substrato) 6 NADH = 15 ATP (considerando o NADH produzido na converso do piruvato para acetil-CoA) 2 FADH2 = 3 ATP TOTAL = 30 ATP produzidos para cada molcula de glicose que completamente oxidada at CO2 e H2O

f) A Via das Pentoses-Fosfato A gliclise no a nica rota disponvel para oxidao de glucose em plantas. A via oxidativa das pentoses-fosfato (Figura 8) pode tambm realizar esta tarefa, usando enzimas que so solveis no citosol, podendo contribuir com 5 a 20% do fluxo de carbono respiratrio. As duas primeiras reaes so irreversveis e representam os eventos de oxidao desta via, convertendo glucose-6-fosfato (6C) em ribulose-5-fosfato (5C), com perda de um CO2 e gerao de duas molculas de NADPH (Figura 8). O restante da via das pentoses-fosfato

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consiste de uma srie de interconverses metablicas, que convertem a ribulose-5-fosfato em dois intermedirios da gliclise (Frutose-6-fosfato e Gliceraldedo-3-fosfato).

Figura 8 A via das pentose-fosfato (Hopkins, 2000). As funes atribudas via das pentoses-fosfato so: Produo de NADPH, que pode ser utilizado como fonte de poder redutor nas reaes biossintticas e, alternativamente, como fonte de energia que pode ser utilizada na CTE para produo de ATP (lembre-se da desidrogenase do NAD(P)H que existe na face externa da membrana interna da mitocndria de plantas). Gerao de intermedirios do ciclo de Calvin (fotossntese) que podem ser utilizados em folhas jovens, que no so completamente autotrficas (ribulose-5-P, ribose-5-P, eritrose-4-P, dentre outros). Produo da ribose-5-fosfato, precursor da ribose e da desoxirribose (sntese de cidos nuclicos). Produo de eritrose-4-fosfato, que participa, juntamente com o fosfoenolpiruvato (PEP), da sntese de aminocidos aromticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e dos precursores da lignina, flavonides e fitoalexinas.

g) A Respirao e a Formao de Esqueletos de Carbono Como j comentamos anteriormente, uma das importantes funes da respirao, alm da produo de ATP e poder redutor (NADH, NADPH e FADH2), a produo de esqueletos de carbono requeridos para a biossntese de outras molculas da clula. A biossntese de 168

cidos nuclicos, protenas, celulose, lipdios e outras molculas celulares requerem, alm de energia (ATP e poder redutor), os esqueletos de carbono que formam as unidades estruturais bsicas destas macromolculas. Os mais importantes esqueletos de carbono, formados a partir de intermedirios da gliclise e Ciclo de Krebs, so mostrados na figura 9.

Figura 9 O papel da respirao nos processos de biossntese (Hopkins, 2000) A retirada de intermedirios da gliclise e do Ciclo de Krebs para a sntese de outras molculas significa, obviamente, que nem todos os substratos da respirao podero ser completamente oxidados at CO2 e H2O. Deve-se ter em mente, no entanto, que um suprimento adequado de ATP tambm necessrio, visto que as reaes de biossntese e inmeras outras funes da clula tambm requerem esta fonte de energia. Assim, acredita-se que o fluxo de carbono atravs da respirao celular deve representar um balano entre a demanda metablica por ATP, de um lado, e o requerimento de poder redutor e de esqueletos de carbono, do outro. Por exemplo, quando a demanda por ATP alta, maior percentagem dos substratos podero ser completamente oxidados para produzir esta fonte de energia. Outro importante ponto a ser considerado que durante perodos de alta atividade biossinttica, a retirada dos cidos orgnicos do Ciclo de Krebs para a produo de outros compostos (aminocidos, por exemplo), poder reduzir significativamente o nvel de cetoglutarato, paralisando ou inibindo o Ciclo de Krebs e, consequentemente, o processo respiratrio. Isto, no entanto, evitado atravs das chamadas Reaes Anaplerticas ou de Suplementao. Estas reaes catalisadas por enzimas citoslicas (carboxilase do PEP e desidrogenase do malato) e mitocondriais (desidrogenase do malato e enzima mlica),

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transferem molculas da gliclise para o Ciclo de Krebs, garantindo o funcionamento normal da respirao (Estas reaes so mostradas nas pginas 160 e 163). 3 RESPIRAO NOS RGOS VEGETAIS a) Taxas de Respirao em Funo da Idade O estudo da respirao ao nvel de rgos ou da planta mais complicado do que estud-la em clulas individuais. A respirao na planta normalmente estudada, medindo-se a absoro de O2 ou a evoluo de CO2, sendo que as taxas obtidas desta maneira so altamente variveis. Em adio, as taxas de respirao diferem entre rgos, mudando com a idade e o estdio de desenvolvimento e, so bastante influenciadas pela temperatura do ar, nveis de oxignio, dentre outros fatores. Como regra geral, a taxa respiratria reflete o nvel de demanda metablica. Assim, plantas, rgos ou tecidos jovens respiram mais rapidamente do que plantas, rgos ou tecidos velhos. A alta taxa de respirao durante os estdios iniciais de crescimento est presumivelmente relacionada aos requerimentos de energia e de esqueletos de carbono para as clulas que esto em processos de diviso e de alongamento. Quando a planta ou rgo aproxima-se da maturidade, o crescimento e as demandas metablicas a ele associadas tambm decrescem (Figura 10).

Figura 10 Taxas de respirao em funo da idade. Esta curva aplica-se maioria das plantas herbceas, tecidos e rgos (Hopkins, 2000). importante destacar que alguns rgos, especialmente folhas e alguns frutos, experimentam um aumento transitrio na respirao, conhecido como climatrio, o qual marca a senescncia e as mudanas degenerativas que precedem a morte (Figura 10). No caso de frutos climatricos, estas mudanas coincidem com o amadurecimento. Tipicamente, no climatrio, aumento no consumo de O2 acompanhado pela queda na fosforilao oxidativa, indicando que a produo de ATP no est sendo acoplada ao transporte de eltrons. OBS: A taxa de respirao em sementes germinando ser estudada na Unidade XIII

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b) Taxa de Respirao e Economia no Uso do Carbono Um aspecto importante a ser considerado que, na maioria das plantas, uma proporo significativa do carbono fotoassimilado alocado para a respirao. Um levantamento feito com espcies herbceas mostrou que 30 a 60% do ganho dirio com a fotossntese so consumidos pela respirao, e este valor decresce com a idade da planta. Em rvores lenhosas jovens as perdas podem chegar a um tero do carbono assimilado, podendo dobrar nas plantas adultas devido ao aumento na proporo de tecidos no fotossintticos. Em reas tropicais, a respirao pode consumir de 70 a 80% dos fotoassimilados, por causa da alta respirao noturna associada s elevadas temperaturas desta regio. Em um esforo para melhor entender o impacto da respirao sobre a economia no uso de carbono nas plantas, alguns fisiologistas tm tentado distinguir entre os gastos com o crescimento (carbono e energia) e os gastos com a manuteno das atividades e estruturas celulares (carbono e energia). Assim, tm sido proposto os termos Respirao de Crescimento e Respirao de Manuteno. A respirao de CRESCIMENTO inclui o carbono realmente incorporado (produo de esqueletos de carbono para a formao de parede celular, macromolculas, etc.) mais o carbono respirado para produzir a energia, na forma de ATP e poder redutor (NADPH, NADH, FADH2), necessria para as reaes de biossntese e para o crescimento. A RESPIRAO DE MANUTENO, por outro lado, fornece a energia para os processos que no resultam em incremento de matria seca (crescimento), tais como: turnover de molculas orgnicas, manuteno das estruturas de membranas e troca de solutos, dentre outros. Esta respirao de manuteno baixa em plantas e rgos jovens que esto em processo de rpido crescimento (Figura 11). No entanto, em rgos que terminaram o seu crescimento, a respirao de manuteno pode corresponder a uma elevada percentagem da respirao total. Em folhas maduras, por exemplo, ela aproxima-se de 100% de toda a respirao.

Relative Respiration Rate

Growth component

Maintenance component

Relative Growth Rate

Figura 11 Relao entre a taxa de crescimento do rgo e a respirao de manuteno (Hopkins, 2000). Como vimos anteriormente, a respirao produz a energia metablica que requerida para vrios processos de crescimento, contribuindo, portanto, para o aumento na produo de biomassa. No entanto, ela pode consumir carbono com pouco ou nenhum aproveitamento de 171

energia til. Visto que, esta ltima situao representa uma perda de carbono pela planta, temse assumido que uma menor taxa de respirao pode favorecer uma maior economia de carbono, resultando em maior crescimento e produtividade. Corroborando com esta afirmao, alguns estudos tm mostrado a existncia de correlao inversa entre a taxa de respirao e a taxa de crescimento (Figura 12). De acordo com estes estudos, os gentipos mais produtivos foram os que apresentaram menor taxa de respirao de manuteno nos tecidos maduros. Em outras palavras, quanto menor o consumo de carbono na respirao de manuteno, maior proporo do carbono estar disponvel para o crescimento.

Figura 12 A correlao inversa entre a taxa de respirao e a taxa de crescimento em gentipos de Lolium pratense (Hopkins, 2000). 4 FATORES QUE AFETAM A RESPIRAO a) Disponibilidade de substrato A respirao depende da disponibilidade de substratos. Plantas pobres em amido, frutanas ou acares de reserva, respiram em taxas consideravelmente baixas. Plantas deficientes em acares aumentam sensivelmente suas taxas de respirao quando supridas com os referidos substratos. De fato, a taxa de respirao de folhas maior no incio da noite, quando os nveis de acares so altos, do que antes de iniciar o dia, quando os nveis de substratos so baixos. Alm disso, folhas sombreadas (no interior da copa de uma rvore, por exemplo) apresentam menores taxas de respirao do que folhas expostas ao sol. Isto se deve, provavelmente, menor taxa de fotossntese e, consequentemente, menor produo de substratos nas folhas sombreadas. interessante que, quando ocorre uma forte deficincia de acares, as protenas podem ser utilizadas como substrato para respirao. Estas protenas so primeiramente hidrolisadas produzindo aminocidos, os quais so degradados nas reaes da gliclise e ciclo de Krebs.

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b) Luz Os efeitos da luz sobre a respirao mitocondrial tm sido motivo de considervel discusso. Alguns consideram que a respirao mitocondrial decresce na luz, porm no se conhece ao certo a intensidade deste efeito. Na realidade, as tentativas para estudar a respirao em folhas verdes tem levado a concluses conflitantes. Estas variam desde completa inibio da atividade mitocondrial, operao parcial do ciclo de Krebs, ou at estmulo da respirao pela luz. O problema reside na dificuldade de se medir a respirao em um perodo em que a troca de gases dominada pelo fluxo de CO2 e O2 devido a fotossntese, a reciclagem de CO2 dentro da folha e a troca de metablitos entre cloroplastos e mitocndrias. Alguns acreditam que pelo menos uma operao parcial do ciclo de Krebs necessria, para fornecer esqueletos de carbono para a sntese de compostos durante o dia. OBS: Mutantes sem o complexo respiratrio em folhas fotossintetizantes sofrem inibio do desenvolvimento foliar de da fotossntese. c) Temperatura O coeficiente de temperatura (Q10) usado para descrever o efeito da temperatura sobre a respirao. Q10 = Taxa de Respirao em (t + 10oC) Taxa de Respirao em toC Em temperaturas entre 5 e 25 ou 30oC, a respirao aumenta exponencialmente com a temperatura e o valor do Q10 fica em torno de 2,0. Nesta faixa de temperatura, a taxa de respirao dobra para cada aumento de 10oC, o que est de acordo com o comportamento tpico das reaes enzimticas. Em temperaturas acima de 30oC, o valor de Q10 na maioria das plantas comea a cair. Quando a temperatura aproxima-se de 50 a 60oC, a desnaturao trmica das enzimas respiratrias e danos sobre as membranas, praticamente paralisam a respirao mitocondrial. d) Oxignio Como aceptor final de eltrons, a disponibilidade de O2 , obviamente, um fator determinante da taxa respiratria. No entanto, sob condies normais, o oxignio raramente um fator limitante. Porm, existem algumas situaes onde a disponibilidade de O2 pode tornar-se um fator limitante. Por exemplo, em tecidos com baixa relao superfcie/volume, como tubrculos de batata, a lenta difuso de O2 pode restringir a respirao no interior destes rgos. O suprimento de O2 tambm comprometido em cultivos inundados, onde a respirao mitocondrial torna-se comprometida, principalmente em espcies no adaptadas. Nestes casos, pode-se verificar aumento na respirao anaerbica (principalmente a fermentao alcolica). Este tipo de respirao, por ser menos eficiente (produz pouco ATP) pode levar a um maior consumo de carboidratos (Efeito Pasteur).

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BIBLIOGRAFIA BEWLEY, J. D., BLACK, M. SEEDS: Physiology of Development and Germination. 2nd ed. New York, Plenum Press, 1994, 445p. FERRI, M. G. (Coord.) Fisiologia Vegetal, v. 1. 2nd ed. So Paulo: EPU, 1985, 361p. HOPKINS, W. G. Introduction to Plant Physiology. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2000, 512p. SALISBURY, F. B., ROSS, C. W. Plant Physiology. 4th ed. California: Wadsworth Publishing Company, Inc., 1991, 682p. TAIZ, L., ZEIGER, E. Plant Physiology. 2nd ed. Massachusetts: Sinauer Associates, 1998, 792p.

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ESTUDO DIRIGIDO No 06 ASSUNTO: RESPIRAO 1. Mostre a equao geral da respirao partindo da sacarose. 2. Quais os principais substratos utilizados na respirao? 3. Calcule o quociente respiratrio (QR) do cido palmtico (C16H32O2), do cido mlico (C4H6O2) e da frutose (C6H12O6). 4. Quais as funes da gliclise? 5. Discuta sobre o destino do piruvato formado na gliclise. 6. Quais as funes do Ciclo de Krebs? 7. Mostre a localizao da Cadeia de Transporte de Eltrons. Esquematize a composio bioqumica da CTE de plantas. 8. Qual a diferena entre fosforilao ao nvel do substrato e fosforilao oxidativa? 9. Qual a funo do oxignio na respirao? 10. Mostre como a sntese da ATP na mitocndria explicada pelo Mecanismo Quimiosmtico proposto por Mitchel (1960). 11. Faa um balano energtico da oxidao completa de um mol de glucose atravs da gliclise, Ciclo de Krebs e CTE. 12. Mostre graficamente a relao entre a taxa de respirao e a idade de um rgo vegetal. 13. Defina respirao de manuteno e respirao de crescimento. 14. Mostre como a temperatura pode afetar a respirao vegetal. Avalie possveis efeitos sobre a produtividade.

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