INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS

Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos

CLEYTON LAGE ANDRADE

Anlise de Risco em Metodologia Analtica de Controle de Qualidade do Biofrmaco Alfainterferona 2b

Dissertao apresentada ao Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Tecnologia de Imunobiolgicos

Rio de Janeiro 2013

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca de Cincias Biomdicas / ICICT / FIOCRUZ - RJ

A553

Andrade, Cleyton Lage Anlise de risco em metodologia analtica de controle de qualidade do biofrmaco Alfainterferona 2b / Cleyton Lage Andrade. Rio de Janeiro, 2013. xvi,110 f. : il. ; 30 cm. Dissertao (Mestrado) Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos, Ps-Graduao em Tecnologia de Imunobiolgicos, 2013. Bibliografia: f. 85-93. 1. Controle de qualidade. 2. Alfainterferona 2b. 3. Gesto de risco para qualidade. 4. HACCP. 5. Quantificao de DNA. I. Ttulo. CDD 615.37

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Trabalho realizado no Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos, Departamento de Controle de Qualidade DEQUA, sob a orientao da Dra. Elezer Monte Blanco Lemes.

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INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS

Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos

CLEYTON LAGE ANDRADE Anlise de Risco em Metodologia Analtica de Controle de Qualidade do Biofrmaco Alfainterferona 2b
Orientadora: Dra. Elezer Monte Blanco Lemes Dissertao apresentada em 06 de maro de 2013.

Examinadores: Prof. Dr. Jos Procpio Moreno Senna Instituto de Tecnologia de Imunobiolgicos Bio-Manguinhos (Fiocruz) Prof. Dr. Antnio Carlos Augusto da Costa Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Prof. Dr. Damio Carlos Moraes dos Santos Universidade Gama Filho (UGF)

Rio de Janeiro 2013

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minha famlia em Belo Horizonte que mesmo longe me do muita fora, carinho, amor e iluminam minha vida. Aos amigos (in memoriam) Orlando e Professor Armando pelos ensinamentos, amizade e carinho. Minha eterna gratido.

AGRADECIMENTOS

Fiocruz pela oportunidade da realizao do mestrado e apoio financeiro. Ao Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos Bio-Manguinhos pela possibilidade de realizao deste trabalho e condies fornecidas e direo do MPTI nas pessoas das Dra. Sheila e Zara pela ateno, empenho, ajuda e conselhos.

Meu Deus, meu Jesus e meu So Jorge, a cada dia que ouviam minhas preces aliviaram a saudade de casa, me deram fora e coragem para continuar a enfrentar esse meu novo caminho. Obrigado a vs.

Doutora Elezer Monte Blanco Lemes pelo interesse, motivao, apoio, ateno, orientao e ensinamentos para que esse trabalho pudesse ganhar vida e por me encorajar a enfrentlo sem medo.

Aos amigos do mestrado que nas horas ruins e boas estavam sempre juntos, em especial Ingrid Medeiros e Michel Gomes que passaram mais dois anos de penao juntos; ao Dnis Millan, Lvia Rubatino e Aline Martins pelo apoio direto nas horas de receio e dvidas sobre o novo assunto para mim e aqueles que de certa forma me ajudaram na realizao do trabalho.

Ao DEQUA na pessoa da Darcy Akemi Hokama pela ateno inicial e possibilidade da realizao do trabalho no departamento. Daniel Guedes que primeiramente se props a me orientar, contudo mesmo no sendo possvel a continuao foi de grande auxlio e sempre prestativo. Marisa Ribeiro, rica Fonseca, Joyce Brito e Gisela Freitas pela ateno e por estarem sempre disponveis e prestativos a esclarecer dvidas. Professor Jos Procpio pelas contribuies para finalizao deste trabalho. Aos amigos de Fundo pelos momentos de curtio, alegria, descontrao e brincadeiras. minha famlia do Rio de Janeiro Samuel Toledo, Carlos Gustavo Azevedo e Tatiana Oliveira.

Agradeo do fundo do corao a todos que contriburam de alguma forma para realizao deste trabalho.

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NDICE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................... viii LISTA DE QUADROS ........................................................................................................ xii LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... xii LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... xiii RESUMO ............................................................................................................................ xv ABSTRACT ....................................................................................................................... xvi 1 - INTRODUO ................................................................................................................ 2 1.1- Histrico Geral............................................................................................................ 2 1.2 Alfainterferona em Bio-Manguinhos ......................................................................... 3 1.3 Interferons ................................................................................................................. 5 1.4 Alfainterferona 2b ..................................................................................................... 7 1.5 - Controle de Qualidade ................................................................................................ 8 1.5.1 Mtodos Analticos .............................................................................................. 10 1.5.2 Garantia de Qualidade Analtica .......................................................................... 12 1.6 - Validao dos ensaios analticos............................................................................... 14 1.6.1 Preciso e reprodutibilidade. ................................................................................ 15 1.6.2 Exatido .............................................................................................................. 16 1.6.3 Equivalncia analtica .......................................................................................... 17 1.7 - Ensaios radioativos de controle de qualidade ............................................................ 17 1.8 - Mtodos Analticos Farmacopeicos .......................................................................... 19 1.9 - Deteco de Traos de DNA .................................................................................... 22 1.10 - Ensaios para Quantificao de DNA Residual de Clulas Hospedeiras (DCH) ....... 24 1.10.1. Hibridizao ..................................................................................................... 24 1.10.2 PCR em tempo real ou PCR quantitativo ........................................................... 26 1.10.3 Threshold .......................................................................................................... 28 1.11 - Gesto de Risco para a Qualidade........................................................................... 30 1.11.1 Design Space ..................................................................................................... 36 1.11.3 HACCP ............................................................................................................. 41 1.12 Relevncia do estudo ............................................................................................. 43 2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 45 2.1 - Objetivo Geral ......................................................................................................... 45 2.2 - Objetivos especficos ............................................................................................... 45

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3 METODOLOGIA .......................................................................................................... 46 3.1 1 fase: Levantamento bibliogrfico ......................................................................... 47 3.2 2 fase: Desenho de fluxogramas ............................................................................. 48 3.3 3 fase: Desenho de diagramas de causa e efeito ...................................................... 48 3.4 4 fase: implementao do HACCP.......................................................................... 48 3.5 5 fase: elencar PCC ................................................................................................ 48 4 RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................... 51 4.1 Fluxogramas ............................................................................................................ 51 4.2 Diagrama de causa e efeito (Ishikawa ou espinha de peixe) ..................................... 63 4.3 Implementao do HACCP...................................................................................... 66 4.3.1 Tabelas de perigos, causas e efeitos. ................................................................. 66 4.3.2 Pontos crticos de controle (PCC) ..................................................................... 71 4.4 Ensaios alternativos para quantificao de DCH ...................................................... 75 5 CONCLUSO ............................................................................................................... 83 5.1 Perspectivas e trabalhos futuros ............................................................................... 84 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS. ........................................................................... 85

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

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P Istopo radioativo Fsforo 32

ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida) ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ATP Adenosine Triphosphate (Adenosina Trifosfato) BPF Boas Prticas de Fabricao BPL Boas Prticas Laboratoriais CBP/p300 CREB-Binding Protein (Protena de Ligao CREB) CEE Comisso de Estudo Especial de Gesto de Risco CGLAB Coordenao Geral de Laboratrios CGPNI Coordenao Geral do Programa Nacional de Imunizaes CGSH Coordenao Geral Sangue e Hemoderivados CHO Chinese Hamster Ovary (Ovrio de Hamster Chins) CIGB Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (Centro de Engenharia Gentica e Biotecnologia) CIM Centro de Inmunologa Molecular (Centro de Imunologia Molecular) CIPBR Centro Integrado de Prottipos, Biofrmacos e Reativos CPP Critical Process Parameters (Parmetros Crticos do Processo) CQA Critical Quality Attributes (Atributos Crticos de Qualidade) CREB cAMP-Response Element-Binding (Elemento de Ligao Resposta de cAMP) DCB Denominao Comum Brasileira DCH DNA de clulas hospedeiras DEQUA Departamento de Controle de Qualidade DNA cido Desoxirribonuclico DOE Design of Experiments (Planejamento de Experimentos) DST Doenas Sexualmente Transmissveis DTP Difteria Ttano Coqueluche EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Acetato Etilenodiamino Tetractico)

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EFPIA European Federation of Pharmaceutical Industries Associations (Federao Europia das Associaes das Indstrias Farmacuticas) ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunosorbente Ligado Enzima) EMA European Medicines Agency (Agncia Europeia de Avaliao dos Medicamentos) EPO Eritropoetina EU Unio Europia EUA Estados Unidos da Amrica FDA Food and Drug Administration (Administrao de Alimentos e Medicamentos) FIOCRUZ Fundao Oswaldo Cruz FMEA Failure Mode, Effects Analysis (Anlise de Modo e Efeitos de Falha) FMECA Failure Mode, Effects and Criticality Analysis (Anlise da Criticidade de Modo e Efeitos de Falha) fsDNA DNA fita simples FTA Fault Tree Analysis (Anlise da rvore de Falhas) FUNASA Fundao Nacional da Sade GMP Good Manufacturing Practice (Boas Prticas de Fabricao) GQA Garantia da Qualidade Analtica HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle) HAZOP Hazard Operability Analysis (Anlise de Perigos de Operabilidade) HCC Hepatite C Crnica HCV Vrus da Hepatite C HIB Haemophilus influenza B HIV Vrus da Imunodeficincia Adquirida HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Lquida de Alta Performance) ICH International Conference on Harmonisation (Conferncia Internacional de Harmonizao) IEC International Engineering Consortium (Conscio Internacional de Engenharia) IFA Ingrediente Farmacutico Ativo IFN Interferon

IFN Interferon IFN-2b Interferon Alfa 2b IFN- Interferon IKK- Inhibitor-B kinase (protena Quinase Inibidora de B) ILA Imuno-Ligand Assay (Ensaio Imuno-Ligante) IMA Institute of Management Accountants (Instituto de Gesto de Contadores) IPS-1 Interferon Promoter Stimulator 1(Estimulador Promotor de Interferon 1) IRF-3 Interferon Regulatory Factor 3 (Fator Regulador de Interferon 3) IRF-7 Interferon Regulatory Factor 7 (Fator Regulador de Interferon 7) IRF-9 Interferon Regulatory Factor 9 (Fator Regulador de Interferon 9) ISG Interferon Stimulated Genes (Genes Estimuladores de Interferon) ISGF3 Interferon-Stimulated Genes Factor 3 (Genes Estimuladores de Interferon Fator 3) ISO International Organization for Standardization (Organizao Internacional para Padronizao) ISRE Interferon-Sensitive Response Element (Elemento de Resposta Sensitivo Interferon) Jak Janus kinase (Janus Quinase) LAPS Light-Addressable Potentiometric Sensor (Sensor Potenciomtrico Endereador de Luz) Mhw Ministry of Health and Welfare (Ministrio da Sade e Bem-Estar) NS3 Nonstructural Protein 3 (protena No Estrutural 3) NS4A Nonstructural Protein 4A (protena No Estrutural 4A) OMS Organizao Mundial da Sade PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns (Padro Molecular Associado Patgeno) PC Pontos de Controle PCC Pontos Crticos de Controle PCR Reao em Cadeia da Polimerase Peg-INF Interferon Peguilado PHA Preliminary Harzard Analysis (Anlise Preliminar de Perigos) PhRMA Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (Pesquisa e Fabricantes Farmacuticos da Amrica)

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PNI Programa Nacional de Imunizaes POP Procedimento Operacional Padro PRD Domnio Regulatrio Positivo de DNA PVDC Polyvinylidene Chloride ( Cloreto de Polivinilideno) qPCR quantitative PCR (PCR quantitativo) RCC Carcinoma de Clula Renal RDC Resoluo da Diretoria Colegiada RE Resoluo RIG-I Retinoic acid Inducible Gene I (Gene Indutor de cido Retinico) RNA cido Ribonuclico RVS Resposta Virolgica Sustentada SCTIE Secretaria de Cincia e Tecnologia e Insumos Estratgicos SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sdio) SQ Sistema da Qualidade SSB Single-Stranded Binding protein (protena Ligadora de Fita Simples) SSC Standard Saline Citrate (Citrato Salina Padro) STAT Signal Transducer and Activator of Transcription (Sinal Transdutor e Ativador de Transcrio) STAT1 Signal Transducer and Activator of Transcription type 1 (Sinal Transdutor e Ativador de Transcrio Tipo 1) STAT2 Signal Transducer and Activator of Transcription type 2 (Sinal Transdutor e Ativador de Transcrio Tipo 2) SUS Sistema nico de Sade SVS Secretaria de Vigilncia Sanitria TBE Tris Borato EDTA TBK1 TANK-binding kinase 1 TQM Total Quality Management (Gesto da Qualidade Total) Tyk2 Tyrosine kinase 2 (Tirosina Quinase 2) USP United States Pharmacopeia (Farmacopeia Americana) WHO World Health Organization (Organizao Mundial da Sade)

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LISTA DE QUADROS
Quadro 1.1: Classificao dos testes, segundo sua finalidade................................................14 Quadro 1.2: Ensaios necessrios para a validao do mtodo analtico, segundo sua finalidade.................................................................................................................................15 Quadro 1.3: Metodologias mais comuns de anlise de risco...................................................39 Quadro 3.1: Resumo dos pontos crticos de controle (PCC) para cada ensaio avaliado.........78

LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1: Definies associadas Garantia de Qualidade Analtica....................................13 Tabela 1.2: Usos principais de sondas de cidos nuclicos radiomarcadas in vitro................20 Tabela 4.1: Perigos, suas causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao para o ensaio de Dot Blot radioativo...................................................................................................................67 Tabela 4.2: Perigos, suas causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao para o ensaio de qPCR.........................................................................................................................................68 Tabela 4.3: Perigos, suas causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao para o ensaio de Threshold..................................................................................................................................69 Tabela 4.4: Determinao dos PCCs no ensaio de Dot Blot radioativo...................................71 Tabela 4.5: Determinao dos PCCs no ensaio de qPCR........................................................72 Tabela 4.6: Determinao dos PCCs no ensaio de Threshold..................................................73 Tabela 4.7: Caractersticas de desempenho dos mtodos de quantificao de DCH...............77

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Ao do IFN na infeco por HCV..........................................................................5 Figura 1.2: Linha do tempo para evoluo do processo de qualidade e BPF.............................9 Figura 1.3: O processo de hibridizao.....................................................................................25 Figura 1.4: Ensaio Dot-Blot de hibridizao para a quantificao do DNA genmico residual de E. coli...................................................................................................................................26 Figura 1.5: Diagrama detalhando os estgios do processo de qPCR........................................27 Figura 1.6: Esquema dos estgios do ensaio de DNA Total no sistema Threshold..................29 Figura 1.7: Estgios do ensaio Threshold.................................................................................30 Figura 1.8: Carteira industrial de riscos....................................................................................30 Figura 1.9: Viso geral de um tpico processo de gesto de risco para qualidade....................33 Figura 1.10: Representao esquemtica da interao entre gesto, comunicao e avaliao de riscos....................................................................................................................................34 Figura 1.11: Ligao entre Espao de Conhecimento, Design Space e Faixa Normal de Operao...................................................................................................................................38 Figura 4.1: rvore de perguntas para determinao dos PCC.................................................50 Figura 4.1: Fluxograma do ensaio de dot-blot radioativo........................................................53 Figura 4.2: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa de extrao de DNA................................54 Figura 4.3: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa de preparo do mix master da reao........55 Figura 4.4: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa do preparo da curva padro......................56 Figura 4.5: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa das diluies seriadas...............................57 Figura 4.6: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa do PCR em tempo real.............................58 Figura 4.7: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa de extrao de DNA...............................59 Figura 4.8: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da espectrofotometria.............................60 Figura 4.9: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da eletroforese........................................61 Figura 4.10: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da quantificao de DNA.....................62

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Figura 4.11: Diagrama de causa e efeito das possveis fontes de variao nos ensaios de quantificao de DNA de clula hospedeira (DCH).................................................................64 Figura 4.12: Ilustrao indicativa das fontes tpicas de incertezas...........................................66 Figura 4.13: Representao esquemtica do alcance dinmico dos mtodos de quantificao de DNA.....................................................................................................................................76 Figura 4.14: Grfico representativo da importncia dos fatores que influenciam na escolha de uma metodologia analtica para quantificao de DCH...........................................................81

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RESUMO
O Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos Bio-Manguinhos uma unidade de produo da Fundao Oswaldo Cruz ligado ao Ministrio da Sade. Em 2004 realizaram-se acordos com o Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) para a produo do biofrmaco Alfainterferona 2b (IFN-2b) para suprir a demanda do Programa de Medicamentos de Dispensao Excepcional do Ministrio da Sade. Assim, a produo e distribuio deste biofrmaco garante populao o acesso gratuito aos produtos de alta tecnologia, fortalecendo os princpios de universalidade, integralidade e equidade que norteiam as aes do Sistema nico de Sade. A anlise de produtos biotecnolgicos baseia-se no uso de mtodos analticos sofisticados para demonstrar sua identidade estrutural, homogeneidade de protenas e avaliar sua vida til ou estabilidade. Embora no haja relatos de efeitos adversos para a sade pelo DNA do hospedeiro no produto intermedirio de produtos biotecnolgicos, as agncias regulatrias tem requerido s indstrias a garantia de que o nvel de DNA neles seja bem reduzido. A tcnica comumente utilizada pelo CIGB para quantificar nveis de DNA a hibridizao radioativa. No entanto, vrios fatores tornam impraticvel seu uso na rotina dos laboratrios analticos: trabalhoso, demorado, semi-quantitativo e requer um radioistopo. Para determinar essas pequenas quantidades de DNA, um mtodo analtico deve ser extremamente sensvel e robusto. Em princpio, trs tcnicas tm a sensibilidade requerida: a hibridizao, os mtodos baseados em ligao de DNA e protena (como o Threshold) e o PCR quantitativo. A Gesto de Riscos para Qualidade (GRQ) um processo sistemtico para avaliao, controle, comunicao e anlise de riscos para a qualidade do produto (medicamento) em todo seu ciclo de vida. O gerenciamento de riscos auxilia na deciso, levando em considerao as incertezas, a possibilidade de circunstncias ou eventos futuros e seus efeitos sobre os objetivos acordados. A GRQ apoia uma abordagem cientfica e prtica para a tomada de decises e podem avaliar e gerenciar riscos utilizando ferramentas prprias. Neste trabalho, nossa proposta foi estabelecer uma metodologia alternativa para o controle de qualidade do biofrmaco IFN-2b utilizando como metodologia a ferramenta de anlise de risco, Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (HACCP). Foram observados 25 perigos para o dot-blot nas oito etapas do ensaio, 14 perigos nas cinco etapas do qPCR e 19 perigos nas cinco etapas do Threshold. Vrios desses perigos, nos respectivos ensaios, apresentam causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao semelhantes. Verificou-se que o e dot-blot radioativo o ensaio que apresenta maior nmero de pontos crticos de controle (PCC) devido a sua natureza radiativa, 16 no total. Logo aps vem o qPCR com seis PCC em trs etapas seguido do Threshold com cinco PCC estando quatro em uma nica etapa, o que evidencia que a alta criticidade da etapa e que muitas medidas de mitigao precisam ser implementadas para que o ensaio esteja dentro dos padres de controle de uso na rotina dos laboratrios. Conclui-se a partir da anlise dos perigos pelo uso do HACCP que a metodologia analtica alternativa melhor avaliada para a questo proposta o qPCR.

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ABSTRACT
The Immunobiological Technology Institute Bio-Manguinhos is a production unit of Oswaldo Cruz Foundation attached to the Ministry of Health, committed to improving the health of the population, so in 2004 took place agreements with the Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) for IFN 2b (IFN-2b) production to supply the demand of the Ministry of Health Special Medication Program. Therefore, the production and distribution of that biopharmaceutical guarantees to the population free access to high technology products, strengthening the principles of universality, comprehensiveness and fairness that guide the actions of the Unified Health System. The analysis of biotechnology products relies on the use of sophisticated analytical methods to establish the identity, homogeneity of structural proteins and evaluate the useful life or the stability of it. Although there isnt reports of adverse health effects for their content of host-DNA, regulatory agencies have required to the industries to ensure the low level of DNA in these products. The technique commonly used by CIGB to quantify DNA level is a radioactive-hybridization. However, several factors make it impractical for use in routine test for DNA contaminants: it is labor intensive, time consuming, semiquantitative and requires a radioisotope. To determine these small amounts of DNA, an analytical method has to be extremely sensitive and robust. In principle, three techniques have the sensitivity required: hybridization, DNA binding protein-based methods (such as the Threshold) and quantitative PCR. Quality Risk Management (QRM) is a systematic process to assess, control, communicate and review of risks to verify the quality of the product (drug) throughout its life cycle. The process of risk management helps to make decision, considering the uncertainties and the possibility of future events or circumstances (intentional or unintentional) and their effects on the agreed objectives. QRM supports a scientific and practicing approach to make a decision and can assess and manage risk using self-tools. In this study, our proposition was to establish an alternative methodology for quality control of the biopharmaceutical IFN-2b using the risk analysis tool Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) as methodology. There were 25 hazards to the dot-blot assay in eight steps of it, 14 hazards in five steps of qPCR and 19 hazards in all five stages of the Threshold. Moreover, even different, many of these hazards in their respective testing, exhibit the sames causes, effects, detection and mitigation measures. It was found that e radioactive dot-blot assay is the one with the greatest number of critical control points (CCP) due to its radioactive nature, 12 in total. After it comes qPCR with six CCP in three steps followed by Threshold with five CCP which four appears in one step, which demonstrates the high criticality of the step and because this many mitigation measures need to be implemented so that the test is within the standards control use in routine laboratories. We conclude from the analysis of hazards by the use of the HACCP alternative analytical methodology to better evaluate the issue is the proposed qPCR.

1 - INTRODUO
1.1- Histrico Geral O Instituto Soroterpico Federal que deu origem Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) foi fundado em 1900 para produzir vacinas com o objetivo de enfrentar a epidemia de peste bubnica que assolava o Brasil na virada do sculo. Em 1976, a Fiocruz criou uma unidade voltada especialmente para produo de imunobiolgicos, o Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos , que atualmente responde por cerca de um tero das vacinas consumidas no Brasil. Junto com outros laboratrios pblicos brasileiros, Bio-Manguinhos abastece o Sistema nico de Sade com os imunobiolgicos do Programa Nacional de Imunizaes (PNI) (Bio-Manguinhos, 2010). Bio-Manguinhos atende prioritariamente ao mercado pblico representado pelos seguintes rgos do Ministrio da Sade (MS): Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS) responsvel pela aquisio de vacinas por meio da Coordenao Geral do Programa Nacional de Imunizaes (CGPNI), de reativos para diagnstico laboratorial por meio da Coordenao Geral de Laboratrios (CGLAB) e do Departamento de Doenas Sexualmente Transmissveis, AIDS e Hepatites Virais (DST/AIDS); Secretaria de Cincia e Tecnologia e Insumos Estratgicos (SCTIE) responsvel pela aquisio de alguns biofrmacos do Programa de Medicamentos Excepcionais do MS. A partir de 2010, Bio-Manguinhos passou a atender tambm demanda da Secretaria de Ateno Sade (SAS) por meio da aquisio pela Coordenao Geral Sangue e Hemoderivados (CGSH) do Teste NAT para HIV/HCV para triagem de bolsas de sangue. As atividades de Bio-Manguinhos alm de garantirem o no desabastecimento de Programas do MS, tambm servem como um importante instrumento de poltica pblica visando reduo de preos e ampliao do acesso populao. Em todas as linhas de produtos, os principais fatores de diferenciao de BioManguinhos so: a qualidade assegurada dos produtos conforme os requisitos necessrios ao atendimento das demandas de sade pblica do pas; o alinhamento s polticas pblicas na rea da sade, e s polticas de desenvolvimento industrial e tecnolgico. Estes fatores conferem ao Instituto papel estratgico em uma indstria altamente sensvel dinmica de competio privada (Bio-Manguinhos, 2010).

Diversificando mais uma vez sua linha produtiva, Bio-Manguinhos assumiu um novo desafio tecnolgico para atender demanda do Ministrio da Sade, com relao a medicamentos de uso contnuo de alto valor agregado para pacientes: a produo de biofrmacos. Este novo mercado, diferente dos imunoprevenveis, proporcionou dois acordos de transferncia de tecnologia assinados em agosto de 2004: um com o CIMAB - empresa comercializadora dos produtos do Centro de Inmunologa Molecular (CIM) em Havana, Cuba - para a produo nacional do biofrmaco Eritropoetina (EPO), e outro com a Heber Biotec empresa comercializadora dos produtos do Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) Havana, Cuba - para a produo nacional do biofrmaco Alfainterferona 2b (IFN-2b) (Bionotcias-2004). Estes dois biofrmacos esto tendo sua produo nacionalizada e realizadas no CIPBR (Centro Integrado de Prottipos, Biofrmacos e Reativos), com duas plataformas de produo distintas: uma em clula de mamfero (CHO Clula do Ovrio de Hamster), e outra em clula de bactria (E. coli). Ambas plataformas iro trabalhar com clulas geneticamente modificadas. Estas novas tecnologias trazem como desafio para o Controle de Qualidade, novos equipamentos e metodologias de anlise mais acuradas que possam responder a tempo e hora as demandas da produo e, desta forma, assegurar produtos com qualidade, eficcia e segurana. Para atender s necessidades da sade da populao brasileira, Bio-Manguinhos investe no desenvolvimento e produo de vacinas, reativos para diagnstico e biofrmacos de qualidade assegurada. O cumprimento dos requerimentos de Boas Prticas de Fabricao (BPF) assim como a certificao de qualidade de seus laboratrios, faz do Instituto um importante agente para a melhoria da sade pblica do pas. Sendo assim, o compromisso de BioManguinhos , por meio da melhoria contnua, desenvolver e produzir vacinas, reativos para diagnstico e biofrmacos dentro dos padres da qualidade, motivando permanentemente seus colaboradores para atender s expectativas de seus clientes, atuando com responsabilidade social e atentando para a preservao do meio ambiente (Bio-Manguinhos, 2010). 1.2 Alfainterferona em Bio-Manguinhos O Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos (Bio-Manguinhos, comprometida com a melhoria das condies de sade da populao brasileira. Ao longo de sua existncia a referida Instituio tem investido em desenvolvimento prprio, colaboraes a partir de processos de alianas estratgicas e transferncia de tecnologia e apoio a projetos que visem solues para

preveno, diagnstico e tratamento de doenas de grande impacto na sade pblica do pas (Bio-Manguinhos, 2010). No que se refere ao processo de transferncia de tecnologia, Bio-Manguinhos tem realizado vrios acordos com diversas instituies para incorporao de produtos de interesse do MS, com destaque para o acordo firmado em 2004 com o Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) para a produo de IFN-2b. A importncia desse acordo de transferncia de tecnologia foi atender de forma rpida a demanda do Programa de Medicamentos de Dispensao Excepcional do Ministrio da Sade, o qual foi iniciado em 1982, e tem como principal objetivo a disponibilizao de medicamentos de alto custo utilizados para o tratamento de doenas especficas que atingem um nmero limitado de pacientes. Por se tratarem de doenas crnicas, sabe-se que os pacientes atendidos pelo programa recebero os produtos por perodos prolongados em uma das unidades ambulatoriais do Sistema nico de Sade (SUS). Sendo assim, o fornecimento desses medicamentos denominados como de alto custo depende da aprovao especfica das Secretarias Estaduais de Sade e de uma avaliao clnica e laboratorial do paciente. Os critrios de incluso previstos pelo Programa encontram-se estabelecidos nos Protocolos Clnicos e Diretrizes Teraputicas PCDT (Ministrio da Sade, 2010). O IFN 2b foi includo especificamente no PCDT da Hepatite Viral C em 2007 (Brasil, 2007). Vale a ressalva que o nome genrico do produto Interferon alfa 2b humano recombinante, a representao qumica do seu princpio ativo IFN 2b, porm, seguindo a Denominao Comum Brasileira (DCB) de 2009, o produto comercializado por BioManguinhos chamado de Alfainterferona 2b (INF-2b). Dessa forma, a produo nacional juntamente com a parceria com as Secretarias Estaduais de Sade garantem a distribuio desse biofrmaco o que permite que a populao brasileira tenha acesso gratuito e garantido a um medicamento extremamente importante e de elevada tecnologia, fortalecendo os princpios de universalidade, integralidade e equidade que norteiam as aes do SUS contribuindo, dessa forma, para a reduo dos gastos do Ministrio da Sade.

1.3 Interferons Os interferons foram a primeira famlia de citocinas a ser descoberta. Em 1957 pesquisadores observaram que se clulas animais susceptveis fossem expostas infeco viral, estas clulas imediatamente tornavam-se resistentes ao ataque de outros vrus (Isaacs e Lindenmann, 1957). Esta resistncia foi induzida por uma substncia secretada pelas clulas infectadas com o vrus, a qual foi chamada de interferon (IFN). Subsequentemente, foi mostrado que a maioria das espcies animais produzia de fato um extenso conjunto de interferons (Walsh, 2003). Segundo Walsh (2003), os interferons so produzidos por uma variedade de diferentes tipos celulares, e exibem uma ampla faixa de efeitos biolgicos, incluindo: Induo de resistncia celular a infeco viral; Regulao da resposta imune; Regulao do crescimento e diferenciao de muitos tipos celulares; Sustentao das fases primrias da gravidez em algumas espcies animais.

Os IFNs so potentes citocinas e elementos-chave na estimulao da resposta imune inata antiviral. Os IFNs medeiam os efeitos antivirais por meio da ativao da transcrio de genes IFN-estimulado (ISGs Interferon Stimulated Genes) (McHutchinson, 2004) (Figura 1.1). Os ISGs so principalmente induzidos pela sinalizao intracelular desencadeada por IFN atravs do receptor de IFN /, que ativa o sinal Janus quinase transdutor e ativador da via de transcrio (Jak-STAT Janus kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription) (Figura 1.1c) (Feld e Hoofnagle, 2005). O IFN desencadeia a fosforilao de STAT1(Signal Transducer and Activator of Transcription type 1) e STAT2 (Signal Transducer and Activator of Transcription type 2) para mediar a ativao de STAT e a formao do complexo ISGF3 (Interferon-Stimulated Genes Factor 3) consistindo de STAT1, STAT2 e IRF-9 (Interferon Regulatory Factor 9) (Der et al, 1998; Heim, 1999). O ISGF3 liga-se ao elemento de resposta estimulado por interferon (ISRE Interferon-Sensitive Response Element) dentro da regio promotora do ISGs para induzir a expresso do gene. Os produtos ISG difundem aes celulares que limitam a replicao viral e o espalhamento viral clula a clula e indiretamente modulam a maturao da resposta imune adaptativa (Figura 1.1d) (Stark et al., 1998; Shimazaki et al., 2002). Os IFNs so produzidos naturalmente durante a infeco pelo vrus da hepatite C (HCV) ou outros vrus. No caso do HCV, o reconhecimento do RNA viral pela protena gene-I indutor

de cido retinico (RIG-I Retinoic acid Inducible Gene I) desencadeia uma cascata de sinalizao atravs do estimulador promotor 1 de IFN protena simuladora-1 (IPS-1 Interferon Promoter Stimulator 1) promotora de interferon essencial, levando ativao do fator de transcrio fator-3 regulador de interferon (IRF-3) e a induo e uma expresso de IFN / (Sen, 2001; Guo et al., 2001). O HCV pode antagonizar a sinalizao RIG-I a IRF-3 atravs das aes da protease viral NS3/4A, que alveja e cliva IPS-1 interrompendo a ativao de IRF-3 (Guo et al., 2001; Foy et al., 2005) (Figura 1.1a). Assim, a aplicao teraputica do IFN para mediar a alta expresso sustentada de ISG e, concomitantemente, promover ou restaurar a sinalizao de RIG-I nas clulas infectadas pode proporcionar aumento da potncia antiviral contra HCV (Erickson, 2008).

Figura 1.1: Ao do IFN na infeco por HCV. (a) Ligao da PAMP viral (HCV RNA) a RIG-I ou TLR3 resulta na
fosforilao e ativao do IRF-3 pelas protenas quinase TBK1 ou IKK-. O dmero de fosfo-IRF-3 transloca para o ncleo da clula, interage com seus parceiros de transcrio, incluindo CBP/p300 e se liga ao domnio regulatrio positivo de DNA (PRD) na regio promotora dos genes-alvo do IRF-3, incluindo IFN-. (b) A ativao de IRF-3 resulta na produo e secreo de IFN pela clula infectada. (c) O IFN- se liga ao receptor de IFN-/ e ativa as protenas quinases associadas Tyk2 e Jak1 para dirigir a fosforilao e montagem de um heterodmero STAT1-STAT2 e o complexo trimrico ISGF3 contendo IRF-9. O complexo ISGF3 se aloca ao ncleo da clula, onde se liga ao ISRE em genes-alvo para direcionar a expresso de ISG. (d) Os ISGs so os efetores genticos da resposta do hospedeiro. IRF-7 um fator de transcrio e um ISG. Ele ativado aps a expresso atravs de vias de sinalizao PAMP viral que se sobrepem com os caminhos da ativao de IRF-3. A fosforilao, dimerizao e heterodimerizao de IRF-7 com IRF-3 permite sua ligao ao elemento cognato de resposta ao (VRE) na regio promotora dos genes de IFN-, resultando na produo de diversos subtipos de IFN- que sinaliza a expresso de ISG . Isso aumenta a abundncia de RIG-I e PAMP viral cujos componentes continuam a sinalizao sinalizao para amplificar a produo de IFN e a resposta do hospedeiro. A administrao teraputica do IFN- fornece ao antiviral contra HCV por sinalizao e expresso de ISG atravs do receptor IFN-/ e a via Jak-STAT. A separao de RIG-I e TLR3 sinalizada por proteases HCV NS3/4A, bloqueia a ativao de IRF-3 e atenua a resposta do hospedeiro infeco (Fonte: Gale e Foy, 2005).

1.4 Alfainterferona 2b Empregando-se a tcnica de DNA recombinante, ferramentas de biotecnologia e boas prticas de fabricao, foi possvel padronizar e comercializar vrias formulaes de interferon para uso teraputico. Esta protena teraputica (biofrmaco) tem sido amplamente aplicado em incontveis doenas (Srivastava et al. 2005). Vrios estudos foram realizados em hepatite C crnica, incluindo indivduos de todas as idades e sexos. Os estudos compreenderam tanto o uso de monoterapia com Alfainterferona 2b como em combinao com ribavirina. Em todos os estudos, os dados de eficcia clnica e de segurana so comparveis aos da literatura internacional com Alfainterferona (BioManguinhos, 2006). At o momento. a terapia com Interferon para a hepatite C crnica (HCC) tem sido o nico tratamento que pode eliminar completamente o vrus. A terapia de combinao com IFN peguilado (Peg-IFN) e ribavirina tem sido amplamente recomendada como a primeira escolha para pacientes com hepatite C crnica com altas cargas virais (Nagao e Sata, 2010). A taxa de resposta virolgica sustentada (RVS), para o HCV gentipo 1, aps 48 semanas de tratamento com uma dose padro de aproximadamente 40 a 50% (Hadziyannis et al., 2004; Mangia et al., 2008). Tem sido demonstrado que a terapia com IFN diminui a taxa de desenvolvimento de HCC e melhora o prognstico a longo prazo (Yoshida et al., 1999; Mazzaferro et al., 2006). Nos ltimos anos, ensaios clnicos utilizando agentes antivirais de ao direta contra o HCV, tm mostrado que os inibidores de protease so uma estratgia eficaz para o tratamento do gentipo 1. Boceprevir e Telaprevir so os primeiros inibidores de protease para tratamento do HCV e foram recentemente registrados na ANVISA, permitindo sua introduo no arsenal teraputico nacional. Essas duas medicaes apresentam molculas diferentes e atuam inibindo a enzima proteas e serina NS3 do HCV, agindo diretamente sobre o vrus da Hepatite C atravs do bloqueio da sua replicao. Ambos so utilizados em associao com IFN peguilhado e ribavirina, constituindo assim uma terapia tripla (Ministrio da Sade, 2012). Em outras enfermidades virais que constituem indicaes aprovadas para o Alfainterferona 2b se incluem estudos em hepatite B crnica; hepatite C aguda; indivduos infectados por HIV em etapas iniciais da infeco; infeces por Papiloma Vrus. Neste ltimo grupo, cabe destacar o programa nacional de uso de Alfainterferona 2b em Papilomatose Respiratria Recorrente, onde o estudo indica um impacto do produto na soluo desse

problema de sade. A indicao mais importante do Alfainterferon 2b em neoplasias a leucemia mielide crnica, na qual so relatados 3 estudos com 67 pacientes, demonstrando a eficcia do produto nesta indicao, alcanando aumento significativo do intervalo livre de recadas e da sobrevida (Bio-Manguinhos, 2006). Alm desses, o carcinoma de clula renal (RCC) tem sido historicamente tratado com IFN com taxa de resposta de 10 a 15% e sobrevivncia mdia de 12 meses (Motzer et al., 2002; Rini et al., 2010). IFN tambm tem demonstrado uma vantagem de sobrevivncia modesta em relao aos hormnios e quimioterapia em ensaios clnicos aleatrios e metaanlises (Coppin et al., 2005; Rini et al., 2010). As propriedades antivirais, antitumorais e imunomoduladoras dos interferons garantiram sua aprovao para uma variedade de aplicaes teraputicas. Atualmente, a maioria das Alfainterferona 2b fabricadas e vendidas pelas companhias biofarmacuticas so produzidos em E. coli (Pestka, 2007; Walsh, 2003). 1.5 - Controle de Qualidade O movimento da qualidade pode traar suas razes de volta Europa medieval, onde os artesos comearam a se organizar em sindicatos chamados guildas no final do sculo 13. At o incio do sculo 19, a fabricao no mundo industrializado tendeu a seguir esse modelo artesanal. O sistema fabril, com sua nfase na inspeo do produto, comeou na Gr-Bretanha na Revoluo Industrial, no incio de 1800. No incio do sculo 20, os fabricantes comearam a incluir os processos de qualidade nas prticas industriais (Figura 1.2). Depois que os Estados Unidos (EUA) entraram na Segunda Guerra Mundial, qualidade tornou-se um componente crtico do esforo de guerra. O nascimento de qualidade total nos Estados Unidos veio como uma resposta direta revoluo de qualidade no Japo aps a Segunda Guerra Mundial (American Society For Quality, 2011) (Figura 1.2). A partir da dcada de 50, surgiu a preocupao com a gesto da qualidade, que trouxe uma nova filosofia gerencial com base no desenvolvimento e na aplicao de conceitos, mtodos e tcnicas adequados uma nova realidade. A gesto da qualidade total, como ficou conhecida essa nova filosofia gerencial, marcou o deslocamento da anlise do produto ou servio para a concepo de um sistema da qualidade. A qualidade deixou de ser um aspecto do produto e responsabilidade apenas de departamento especfico, e passou a ser um problema

da empresa, abrangendo, como tal, todos os aspectos de sua operao (Longo, 1996) (Figura 1.2). Na dcada de 1970, os setores industriais dos EUA, tais como automveis e eletroeletrnicos perderam destaque pela concorrncia japonesa de alta qualidade. A resposta dos EUA, enfatizando no apenas estatsticas, mas abordagens que abraaram toda a organizao tornaram-se conhecidas como Gesto da Qualidade Total (TQM) (Figura 1.2). Na ltima dcada do sculo 20, o TQM foi considerado um modismo por muitos lderes empresariais. Mas, enquanto o uso do termo TQM desapareceu um pouco, principalmente nos Estados Unidos, suas prticas continuaram. Nos poucos anos desde a virada do sculo, o movimento da qualidade parece ter amadurecido para alm da Qualidade Total. Os Sistemas de Qualidade com novas abordagens evoluram a partir das bases de Deming, Juran e os primeiros praticantes japoneses de qualidade, e foram alm de fabricao em servio, sade, educao e setores do governo (American Society For Quality, 2011). Sendo assim, a Gesto da Qualidade precisa acompanhar as transformaes, tendo como objetivo se adequar tanto s novas necessidades das organizaes produtivas quanto s novas exigncias e caractersticas do ambiente competitivo (Chiavenato, 1999). A adoo de normas de Boas Prticas de Fabricao e Controle de Qualidade numa indstria farmacutica e/ou de imunobiolgicos de grande importncia, visto que todo o sistema de produo monitorado sob rigorosos procedimentos, a cada etapa do processo, at o produto ser liberado para comercializao. A verso brasileira de BPF, traduzida da Organizao Mundial de Sade (OMS) pelos especialistas do Ministrio da Sade e da Secretaria da Vigilncia Sanitria, surgiu em meados de 1994 (Rosenberg, 2000) e foi revisada na resoluo RDC n 134 em 2001. Atualmente est em vigor a RDC n 17, de 16 de abril de 2010, revisada e editada pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA (Figura 1.2). O Controle de Qualidade consiste em um conjunto de operaes cujos objetivos incluem a obteno de medicamentos cada vez melhores, mais eficazes e seguros, menos txicos e mais estveis. Antigamente, as solues para estes problemas eram feitas intuitivamente e com base em observaes e referncias populares, isto , empiricamente. Hoje, os procedimentos so realizados racionalmente fixando-se hipteses prvias que podem ou no ser comprovadas experimentalmente (Pinto et al., 2003).

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BPF - Brasil 1994
RDC 34 ANVISA 2001 RDC 210 ANVISA 2003

GMP EUA FDA 1938 EUA - Gesto da Qualidade Total 1950 Processos de qualidade 1901

RDC 17 ANVISA 2010

1900

1900

1911

1922

1933

1945

1956

1967

1978

1990

2001
Hoje

2013

EUA - qualidade (esforo de guerra) EUA - Setores industriais perderam destaque (alta qualidade, Japo) TQM (modismo) - prticas continuaram

1942

1945

1970

1980
1990 2000

SQ (novas abordagens) evoluram - bases de Deming, Juran

2001

2013

Figura 1.2: Linha do tempo para evoluo do processo de qualidade e BPF. EUA: Estados Unidos da Amrica; GMP: Good Manufacturing Practice; FDA: Food and Drug Administration; BPF: Boas Prticas de Fabricao; RDC: Resoluo da Diretoria Colegiada; ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria; TQM: Gesto da Qualidade Total; SQ: Sistema da Qualidade.

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Outro objetivo do controle de qualidade verificar se o produto est em conformidade com as especificaes farmacopeicas. A no conformidade representa um somatrio de atribuies para a empresa que podem resultar, alm dos prejuzos decorrentes do retrabalho, a perda de credibilidade e at a cassao da licena de funcionamento e do registro do produto (Cooper, 1979). Alm disso, o controle de qualidade deve estabelecer as especificaes, padronizar e validar os mtodos analticos utilizando sempre padres de referncia e, para os casos de possveis reanlises, reter e armazenar amostras de lotes aprovados e liberados. Deve realizar estudos de estabilidade do princpio ativo e estabelecer o prazo de validade, atravs de avaliaes de estudos acelerados e de longo prazo temperatura proposta, alm de acompanhamento de estabilidade anual. Compete tambm ao controle de qualidade dar assistncia tcnica s reclamaes concernentes ao controle de qualidade do produto, em conjunto com a garantia da qualidade e marketing, assim como autorizar o descarte de lotes no conformes (Hokama, 2005). Para o paciente, a falta de qualidade do medicamento ocasiona srios transtornos com o comprometimento da sua sade (Peixoto et al., 2005). 1.5.1 Mtodos Analticos Um dos passos de controle da segurana qumica dos alimentos e produtos farmacuticos a obteno de dados sobre os nveis de certas substncias que podem estar presentes nos mesmos (contaminantes, resduos, aditivos e nutrientes). A obteno destes dados o resultado de um processo que comea com a seleo e validao de um mtodo analtico. A execuo deve ser controlada de forma permanente (Gonzlez-Moreno et al., 1997). O mtodo analtico um procedimento que envolve o desmembramento de um todo, quebrando-o em suas partes ou elementos para observar as causas, a natureza e os efeitos. A anlise a observao e considerao de um fato particular. Voc deve conhecer a natureza do fenmeno e objeto que est sendo estudado para compreender a sua essncia. Este mtodo permite-nos saber mais sobre o objeto de estudo, com o qual se pode: explicar, fazer analogias, entender melhor seu comportamento e desenvolver novas teorias (Marchetti, 2012). A definio do mtodo analtico para ser usado pressupe o conhecimento de certo nmero de fatores, entre os quais: a natureza do analito; a natureza da amostra (a presena de substncias particulares na matriz da amostra pode afetar a aplicabilidade ou o desempenho de uma tcnica analtica); a concentrao do analito; e a confiabilidade necessria para a anlise. Estes parmetros determinam a escolha da tecnologia (alguns no podem ser usados porque as

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concentraes so muito baixas para serem determinadas, ou a tcnica no suficientemente precisa). Por outro lado, fazer uma anlise mais precisa ou exata muitas vezes necessria, conduz frequentemente despesa adicional. O conhecimento das caractersticas de um mtodo analtico permite verificar a adequao da tcnica para a aplicao particular (Marchetti, 2012). A anlise dos resduos e contaminantes em alimentos e produtos farmacuticos envolve a identificao de substncias encontradas em quantidades muito pequenas (da ordem de mg/kg ou g/kg) em matrizes complexas. Por conseguinte, necessrio realizar uma primeira extrao quantitativa da substncia, alm de purificar e/ou concentrar o extrato obtido, antes da sua deteco e quantificao. Para a seleo correta de um mtodo analtico, entendendo como mtodo o conjunto sucessivo das fases indicadas de extrao, purificao e identificao (deteco e/ou quantificao), devemos considerar todos os fatores que podem influenciar na validade do resultado em relao s razes que levaram sua aplicao (Gonzlez-Moreno et al., 1997). Segundo Brando (2001), os principais mtodos analticos so: Mtodos qumicos So os mtodos resultantes de um processo de transformao qumica, descritos pela maioria das farmacopeias oficiais, por serem os mais acessveis e de menor custo. Classificamse em: gravimtrico, volumtrico e gasomtrico. Os mtodos qumicos de identificao de funes ou determinados grupos qumicos presentes em frmacos, consistem em reaes que resultam em formao de precipitado, produto colorido, desprendimento de gs, descoramento do reagente usado ou outro fenmeno qualquer, facilmente perceptvel. Estes ensaios no so aplicveis em uma mistura de frmacos. Mtodos fsicos So aqueles descritos pela cincia bsica. Classificam-se em: mecnicos (medio de energia e fora); trmicos (medio de temperatura); ticos (medio de energia radiante, absoro, transformao e emisso); eltricos (medio de fenmenos eletroqumicos); radioqumicos (medio de radioatividade).

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Mtodos biolgicos So aqueles utilizados para medir a potncia (atividade) de um medicamento (grau de inibio de um agente microbiano por exemplo), tambm utilizado para contagem de agentes patgenos de uma determinada amostra ou matria-prima que utiliza reagentes biolgicos, tais como microrganismos, animais, fluidos e rgos isolados de animais. A caracterstica dos reagentes biolgicos a sua variabilidade. Para que possamos estud-los, necessrio o emprego de padres de referncias adequados e mtodos estatsticos, bem como uma criteriosa anlise dos resultados. 1.5.2 Garantia de Qualidade Analtica Os procedimentos de Garantia de Qualidade Analtica (GQA) devem ser baseados em um sistema de rastreabilidade e feedback. A rastreabilidade, neste contexto, exige que todas as etapas de um procedimento possam ser verificadas, sempre que possvel, por referncia aos resultados documentados, s calibraes, s normas, aos clculos e outros. Por exemplo, onde o equilbrio fundamental para um equipamento de laboratrio, a preciso da medio deve ser verificada regularmente. Os pesos utilizados para este fim devem ter um certificado demonstrando que obedecem a um padro que deve ser verificado regularmente contra tais normas pelo uso regular de pesos de seleo que esto bem documentados e, portanto, podem ser ligados dentro do laboratrio ao padro de calibrao. Este princpio tambm se aplica para a calibrao de outros equipamentos (WHO, 1996). O feedback o princpio de que os problemas ou omisses no sistema GQA devem ser levados ao conhecimento da administrao. Quando, em um laboratrio, ocorrem problemas, os procedimentos devem assegurar que isso seja facilmente reconhecido e corrigido. Os critrios para o reconhecimento e correo de mau desempenho, bem como as responsabilidades de ao corretiva devem ser identificados. Os procedimentos para alcanar este reconhecimento e correo devem ser claramente estabelecidos (WHO, 1996). Os sistemas de controle baseados na anlise estatstica, usados em programas de controle de qualidade interno e externo, tambm devem estar em conformidade com os princpios de rastreabilidade e de feedback para garantir que os critrios corretos adequados para a qualidade sejam adotados e que eventuais problemas sejam rapidamente reconhecidos e corrigidos (WHO, 1996). importante conhecer algumas definies associadas Garantia de Qualidade Analtica para um melhor entendimento da mesma (tabela 1.1).

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Tabela 1.1: Definies associadas Garantia de Qualidade Analtica (Adaptado de WHO, 1996). TERMO DEFINIO A totalidade das caractersticas de uma entidade relacionada com sua capacidade de satisfazer necessidades explcitas e implcitas. As intenes e princpios gerais de uma organizao com relao qualidade, como formalmente expressada pela alta administrao. A poltica de qualidade constitui um elemento da poltica corporativa e est autorizada pela alta administrao. Todas as atividades planejadas e sistematicamente implementadas no sistema da qualidade e demonstradas como necessrias para proporcionar confiana adequada de que uma entidade venha a cumprir os requisitos de qualidade. Estrutura organizacional, procedimentos, processos e recursos necessrios para implementar a gesto de qualidade. As responsabilidades, autoridades e relacionamentos atravs dos quais uma organizao executa suas funes. Uma forma especificada de executar uma atividade. Quando um procedimento est documentado os termos Procedimento Operacional Padro ou procedimento documentado so frequentemente usados. Um procedimento documentado geralmente contm os objetivos e mbitos de uma atividade, o que deve ser feito e por quem, quando, onde e como deve ser feito, quais os materiais, equipamentos e documentos devem ser usados e como ele deve ser controlado e registrado. Um conjunto de recursos inter-relacionados e atividades que transformam entradas em sadas. Os recursos podem incluir pessoal, finanas, instalaes, equipamentos, tcnicas e mtodos. Todas as atividades da funo de gesto global que determinam a poltica da qualidade, objetivos e responsabilidades. So implementados por meios tais como o planejamento da qualidade, o controle de qualidade, a garantia de qualidade e a melhoria da qualidade dentro do sistema de qualidade. Abrange as tcnicas e atividades operacionais que so utilizados para satisfazer as exigncias de qualidade. Os termos de controle de qualidade interno e controle de qualidade externo so comumente usados. O primeiro se refere s atividades realizadas dentro de um laboratrio para monitorar o desempenho e o segundo se refere s atividades que levam comparao com outros laboratrios de referncia ou resultados de consenso entre os vrios laboratrios. Exame sistemtico e independente para determinar se as atividades de qualidade e resultados obtidos satisfazem as disposies previstas e se estas disposies so aplicadas eficazmente e se so adequadas para alcanar os objetivos. Capacidade de rastrear a histria, aplicao ou localizao de uma entidade por meio de identificaes registradas. No contexto da calibrao, refere-se ao equipamento de medio para as normas nacionais e internacionais, padres primrios, propriedades ou constantes fsicas bsicas (temperatura, presso, volume por exemplo), ou materiais de referncia. No contexto da coleo de dados, correlaciona o clculo e os dados gerados com os requisitos de qualidade para a entidade.

Qualidade Poltica da qualidade

Garantia da qualidade Sistema da qualidade Estrutura organizacional

Procedimento

Processo

Gesto da qualidade

Controle de qualidade

Auditoria de qualidade

Rastreabilidade

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1.6 - Validao dos ensaios analticos Qualquer mtodo analtico antes de ser utilizado deve ser validado, assim os controles so realizados para garantir que o mtodo seja cientificamente correto nas condies que sero aplicadas (ANVISA-RE 899, 2003). No processo de validao so verificadas suas interfaces de usurio em termos de seletividade, especificidade, sensibilidade, linearidade, limites de deteco, identificao ou quantificao, exatido e preciso, seguindo normas internacionais e/ou nacionais. O processo para determinar o rigor dos mtodos realizado com materiais de referncia certificados, se possvel, ou com amostras enriquecidas artificialmente em caso de indisponibilidade de materiais de referncia adequados. A preciso do mtodo calculada por repetio da anlise da mesma amostra (Gonzlez-Moreno et al., 1997). A validao um processo estabelecido por evidncias documentadas que comprovam que uma atividade especfica apresenta conformidade com as especificaes pr-determinadas e atende aos requisitos de qualidade (ANVISA-RE 899, 2003). O objetivo de uma validao demonstrar que o mtodo apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinao qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de frmacos e outras substncias em produtos farmacuticos. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, seletividade, linearidade, intervalo, preciso, sensibilidade, limite de quantificao, exatido e robustez adequados anlise. A RE 899 classifica os mtodos analticos e bioanalticos em quatro categorias e informa quais so os ensaios necessrios para cada um deles (tabelas 1.2 e 1.3).
Quadro 1.1: Classificao dos testes, segundo sua finalidade (ANVISA-RE 899, 2003). FINALIDADE DO TESTE I Testes quantitativos para a determinao do princpio ativo em produtos farmacuticos ou matrias primas Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinao de impurezas e produtos de degradao em produtos farmacuticos e matrias-primas Testes de desempenho (por exemplo: dissoluo, liberao do ativo) Testes de identificao

Categoria

II III IV

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Quadro 1.2: Ensaios necessrios para a validao do mtodo analtico, segundo sua finalidade (ANVISA-RE 899, 2003). CATEGORIA II QUANTITATIVO ENSAIO LIMITE Sim Sim Sim No Sim * Sim ** No Sim Sim Sim Sim Sim No No Sim No * Sim

PARMETRO Especificidade Linearidade Intervalo Preciso (Repetibilidade) Preciso (Intermediria) Limite de deteco Limite de quantificao Exatido Robustez

CATEGORIA I Sim Sim Sim Sim ** No

CATEGORIA III * * * Sim ** * * * No

CATEGORIA IV Sim No No No No No No No No

* pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico; ** se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria a comprovao da Preciso Intermediria.

1.6.1 Preciso e reprodutibilidade. A Conferncia Internacional sobre Harmonizao (ICH) atravs do seu Q2A de qualidade (ICH Q2A, 1994) define a preciso de um procedimento analtico como o grau de concordncia (grau de disperso) entre uma srie de medidas obtidas a partir de amostragem mltipla de uma mesma amostra homognea nas condies prescritas. A preciso pode ser considerada em trs nveis: repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade. O Guia Q2B de qualidade do ICH (1996) sugere que a repetibilidade seja verificada a partir de um mnimo de nove determinaes cobrindo o limite especificado do procedimento (ex.: trs nveis, trs repeties cada um), ou a partir de um mnimo de seis determinaes a uma concentrao similar ao valor esperado. Por exemplo, em ensaios cromatogrficos, os resultados podem ser obtidos em trs concentraes com trs injees em cada concentrao. A preciso intermediria determinada pela comparao dos resultados de um mtodo realizado dentro de um nico laboratrio durante certo nmero de dias. Segundo Huber (2007) a preciso intermediria do mtodo pode refletir diferenas de resultados obtidos por: Diferentes operadores; Prtica de trabalho inconsistente;

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Diferentes instrumentos; Padres e reagentes de diferentes fornecedores; Colunas de diferentes lotes; Combinao dos mesmos.

O objetivo da preciso intermediria na validao verificar que no mesmo laboratrio o mtodo ir fornecer os mesmos resultados, uma vez que a fase de desenvolvimento longa. O objetivo da reprodutibilidade verificar que o mtodo ir fornecer os mesmos resultados em laboratrios diferentes (Huber, 2007). A reprodutibilidade de um mtodo analtico determinada atravs da anlise de alquotas de lotes homogneos em laboratrios diferentes, com analistas diferentes. Alm disso, variaes tpicas de condies operacionais e ambientais que podem diferir, mas ainda esto dentro dos parmetros especificados do mtodo, so utilizados. A validao da reprodutibilidade importante se o mtodo para ser utilizado em laboratrios diferentes. Fatores que podem influenciar a reprodutibilidade incluem diferenas de temperatura e umidade, ou equipamentos com caractersticas diferentes, tais como volume de atraso de um sistema de HPLC, colunas de diferentes fornecedores ou lotes diferentes e operadores com experincia e rigor diferentes (Huber, 2007). 1.6.2 Exatido A ICH Q2A (1994) define a exatido de um procedimento analtico como o grau de concordncia entre o valor verdadeiro convencional ou um valor de referncia aceito e o valor encontrado. O ICH Q2B (1996) recomenda que a exatido seja avaliada utilizando um mnimo de nove determinaes ao longo de um mnimo de trs nveis de concentrao que cobre o intervalo especificado (por exemplo, trs concentraes com trs repeties de cada). A exatido deve ser relatada como percentagem de recuperao atravs do ensaio de quantidade adicionada de analito conhecida na amostra ou como a diferena entre a mdia e o valor verdadeiro aceito juntamente com os intervalos de confiana.

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1.6.3 Equivalncia analtica A natureza dos testes de validao diferente de testes de equivalncia. De acordo com o ICH Q2A (1994), "O objetivo da validao de um procedimento analtico demonstrar que ele adequado para a sua finalidade". Na prtica, a validao normalmente determina a qualidade de um nico mtodo analtico. A equivalncia demonstra a uniformidade de dois mtodos analticos. Dois mtodos validados de forma independente no so inerentemente equivalentes. Dois mtodos podem ser validados da mesma maneira, com os mesmos critrios, e rendimento de dados no equivalentes, porque as experincias de validao no so projetadas para detectar diferenas nos mtodos. A distino entre validao e equivalncia reconhecida nas orientaes para testes de equivalncia proposto no Frum da Pharmacopeia (USP, 2009). A tendncia sempre uma considerao importante na avaliao de dados, como nas avaliaes de estabilidade do produto, o mtodo de equivalncia pode oferecer uma vantagem sobre a validao por si s. A equivalncia pode ser uma considerao imperativa se uma tendncia de descontinuidade na estabilidade indicar uma validade de produtos diferentes. Tambm importante saber se um novo mtodo pode produzir resultados cruzando critrios de limites de aceitao comparados com os resultados gerados por um mtodo existente. Se um novo mtodo requer uma mudana fora da faixa validada de um mtodo existente, ento ele vai exigir uma validao adicional. Dependendo do grau de mudana, os testes de equivalncia podem ser o caminho mais apropriado para um ensaio. 1.7 - Ensaios radioativos de controle de qualidade Mtodos desenvolvidos na dcada de 1960 para detectar e medir a reassociao entre fitas complementares de cidos nuclicos levou toda uma gerao de bilogos moleculares a confiar exclusivamente em istopos radioativos - geralmente
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P - para detectar a hibridizao entre

sondas e sequncias alvos. O protocolo mais familiar para os investigadores hoje envolve a deteco de cidos nucleicos-alvo imobilizados em membranas de nitrocelulose ou nylon (Sambrook, 2001). Esse mtodo descende a partir do trabalho de Nygaard e Hall (1963 Apud Sambrook, 2001), que foram os primeiros a imobilizar DNA em membranas de nitrocelulose; Denhardt (1966 Apud Sambrook, 2001) e Gillespie e Spiegelman (1965 Apud Sambrook, 2001), que detectaram esses cidos nuclicos fixos com sondas radioativas e Southern (1975 Apud

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Sambrook, 2001), que desenvolveu mtodos para detectar sequncias alvo em conjuntos de molculas de cido nucleico que haviam sido separadas de acordo com o tamanho, por eletroforese em gel de agarose. Aps a hibridizao, as partculas emitidas pelas sondas radioativas foram medidas e localizadas por contagem de cintilao lquida, autoradiografia, ou, mais recentemente, imagem de fsforo. Assim, h 30 anos, a hibridizao de cidos nuclicos e de radioatividade foram estreitamente interligadas; mtodos foram projetados com radioatividade em mente, e os experimentos laboratoriais foram programados em torno da entrega regular das ordens permanentes de compostos radioativos. Desta maneira, tanto as vantagens como os impedimentos do trabalho com istopos radioativos tornaram-se institucionalizados e fazeram parte da cultura de clonagem molecular (Sambrook, 2001). Embora as sondas marcadas com 32P possam detectar pequenas quantidades de DNA alvo imobilizado (<1 pg), estas possuem uma meia-vida curta (14,3 dias) e so incapazes de serem utilizadas para obteno de imagem de alta resoluo. Alm disso, quando utilizado em grande quantidade como ocorre com o ortofosfato, 32P deve ser manuseado em laboratrios de istopos especialmente concebidos a esse propsito. A exposio do pessoal radiao das partculas energticas liberadas pela decomposio de
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P pode ser significativa. No

surpreendentemente, a quantidade de documentao e equipamento necessrio para ordenar e monitorar o uso e descarte de materiais radioativos tem aumentado significativamente ao longo dos anos, ao ponto de se tornar um verdadeiro fardo para as Instituies de Pesquisa e Desenvolvimento. Alm disso, as dificuldades fsicas e as polticas no armazenamento e disposio de resduos radioativos de baixo nvel tornaram-se significativas e continuam a crescer. A Comisso Nacional de Energia Nuclear (CNEN) que o rgo superior de planejamento, orientao, superviso, fiscalizao e estabelece normas e regulamentos em radioproteo e licena, fiscaliza e controla a atividade nuclear no Brasil. Ela estabelece por meio de suas normas sobre a permisso e qualificao de quem pode trabalhar com material radioativo, alm de fornecer as obrigaes sobre o transporte desse material. A norma NN-6.01 (1998) da CNEN informa os requisitos para o registro de pessoas fsicas para o preparo e manuseio de fontes radioativas e a norma CNEN-NE-5.01 (1988) estabelece todas as regras para o transporte de materiais radioativos. Pelas normas, verifica-se que h uma legislao muito rgida sobre o trabalho com material radioativo e confirma-se o grande volume de

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informaes, regras, etapas e obrigaes que tornam o trabalho desse tipo muito burocrtico e complexo. O ensaio mais comum para a deteco de DNA contaminante do hospedeiro em protenas teraputicas (biofrmacos) faz uso de material radioativo, entretanto, tecnologias mais sofisticadas com marcadores no radioativos esto disponveis, um dos motivos pelo qual BioManguinhos no possui mais licena para o trabalho com radioistopos. Aliado a essas novas metodologias existe a grande burocracia exigida pela CNEN para a concesso de registro de pessoal hbil para lidar com esse tipo de material, alm de treinamentos, transporte e descarte do material radioativo, que tornaria o trabalho, de uma forma geral, muito rduo e complexo. A confluncia destes fatos tem levado busca de mtodos alternativos que so to sensveis, contudo menos perigosos e dispendiosos do que as tcnicas de radioqumica (Sambrook, 2001). Na tabela 1.2 verificam-se os principais ensaios que utilizam sondas de cidos nuclicos radiomarcadas in vitro. 1.8 - Mtodos Analticos Farmacopeicos Embora os produtos biolgicos/biotecnolgicos possam estar sujeitos a perdas significativas de atividade, alteraes fsico-qumicas ou degradao durante o armazenamento, os regulamentos nacionais e internacionais tm fornecido pouca orientao no que diz respeito distino s especificaes de liberao e trmino do perodo de vida til. As recomendaes para o mximo de perdas aceitveis de atividade, os limites para as alteraes fsico-qumicas, ou de degradao durante o prazo de validade no foram desenvolvidos para tipos individuais ou grupos de produtos biolgicos/biotecnolgicos, mas so considerados numa base caso a caso. Cada produto deve manter as suas especificaes dentro dos limites estabelecidos para a segurana, pureza e potncia em toda a sua proposta de vida de prateleira. Estas especificaes e limites devem ser derivados de todas as informaes disponveis atravs dos mtodos estatsticos apropriados. O uso de diferentes especificaes para liberao e de validade devem ser apoiadas por dados suficientes para demonstrar que o desempenho clnico no afetado como discutido no ICH em um dos seus guias sobre a estabilidade (ICH Q5C, 1995).

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A anlise de produtos derivados da biotecnologia baseia-se fortemente no uso de mtodos analticos sofisticados para demonstrar a identidade estrutural e a homogeneidade de protenas, alm de avaliar a vida til ou a estabilidade desses produtos (USP, 2009). Existem inmeros mtodos analticos que dizem respeito aos produtos derivados de biotecnologia. (USP, 2009). A Farmacopeia Americana (2009), lista como mtodos analticos tpicos para produtos biotecnolgicos os seguintes ensaios: Teor de protena; Anlise de aminocidos; Sequenciamento de protena; Imunoensaios; Eletroforese; Mtodos cromatogrficos; Determinao de carboidrato; Deteco de agentes adventcios e endgenos. Ensaios quantitativos; Determinao de DNA; Em relao aos objetivos deste trabalho destacam-se os dois ltimos mtodos. Os ensaios biomimticos (ensaios que imitam o efeito biolgico do produto) so de grande importncia na discusso de ensaios para produtos biotecnolgicos. Esses ensaios medem a atividade do produto e garantem a sua eficcia. Essencialmente, h trs tipos principais de ensaios quantitativos: os ensaios de modelo animal, os ensaios baseados em cultura de clulas e os ensaios in vitro (fsico-qumicos), sendo esse importante para este trabalho. Independentemente do tipo de ensaio quantitativo utilizado, desejvel e em muitos casos necessrio o uso do ensaio biomimtico. O grupo de ensaios in vitro (fsico-qumicos) no depende de um modelo vivo, contudo usualmente baseado na ao qumica do produto biolgico. Esses mtodos so comparativamente simples, rpidos, precisos e exatos (USP, 2009).

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Tabela 1.2: Usos principais de sondas de cidos nuclicos radiomarcadas in vitro (Modificado de Sambrook, 2001)
MTODO DE MARCAO Iniciao aleatria usando modelos de DNA Iniciao aleatria usando modelos de RNA Iniciao com oligo(dT) da sntese de cDNA usando modelos de RNA TIPO DE SONDA POSIO DO MARCADOR DNA dupla fita DNA fita simples ou hbridos DNA-RNA cDNA fita simples ou hbridos cDNA-RNA Interno ~ 400-600 nucleotdeos Southern e northern blotting e para bibliotecas de triagem Triagem diferencial de bibliotecas de cDNA; sondas subtradas; exibio diferencial TAMANHO DA SONDA USOS PRINCIPAIS

Interno

~ 400-600 nucleotdeos

Interno

~ 400-600 nucleotdeos

Sondas subtradas; exibio diferencial Mapeamento de junes de terminal 5 e de ligao em mRNA por nuclease; Southern, northern blotting e bibliotecas de triagem por hibridizao Southern, northern blotting e bibliotecas de triagem Mapeamento de junes de terminal 5 e de ligao em mRNA por nuclease; Southern, northern blotting e bibliotecas de triagem por hibridizao

PCR

DNA fita simples ou dupla DNA dupla fita

Interno

Gera molculas de DNA marcadas de comprimento definido, dependendo do espaamento dos iniciadores ~ 400 nucleotdeos Gera molculas de DNA marcadas de comprimento

Nick translation Extenso de iniciadores usando iniciadores universais ou alvoespecficos e modelos de DNA fita simples Extenso de iniciadores usando dois iniciadores universais e modelos de DNA fita simples Transcrio in vitro de modelos de DNA dupla fita Adio de nucleotdeos para fazer uma pausa ou projetar os terminais 3 de DNA dupla fita Fosforilao dos terminais 5 de DNA dupla fita

Interno

DNA dupla fita

Interno

definido de bacterifago M13 ou fagemdeo de modelo de DNA; os comprimentos dos DNAs so de 150 pb a 2 kb, dependendo do espaamento dos iniciadores Gera sondas de comprimentos heterogneos (normalmente 200-300 nucleotdeos)

DNA dupla fita

Interno

Southern, northern blotting e bibliotecas de triagem

RNA fita simples

Interno

Gera molculas de RNA radiomarcadas de comprimentos definidos

Mapeamento de junes de terminal e de ligao em mRNAs por proteo RNase; Southern e northern blotting e para bibliotecas de triagem; hibridizao in situ Sequenciamento Maxam-Gilbert; mapeamento de junes de terminal e de ligao em mRNA por nucleasse; marcadores de tamanho de DNA radiomarcados; footprinting e proteo de ribonuclease Sequenciamento Maxam-Gilbert; mapeamento de junes de terminal e de ligao em mRNA por nucleasse; marcadores de tamanho de DNA radiomarcados; footprinting e proteo de ribonuclease

DNA dupla fita

Terminal 3

Gera molculas de DNA radiomarcadas de comprimentos definidos e com posio das marcaes definidas

DNA dupla fita

Terminal 5

Gera molculas de DNA radiomarcadas de comprimentos definidos e com posio das marcaes definidas

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O DNA residual de clulas hospedeiras um potencial processo-especfico de impureza em um produto derivado de biotecnologia. O DNA residual nico para cada produto, pois dependente do organismo hospedeiro e do procedimento de recuperao usado na produo do mesmo. Embora no tenha havido relatos de efeitos adversos para a sade de produtos biotecnolgicos pelo seu contedo de DNA, as agncias regulatrias tm requerido s indstrias a garantia que o nvel de DNA nesses produtos seja reduzido a nveis baixos (USP, 2009). A tcnica da hibridizao radioativa de DNA (anlise dot blot radioativo) referncia e rotineira para determinar o contedo de DNA nos produtos. valioso como ensaio de processo de purificao para demonstrar que um baixo nvel de DNA foi atingido no incio do processo de fabrico. O mtodo baseia-se na hibridizao do DNA celular da amostra com sondas especficas de DNA marcadas por 32P ou modificados quimicamente, obtidos do DNA da clula hospedeira. A sensibilidade do ensaio, isto , 10 a 250 pg, determinada pelo limite de deteco visual acima dos padres de DNA diludos sericamente (USP, 2009). Outros mtodos para a determinao de DNA tm sido desenvolvidos utilizando-se a tecnologia de biosensor. Essa metodologia atualmente determina o total de impurezas de DNA/cidos nuclicos em vez do DNA de clulas hospedeiras. Essa tecnologia pode se tornar muito valiosa no futuro, especialmente quando mais mtodos de ligao de DNA forem desenvolvidos (USP, 2009). Finalmente, a tecnologia de reao em cadeia de polimerase (PCR), a qual envolve a amplificao de DNA, pode ser til na deteco e identificao de DNA contaminante. O uso quantitativo dessa tecnologia em controle de qualidade rotineiro, contudo, necessita de mais desenvolvimento (USP, 2009) e talvez uma diminuio no custo de compra e manuteno dos equipamentos para que estes custos no sejam repassados para o produto final. 1.9 - Deteco de Traos de DNA Traos contaminantes de DNA em protenas teraputicas ou anticorpos monoclonais injetveis podem sujeitar a riscos considerveis (discutidos no item 5.4). Consequentemente, o FDA e as indstrias biofarmacuticas tm adotado guias restritivos em relao pureza desses medicamentos. Tradicionalmente, a quantidade de DNA em amostra determinada por medio espectrofotomtrica ou fluorometricamente a partir de fluorocromos, como o brometo de etdio. Nenhum desses mtodos pode detectar concentraes de DNA menores que 10 ng/ml.

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A tcnica comumente utilizada de hibridizao para deteco de sequncia especfica de DNA tem sensibilidade em torno de 10 pg de DNA. No entanto, vrios fatores tornam impraticvel a hibridizao de rotina para testar os contaminantes de DNA: trabalhoso, demorado, semiquantitativo na melhor das hipteses, e geralmente requer um radioistopo. Alm disso, a especificidade do mtodo pode fazer com que algum DNA contaminante passe despercebido (Kung et al, 1990). Uma tarefa crtica durante a produo de biofrmacos a purificao do Ingrediente Farmacutico Ativo (IFA). O processo downstream deve remover todos os contaminantes, incluindo o material da clula hospedeira, tais como DNA e de protena celular. Quantidades vestigiais de DNA e protenas da clula hospedeira podem ser co-purificados juntamente com a IFA. Tais contaminantes so obviamente indesejveis, porque possvel que haja consequncias quando injetados em pacientes. Eles podem causar reaes alrgicas (protenas) ou mesmo a transfeco de clulas (DNA), resultando em tumores (Wolter e Richter, 2005). Devido a esses potenciais efeitos negativos, as autoridades reguladoras lanaram diversos documentos de orientao sobre quais nveis de impurezas so aceitveis. O DNA residual em produtos a granel finais deve ser geralmente inferior a 100 pg por dose teraputica (FDA, 1997; Lovatt, 2002; Wolter e Richter, 2005; Mehta e Keer, 2007; Lotfipour e Halladj-Nezhadi, 2012). A Anvisa, oficialmente, ainda no definiu um limite para a quantidade de DNA residual de produtos derivados de biotecnologia, contudo a agncia solicita s indstrias que essa quantidade seja a mnima possvel e as mesmas levam em conta os valores mnimos definidos pelas autoridades internacionais. Outras referncias sugerem que nveis mais elevados podem ser aceitveis (WHO, 1998). O limite de 100 pg requer um processo de purificao que seja muito eficaz e robusto na remoo de DNA, bem como mtodos analticos que sejam extremamente sensveis e confiveis para comprovao (Wolter e Richter, 2005). As protenas de clula hospedeira na IFA devem estar "abaixo dos nveis detectveis atravs de um mtodo analtico altamente sensvel" (FDA, 1997). Como regra geral, essa quantidade no deve exceder um nvel de cerca de 100 ppm. Mas nenhum limite exato definido para as protenas e, portanto, a especificao de protenas deve ser determinada caso a caso (Wolter e Richter, 2005). De acordo com a Agncia Europeia de Avaliao dos Medicamentos (EMA, 1997) duas estratgias diferentes podem ser utilizadas para assegurar que uma substncia medicamentosa

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se encontre dentro dos limites admissveis de contaminao com DNA ou protenas de clula hospedeira. Pode-se validar um processo que remove uma quantidade suficiente de tais contaminantes ou realizar testes de rotina em produto final para determinar se eles esto presentes. Os ensaios e mtodos envolvidos na determinao de DNA residual, qualquer que seja a abordagem utilizada, e as protenas tm de satisfazer requisitos de validao do ICH (Q2A e Q2B). Obviamente essas tcnicas devem ser suficientemente sensveis para determinar nveis muito baixos de contaminao (por exemplo, na gama ppm). 1.10 - Ensaios para Quantificao de DNA Residual de Clulas Hospedeiras (DCH) A produo de biofrmacos, tais como anticorpos monoclonais, protenas recombinantes, vacinas e cidos nuclicos requer tcnicas especiais e mtodos de controle de qualidade. Mtodos de cromatografia, eletroforese e imunoqumicos so comumente usados em conjunto para monitorar e otimizar o processo de fabricao de produtos biofarmacuticos. O limite de 100 pg de DNA por dose definida pelas autoridades reguladoras aproximadamente igual quantidade de DNA de menos de 17 clulas de ovrio de hamster diplide Chins (CHO) (Wolter e Richter, 2005). Para determinar essas pequenas quantidades de DNA, um mtodo analtico deve ser extremamente sensvel e robusto. Em princpio, trs tcnicas tm a sensibilidade requerida: a hibridizao, os mtodos baseados em ligao de DNA de protena (Como o sistema Threshold) (Kung, 1990) e o PCR quantitativo (qPCR) (Lovatt, 2002; Mehta e Keer, 2007). Em 2004, a Farmacopeia Europeia claramente informa que o DNA residual deve ser determinado utilizando tcnicas independentes de sequncias e passa a especificar que mtodos como a hibridizao ou ensaios de ligao de DNA de protena devem ser usados. 1.10.1. Hibridizao Para o estudo proposto, os ensaios de hibridizao envolvem a ligao de sondas de DNA (pequenos fragmentos de DNA marcados radioativamente) ao DNA da clula hospedeira desnaturada e imobilizadas em superfcie slida (membrana de nylon), o DNA liga-se membrana por interao eletrosttica. Como o DNA possui, superficialmente, carga negativa, usa-se membrana de carga eltrica positiva. As reivindicaes das diretrizes sugerem que as sondas devem ser fabricadas independentes da sequncia de DNA. Isso pode ser conseguido,

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por exemplo, por um procedimento "priming aleatrio". As sondas so marcadas com marcadores radioativos ou corantes fluorescentes e se ligam aos alvos complementares durante a hibridizao. A deteco do sinal conseguida com autorradiografia ou atravs de sistemas de fsforo ou de fluorescncia de imagens e o sinal detectado proporcional quantidade de DNA imobilizado sobre um filtro (Figura 1.3) (Saunders et al., 1999). Dependendo da sonda utilizada, este ensaio pode ser especfico ou no especfico de sequncia (Wolter e Richter, 2005; Mehta e Keer, 2007).

Figura 1.3: O processo de hibridizao (Modificado de Mehta e Keer, 2007).

O ensaio de hibridizao mede aleatoriamente o DNA total a partir de poucos pares de bases (pb) at milhares de pares de bases de comprimento. especfico para o DNA de origem, mas no para a sequncia (Wolter e Richter, 2005). Todos os ensaios de quantificao do DNA precisam de pr-tratamento da amostra e, por conseguinte, deve ser concebida como ensaios de pico de recuperao para controlar a perda de material durante a preparao da amostra. A figura 1.4 ilustra uma estratgia de controle de recuperao de pico para um ensaio de hibridizao. Os padres de DNA para a clula hospedeira e do vetor em uso, em geral, so comercialmente disponveis. Portanto, os padres

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internos devem ser produzidos e quantificados por absoro de UV. Esses materiais de referncia devem tambm ser quantificados e qualificados por eletroforese em gel de agarose para confirmar os dados de UV e de degradao de controle de DNA (Wolter e Richter, 2011).

1600

800

400

200

100

50

25

12,5

6,4

3,2

1,6

0,8

Figura 1.4: Ensaio Dot-Blot de hibridizao para a quantificao do DNA genmico residual de E. coli. As amostras so analisadas em duplicata, com e sem adio de DNA de referncia (DNA Pico). So aplicadas linhas de calibrao de DNA genmico de E. coli a partir de 1600 pg at 0,8 pg. Neste caso, o intervalo de quantificao tpico 3,1-800 pg. As linha de calibrao, as amostras, os controles e as amostras teste so aplicados ao filtro atravs de um procedimento baseado em vcuo blotting. O DNA interligado por luz ultravioleta (UV) e depois incubado com uma sonda de DNA randomizada marcada com 32P (fsforo istopo 32). Depois de lavado o filtro avaliado por um instrumento de imagem de fsforo (BAS Reader da Fuji, Saitama City, Japo, www.fujimed.com). O teor de DNA das amostras calculado usando os sinais de linha de calibrao. Para cada amostra de teste, uma recuperao individual calculada com os valores da amostra Pico, com controles de Pico e com os controles negativos (Adaptado de Wolter, 2005).

1.10.2 PCR em tempo real ou PCR quantitativo A Polymerase Chain Reaction (PCR), PCR quantitativa (qPCR) ou PCR em tempo real, (figura 1.5) uma extenso da reao em cadeia da polimerase (PCR) e explora a capacidade de monitorizar o progresso de PCR tal como ocorre (em tempo real) para determinar a quantidade de DNA na reao. Os dados so recolhidos durante todo o processo para monitorar o aumento da formao do produto de PCR na fase exponencial da reao, permitindo a determinao quantitativa do total inicial de DNA em uma amostra. Uma gama de produtos qumicos diferentes pode ser usada para detectar o DNA de clula hospedeira (DCH) como por

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exemplo, a emisso dos compostos fluorescentes que geram um sinal que aumenta na proporo direta da quantidade de produto da PCR, sendo assim, os valores da fluorescncia so gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado. Os compostos fluorescentes mais utilizados so os SYBR Green I corante (Molecular Probes) que se liga entre a fita dupla de DNA e que quando excitado em comprimento de onda especfico emite uma fluorescncia verde (Applied Biosystems) (Arya, 2005). Este ensaio especfico de uma sequncia delimitada por primers que ser reconhecida e amplificada (Wolter e Richter, 2005; Mehta e Keer, 2007). A PCR em tempo real requer instrumentos especficos para que possa ser detectada a reao e a emisso de fluorescncia, bem como programas especficos para aquisio dos dados e anlise final. A reao em cadeia de polimerizao em tempo real combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de deteco e quantificao por fluorescncia. Isso permite que os processos de amplificao, deteco e quantificao de DNA sejam realizados em uma nica etapa, agilizando a obteno de resultados, diminuindo o risco de contaminao da amostra e dando maior preciso ao processo.

Figura 1.5: Diagrama detalhando os estgios do processo de qPCR (adaptado de Mehta e Keer, 2007).

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1.10.3 Threshold O sistema Threshold uma plataforma dedicada para a quantificao rpida de produtos biofarmacuticos ou contaminantes de biorreatores/fermentadores, processamento e controle de qualidade do produto final. O sistema ideal para a quantificao de protenas, peptdeos e sequncia de DNA total no especfico em baixas concentraes e foi desenvolvido para resolver as dificuldades em experimentos ao tentar desenvolver imunoensaios altamente sensveis e reprodutveis sem o uso de radioatividade. Enquanto os testes de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) so uma alternativa comum, eles so frequentemente afetados pela matriz da amostra e muitas vezes exigem um esforo de desenvolvimento significativo para atingir a saturao uniforme de anticorpos de poo para poo e placa para placa (Molecular Devices, 2011). O ensaio Threshold baseia-se em uma tcnica de captura na qual a protena Ligadora de Fita Simples (SSB) biotinilada e um anticorpo anti-fsDNA (DNA fita simples) conjugado a urease ligam-se simultaneamente ao DNA de fita simples presente numa amostra. Em primeiro lugar, um complexo de reao formado quando a protena SSB biotinilada e o anticorpo antifsDNA (conjugado com urease) se ligam ao DNA de fita simples da clula hospedeira (Figura 1.6). Segue-se a uma fase de filtrao, durante a qual a forte afinidade de estreptavidina por biotina usada para capturar e concentrar os complexos de reao em uma membrana biotinilada. Aps a filtrao, a membrana colocada em um leitor contendo a ureia substrato. A urease hidrolisa a uria a NH3 e CO2 o que resulta numa mudana do pH que se correlaciona com a quantidade de DNA da clula hospedeira na amostra (Figura 1.7) (Wolter e Richter, 2005; Mehta e Keer, 2007). A ligao especfica de DNA durante o ensaio Threshold realizada por duas protenas de ligao de DNA, ambas as quais devem ligar-se a cada fragmento de fsDNA. Portanto, este ensaio requer fragmentos de DNA com no mnimo 600 pb (Kung, 1990) para formar um complexo de reao que produza um sinal no leitor. E este ensaio no especfico para a sequncia de DNA, sendo capaz de detectar toda molcula de DNA presente dentro da especificidade de sua sensibilidade. Em relao ao DNA total, a sensibilidade do ensaio de 2 pg pode ser alcanada. Normalmente, os ensaios tem um alcance dinmico de 2 logs ou mais, assim, pequenas

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diluies das amostras so necessrias para uma quantificao precisa. Alm disso, os ensaios so rpidos e completam-se em apenas 90 segundos (Molecular Devices, 2011). Essa sensibilidade do sistema Threshold se deve ao uso do LAPS (Light-Addressable Potentiometric Sensor) ou Sensor Potenciomtrico Endereador de Luz que possibilita identificar sensveis mudanas de pH que so sinalizadas no sistema como V/s (microvolt/segundo). O dispositivo LAPS contm uma estrutura de silcio monoltico com uma superfcie de deteco plana sem microcircuitos que precisa ser encapsulada. A superfcie plana do sensor facilita a formao de microvolumes reprodutveis. Em um ensaio baseado na alterao do pH causada pela atividade da enzima a diminuio do volume de ensaio para se concentrar a enzima aumenta a sensibilidade. Outra caracterstica dos LAPS a capacidade de mltiplas medies potenciomtricas. Um dispositivo semicondutor nico LAPS pode detectar vrias reaes qumicas simultneas, monitorando a fotocorrente induzida atravs da iluminao de locais discretos de sensoriamento. As determinaes simultneas de vrias amostras, controles e calibradores aumentam o rendimento e a preciso do ensaio (Olson, 1990; Jia, 2012).

Figura 1.6: Esquema dos estgios do ensaio de DNA Total no sistema Threshold (Adaptado de Molecular Devices, 2011).

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Figura 1.7: Estgios do ensaio Threshold (Adaptado de Molecular Devices, 2011).

1.11 - Gesto de Risco para a Qualidade Nas ltimas dcadas, a palavra riscos vem sendo amplamente utilizada na literatura, com objetivos distintos, riscos de negcios, social, econmico, investimentos, poltico (Figura 1.8), mas em indstrias alimentcias e farmacuticas, a sua aplicao est voltada para a questo de segurana alimentar e de medicamentos, estando intimamente ligada ao termo perigo (Kaplan e Garrick, 1981).

Figura 1.8: Carteira industrial de riscos (Modificado de IMA, 2007).

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Segundo Santos-Reyes e Beard (2002) a segurana no um fator isolado e o grau de segurana depende do resultado das atividades interelacionadas de pessoas, projeto da organizao, gerenciamento, processo. Resumidamente, Van Schothorst (1998) define como o risco aceitvel os perigos que no causam danos aos consumidores. No uso comum, as palavras "risco" e "perigo" ou "arriscado" e "perigoso" so frequentemente usados como sinnimos. Na disciplina formal de avaliao de risco, "risco" e "perigo" tm significados especficos. Perigo uma potencial fonte de dano (ISO/IEC 51), o qual leva uma sequncia de prticas inadequadas de fabricao que podem causar: perda ou falta de eficcia e de esterilidade, efeitos txicos, reaes adversas e at morte dos pacientes. Em termos simples, um perigo considerado ser a possibilidade de um efeito indesejvel. Risco, no entanto, segundo a ISO/IEC 51 a combinao do fato de que um perigo existe, a probabilidade de isso acontecer, e da gravidade das consequncias ou danos que podem ocorrer. A Conferncia Internacional de Harmonizao (ICH) trata-se de um processo de harmonizao compartilhado por EUA, Europa e Japo, refletindo as prioridades oriundas do desenvolvimento cientfico e tecnolgico alcanado pelo setor farmacutico e, por isso mesmo, as iniciativas tomadas em comum vm sendo principalmente orientadas para unificar procedimentos em relao aos ensaios clnicos e pesquisa e avaliao de novos produtos (ICH, 2010). A introduo destes ltimos, nos diversos mercados, enfrentava problemas, precisamente, nas discrepncias de critrios vigentes nos diversos pases em relao aos processos de investigao e desenvolvimento das inovaes farmacuticas. O que se pretende obter a partir da harmonizao de normas no campo mencionado um fluxo mais gil de produtos novos, sem prejuzos do trabalho de vigilncia e controle, alm de uma melhoria significativa na qualidade da investigao, no desenvolvimento e nos processos de avaliao dos produtos farmacuticos (Arango, 1997). A ICH teve incio em 1990, como um projeto conjunto da indstria e das autoridades reguladoras, com o propsito de tornar o desenvolvimento do setor farmacutico, bem como os processos de registro, mais eficientes, com melhor custo/efetividade e tendo em conta os interesses da sade pblica. Atualmente, o empreendimento tem como entidades patrocinadoras: Comisso Europia da UE, European Federation of Pharmaceutical Industries Associations (EFPIA), Ministry of Health and Welfare (Mhw) do Japo, Japan Pharmaceutical Manufacturers Association, Food and Drug Administration e Pharmaceutical Research and

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Manufacturers of America (PhRMA). As exigncias de natureza tcnica requeridas para comprovar a eficcia, segurana e qualidade j foram quase que totalmente harmonizadas no mbito da UE, dos Estados Unidos e do Japo. At 2004 foram realizadas seis conferncias (a cada dois anos), o que poderia ser considerada a fase inicial das atividades previstas para a Conferncia, tido o termo ICH escolhido na quarta Conferncia, realizada em Bruxelas, em julho de 1997. Nesta ocasio, foram definidos os princpios que deveriam orientar os tpicos a serem harmonizados, compreendendo quatro grandes categorias (Barros, 2004): Qualidade, relacionada a aspectos qumicos e farmacuticos. Segurana, englobando os estudos pr-clnicos in vitro e in vivo. Eficcia, referente aos estudos clnicos em humanos. Multidisciplinar, englobando tpicos que no se enquadram nas categorias anteriores, a exemplo da terminologia mdica e padres eletrnicos para a transmisso da informao reguladora. Para cada tema de discusso selecionado, cria-se um grupo de trabalho com um especialista representante de cada uma das entidades patrocinadoras ( Experting Working Group). O processo de harmonizao coordenado por um Comit (Steering Committee) que se rene trs vezes ao ano, coincidindo com as reunies dos grupos de trabalho, a ele competindo decidir quais os temas que devem ser harmonizados, responsabilizando-se pelo seu seguimento com vistas a corrigir e evitar disfunes, adotando os documentos conclusivos. A estratgia adotada para atingir o processo de harmonizao comporta uma srie das etapas ou fases e que so as seguintes: na primeira, busca-se chegar a um acordo entre os representantes das entidades em proposta que, uma vez formulada se envia ao Steering Committee que, por sua vez, o encaminha para apreciao das agncias reguladoras das trs regies; terminada a ampla consulta desencadeada na fase anterior, na fase quatro, o Comit recomenda adoo do documento pelas trs agncias, seguindo-se a incorporao na legislao de cada pas (Montero, 1998). A Gesto de Riscos para Qualidade (GRQ) um processo sistemtico para a avaliao, controle, comunicao e anlise de riscos para a qualidade do produto (medicamento) em todo o ciclo de vida do produto. Um modelo para a GRQ esboado no diagrama (Figura 1.9). Entretanto, outros modelos poderiam ser utilizados no se limitando a este esboo. A nfase em cada um dos componentes do quadro pode ser diferente de caso para caso, mas um processo

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robusto ir incorporar a considerao de todos os elementos em um nvel de detalhe que seja compatvel com o risco especfico (ICH Q9).

Figura 1.9: Viso geral de um tpico processo de gesto de risco para qualidade (Adaptado de ICH Q9).

Um programa de gesto de risco comea com a identificao dos possveis riscos (e benefcios) associados a um produto ou com o processo usado para desenvolver, fabricar e distribuir o produto. Segundo Griffith (2004), as seguintes perguntas devem ser feitas em cada fase do ciclo de vida do produto: Quais so os riscos de segurana? Quem est em maior risco? Quais populaes esto em risco? Os riscos so previsveis? Os riscos so evitveis?

A ltima pergunta muito importante porque ela forma a base do plano de interveno. A fim de determinar se o risco evitvel, a causa raiz de cada risco tem de ser determinada. Uma vez que a causa da raiz estabelecida, a probabilidade de ocorrncia pode ser calculada e

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o risco interpretado pela severidade, frequncia ou durao. Seguindo interpretao, a prxima fase, desenho e implementao de intervenes (planos de mitigao, por exemplo), podem ser iniciados (Griffith, 2004). Conforme a CEE-63 (ABNT, 2011) todas as atividades de uma organizao envolvem riscos que devem ser gerenciados. O processo de gesto de riscos auxilia a tomada de deciso, levando em considerao as incertezas e a possibilidade de circunstncias ou eventos futuros (intencionais ou no intencionais) e seus efeitos sobre os objetivos acordados (Figura 1.9). A gesto de riscos inclui a aplicao de mtodos lgicos e sistemticos para: A comunicao e consulta ao longo de todo processo; O estabelecimento do contexto para identificar, analisar, avaliar e tratar o risco associado a qualquer atividade, processo, funo ou produto; O monitoramento e anlise crtica de riscos; O relatrio e registro dos resultados de forma apropriada.

Uma interpretao da interao entre os trs aspectos da anlise de riscos mostrada na figura 1.10.

Figura 1.10: Representao esquemtica da interao entre gesto de riscos, comunicao de riscos e avaliao de riscos. A avaliao de risco pode ser iniciada a partir de qualquer fonte, mas a sua conduta estar tipicamente sob o controle de um gerente de risco que vai coordenar o processo, fiscalizar o intercmbio de informaes e de transformar os resultados da avaliao em um plano de ao. O diagrama tambm enfatiza que o processo de anlise de risco no sequencial, mas interativo e iterativo. (Adaptado de McNab et al. (1998).

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O processo de avaliao de riscos a parte da Gesto de Riscos que fornece um processo estruturado para identificar como os objetivos podem ser afetados, e analisa o risco em termos de consequncias e suas probabilidades antes de decidir se um tratamento adicional requerido. O processo de avaliao de riscos tenta responder s seguintes questes fundamentais (ABNT/CEE-63, 2011): O que pode acontecer e por qu (pela identificao de riscos)? Quais so as consequncias? Qual a probabilidade de sua ocorrncia futura? Existem fatores que mitigam a consequncia do risco ou que reduzam a probabilidade do risco? O nvel de risco tolervel ou aceitvel e requer tratamento adicional?

O controle de riscos inclui a tomada de deciso para reduzir e/ou aceitar riscos. O propsito do controle de risco o de reduzir o risco para a um nvel aceitvel. A quantidade de esforo usado para controle de risco deve ser proporcional importncia do risco. Quem toma a deciso pode utilizar diferentes processos para compreender o nvel timo de controle de risco, incluindo a anlise de custo-benefcio (Griffith, 2004; ICH Q9, 2005). O controle de risco pode se concentrar sobre as seguintes questes (ICH Q9, 2005): O risco est acima de um nvel aceitvel? O que pode ser feito para reduzir ou eliminar os riscos? Qual o equilbrio adequado entre os benefcios, riscos e recursos? So introduzidos novos riscos como resultado do controle dos riscos identificados?

A reduo do risco concentra-se em processos de sua mitigao ou preveno qualidade quando se excede um nvel (aceitvel) especificado (ver figura 1.9). A reduo de risco pode incluir aes tomadas para atenuar a gravidade e a probabilidade de dano. Os processos que melhoram a detectabilidade de perigos e riscos de qualidade podero tambm ser usados como parte de uma estratgia de controle dos mesmos. A implementao de medidas de reduo pode introduzir novos riscos para o sistema ou aumentar o significado de outros riscos existentes. Por isso, pode ser apropriado para rever a avaliao de riscos, identificar e avaliar qualquer possvel mudana dos mesmos aps a implementao de um processo de reduo de risco (ICH Q9, 2005).

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A comunicao de risco um processo interativo de troca de informaes e opinies sobre o risco entre avaliadores, gestores dos riscos e outras partes interessadas. parte integrante e permanente do exerccio de anlise de risco e, idealmente, todos os grupos interessados devem ser envolvidos desde o incio. A comunicao de risco faz com que as partes interessadas fiquem a par do processo em cada etapa da avaliao de riscos. Isso ajuda a garantir que a lgica, os resultados, a importncia e as limitaes da avaliao de risco sejam claramente entendidas por todas as partes interessadas (WHO, 1998). 1.11.1 Design Space A Conferncia Internacional de Harmonizao em seu guia, ICH Q8 define Design Space como a combinao e interao multidimensional de variveis de entrada (por exemplo, atributos de material) e os parmetros de processo que tm sido demonstrados para fornecer garantia de qualidade. O conceito de Design Space requer que um produto biotecnolgico seja projetado de modo a cumprir o seu desempenho clnico desejado e o processo projetado para entregar consistentemente um produto que atenda aos atributos de qualidade necessrios para o desempenho clnico. O principal benefcio de um Design Space aprovado a flexibilidade regulatria, mais notavelmente o potencial para fazer melhorias de processos dentro do espao de projeto desenhado sem superviso regulatria permanente. Para atingir o nvel necessrio de conhecimento do processo, no entanto, estudos de caracterizao de processo devem ser extensos e abrangerem juntamente com uma ampla gama de parmetros do processo (Anurag et al., 2007; Garcia et al., 2008; Peterson, 2008; Yu, 2008). Em outubro de 2006, em uma reunio do Comit Consultivo para Cincias Farmacuticas (Chen, 2006), as seguintes questes foram levantadas sobre o Design Space: - Como o Design Space e o Espao de Controle foram institudos para cada unidade de operao? - O Design Space de cada unidade de operao independente de projeto de equipamentos e tamanho de lote? - Como o Espao de Controle se relaciona com o Design Space?

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- Como o relacionamento do Espao de Controle com as faixas operacionais varia no registro do lote Mestre (frmula mestre)? O Design Space para medicamentos genricos foi estabelecido em lotes de pequena escala utilizando planejamento de experimentos (DOE Design Of Experiments) e conhecimento prvio, e deve ser verificada em escala comercial. O Design Space depende do princpio de projeto dos equipamentos e tamanho do lote. O Espao de Controle (ou faixas de operao normal) definido como o limite superior e/ou inferior para os atributos crticos de matriaprima e para os parmetros de processo, entre os quais o parmetro e materiais so rotineiramente controlados durante a produo a fim de garantir a reprodutibilidade. O Espao de Controle deve estar dentro do Design Space. Se o espao de controle for muito menor do que o Design Space, o processo ento considerado robusto. Caso contrrio, um rigoroso controle de processo pode ser necessrio para assegurar que o mesmo pode ser operado constantemente dentro do Design Space (Yu, 2008). A criticidade determina quais atributos de qualidade e parmetros de processo so definidos no Design Space. O Design Space define a relao entre Atributos Crticos de Qualidade (CQAs Critical Quality Attributes ) e Parmetros Crticos do Processo (CPPs Critical Process Parameters), e identifica faixas de operao aceitvel para CPPs. a regio onde o produto aceitvel pode ser produzido (Figura 1.11). A faixa normal de operao um subconjunto do Design Space, onde a produo rotineira tipicamente realizada em uma base diria. Finalmente, a Estratgia de Controle assegura que a operao do processo seja mantida no Design Space. A inteno evitar operar nas regies limites conhecidas do processo ou nas regies que se sabe que causam falhas no produto (Garcia et al., 2008). H muitos meios cientificamente justificveis para alcanar um Design Space. A abordagem a qualquer projeto especfico pode aproveitar qualquer combinao de ferramentas, dependendo da tecnologia especfica que est sendo avaliada, da literatura disponvel, da experincia corporativa interna e do nvel de conforto. O Design Space, especialmente quando ligado a uma estratgia de controle estruturada e a uma avaliao da criticidade, tem o potencial de mudar aspectos de interaes reguladoras fornecendo dados e contextos, enquanto continua a fornecer um alto nvel de garantia de qualidade e desempenho farmacutico (Lepore e Spavins, 2008).

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Figura 1.11: Ligao entre Espao de Conhecimento, Design Space e Faixa Normal de Operao (Adaptado de Garcia; Cook; Nosal, 2008).

1.11.2 Ferramentas de Anlise de Risco A gesto de riscos para qualidade apoia uma abordagem cientfica e prtica para a tomada de decises. Ela fornece mtodos documentados, transparentes e reprodutveis para realizar as etapas do processo de qualidade de gesto de risco com base no conhecimento atual sobre a avaliao da probabilidade, gravidade e s vezes detectabilidade do risco. Tradicionalmente, os riscos para a qualidade foram avaliados e gerenciados em uma variedade de meios informativos (procedimentos empricos e/ou interno) com base em, por exemplo, compilao de observaes, tendncias e outras informaes. Essas abordagens continuaro a fornecer informaes teis que possam apoiar temas como tratamento de reclamaes, defeitos de qualidade, desvios e alocao de recursos (ICH Q9, 2005). Alm disso, a indstria farmacutica e os reguladores podem avaliar e gerenciar riscos utilizando ferramentas de gesto de risco reconhecidos e/ou procedimentos internos (ICH Q9, 2005). Fault Tree Analysis FTA (Anlise da rvore de Falhas) Failure Mode Effects Analysis FMEA (Anlise de Modo e Efeitos de Falha)

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Failure Mode, Effects and Criticality Analysis FMECA (Anlise da Criticidade de

Modo e Efeitos de Falha)

Hazard Analysis and Critical Control Points HACCP (Anlise de Perigos e Pontos
Crticos de Controle)

Preliminary Hazard Analysis PHA (Anlise Preliminar de Perigos) Hazard Operability Analysis HAZOP (Anlise de Perigos de Operabilidade) Risk Ranking and Filtering (Eleio e Ponderao do Risco)

O quadro 1.3 mostra o detalhamento de cada uma das ferramentas utilizadas nas metodologias de avaliao de risco.
Quadro 1.3: Metodologias mais comuns de anlise de risco (Modificado de LabCompliance, 2010).

FTA

FMEA/ FMECA

HACCP

PHA

HAZOP

RISK RANK AND FILTERING

Grfica, dedutiva, ferramenta estruturada.

Ferramenta indutiva estruturada. Pode ser qualitativa e quantitativa.

Prevenir os riscos conhecidos para reduzi-los nos pontos de controle especficos.

Ferramentas indutivas qualitativas.

Identificao de todos os desvios acreditveis que possam conduzir a eventos perigosos ou a problemas operacionais.

Elege e pondera riscos avaliados quantitativamente em conjunto com outros avaliados qualitativamente.

PRINCPIO

Processo de gesto integral de riscos. Uso de diagrama de rvore de falha com smbolos padronizados que mostram o caminho desde o evento bsico at o evento indesejado. Universal e pode-se fazer uso de escala, por exemplo, para alto nvel e avaliao detalhada do risco. Especfica e flexvel. Foco na preveno. Manuteno de registros para questes de conformidade e responsabilidade do produto. Facilmente adaptvel maioria das situaes.

VANTAGENS

Sistematicidade, flexibilidade e abrangncia de perigos e problemas operacionais. Maior entendimento do funcionamento da unidade

Aceita alto grau de complexidade. Flexvel. Faz uso de escala para incluir mltiplos fatores de risco. Pode ser usado com uma variedade de critrios de avaliao quantitativos e qualitativos

LIMITAES

Pode tornar-se muito complexa por focar em uma falha de cada vez.

Ferramentas no consideram questes operacionais ou de desempenho do operador. No mostra a interao entre os eventos.

Requer informaes detalhadas sobre produtos e processos.

Relativamente desestruturada, portanto pode deixar escapar perigos potenciais.

Avalia apenas as falhas de processo para determinar as potenciais anormalidades de engenharia. Requer uma equipe multidisciplinar com larga experincia para implementao da tcnica.

Pode exigir um esforo significativo para estabelecer fatores e critrios de risco. Pode exigir um esforo significativo para desmembrar o risco em muitos fatores. Pode ser difcil correlacionar diretamente com riscos absolutos.

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FTA

FMEA/ FMECA

HACCP

PHA

HAZOP

RISK RANK AND FILTERING

FERRAMENTAS

Grficos com smbolos padronizados. Software dedicado recomendado.

Tabelas.

Diagrama de processo detalhada. Tabelas

Desenhos e tabelas

Uso apropriado de um conjunto de palavras guias aplicadas a pontos crticos do sistema em estudo.

Software dedicado recomendado.

CARACTERSTICA DO MTODO

Qualitativo.

Qualitativo/ Quantitativo.

Qualitativo/ Quantitativo.

Qualitativo.

Qualitativo.

Qualitativo.

PRINCIPAL APLICAO DE USO

Usado para definir um determinado evento indesejado e identificar as suas causas (eventos bsicos). Para problemas potenciais com srios impactos.

Uso universal, por exemplo, para dispositivos mdicos, industriais. Utilizado para identificar potenciais modos de falha e impacto nos processos, instalaes e equipamentos. Utilizado durante projeto e operao.

Alimentos e indstria qumica. Adaptado para a indstria farmacutica pela OMS. Cobrir a cadeia completa do produto.

Utilizada no incio de novos produtos e mudanas em produtos e processos (fase de projetos) Indstria qumica. Primeira etapa de avaliaes de riscos complexos.

Fase inicial do projeto. Reviso geral de segurana de unidades em operao. Modificaes de unidades de processo j em operao. Esta ferramenta usada para indicar as reas que devem ser priorizados numa inspeo/auditoria.

Pode ser adequado adaptar essas ferramentas para uso em reas especficas relativas qualidade do produto em relao droga (substncia) e ao medicamento. Mtodos de Gesto de Risco para a Qualidade e as ferramentas de apoio estatsticas podem ser utilizados em combinao. O uso combinado proporciona flexibilidade que pode facilitar a aplicao de princpios da Gesto de Risco para a Qualidade. O grau de rigor e formalidade da gesto de risco qualidade deve refletir o conhecimento disponvel e ser proporcional complexidade e/ou grau de importncia da questo a ser abordada (ICH Q9, 2005). As seguintes reas so identificadas como potencial na indstria farmacutica para a qualidade da aplicao de gesto de risco (Prasad, 2011): 1. Documentao [POPs, lote registros etc.] 2. Treinamento [Horrios e eficcia] 3. Defeitos de qualidade [Reclamaes, desvios, sistema operacional online, etc.]

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4. Auditorias [Conformidade] 5. Revises peridicas [Avaliao de revalidao] 6. Alterar controles [Avaliao do impacto] 7. Relatrios de desenvolvimento [Verificao de processo e controles] 8. Instalaes, equipamentos e utilitrios [componentes, manuteno, etc.] 9. Gerenciamento de materiais [recepo, armazenagem e distribuio] 10. Embalagem e rotulagem [sistema de fechamento e rotulagem de embalagem] O uso de uma abordagem baseada no risco fornece um mtodo consistente para a tomada de deciso que foi facilmente associada com a alocao de recursos e garantia da segurana do paciente. Em ltima anlise, aplicao de gesto de risco para a indstria farmacutica deve reduzir o nmero de ameaas ou minimizar o seu impacto atravs da utilizao consistente das ferramentas/mtodos e reviso peridica. As informaes produzidas como resultado da operao da gesto de risco auxilia a organizao a atender seus objetivos definidos (Prasad, 2011). importante ressaltar que a Gesto de Risco para a Qualidade dos produtos no se limita aos 10 itens abordados, uma vez que diferentes setores da indstria farmacutica podem incorporar os conceitos e ferramentas para melhor entenderem seus processos, e os possveis riscos em suas atividades seja de produo, de controle de qualidade ou gesto. 1.11.3 HACCP Para este trabalho ser utilizada a ferramenta Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle, por se entender que os PCC (Pontos Crticos de Controle) podem ser de grande valia para a comparao de metodologias analticas. E a partir das avaliaes, tomar decises que por vezes podem envolver compra de equipamentos, software, recursos humanos, etc. Tradicionalmente, a metodologia Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (HACCP) tem sido considerada como um sistema de gesto de segurana. Tem como objetivo prevenir os perigos conhecidos e reduzir os riscos que podem ocorrer em pontos especficos de diferentes setores. Tais princpios esto sendo cada vez mais aplicados em indstrias, tais como a indstria automobilstica, de aviao, na indstria qumica e biofarmacutica (WHO, 2007). Os perigos que afetam a qualidade so controlados em certa medida por meio da validao das operaes crticas e dos processos na produo de produtos farmacuticos de acordo com as Boas Prticas de Fabricao (BPF). No entanto, as BPF no abrangem a segurana dos

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funcionrios envolvidos na produo, enquanto ambos os aspectos so abordados pelo HACCP (WHO, 2007). Os procedimentos, incluindo as BPF, abordam as condies operacionais e fornecem a base para o HACCP. O HACCP um mtodo sistemtico para a identificao, avaliao e controle dos riscos de segurana. A ferramenta HACCP um sistema de gesto em que a segurana abordada atravs da anlise e controle de perigos qumicos, biolgicos e fsicos originados da aquisio de matrias-primas, produo e manuseio, fabricao, distribuio e consumo do produto acabado (FDA, 2011). uma tcnica racional e dinmica, recomendada pelo comit de especialistas da WHO (2003), embasada na aplicao de princpios tcnicos e cientficos de preveno, que representa uma atitude pr-ativa e cujos ideais encontram-se em concordncia com as disposies das BPF (Bansal, 2004). As BPF para produtos farmacuticos requerem a validao dos processos crticos bem como de alteraes no processo de fabricao que podem afetar a qualidade do produto final. A experincia mostra que a maioria dos processos de fabricao contm etapas que so "crticas" do ponto de vista de variaes na qualidade do produto final (WHO, 2007). O HACCP no deve ser confundido com validao, uma vez que a sua abordagem mais ampla. Assim, ajuda a identificar questes sobre as quais a validao deve se concentrar. baseada na cincia e sistemtica, e identifica perigos especficos e medidas para seu controle, bem como fornece informaes sobre proteo ambiental e segurana do trabalho. uma ferramenta para avaliar perigos e estabelecer sistemas de controle focados na preveno em vez de depender de aes corretivas baseadas nos testes de produto final. Todos os sistemas de HACCP so capazes de acomodar alteraes, tais como avanos no desenho de equipamentos e procedimentos de processamento ou desenvolvimentos tecnolgicos (WHO, 2007; FDA, 2011). O HACCP no deve substituir a BPF, no entanto, a sua aplicao pode ser utilizada como um primeiro passo para se trabalhar com BPF. Em pases onde so aplicadas regulaes apropriadas de conformidade, com atividades BPF (incluindo validao) e inspees, se fornecem garantias de que os riscos so amplamente controlados. Em outros pases onde a ao dos rgos reguladores menos eficaz, no entanto, os pacientes podem ser colocados em risco devido produo de produtos farmacuticos de

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baixa qualidade, eficcia e segurana. A avaliao dos riscos individuais relacionados com produtos especficos e matrias-primas, bem como o reconhecimento de perigos em fases especficas da produo ou distribuio deve permitir que as autoridades reguladoras melhorem o controle de medicamentos, aumentando a eficcia de suas atividades dentro dos limites dos recursos disponveis (WHO, 2007). Esse sistema contnuo, detectando-se os problemas antes que ocorram, ou no momento em que surgem, e aplicando-se imediatamente as aes corretivas. Alm disso, uma ferramenta sistemtica, por ser um plano completo que cobre todas as operaes, os processos e as medidas de controle, diminuindo a chance de ocorrncia de perigos. O HACCP compatvel com outros sistemas de controle de qualidade (WHO, 1997). Isto significa que inocuidade, qualidade e produtividade podem ser abordadas em conjunto, resultando em benefcios para os consumidores, como maior confiana, mais lucros para as empresas, e melhores relaes entre os que trabalham em funo do objetivo comum de garantir a qualidade, eficcia e segurana dos produtos. A implementao do sistema HACCP reduz a necessidade de inspeo e teste de produto final, aumenta a confiana do consumidor e resulta num produto comercialmente mais vivel. Isso facilita o cumprimento de exigncias legais, e permite o uso mais eficiente de recursos, acarretando reduo nos custos da indstria. 1.12 Relevncia do estudo O mercado de produtos biofarmacuticos tende uma globalizao de metodologias de produo e controle de qualidade, bem como de requisitos regulatrios para que os produtos sejam produzidos e controlados com o mesmo nvel de qualidade, eficcia e segurana. As diretrizes do ICH para os Requisitos Tcnicos de Registro de Produtos Farmacuticos para Uso Humano preconizam na sua categoria de qualidade uma srie de Guias orientativos que visam enfocar de forma sistemtica a gesto de riscos para a qualidade, facilitando o cumprimento das Boas Prticas de Fabricao e outros requisitos de qualidade. As diferentes ferramentas de Gesto de Risco para Qualidade procuram focar na especificao de parmetros que realmente impactem na segurana e eficcia do produto e que estas avaliaes devem basear-se em conhecimento cientfico, traduzido por dados.

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As novas metodologias analticas que procuram a eficcia de dados mais acurados e com a velocidade de resposta esperada pelos produtores tm uma similaridade com a validao de processos e com a Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle. Permitindo que os ensaios analticos sejam desenhados dentro de um Design Space que preconiza os limites pr-definidos de parmetros de processo que demonstraram a segurana para a qualidade do produto. O ensaio mais comum para a deteco de DNA contaminante em biofrmacos, faz uso de material radioativo, o que no mais realizado no Instituto. Isso se deve, principalmente s normas exigidas pela CNEN, que envolve uma burocracia para a concesso de registro de pessoal hbil para lidar com esse tipo de material, alm de treinamentos, transporte e descarte do material radioativo, que tornaria o trabalho, de uma forma geral, muito rduo.

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2 OBJETIVOS
2.1 - Objetivo Geral Utilizar a ferramenta de anlise de risco, Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (HACCP) para estabelecer um critrio de escolha para uma metodologia alternativa para o controle de qualidade do biofrmaco alfainterferona 2b e uma melhor exatido e/ou preciso com relao ao mtodo atual preconizado pela farmacopeia, que utiliza material radioativo em seu ensaio.

2.2 - Objetivos especficos Promover a inovao das atividades do controle de qualidade inserindo os conceitos de gerencimento de risco no Departamento de Controle de Qualidade - DEQUA em Bio-Manguinhos. Possibilitar uma melhor escolha, fundamentada em dados, de uma metodologia alternativa para o controle de qualidade do biofrmaco alfainterferona 2b tendo como base os pontos crticos de controle e visando seus riscos potenciais. Avaliar, controlar e aprimorar as metodologias mais refinadas envolvendo ensaios de biologia molecular. Propiciar um ensaio quantitativo, para ir alm da expectativa do ensaio preconizado pela farmacopeia focando o biofrmaco alfainterferona 2b.

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3 METODOLOGIA
A proposta foi baseada em um estudo de caso que trata de um processo especfico para o desenvolvimento de uma metodologia alternativa para o controle de qualidade do biofrmaco Alfainterferona 2b. um desenho do desenvolvimento de uma metodologia que pode ser conduzido no quadro de paradigmas bem distintos, como o positivista, o interpretativo ou o crtico (Kilpatrick, 1988). Assume-se o desenvolvimento de forma a descobrir o que h de mais essencial e caracterstico na situao em estudo. Essa metodologia utiliza uma grande variedade de instrumentos e estratgias de colheita de dados. Tem um forte cunho descritivo que conduz a um profundo alcance analtico, alm de procurar identificar padres e no testar hipteses. O analista o principal instrumento de colheita de dados e na interpretao dos mesmos (Cohen; Manion; Morrison, 2000). O mtodo de estudo de caso abrange todo o conjunto de procedimentos necessrios para fazer um estudo de caso. Essas tarefas incluem projetar o estudo, coletar os dados do estudo, analisar os dados e apresentar os relatrios e resultados (Yin, 2011). Esta metodologia permite descrever e avaliar situaes quando as questes de pesquisa so do tipo como e por que, em que o pesquisador no tem controle sobre o evento e busca ampliar seu conhecimento acerca de determinado tema. Podem ser apontadas pelo menos seis fontes de evidncias em um estudo de caso: documentos, arquivos de registros, entrevistas, observao direta, observao de participantes e artefatos fsicos (Stake, 1995; Tellis, 1997; Yin, 2008). Os fundamentos deste delineamento baseiam-se na idia de que a anlise de uma unidade de determinado universo possibilita a compreenso da sua generalidade, ou, pelo menos, o estabelecimento de bases para uma investigao posterior. O estudo de caso bastante utilizado em pesquisas exploratrias por sua flexibilidade, sendo aplicado com pertinncia s situaes em que o objeto de estudo j suficientemente conhecido a ponto de ser enquadrado em determinado tipo ideal (Gil, 1995). As tcnicas utilizadas para determinar DNA contaminante no biofrmaco Alfainterferona 2b so normalmente abordadas segundo duas perspectivas: Avaliao Qualitativa (Hibridizao

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com sonda radioativa Anlise dot blot) e Avaliao Quantitativa (qPCR e tecnologia usando biosensor como o Threshold) (USP, 2009). Primeiramente foi feita uma pesquisa dos mtodos, assim como um estudo de seus protocolos para se obter um embasamento cientfico dos mesmos com intuito de dar suporte utilizao da ferramenta de anlise de risco HACCP. Dessa forma, o trabalho foi composto de cinco fases distintas e subsequentes: 1a fase: foi realizado um levantamento e reviso bibliogrfica acerca dos assuntos contemplados pela proposta de trabalho e etapas presentes ao longo de todo o processo de elaborao da dissertao. 2a fase: as metodologias em estudo foram representadas a partir do desenho de seus respectivos fluxogramas. 3a fase: a partir dos fluxogramas da etapa anterior, foi desenhado um diagrama de causa e efeito das possveis fontes de variabilidade nos ensaios de quantificao de DNA de clula hospedeira (DCH). 4a fase: nesta fase implementou-se o HACCP. 5a fase: foram elencados os pontos crticos de controle (PCC). 6 fase: interpretao e comparao dos PCC entre os mtodos. 3.1 1 fase: Levantamento bibliogrfico Inicialmente, foi realizado um levantamento e reviso bibliogrfica acerca dos assuntos contemplados pela proposta de trabalho e etapas presentes ao longo de todo o processo de elaborao da dissertao. Nesta fase, foram estudados os fundamentos tericos do gerenciamento de riscos qualidade, tendo como base fundamental o documento Quality Risk Management - Q9, do ICH (2005). A coleta de dados dos ensaios para deteco de DNA contaminante se deu por meio de POPs, protocolos cientficos, manuais de instruo de fabricantes, farmacopeias, alm de anlises no Departamento de Qualidade de Bio-Manguinhos (DEQUA).

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Para a construo dos fluxogramas e diagramas foram utilizados os guias e especificaes de legislaes nacionais e internacionais, alm de instrues de trabalho. 3.2 2 fase: Desenho de fluxogramas Para a aplicao da ferramenta de anlise de risco, Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (HACCP) se fez necessrio o uso de anlises mais especficas que permitiram elencar os pontos crticos de cada tcnica avaliada. Os desenhos de fluxogramas so representaes tpicas de um processo que permite dividi-lo em suas etapas, facilitando a observao tcnica. 3.3 3 fase: Desenho de diagramas de causa e efeito O Desenho de Diagrama de Causa e Efeito permitiu identificar e organizar as possveis causas, alm de associar vrias possveis causas com um nico efeito, o que possibilitou distinguir a criticidade de um evento/modo de falha. 3.4 4 fase: implementao do HACCP Nesta etapa foi realizada a implementao do sistema de HACCP seguindo os seguintes passos: 1. Construo do fluxograma comparativo das tcnicas 2. Confirmao do local de instalao dos equipamentos 3. Listagem de todos os perigos, analise dos riscos e considerao dos controles necessrios; 4. Determinao dos pontos crticos de controle (PCC); 5. Estabelecimento dos limites crticos para todos os PCC; 6. Estabelecer documentao e manter registros. Os passos 5 e 6 devero ser completamente implementados aps a validao do(s) ensaio(s) para deteco de DNA de clula hospedeira. 3.5 5 fase: elencar PCC Um dos princpios do Sistema HACCP a identificao dos PCC. O PCC qualquer ponto, etapa ou procedimento no qual se aplicam medidas de controle (preventivas), para

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manter um perigo significativo sob controle, com objetivo de eliminar, prevenir ou reduzir os riscos inerentes ao processo. As Boas Prticas de Fabricao adotadas como pr-requisito do Sistema HACCP, so capazes de controlar muitos dos perigos identificados (Pontos de Controle PC); porm, aqueles que no so controlados (total ou parcialmente) atravs dos programas de pr-requisitos devem ser considerados pelo Sistema HACCP. Os PCC so os pontos caracterizados como realmente crticos segurana. As aes e esforos de controle dos PCC devem ser, portanto, concentrados. Assim, o nmero de PCC deve ser restrito ao mnimo e indispensvel. interessante assinalar que mais de um perigo pode ser controlado em um mesmo PCC, ou que mais que um PCC pode ser necessrio para controlar um nico perigo (SENAI, 2000). A partir da so estabelecidos os limites crticos de todos os PCC. O limite crtico um valor mximo e/ou mnimo de parmetros biolgicos, qumicos ou fsicos que assegure o controle do perigo. Os limites crticos so estabelecidos para cada medida preventiva monitorada dos PCC. Estes valores podem ser obtidos de fontes diversas, tais como: guias e padres da legislao, literatura, experincia prtica, levantamento prvio de dados, experimentos laboratoriais que verifiquem adequao e outros. Os limites crticos devem estar associados a medidas como: temperatura, tempo, atividade de gua, pH, acidez titulvel, resduos de antibiticos e outras. Pode-se, tambm, estabelecer limites de segurana com valores prximos aos limites crticos e adotados como medida de segurana para minimizar a ocorrncia de desvios nos limites crticos. Uma estratgia utilizada para facilitar a identificao de cada PCC uma rvore de deciso PCC (Figura 4.1). Embora a aplicao da rvore de deciso PCC possa ser til para determinar se um passo particular um PCC para um perigo previamente identificado, meramente uma ferramenta e no um elemento obrigatrio da HACCP. Uma rvore de deciso PCC no um substituto para o conhecimento de especialistas (FDA, 1997). Assim sendo, cada mtodo de identificao de DNA contaminante estudado teve, aps o estudo dos mesmos e a partir dos respectivos fluxogramas, seus PCC identificados no intuito de se avaliar, confrontar e comparar os riscos de cada um.

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Figura 3.1: rvore de perguntas para determinao dos PCC (Adaptado de FAO/WHO, 1997).

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4 RESULTADOS E DISCUSSO

Neste captulo sero apresentadas as planilhas para anlise dos dados elencados durante o processo de estudo de caso, que consistem basicamente do entendimento dos processos aqui representados pelas metodologias e seus respectivos equipamentos, do diagrama de causa e efeito e, por fim, do levantamento e anlise dos pontos crticos de controle. A estratgia de colheita de dados como fontes de evidncia para este estudo foram os documentos, as entrevistas, a observao direta e a observao de especialistas que trabalham diretamente com as tcnicas, porm com outros objetivos. 4.1 Fluxogramas Os fluxogramas fornecem uma vista detalhada do processo e aumentam a compreenso de como o processo ocorre. Com um fluxograma de processo, as equipes podem identificar passos repetitivos, gargalos e ineficincias no processo (McDermott et al., 2008). Quando usados com uma ferramenta de anlise de risco, como o HACCP, os fluxogramas aumentam o entendimento da equipe sobre determinado processo, o que por sua vez facilita identificar possveis falhas, efeitos e solues (McDermott et al., 2008; Tague, 2010). A partir disso, foram pesquisados e desenhados, primeiramente, os fluxogramas dos trs ensaios: dot-blot radiotivo (Figura 4.1), qPCR (Figuras 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 e 4.6) e Threshold (Figuras 4.7; 4.8; 4.9 e 4.10). Os fluxogramas foram confeccionados em separado a partir de cada uma das etapas dos ensaios de qPCR e Threshold. Por opo, o mesmo no aconteceu com o dot-blot radioativo para facilitar sua visualizao como um todo, por no ser o foco do trabalho e sim servir de comparao para os ensaios alternativos analisados, uma vez que esta metodologia no tem condies de ser implantada em Bio-Manguinhos, conforme mencionado anteriormente. Contudo, o mesmo foi separado em suas diferentes etapas para verificao dos perigos, para o levantamento dos seus PCC e para verificar se os mesmos pontos se repetem nas metodologias

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alternativas, com isso, poderamos verificar se o escopo de abrangncias dos diferentes ensaios metodolgicos so compatveis (ver subitens 4.3 e 4.4). O fluxograma foi testado acompanhando processos semelhantes com outras finalidades, usando desta vez o quadro como um guia. Vale ressaltar que tanto os ensaios de qPCR e Threshold podem ser aplicados com diferentes finalidades na rotina do controle de qualidade para produtos terminados que no especificamente para o caso de deteco de DNA de clulas hospedeiras DCH. Todo o fluxograma definido para um processo deve ser revisto periodicamente para se ter certeza de que mantido atualizado (McDermott et al., 2008). Vale lembrar que este fato importante para quaisquer processo/ensaio validados e utilizados periodicamente, seja no controle de qualidade ou na produo. Nesse trabalho, os fluxogramas foram analisados por profissionais que tem experincia nos respectivos ensaios, sejam do desenvolvimento, qualidade ou produo.

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Fluxograma Dot-Blot para Alfainterferon 2B

Figura 4.1: Fluxograma do ensaio de dot-blot radioativo geral.

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Fluxograma qPCR - Extrao de DNA residual (PrepSEQ Residual DNA Sample Preparation Kit - Applied Biosystems)

Figura 4.2: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa de extrao de DNA.

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Fluxograma qPCR - Preparo do Mix Master da reao (resDNASEQ Quantitative DNA kit- Applied Biosystems)

Figura 4.3: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa de preparo do mix mster da reao.

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Fluxograma qPCR - Preparo da curva padro (PrepSEQ Residual DNA Sample Preparation Kit - Applied Biosystems)

Figura 4.4: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa do preparo da curva padro.

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Fluxograma qPCR - Preparo das diluies seriadas do DNA controle (resDNASEQ Quantitative DNA kit- Applied Biosystems)

Figura 4.5: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa das diluies seriadas.

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Fluxograma qPCR - PCR em tempo real (7500 Fast instrument with 7500 Fast instrument SDS software Applied Biosystems)

Figura 4.6: Fluxograma do ensaio de qPCR, etapa do PCR em tempo real.

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Fluxograma Threshold - Mtodo de extrao de DNA livre de fenol (Kit DNA Extractor - Wako Chemicals USA)

Figura 4.7: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa de extrao de DNA.

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Fluxograma Threshold - Preparao e verificao da integridade de padres de DNA: Espectrofotometria

Figura 4.8: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da espectrofotometria. AU: unidade de absoro.

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Fluxograma Threshold - Preparao e verificao da integridade de padres de DNA: Eletroforese

Figura 4.9: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da eletroforese.

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Fluxograma Threshold - Quantificao de DNA residual em Biofrmaco

Figura 4.10: Fluxograma do ensaio Threshold, etapa da quantificao de DNA.

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Pode-se observar entre as metodologias alternativas avaliadas qPCR e o Threshold, excluindo-se as fases de tratamentos de amostras que existem dois passos chaves para ambos, at mesmo por se tratarem de ensaios para quantificao de DNA: a extrao de DNA e a desnaturao da fita dupla em fita simples. O primeiro passo por necessidade de se ter material de partida - cido desoxirribonucleico para seguimento do trabalho e o segundo passo de vital importncia que a desnaturao do DNA, porm, por peculiaridades especficas de cada processo a temperatura da mesma pode variar entre 95 oC 105oC, dependendo da tcnica a ser utilizada e de como o procedimento estabelecido. O qPCR necessita desnaturar o DNA para que as contnuas reaes de amplificao da molcula possam aumentar o nmero delas para que a quantificao possa ser realizada. J no caso do Threshold, a desnaturao deve ocorrer, obrigatoriamente, por se tratar de um ensaio enzimtico que tem a capacidade de quantificar todas as molculas de DNA fita simples que so capturadas pelo conjugado biotina-estreptavidina-anticorpo anti-fsDNA. Indiscutivelmente, s haver a quantificao de DNA no IFN-2b se durante o processo de produo o DNA de clula hospedeira ficar contido na IFA aps sua purificao. 4.2 Diagrama de causa e efeito (Ishikawa ou espinha de peixe) O uso de uma abordagem de equipe para a resoluo de problemas, muitas vezes leva a muitas opinies para a causa raiz do problema. Uma maneira de capturar essas ideias diferentes e estimular o brainstorming da equipe nas causas raiz o diagrama de causa e efeito, comumente chamado de espinha de peixe ou diagrama de Ishikawa. A espinha de peixe vai ajudar a mostrar visualmente as muitas causas potenciais para um problema especfico ou efeito. particularmente til em um ambiente de grupo e para situaes em que poucos dados quantitativos esto disponveis para anlise (Crocker et al., 1984; Tague, 2004). Os ensaios em estudo apresentam caractersticas comuns por serem utilizados para o mesmo fim, a quantificao de DNA, apesar dos mtodos serem diferentes, apresentam riscos semelhantes. A partir destas informaes, foi desenhado um diagrama de causa e efeito geral que abrange as fontes de variabilidade ou perigos dos mesmos que podem estar associados a cada etapa do procedimento (Figura 4.11).

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Representao esquemtica de causa e efeito das possveis fontes de variabilidade nos ensaios de quantificao de DCH

Figura 4.11: Diagrama de causa e efeito das possveis fontes de variao nos ensaios de quantificao de DNA de clula hospedeira (DCH).

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Esse diagrama tem um benefcio maior para auxiliar e ajudar a trazer uma explorao mais aprofundada das questes por trs dos problemas o que vai levar a uma soluo mais robusta das proposies sejam elas intrnsecas s questes metodolgicas ou mesmo a procedimentos pertinentes na execuo dos ensaios que envolvam o elemento humano. Mehta e Keer (2007) indicam que um processo analtico apresenta trs estgios (causas principais) nos quais uma variabilidade de sugestes pode ocorrer: o preparo das amostras, as medidas analticas e a anlise como evidenciados pela figura 4.10. Neste estudo, a pergunta principal concentra-se na variabilidade da quantificao de DNA da clula hospedeira, as causas relacionadas com o primeiro estgio (preparo de amostras) expressam dois nveis de dependncia onde normalmente encontramos as causas raiz da abordagem; quanto mais respondemos s causas de cada abordagem, estamos chegando o mais perto possvel das causas raiz do problema. Como causas secundrias no preparo das amostras, observa-se o vis de amostragem, a exatido de amostra e a integridade e estabilidade da amostra. Relaciona-se secundariamente, ao segundo estgio, s medidas da quantidade de DNA alvo, as condies de trabalho, a sensibilidade e a contaminao cruzada. J para o terceiro estgio - anlise, esto relacionadas performance de controles, a interpretao e registros de dados e os padres utilizados. A cada estgio seguem as causas tercirias, que refinam os questionamentos e so direcionadas s respostas que vo de encontro s causas raiz. Podemos observar, de maneira geral, que os desvios no preparo de amostras, particularmente, so influenciados pelas condies das mesmas e a interferncia do analista ao manipul-las. No caso das medidas, esses erros esto relacionados, principalmente, s reas de trabalho, aos equipamentos e ao analista. J os erros dentro da anlise, basicamente, relacionam-se ao analista e calibragem de pipetas (figura 4.11). Nestes casos, o componente humano pode ser minimizado com treinamentos, conscincia e eficincia na realizao do ensaio. Os mtodos de quantificao de DCH, como observado, apresentam fontes de variabilidade. Fontes de variabilidade nos processos de anlise e metodologia podem dar origem incerteza de medio. Uma srie de fatores pode contribuir para a preciso global de determinao DCH (Eurachem/CITAC, 2012). A figura 4.12 representa esquematicamente algumas das etapas onde a variabilidade pode ocorrer e que se pode verificar, maioritariamente, que esto relacionados s condies do local de trabalho, aos instrumentos e aos analistas.

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Figura 4.12: Ilustrao indicativa das fontes tpicas de incertezas (Modificado de Eurochem/CITAC, 2012).

4.3 Implementao do HACCP O conceito de HACCP pressupe um estudo sistemtico para identificar os perigos, avaliar a probabilidade dos mesmos acontecerem durante o processo, a distribuio ou o uso do produto e definir meios para control-los. Como este estudo exploratrio, ou seja, as metodologias estudadas no so aplicadas com a finalidade de investigar traos de DNA da clula hospedeira no produto final, foi necessrio montar as tabelas de perigos, causas e efeitos. 4.3.1 Tabelas de perigos, causas e efeitos. A partir da anlise dos fluxogramas de cada ensaio e do diagrama de espinha de peixe desenhados, foi feita uma tabela para cada ensaio detalhando os perigos, as causas, os efeitos e relacionando a eles, as possveis deteces e as medidas de mitigao desses perigos, separados por cada etapa dos ensaios como se pode observar abaixo pelas tabelas 4.1 (dot-blot radioativo); 4.2 (qPCR) e 4.3 (Threshold). Essas tabelas foram de grande importncia para a anlise profunda dos riscos a fim de auxiliar na verificao dos pontos crticos em cada um deles. Foram observados 25 perigos para o dot-blot radioativo nas oito etapas do ensaio, 14 perigos nas cinco etapas do qPCR e 19 perigos nas cinco etapas do Threshold. Pelas tabelas abaixo se

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verifica, tambm, que mesmo diferentes, vrios desses perigos, nos respectivos ensaios, apresentam causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao semelhantes, o que nos permite dizer, que alguns perigos so comuns aos trs ensaios como, por exemplo, contaminao cruzada, volumes fora da especificao e interpretao de dados. O que nos leva a questes que envolvem componente humano e instrumental. O dot-blot radioativo tem uma peculiaridade por ser um mtodo semi-quantitativo, no envolve um equipamento para leitura final do resultado, o que permite uma variabilidade na interpretao do resultado, nos outros casos um equipamento est associado ao resultado quantitativo e intrinsicamente a variabilidade est na qualificao do instrumental. Junto a isso somam-se os problemas com descalibrao dos equipamentos, que so problemas de fcil soluo ao se estabelecer calibraes peridicas dos mesmos. Outro ponto importante de perigo relacionado tanto com o dot-blot radioativo quanto com o Threshold diz respeito ao alcance da temperatura de desnaturao da molcula de DNA ao se fazer uso de um termobloco para ambos. Verificamos que o termobloco de grande importncia para ambos e que torna de grande necessidade a obteno de um fornecedor qualificado para evitar transtornos de trabalho. Outro ponto que vale destacar que, diferentemente do qPCR e do Threshold, que possuem kits j qualificados e com garantia do uso especfico, o dot-blot radioativo um ensaio in house, ou seja, necessrio que todos seus reagentes sejam preparados em laboratrio pelos prprios analistas, qualificando-os para sua utilizao no ensaio, alm de manter essas caractersticas com avaliaes frequentes. Isso eleva a variabilidade nos resultados por aumentar as fontes de incertezas do ensaio. Com isso, o dot-blot torna-se mais dispendioso em relao tempo, trabalho e cuidados que acabam elevando a probabilidade dos riscos e de interferncias negativas nos resultados esperados. De maneira geral foi observado que so de extrema importncia a fim de se mitigar os riscos aos ensaios: os treinamentos, as calibraes e as boas prticas laboratoriais (BPL). A importncia de se trabalhar na rotina de produo com equipamentos e reagentes validados e qualificados, passa pela minimizao da variabilidade nos resultados.

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Tabela 4.1: Perigos, suas causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao para o ensaio de Dot Blot radioativo.

Dot Blot radioativo

ETAPA PERIGO
Contaminao cruzada A temperatura de 95C no atingida A temperatura de 95C no uniforme em todo termobloco Preparo de reagentes Material do termobloco fora da especificao Uso de membranas fora da especificao A fixao no ocorre Preparo de reagentes No h de ligao entre os dDTPs e -dATP32 Decaimento radioativo Contaminao do analista Purificao Coluna de purificao fora da especificao (tipo e beads)

CAUSA
Aerossis Equipamento descalibrado Fissuras no termobloco Operador Fornecedor no qualificado Fornecedor no qualificado Tempo de exposio insuficiente e vida til da lmpada de UV Operador A sonda no foi digerida Meia-vida do istopo radiativo Operador Operador Operador

EFEITO
Resultado falso positivo As molculas de DNA no so desnaturadas No h uniformidade na desnaturao das amostras e padres Alterao do resultado esperado No h desnaturao ou uniformidade da mesma No h a fixao do DNA

DETECO
Resultado dos controles negativo e positivo fora do padro Termmetro do termobloco Termmetro nos poos No detectvel. No detectvel. Observao do tempo de vida til da lmpada

MEDIDAS DE MITIGAO
Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Plano mestre de calibrao Observao, comparao de resultados e anlise visual do termobloco Treinamento Qualificar o fornecedor Qualificar o fornecedor Cadastro rotineiro do tempo de cada uso da lmpada UV Treinamento Seguir corretamente POP; treinamento especfico para lidar com istopos radioativos; plano mestre de calibrao Uso de EPIs; realizar etapa em rea segregada e devidamente protegida para o trabalho com radioistopos Seguir corretamente o POP; treinamento Seguir corretamente o POP; treinamento Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Seguir corretamente o POP; treinamento Treinamento Plano mestre de calibrao Seguir corretamente o POP; treinamento Plano mestre de calibrao Treinamento Treinamento dos operadores no preparo de solues Qualificar fornecedor, reposio peridica de filmes no quarto escuro Checar periodicamente a manuteno de escurido do quarto Garantir fornecimento de gelo seco e manuteno da caixa isotrmica Treinamento Qualificar o fornecedor, trocar periodicamente as solues

Desnaturao do DNA no preparo da sonda

Fixao membrana de nylon

Alterao do resultado esperado Resultado fora do especificado Afastamento, doena do analista A sonda marcada no purificada Alterao do resultado esperado Resultado falso positivo Alterao do resultado esperado Alterao do resultado esperado Resultado fora do esperado Volume insuficiente para cobrir a membrana de hibridizao DNA e sonda no hibridizam Alterao do resultado esperado DNA e sonda no hibridizam

No detectvel. Checagem da digesto por eletroforese Checagem com contador de partculas Exames mdicos; no detectvel Checagem da purificao por contagem de partculas radiativa no eluato No detectvel; controle positivo Resultado dos controles negativo e positivo fora do padro No detectvel - Somente no resultado final No detectvel. No detectvel Visualmente Termmetro do forno de hibridizao No detectvel. No detectvel Visualmente pelo operador

Marcao da sonda

Extrao de DNA da clula hospedeira na IFA

Contaminao cruzada

Aerossis Rotulagem errada Operador Pipetas automticas descalibradas Pipetas automticas descalibradas A temperatura de pr-hibridizao e hibridizao no atingida Operador Concentrao dos componentes Data de validade Montagem da sequncia errada Diferena na temperatura -70C para ocorrer o print no filme de raio X Operador Data de validade dos agentes de revelao e fixao Avaliao sem levar em considerao o protocolo padro

Preparo de reagentes Volume fora de especificao Volume fora de especificao Pr hibridizao e Hibridizao No ocorrncia de hibridizao Preparo de reagentes Soluo de hibridizao Filme de raio-X Quarto escuro e montagem do cassete Revelao Armazenamento do cassete Preparo de reagentes Revelao Anlise de resultados

No marcao no filme

Alterao do resultado esperado Manchas no filme - resoluo ruim

Operador verificar se o quarto est totalmente escuro. Seguir sequncia do POP Verificar que o cassete esteja embrulhado em material escuro e deixar em contato com o gelo seco em caixa isotrmica No detectvel. Operador verificar validade dos insumos Observao dos parmetros da curva padro; comparao com outros experimentos e dados histricos; o resultado semiquantitativo por comparao

Interpretao de dados

Alterao do resultado esperado

Treinamento

POP: Protocolo Operacional Padro UV: raios ultravioletas; dDTPs: Desoxirribonucleotdeos Trifosfatados; -dATP32: Adenosina trifosfato marcado com fsforo 32; IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo; EPIs: Equipamentos de Proteo Individual.

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Tabela 4.2: Perigos, suas causas, efeitos, deteco e medidas de mitigao para o ensaio de qPCR.

qPCR
ETAPA PERIGO CAUSA
Operador Extrao de DNA de clula hospedeira na IFA Contaminao cruzada Aerossis Rotulagem errada Pipetas automticas descalibradas Pipetas automticas descalibradas Aerossis Operador Erro no clculo de diluio Volume fora de especificao Pipetas automticas descalibradas Pipetagem imprecisa Preparo das diluies seriadas do DNA controle e preparo da curva padro Degradao do DNA Armazenamento inadequado Operador Rotulagem errada Contaminao cruzada Aerossis Interferncia na leitura Troca das posies corretas de amostras e controles na placa Inverso da posio da placa Degradao de primers, Taq e sondas PCR em tempo real Insumos fora da especificao Resultado falso negativo Temperatura de armazenamento Arranho no adesivo da placa Placa fora da especificao Interferncia da leitura ptica Falta de limpeza na base do equipamento Equipamento descalibrado Talco das luvas Anlise de resultados Interpretao de dados Avaliao sem levar em considerao o POP e resultados esperados Alterao do resultado esperado Interferncia no resultado esperado Termmetro Visualmente Confirmao da especificao da placa Visualmente; checagem pelo operador (POP) Anlise dos controles negativo e positivo Observao do perfil geral de amplificao e parmetros da curva padro; comparao com outros experimentos e dados histricos Anlise dos controles Bolhas nos poos Resultado falso positivo Alterao do resultado esperado Resultado dos controles negativo e controle positivo Visualmente, observao do fundo dos poos Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Homogeneizar a soluo observando o fundo do poo Seguir corretamente o POP; uso de espelho da placa como guia; uso de sistema luminoso para aplicao nos poos; treinamento Seguir corretamente o POP; treinamento Teste com DNA padro para verificar integridade; qualificar o fornecedor Controle rotineiro da temperatura do freezer; plano mestre de calibrao Cuidado ao colar o adesivo na placa Qualificar o fornecedor Limpeza rotineira Calibrao rotineira com o fluorforo Uso de luvas de nitrila e qualificao de fornecedor Anlise de cada uma das amostras individualmente, treinamento. Resultado falso negativo Alterao do resultado esperado Alterao do resultado esperado

EFEITO
Alterao do resultado esperado Resultado falso positivo Alterao do resultado esperado Resultado fora do esperado Alterao do resultado esperado Resultado falso positivo Alterao do resultado esperado

DETECO
No detectvel - Somente no resultado final Resultado dos controles negativo e positivo fora do padro No detectvel - Somente no resultado final No detectvel Visualmente Resultado dos controles negativo e controle positivo fora do especificado No detectvel Reviso dos clculos; resultado fora da especificao Visualmente Visualmente Ausncia de sinal de deteco No detectvel - Somente no resultado final

MEDIDAS DE MITIGAO
Seguir corretamente o POP; treinamento Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao e limpeza do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Seguir corretamente o POP; treinamento Plano mestre de calibrao Plano mestre de calibrao Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao e limpeza do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Rotulagem correta; treinamento Seguir POP; Treinamento Plano mestre de calibrao Treinamento

Volume fora de especificao Utilizao de volumes de primers e sondas incorretos Preparo do Master MIX da reao Contaminao cruzada Troca da soluo de DNAestoque com DNA-trabalho

Seguir corretamente POP; treinamento

Operador

Alterao do resultado esperado

No detectvel - Somente no resultado final

POP - Protocolo Operacional Padro; IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo

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Tabela 4.3: Perigos, suas causas, efeitos e deteco para o ensaio de Threshold.

Threshold
ETAPA PERIGO CAUSA
Operador Contaminao cruzada Extrao de DNA de clula hospedeira na IFA Volume fora de especificao Preparo de solues Aerossis Rotulagem errada Pipetas automticas descalibradas Concentrao dos componentes Erro no clculo de diluio Diluio das amostras Espectrofotometria Leituras incorretas Preparo de solues Pipetas automticas descalibradas Alterao do resultado esperado Pipetagem imprecisa Leitores espectrofotomtricos descalibrados Concentrao dos componentes Pipetas automticas descalibradas Alterao do resultado esperado Volume fora de especificao Eletroforese No ocorrncia da migrao eletrofortica ou perda das amostras no gel Volume de Labeling Reagente (reagente marcador) fora de especificao A temperatura de 105C no atingida A temperatura de 105C no uniforme em todo termobloco Material do termobloco fora da especificao Troca das posies corretas de amostras nos sticks No ocorrncia de reao cataltica Alterao na programao padro para a reao Contaminao cruzada Rotulagem errada No so formados os complexos enzimticos na membrana do stick Incubao incorreta das amostras Anlise de resultados Interpretao de dados Descalibrao da bomba de vcuo Resultado falso negativo Rompimento da membrana Descalibrao do banho Avaliao sem levar em considerao o protocolo padro No ocorrncia da reao das amostras com o Labelling Reagent Alterao do resultado esperado Termmetro Observao dos parmetros da curva padro; comparao com outros experimentos e dados histricos Alterao do resultado esperado Seguir corretamente o POP; treinamento Plano mestre de calibrao Treinamento, anlise dos filtros antes do uso, Qualificar fornecedor Plano mestre de calibrao Anlise de cada uma das amostras individualmente em cada etapa do processo, treinamento Pipetagem imprecisa Treinamento Excesso de volume aplicado ao poo Programao do equipamento fora do especificado (voltagem/tempo) Uso de gua em vez de tampo (gel; cuba) Inverso de plos na corrida eletrofortica Pipetas automticas descalibradas Alterao do resultado esperado Pipetagem imprecisa Equipamento descalibrado Fissuras no termobloco Fornecedor no qualificado Operador Exausto do substrato, quantidade insuficiente de substrato calculado para a reao Operador No detectvel - somente no resultado final Aerossis Resultado falso positivo Realizar etapa em capela ou cabine Seguir corretamente o POP; treinamento Alterao do resultado esperado Treinamento As molculas de DNA no so desnaturadas No h uniformidade na desnaturao das amostras e padres No h desnaturao ou uniformidade nos poos do termobloco Termmetro do termobloco Termmetro nos poos No detectvel. Visualmente Treinamento Plano mestre de calibrao Observao, comparao de resultados e anlise visual do termobloco, Plano mestre de calibrao Qualificar o fornecedor, Plano Mestre de calibrao Plano mestre de calibrao Resultado falso positivo Resultado dos controles fora do especificado Visualmente No ocorre a extrao de DNA No detectvel No detectvel Visualmente Treinamento Plano mestre de calibrao Treinamento dos operados no preparo de solues Plano mestre de calibrao

EFEITO
Alterao do resultado esperado Resultado falso positivo Alterao do resultado esperado No ocorrncia de extrao; resultado falso negativo No ocorre a extrao de DNA

DETECO
No detectvel - Somente no resultado final Resultado dos controles negativo e positivo fora do padro

MEDIDAS DE MITIGAO
Seguir corretamente o POP; treinamento Realizar etapa em capela em rea segregada; esterilizao do local de trabalho; material especfico para cada capela; ponteiras com filtro; treinamento Seguir corretamente o DE; treinamento

No detectvel - Somente no resultado final Plano mestre de calibrao No detectvel Reviso dos clculos; conforme POP Treinamento dos operados no preparo de solues Treinamento no POP Plano mestre de calibrao

Ausncia de resultado

Visualmente; checagem pelo operador (POP)

Seguir corretamente o POP; treinamento

Quantificao de DNA na IFA

POP - Protocolo Operacional Padro; IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo

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4.3.2 Pontos crticos de controle (PCC) H um novo conceito das agncias regulatrias, em que a consistncia de produo de biolgicos no pode estar somente baseada nos POPs e aes corretivas e preventivas cabveis. O conhecimento aprofundado do processo e seu controle direcionado de forma a melhorar a qualidade dos processos e consequentemente dos produtos (Gnoth et al. 2007). Os PCC so pontos em que o controle pode ser aplicado e essencial para prevenir ou eliminar um perigo para qualidade farmacutica, ou reduzi-la a um nvel aceitvel. Um PCC no sistema HACCP pode ser mais facilmente determinado pela utilizao de uma rvore de deciso como exemplificado na figura 3.1 o que facilita uma abordagem lgica. A maneira que uma rvore de deciso usada depende da complexidade da operao, por exemplo, embalagem, produo, reprocessamento, armazenamento, distribuio, em qualquer um destes casos um treinamento prvio no seu emprego condio fundamental. Se um perigo tiver sido identificado em uma fase em que o controle necessrio para a segurana da mesma, e nenhuma medida de controle existir nessa etapa, o produto ou o processo deve ser modificado neste ponto, ou em uma fase mais adiante, de modo a permitir que uma medida de controle seja assegurada para o processo (WHO, 2007; Brown, 2010; WHO, 2010). Por meio de anlise criteriosa de cada etapa dos ensaios metodolgicos propostos, foram determinados pontos que podem ameaar a qualidade do produto. Assim sendo, os PCC alm de serem identificados, foram estabelecidos os limites crticos dos mesmos, baseados em informaes previas de outros processos similares. Tais pontos podero ser validados futuramente quando uma metodologia alternativa for implementada. De qualquer forma, os pontos crticos elencados devem ser monitorados para se garantir que eles fiquem dentro dos limites recomendados, caso contrrio aes corretivas sero necessrias e os desvios registrados nos documentos formais de no conformidade (WHO, 2007; Brown, 2010; WHO, 2010). Neste trabalho, so considerados como Pontos de Controle (PC) os pontos ou etapas que afetam a qualidade do produto ou desempenho do processo, mas que podem ser controlados prioritariamente por programas e procedimentos pr-requisitos (BPF, BPL). Com base nestes pontos, e a partir do auxlio da rvore de deciso exemplificada na figura 3.1 os PCC de cada ensaio foram identificados como visto nas tabelas 4.4, 4.5 e 4.6.

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Tabela 4.4: Determinao dos PCCs no ensaio de Dot Blot radioativo. Etapa do processo Perigos significativos Contaminao cruzada A temperatura de 95C no atingida A temperatura de 95C no uniforme em todo termobloco Preparo de reagentes Material do termobloco fora da especificao Uso de membranas fora da especificao A fixao no ocorre Preparo de reagentes No h de ligao entre os dDTPs e -dATP32 Decaimento radioativo Contaminao pessoal Coluna de purificao fora da especificao (tipo e beads) Contaminao cruzada Preparo de reagentes Volume fora da especificao Volume fora de especificao No ocorrncia de hibridizao Preparo de reagentes Soluo de hibridizao Filme de raio-X Quarto escuro e montagem do cassete Armazenamento do cassete Preparo de reagentes Revelao Interpretao de dados Limite crtico P1 No Sim Sim Sim No Sim No Sim Sim Sim Sim Sim No Sim No Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim P2 No No No Sim No No No No No No Sim No No No No No No No No P3 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim No Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim P4 No No No No No No No No No No No No No No No No Sim PCC PC PCC1 PCC2 PCC3 PC PC PC PCC4 PCC5 PCC6 PCC7 PCC8 PC PCC9 PC PC PCC10 PCC11 PCC12 PCC13 PCC14 PCC15 PCC16 PC

Desnaturao do DNA no preparo da sonda

Temperatura 95oC

Fixao do DNA membrana de nylon Marcao da sonda Purificao Extrao de DNA de clula hospedeira na IFA Pr-hibridizao e Hibridizao

Exposio UV por 3 Monitoramento contnuo com Geiger Coluna Sephadex G-25 Definido aps a validao do ensaio

Temperatura do forno de hibridizao 80C

Revelao

Temperatura -70oC, 2 a 5 dias

Anlise de resultados

Pergunta 1 (P1): Existem medidas preventivas para identificar o perigo? Pergunta 2 (P2): Esta etapa elimina ou reduz a probabilidade de ocorrncia do risco? Pergunta 3 (P3): O risco identificado pode aumentar a nveis inaceitveis? Pergunta 4 (P4): As etapas posteriores podem eliminar o risco ou reduzi-lo a nveis aceitveis? IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo; dDTPs: Desoxirribonucleotdeos Trifosfatados; -dATP32: Adenosina trifosfato marcado com fsforo 32

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Tabela 4.5: Determinao dos PCCs no ensaio de qPCR. Etapa do processo Extrao de DNA de clula hospedeira na IFA Preparo do Mix Master da reao Perigos Contaminao cruzada Volume fora de especificao Utilizao de volumes de primers e sondas incorretos Contaminao cruzada Troca da soluo de DNA-estoque com DNAtrabalho Volume fora de especificao Degradao do DNA Contaminao cruzada Interferncia na leitura Troca das posies corretas de amostras e controles na placa Inverso da posio da placa Degradao de primers, Taq e sondas Interferncia da leitura ptica Interpretao de dados Limite crtico (1ml cultivo 50 ng DNA). Limite de deteco: 10 fg P1 Sim Sim Sim No No Sim Sim No Sim No Definido aps a validao do ensaio No Sim Sim Sim P2 No No Sim No No No No No No P3 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim P4 Sim Sim No No No No No Sim PCC PC PC PCC1 Definido aps a validao do ensaio PC PC PCC2 PCC3 PC PCC4 PC PC PCC5 PCC6 PC

Preparo das diluies seriadas do DNA controle e preparo da curva padro

Armazenamento do DNA de -20 oC a 80oC; outros definidos aps a validao do ensaio

PCR em tempo real

Anlise de resultados

Definido aps a validao do ensaio

Pergunta 1 (P1): Existem medidas preventivas para identificar o perigo? Pergunta 2 (P2): Esta etapa elimina ou reduz a probabilidade de ocorrncia do risco? Pergunta 3 (P3): O risco identificado pode aumentar a nveis inaceitveis? Pergunta 4 (P4): As etapas posteriores podem eliminar o risco ou reduzi-lo a nveis aceitveis? IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo

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Tabela 4.6: Determinao dos PCCs no ensaio Threshold. Etapa do processo Extrao de DNA de clula hospedeira na IFA Espectrofotometria Perigos Contaminao cruzada Volume fora de especificao Preparo de solues Diluio das amostras Leituras incorretas Preparo de solues Volume fora de especificao No ocorrncia da corrida eletrofortica ou perda das amostras no gel Volume de Labeling Reagente (reagente marcador) fora de especificao A temperatura de 105C no atingida A temperatura de 105C no uniforme em todo termobloco Material do termobloco fora da especificao Troca das posies corretas de amostras nos sticks No ocorrncia de reao cataltica Alterao na programao padro para a reao Contaminao cruzada No so formados os complexos enzimticos na membrana do stick Incubao incorreta das amostras Interpretao de dados Limite crtico (1ml cultivo 50 ng DNA). Limite de deteco: 2 pg TA230/260 entre 0,4 e 0,5; TA260/280 1,8 e TA260 desnat/260 no desnat 1,35 Agarose 0,8 a 1,2% tempo e voltagem devem ser validados P1 No No No Sim No No No Sim Sim pH 6,88,0; fora inica 100300 mM; [DNA]400 pg/mL; Volume da amostra=500 mL temperatura de desnaturao do DNA=105oC; outros definidos aps a validao do ensaio Sim Sim No No No No No No Sim Definido aps a validao do ensaio Sim P2 No Sim No No No No No P3 Sim No Sim Sim Sim Sim Sim P4 No No No No No Sim PCC PC PC PC PCC1 PC PC PC PC PCC2 PCC3 PCC4 PC PC PC PC1 PC PC PCC5 PC

Eletroforese

Quantificao de DNA na IFA

Anlise de resultados

Pergunta 1 (P1): Existem medidas preventivas para identificar o perigo? Pergunta 2 (P2): Esta etapa elimina ou reduz a probabilidade de ocorrncia do risco? Pergunta 3 (P3): O risco identificado pode aumentar a nveis inaceitveis? Pergunta 4 (P4): As etapas posteriores podem eliminar o risco ou reduzi-lo a nveis aceitveis? IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo; TA: taxa de absoro; Desnat: desnaturado.

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4.4 Ensaios alternativos para quantificao de DCH As preocupaes tericas sobre DNA contaminante como um risco para a sade surgiram desde meados da dcada de 1950. A necessidade de produzir grandes quantidades de vacina viral, fez com que a FDA focasse sobre este tpico. O cultivo de clulas que proliferam continuamente parecia ser um substrato ideal para a produo de vacinas, mas compartilha vrias caractersticas crticas com as clulas cancerosas. A caracterstica mais alarmante compartilhada foi a formao de tumores aps a injeo das clulas em um animal adequado. Alm disso, verificou-se o potencial que as linhagens celulares possuem de serem infectadas com vrus (Briggs e Panfili, 1991). Em contrapartida, isso acabou por ser uma preocupao vlida como evidenciada pela contaminao viral real de vrias vacinas (Hayflick, 1989 apud Briggs e Panfili, 1991). Ento, na dcada de 1950 a preocupao era um risco de segurana em medicamentos biolgicos devido a vrus e tumores de formao de agentes. A soluo adotada pela FDA em 1962 foi testar e controlar em nvel de substrato celular. As culturas de clulas primrias podiam ser utilizadas para cultivar o vrus da vacina, com exceo das estirpes de clulas diplides e as linhagens celulares contnuas. Contudo, essas restries foram gradualmente reduzidas. Esse relaxamento no representou uma diminuio da preocupao da FDA acerca de impurezas potencialmente oncognicas. As causas dos tumores so agora mais bem compreendidas, incluindo o fato de que os oncogenes podem estar presentes no genoma de um indivduo (Lotfipour e Halladj-Nezhadi, 2012). Por isso, a principal preocupao com a contaminao de DNA que ela pode conter um oncogene ou fazer com que um oncogene seja ativado ou at mesmo desativar um gene inibidor de tumor. No entanto, aumentou-se a confiana de que os produtos podem ser purificados de uma forma adequada e a impureza, no caso a molcula de DNA, pode agora ser monitorizada diretamente (Briggs e Panfili, 1991). Vrios mtodos de purificao de DNA, tais como o tratamento de protease, a extrao orgnica, a extrao livre de fenol "Wako" (Wako Chemicals, www.wako-chem.co.jp/english) e a precipitao por etanol ou glicognio devem ser verificados para a sua adequao. Algumas diferenas entre os procedimentos de teste de DNA devem ser levadas em conta na interpretao de dados quantitativos (Wolter e Richter, 2005).

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A robustez do ensaio diferente para cada ensaio, especialmente no que diz respeito s substncias interferentes (Tabela 4.7). Segundo Mehta e Keer (2007), no geral, ensaios de hibridizao so mais robustos do que o Threshold, ou seja, sofrem menos influncia de substncias interferentes que possam estar nas amostras a serem testadas. Mehta e Keer (2007) demonstraram que em termos de alcance dinmico e o limite de deteco/sensibilidade, o qPCR supera todos os mtodos (Figura 4.13).

Figura 4.13: Representao esquemtica do alcance dinmico dos mtodos de quantificao de DNA. Thd: Threshold; g: micrograma; ng: nanograma; pg: picograma; fg: femtograma (Adaptado de Mehta e Keer, 2007).

O qPCR tem uma ampla faixa dinmica e uma sensibilidade muito elevada em comparao com os outros mtodos. O Threshold, por outro lado, tem um alcance dinmico menos abrangente, mas concebido para detectar quantidades baixas do alvo e, assim, adequado para anlise de trao de DCH. A amostragem do Threshold requer uma alquota de 500 L, enquanto que o qPCR requer apenas poucos microlitros de amostra para anlise. Dessa forma, a anlise Threshold pode fornecer uma estimativa mais precisa do DNA total presente de uma amostra por minimizar o efeito da variabilidade de amostragem no resultado de quantificao. Contudo a pequena alquota necessria pela qPCR possibilita menor manipulao da amostra, o que diminui o risco de contaminao e erro do analista. Em medio analtica, na prtica, mais comum considerar as incertezas associadas com elementos de desempenho do mtodo em geral, tais como preciso e tendncias de medida observveis em relao aos materiais de referncia apropriados. Estas contribuies geralmente formam as contribuies dominantes para a estimativa da incerteza, e so mais bem modeladas como efeitos separados sobre o resultado. Em seguida, necessrio avaliar outras possveis

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contribuies apenas para verificar sua significncia, quantificando apenas aqueles que so significativos (Eurochem/CITAC, 2012). Assim sendo, percebe-se a grande importncia de uma seleo criteriosa de um ensaio analtico que possa identificar e quantificar as possveis molculas de DNA de clulas hospedeiras em produtos derivados de biotecnologia como o IFN-2b. Vale lembrar que no h ainda uma exigncia oficial por parte da ANVISA delimitando o nvel de impureza para esses produtos, apenas uma solicitao que essa quantidade seja o mnimo possvel e as indstrias nacionais levem em conta os valores mnimos definidos pelas autoridades internacionais. Dessa forma, pela importncia do produto, IFN-2b, para Bio-Manguinhos buscaram-se ensaios analticos farmacopeicos que mantivessem a qualidade do produto de acordo com as normas internacionais. A partir disso, foram escolhidos para esse fim os ensaios de qPCR e Threshold. As ferramentas de anlise de risco, so exploradas de forma a melhorar o desempenho dos produtos e processos e com isto auxiliam na performance dos mesmos. Existem vrias formas para comparar e avaliar as caractersticas de desempenho dos mtodos analticos empregados para a quantificao de DCH como demonstrado pela tabela 5.7, pois tais elementos tambm so importantes para compor um processo de escolha. O entendimento profundo dos perigos associados s etapas de execuo dos mtodos analticos torna a escolha do ensaio mais completa, pois se passa a entender profundamente cada um deles e qual etapa possibilita o menor risco para a avaliao da qualidade do produto. Fato esse que est dentro do conceito do Design Space e que, consequentemente, traz maiores benefcios para a empresa em se tratando de aspectos regulatrios, uma vez que, com isso, o ente regulador passa a ser mais flexvel, pois percebe que a empresa consegue avaliar os perigos associados a seus processos e prev medidas para mitig-los ou mesmo, em alguns casos, para eliminar os perigos potenciais que poderiam ocorrer nos processos/produtos. Um aspecto importante a ser mencionado que a Gesto de Risco para a Qualidade, ainda no uma exigncia legal para os ensaios de controle de qualidade, porm a ANVISA j aponta tendncias de que o Design Space seja uma condio importante a ser definida para cada produto, desde a sua concepo ainda no seu desenvolvimento farmacutico, o que faz com que Bio-Manguinhos esteja um passo frente a estas futuras exigncias.

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Outro ponto a se destacar que este estudo indito dentro da rea de controle de qualidade farmacutica. No h nenhum trabalho na literatura que faa um estudo comparativo de ensaios analticos para controle de qualidade por meio de ferramentas de Anlise de Risco. Pode-se citar alguns trabalhos que fizeram uso de tais ferramentas para avaliar riscos em instrumentos mdicos (Jahnke e Khn, 2003), para auxiliar na escolha de um bioindicador (Eanso-Bourget, 2006), para integrao de tecnologias de processo de anlise, validao concorrente e programas de libertao paramtrica no processamento assptico (Korczynski, 2004), para analisar a contaminao de reas limpas (Ljungqvist e Reinmller, 1995) e para auxlio em monitoramento ambiental (Katayama et al., 2005 e Sandle, 2012), porm, nenhum com objetivos semelhantes a este trabalho.
Tabela 4.7: Caractersticas de desempenho dos mtodos de quantificao de DCH (Modificado de Wolter e Richter, 2005 e Mehta e Keer 2007).
Hibridizao Custo por teste Preo do equipamento Limite de deteco Vazo (incluindo controle das amostras) Dificuldade de utilizao Tempo/velocidade Mtodo industrial aceito Alcance dinmico (sensibilidade) Especificidade do analito ~R$1,50 ~R$29.400 10 ng Slot blot, tipicamente 72 poos No h kits de reagentes completos disponveis Pelo menos 48 h Menos utilizada 10 ng 2.500 ng DNA fs e fd Sequncia-especfica ou DNA total dependendo da sonda usada; sequncia randmica, espcieespecfica 50 ++ Threshold ~R$32 ~R$16.300 2 pg (ensaio DNA total) 8 poos/paleta, + de 4 paletas em uma corrida Todos os reagentes so fornecidos em kits Pelo menos 3 h Mais de 300 atualmente em uso na indstria biofarmacutica 2 200 pg DNA fs ou protena Sobretudo DNA total, mas alguns ensaios de sequnciaespecfica so disponveis; no espcie-especfica 600 + qPCR ~R$3-6 ~R$65.300 - ~R$392.000 10 fg (DNA bacteriano) 5 pg (DNA mamfero) 32 capilares, placa de 384 poos Todos os reagentes so fornecidos em kits; design e interpretao complexos De 2 a 3,5 h Usado em toda indstria biofarmacutica 10 fg 1 g, dependendo do genoma DNA fs e fd

Especificidade da sequncia

Especfico para uma sequncia alvo

Tam. mn. estimado do DNA (pb) para deteco Robustez substncias interferentes

150 +

R$: reais; ng: nanogramas; pg: pictogramas; fg: femtograma; h: horas; min: minutos; g: microgramas; fs: fita simples; fd: fita dupla; pb: pares de base.

A partir dos PCCs elencados nas duas metodologias avaliadas qPCR, e Threshold, juntamente com o dot-blot radioativo (ensaio padro realizado pelo cessor da transferncia de

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tecnologia) foi possvel montar uma comparao qualitativa do nmero de PCCs encontrados em cada metodologia como demostrado no quadro 4.1. Vrias foram as ferramentas de qualidade (fluxogramas, diagrama de Ishikawa) que deram suporte ferramenta primordial HACCP neste estudo, entendemos tambm que por ser um trabalho exploratrio, o HACCP foi adaptado para o nosso propsito uma vez que no temos dados analticos que possam suportar a aplicao da ferramenta na ntegra.
Quadro 4.1: Resumo dos pontos crticos de controle (PCC) para cada ensaio avaliado.

ENSAIO

PCCs
PCC2: Diluio das amostras PCC2: Volume de Labeling Reagente (reagente marcador) fora de especificao PCC3: A temperatura de 105C no atingida PCC4: A temperatura de 105C no uniforme em todo termobloco PCC5: Incubao incorreta das amostras PCC1: Utilizao de volumes de primers e sondas incorretos PCC2: Volume fora de especificao PCC3: Degradao do DNA PCC4: Interferncia na leitura PCC5: Degradao de primers, Taq e sondas PCC6: Interferncia da leitura ptica

ETAPA
Espectrofotomtetria

Threshold

Quantificao de DNA na IFA

Preparo do Mix Master da reao Preparo das diluies seriadas do DNA controle e preparo da curva padro PCR em tempo real

qPCR

PCC1: A temperatura de 95C no atingida Desnaturao do DNA no preparo da PCC2: A temperatura de 95C no uniforme em sonda todo termobloco PCC3: Preparo de reagentes PCC4: Preparo de reagentes Fixao do DNA membrana de nylon PCC5: No h de ligao entre os dDTPs e dATP32 Marcao da sonda PCC6: Decaimento radioativo PCC7: Contaminao pessoal Dot blot PCC8: Coluna de purificao fora da especificao Purificao (tipo e beads) PCC9: Preparo de reagentes Extrao de DNA PCC10: No ocorrncia de hibridizao Pr-hibridizao e Hibridizao PCC11: Preparo de reagentes PCC12: Filme de raio-X PCC13: Quarto escuro e montagem do cassete Revelao PCC14: Preparo de reagentes PCC15: Armazenamento do cassete PCC16: Revelao IFA: Ingrediente Farmacutico Ativo; dDTPs: Desoxirribonucleotdeos Trifosfatados; -dATP32: Adenosina trifosfato marcado com fsforo 32; Tam. mn.: tamanho mnimo

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Bonan e colaboradores (2009) destacam que com o mtodo HACCP, os perigos so detectados por um processo de monitoramento e so corrigidos com aes definidas. Esta abordagem destaca os pontos fortes e os pontos fracos do processo. Analisando o quadro 4.1, que resume os PCC de cada ensaio, verifica-se que o ensaio realizado pelo cessor da transferncia de tecnologia, o dot-blot radioativo, o ensaio que apresenta maior nmero de PCC, 16 no total. Logo aps ele vem o qPCR com 6 PCC seguido do Threshold com 5 PCC. Interessante nesta anlise comparativa a diferena dos PCC entre o dot-blot e os outros ensaios alternativos. Talvez esta relao esteja relacionada com a capacidade de deteco ou mesmo pela sensibilidade das metodologias, lembrando que o dotblot radioativo um ensaio semi-quantitativo. O qPCR apresenta aproximadamente 63% a menos de PCC que o dot-blot e o Threshold em torno de 69% a menos. Algo notvel ao se lembrar de que alm de menor nmero de pontos crticos de controle, ambos os ensaios alternativos estudados fornecem resultados quantitativos, diferentemente do dot-blot. Assim, verifica-se que alm de mais sensveis o qPCR e o Threshold demonstram tambm serem mais seguros para a verificao da qualidade do IFN-2b. Mehta e Keer em seu trabalho de 2007 comentam que as caractersticas de desempenho so extremamente importantes na influncia para deciso de um laboratrio estabelecer e implementar um mtodo em particular e que um grande nmero de fatores influenciam a escolha da metodologia analtica incluindo custo, rendimento, confiana regulatria e sensibilidade. Os autores classificaram nove fatores, pesquisados por vrios laboratrios, em ordem de importncia (Figura 4.14). Pode-se verificar pela figura 4.14 que a confiabilidade considerada o fator mais importante da escolha da metodologia analtica, seguido da conformidade regulatria e da sensibilidade.

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Importncia dos fatores de influncia na escolha do mtodo analtico

Confiabilidade Conformidade regulatria Sensibilidade Aceitao como mtodo industrial
Facilidade de uso Rendimento Preo por teste Flexibilidade analtica Custo de equipamento

8 7 7 5 5 4 4 2,5 2 0 2 4 6 8

Importncia

Figura 4.14: Grfico representativo da importncia dos fatores que influenciam na escolha de uma metodologia analtica para quantificao de DCH (Mehta e Keer, 2007).

Pela pesquisa acima, ao se confrontar o qPCR com o Threshold pode-se dizer que tanto um quanto o outro possuem sensibilidade para detectar o limite de 100 pg/dose teraputica de DNA aceitvel pela FDA. Ambos so previstos pela farmacopeia americana (2009) como ensaios propcios para quantificao de DNA, logo a conformidade regulatria a mesma. Resta, ento, o fator mais importante que a confiabilidade. Pelos resultados deste trabalho foi visto que o qPCR apresentou seis PCC, enquanto que o Threshold apresentou cinco. A maioria dos PCC do Threshold esto presentes apenas em uma fase (quatro), a quantificao na estao de trabalho (equipamento), enquanto que os PCC do qPCR esto distribudos em trs etapas, possuindo ambos ensaios cinco etapas (quadro 4.1, tabelas 4.5 e 4.6). O fato de que a maioria dos PCCs no Threshold concentrarem-se em uma nica etapa pode representar uma criticidade tal que as medidas de mitigao podem no minimizar os perigos e riscos associados ao equipamento, tais medidas de mitigao refletem a qualificao do projeto, desempenho e instalao, o que em nosso entendimento compete ao fabricante do equipamento, porm a qualificao de operao precisa ser demonstrada no local de operao. Com isso, pode-se dizer tambm que nesta etapa fundamental garantir a desnaturao do DNA e a robustez do equipamento precisa responder ao quesito. Um dado no demostrado neste trabalho que o equipamento Threshold adquirido por Bio-Manguinhos possui problemas tcnicos especficos no termobloco que no esto garantindo sua qualificao de operao.

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Alm disso, vale analisar alguns pontos a se considerar para a comparao entre esses ensaios: 1. Ambos apresentam kits comerciais disponveis; 2. Ambos apresentam assistncia tcnica; 3. Apesar do Threshold apresentar um PCC a menos que o qPCR, a maioria deles est em uma mesma etapa. Em relao ao primeiro ponto, ambos se equivalem, pois como h kits comerciais disponveis no mercado, o fornecimento de matrias-primas para a operao dos mesmos no problema uma vez que existem fornecedores qualificados para este fim. Semelhante ao primeiro ponto, no segundo, os dois ensaios tambm se equivalem, pois as prprias empresas fabricantes dos equipamentos disponibilizam o servio. Contudo, a qualificao e a validao do equipamento so fundamentais neste caso (dado no demonstrado), isto est sendo, por enquanto, um problema para o uso do Threshold. J o terceiro ponto o ponto principal. Essa situao avaliada para o Threshold demonstra que esta nica etapa, na qual se encontram todos os PCC, extremamente crtica no processo e dependente da performance do equipamento que, como dito anteriormente, no vem apresentando resultado satisfatrio. Por outro lado, o qPCR apresenta maior sensibilidade aliada ao domnio maior da tcnica. Mais um fato visto que serve de comparao que, mesmo o Threshold apresentando menos PCC que o qPCR, o ensaio apresenta mais perigos no total, 19 contra 14 (tabelas 4.2 e 4.3). Ento, levando-se em conta a anlise realizada entre ambos ensaios alternativos ao dotblot radioativo, aliados ao volume de amostra, caractersticas de desempenho dos mtodos (custo por teste, limite de deteco, vazo de amostras e sensibilidade) principalmente considerando-se os perigos identificados, o qPCR apresenta maior confiabilidade, segurana e reprodutibilidade que o Threshold no que diz respeito quantificao de DNA em alfainterferona 2b.

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5 CONCLUSO
O presente estudo demonstrou o interesse da aplicao das ideias da Gesto de Risco para a Qualidade na escolha de um ensaio para quantificar o DNA de clula hospedeira no produto intermedirio Alfainterferon 2b. Esse modelo pode tambm ser aplicado em outros laboratrios de Bio-Manguinhos fora do Departamento de Controle de qualidade. O uso da ferramenta HACCP demonstrou ser eficiente para se estabelecer os pontos crticos de controles que serviram de base para comparao entre os ensaios analticos estudados. O HACCP um mtodo preciso que destaca questes e explica um processo complexo em detalhe. Este mtodo til para focar as etapas de produo e processo, o que pode ter uma influncia crtica sobre a qualidade do produto. Com o mtodo HACCP, podemse concentrar os recursos limitados sobre os pontos crticos identificados. Por fim, a anlise de risco tambm fornece uma reviso dos dados documentados, tais como procedimentos operacionais padro, de produo e de protocolos check-up. Foram levadas em considerao as normativas nacionais e internacionais que fizeram com que os ensaios escolhidos para avaliao de um mtodo alternativo para o dot-blot radioativo na quantificao de DNA de clula hospedeira fossem o qPCR e o Threshold e a partir da anlise dos perigos em seus processos pelo uso do HACCP conclui-se que a metodologia analtica alternativa melhor avaliada para a questo proposta o qPCR, principalmente pela facilidade de manipulao e performance do equipamento. Neste tipo de anlise, o local de instalao dos equipamentos e a qualificao dos mesmos passam por anlises que podem ser um diferencial que somados aos pontos crticos elencados definem uma metodologia, um investimento no s em equipamento permanente como em treinamento de recursos humanos. Esse tipo de anlise prvia, em se tratando de metodologias analticas, na qual h uma compreenso detalhada de determinado ensaio, de grande auxlio para avaliar, aprimorar, controlar e escolher o mesmo, alm de possibilitar e facilitar uma melhor busca de causas raiz no que se diz respeito aos possveis perigos e danos.

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O modelo proposto nesse estudo se insere na otimizao dos processos produtivos atravs do controle da qualidade de produtos intermedirios, reduo de custos e a implantao de processos de melhoria contnua para certificao da qualidade, segurana e eficcia dos imunobiolgicos produzidos em Bio-Manguinhos atravs da inovao, implantao e manuteno das diretrizes nacionais e internacionais que prev a Anlise de Risco como ferramenta de melhora contnua no ciclo de vida dos produtos. 5.1 Perspectivas e trabalhos futuros Validar o qPCR para quantificao de traos de DNA para o biofrmaco alfainterferona 2b, tornando-se o padro ouro. Qualificar o equipamento Threshold, para que possa ser empregado em outras quantificaes de amostras principalmente as de processo. Introduzir os conceitos e ideias do uso de ferramentas de Anlise de Risco para validao de metodologias analticas e com isto dar uma maior abrangncia ao Programa de Gesto de Risco para Qualidade de Bio-Manguinhos. Difundir este trabalho em outros laboratrios de Bio-Manguinhos para sensibilizar que ferramentas de anlise de risco podem auxiliar a qualificao de equipamentos e com isto, mostrar o potencial do HACCP com uma ferramenta factvel e que pode ser melhor explorada para este fim.

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6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.
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