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Identificación y caracterización parcial del gen de la enzima

profenoloxidasa en Dactylopius coccus

Fernando García, Patricia Aguilar, Ana Beatriz Celma,

Humberto Lanz, Ignacio del Río y Fidel Hernández

Resumen

La profenoloxidasa (proFO) es la enzima clave de la ruta bioquímica de la fenoloxidasa, la cual

es responsable de activar varios mecanismos de defensa de los invertebrados, tanto para evitar
la entrada de microorganismos invasores, como para realizar la coagulación y cierre de heridas.
En este trabajo se obtuvo la secuencia parcial del gen de la proFO del insecto Dactylopius
coccus o grana fina del nopal, la cual presentó alto grado de homología con la enzima de
dípteros. Por otra parte, se observó que el RNA mensajero (RNAm) de la proFO se expresa en las
ninfas de primer y segundo estadio, así como en las hembras oviplenas del insecto.

Introducción melanina (Ashida y Brey, 1995); b) encapsulación y

En los insectos, el sistema de la profenoloxidasa es
un mecanismo regulador del sistema inmune cuya
activación depende de reacciones en cascada en
las que participan enzimas tipo serina proteasas,
las cuales son activadas por la presencia de compo-
nentes micóticos y bacterianos como los lipopoli-
sacáridos (LPS) y β1-3 glucanos (Zymosan). La acti-
vación del sistema de la fenoloxidasa desencade-
na mecanismos de defensa de la integridad corporal
del insecto, incluyendo la síntesis de melanina, polí-
mero capaz de recubrir el cuerpo de organismos
invasores y de participar en el cierre de heridas,
entre otras funciones.
La melanización consiste en una serie de reaccio-
nes que se inician con la hidroxilación de tirosina
para formar L-hidroxifenilalanina (L-DOPA) la cual,
a su vez, se oxida y da lugar a diferentes compues-
tos llamados dopacromos, y éstos, por su parte,
producen indolquinonas que se polimerizan y for-
man la melanina como producto final (Söderhall e
Iwanaga, 1996). La molécula clave en esta ruta es
la proFO, la cual es una enzima bifuncional que
posee actividad de oxidoreductasa y de mono-
oxigenasa y presenta, además, dos sitios de unión
al cobre. La proFO está asociada a tres procesos
fisiológicos diferentes pero interrelacionados: a)
endurecimiento de la exocutícula, proceso donde
se añaden a esta estructura las moléculas quitina y
melanización de microorganismos extraños, reac-
ciones que forman estructuras que inmovilizan
microorganismos invasores, y c) la producción de
quinonas citotóxicas, compuestos capaces de ma-
tar agentes infecciosos (Sugumaran y Nellaiappan,
1991).
El sistema inmune de la grana fina (Dactylopius
coccus Costa) –insecto parásito del nopal que se cul-
tiva para obtener ácido carmínico (colorante rojo
de uso comercial) (Llanderal y Nieto, 1999)– ha sido
poco estudiado. Las células originadas en el cuer-
po graso de esta especie son portadoras de gránu-
los de ácido carmínico (Maza, 1999), y cuando en-
tran en contacto con azúcares propios de la pared
celular bacteriana y de hongos –como el zymosan
y la laminarina, entre otros–, se produce degranu-
lación y ennegrecimiento del pigmento de los grá-
nulos, lo que sugiere una reacción similar a la
melanización, la cual podría depender de la ruta
de la fenoloxidasa. También se ha observado que
cuando a la hemolinfa (HL) de D. coccus se le agre-
gan zymosan o péptidoglicanos, se presenta cierto
consumo de carmín durante la reacción. Por otra
parte, en la HL tratada con feniltiourea (FTU), un
inhibidor específico de la proFO, se inhibe el con-
sumo de carmín y no ocurre obscurecimiento de la
HL, esto sugiere que el carmín podría ser meta-
bolizado por la proFO (García, Lanz, Rojas y
Hernández, 2002).

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Objetivo

La finalidad de este trabajo es identificar y secuenciar el gen de la proFO de la grana fina Dactylopius coccus,
así como analizar su expresión en diferentes estadios del ciclo de vida de este insecto.

Metodología

Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compa-
ñías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems. Los reactivos para electroforesis
provinieron de Gibco-BRL (Life Technologies).

Insectos. Se utilizaron insectos de la especie D. coccus cultivados en módulos de experimentación tipo cober-
tizo, ubicados en Coyotepec, Oaxaca, en terrenos de la compañía productora de grana Tlapanochestli.

Obtención de DNA genómico y amplificación de un fragmento de proFO. Para extraer el DNA de D. coccus
se utilizaron tres hembras adultas oviplenas. El tejido que se obtuvo fue homogenizado en un tubo de
microcentrífuga con 700 µl de DNAzol (Life Technologies, Rockville, Maryland) Las muestras fueron
centrifugadas a 4,000 x g durante 10 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante (fase viscosa) y se agregaron
0.5 vol de etanol absoluto para precipitar el DNA. Posteriormente, se centrifugaron a 4,000 x g durante 3 min
a 4 °C. La pastilla recuperada se lavó dos veces con etanol a 75% y se resuspendió en 100 µl de NaOH 8 mM
(Ausubel et al., 1989).

Un fragmento del gen de la proFO fue amplificado por PCR usando iniciadores degenerados (amplifican un
dominio fuertemente conservado de la proFO en dípteros) usados previamente en Anopheles gambiae (Müller,
Dimopoulos, Blass y Kafatos, 1999):

PO-CuA 2.5mM

(5'CAICA(TC)TGGCA(TC)TGGCA(TC)CTIGT(GATC)TA(TC)CC-3')

PO-CuB 2.5 mM

(5'-CITGCCAAICG(AG)TA(AG)AAIAA(ACT)CG)GG(AG)TCIC(TG)CAT3')

Las reacciones se obtuvieron mediante 25 ciclos de 2 min a 94 °C, 1.5 min a 50 °C y 1 min a 72 °C. Las
reacciones de PCR incluyeron 0.2 U de TaqPolimerasa, d´NTPs 10 mM, MgCl2 2.5 mM y se llevaron a cabo en
un termociclador PE-2400.

Los fragmentos de DNA obtenidos por PCR se analizaron a través de electroforesis en geles de agarosa (Gibco-
BRL) a 1.5%, en amortiguador Tris-acetato-EDTA (TAE 1X: tris-acetatos 40 mM, EDTA 1 mM pH 8.0), como
marcador de tamaño molecular se utilizó una escalera de moléculas de DNA en múltiplos de 100 pb.

Análisis de expresión por RT-PCR. La expresión del gen de la proFO en los diferentes estadios del ciclo de vida
de D. coccus fue examinado mediante transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR).
Para esta prueba, el RNA total de ninfas de primer estadio, ninfas de segundo estadio y hembras adultas fue
purificado usando TrizolMR (Life Technologies, Rockville, Maryland). Se utilizó un microgramo de RNA para
sintetizar cDNA, para la cual sirvió como iniciador oligo(dT17), también se usó la enzima SUPERSCRIPT IIMR
(purificada de E. coli recombinante que contenía el gen de la retrotranscriptasa del virus de leucemia murina).

La amplificación de la secuencia de la proFO se hizo con los oligos PO-CuA y POCuB con el cDNA de D. coccus,
como se mencionó anteriormente. Para controlar el experimento de RT-PCR se usó el gen de actina, conside-
rado de expresión constante. Para la amplificación de la actina se utilizaron los iniciadores:

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ActFOR 5´- ACATGGAAAATCTGTGCACCACA-3´ y

ActREV 5´- ACAGCTTTTCTTTGATGTCGCGAA -3´

que amplifican un fragmento de actina de Anopheles albimanus. La amplificación se realizó a través de 28 ciclos
de 3 min a 94 °C, 1 min a 50 °C y 2 min a 72 °C (oligos amablemente donados por el D. en C. J. Martínez
Barnetche).

Secuenciación de los fragmentos de cDNA y DNA genómico amplificados. Los productos amplificados que
presentaron el tamaño esperado fueron purificados y clonados mediante el sistema TA CloningMR (Invitrogen),
de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los fragmentos de DNA de las clonas obtenidas se secuenciaron
con el método de amplificación por PCR en presencia de dideoxinucleótidos como terminadores de la reacción
(Big DyeMR Applied Biosystems). Como iniciadores de la reacción de secuenciación se usaron los oligonucleótidos
M13 (forward y reverse). Las reacciones fueron analizadas con el secuenciador automático ABI-PRISMMR (PE
Biosystems).

Análisis de secuencias. Las secuencias de DNA obtenidas se tradujeron en los marcos de lectura posibles por
medio del programa Sixframe, y las secuencias de DNA y productos de traducción deducidos se compararon
con las secuencias almacenadas en los bancos de datos GenBank Invertebrates y Swissprot mediante los pro-
gramas BlastX y BlastN. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las clonas (proFO 900 y proFO
680) de D. coccus se hizo utilizando el programa de alineamiento múltiple CLUSTALW (Múltiple Sequence
Alignment). Basados en las similitudes de secuencia entre las proFO, se construyeron árboles filogenéticos
utilizando el programa PHYLIP (Felsenstein, 1993). Estos programas y bases de datos se encuentran dispo-
nibles en los portales de internet del National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://
ncbi.nlm.nih.gov y San Diego Supercomputing Center (SDSC) http:// workbench.sdsc.edu.

Resultados Figura 1. Amplificación por PCR de la proFO de D.coccus a partir

de DNA genómico

Amplificación y análisis de un fragmento de la proFO

de D. coccus. A partir del DNA genómico de D.
coccus, se amplificó un fragmento de aproxima-
damente 900 pb (proFO-900) de la enzima PROFO
(Figura 1). Por otra parte, utilizando el cDNA de
D. coccus como molde, se obtuvo un producto de
680 pb (proFO-680) (Figura 5). Los dos fragmentos
fueron secuenciados.

Ambas amplificaciones poseen un marco de lectu-

ra abierto (ORF) que puede codificar para un seg-
mento de proteína de 295 aminoácidos (Figura 2).
El amplificado proFO-900 mostró, además, una se-
cuencia no codificante de 165 pb (Figura 4). Al com-
parar la proFO de D. coccus con las bases de datos
de invertebrados, se observó que posee una
homología de 23.6% con la proFO-A1 de Drosophila
melanogaster (Fujimoto et al., 1995); 21.1% con la
proFO-2 de Bombyx mori (Ashida et al., 1998); 35.3%
con la proFO-2 de hemocitos de larvas de Sarcophaga
bullata (Chase, Raina, Bruno y Sugumaran, 2000), y
18% con la proFO-8 de Anopheles gambiae (Müller
et al., 1999).
El DNA genómico de D. coccus fue usado como molde para ampli-
ficar mediante PCR un fragmento de la proFO, para la cual se uti-
lizaron los oligos PO-CuA y PO-CuB del modo descrito en el apar-
tado de Metodología. Carril 1: escalera de moléculas de DNA en
múltiplos de 100 pb, utilizada como marcador de tamaño molecular.
Carril 2: amplificación en la cual se usó como molde DNA genómico
de D. coccus. Carril 3: reacción de control negativo de PCR, carente
de DNA molde. Las muestras fueron analizadas en un gel de agarosa
a 1.5% preparado en amortiguador TAE 1X.

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La secuencia de la proFO de D. coccus mostró características típicas de las proFO descritas: los residuos del
aminoácido 393 al aminoácido 418, que forman uno de los sitios de unión al cobre, son similares, en especial
las posiciones para los residuos metionina-arginina-ác. aspártico y prolina, que están conservados en las cua-
tro especies de insectos descritas anteriormente (Figura 2) (Chase et al., 2000). Al generar el árbol filogenético
mediante el programa PHYLIP, la proFO de D. coccus fue agrupada próxima a la proFO de S. bullata en una
rama independiente a las otras proFO (Figura 3).

Figura 2. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de proFO de diferentes insectos

La secuencia de aminoácidos deducida de las clonas proFO de D. coccus se alineó, mediante el programa CLUSTAL W, con las proFOs indicadas
de B. mori, An. gambiae, S. bullata y D. melanogaster. Los números señalados sobre los alineamientos corresponden a la numeración de
aminoácidos de la proFO de S. bullata tomada como referencia. = indica el sitio de unión al cobre; * = residuos idénticos; := grupos
fuertemente conservados; .= grupos débilmente conservados.. —— = “Gap” entre las secuencias.

Figura 3. Relaciones de parentesco entre las proFOs de diferentes insectos

Los alineamientos entre las proFOs de insectos fueron procesados mediante el paquete de programas PHYLIP para generar un árbol filogenético.

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Figura 4. Secuencia del producto proFO-900 de D. coccus

Las letras subrayadas indican la presencia de un probable intrón; las letras en tono claro, codones que bloquean el marco de lectura.

Figura 5. Expresión de la proFO en los diferentes estadios del ciclo de vida de D. coccus

El cDNA de ninfas I y II y hembras adultas oviplenas de D. coccus se usó como molde para amplificar a través de PCR un fragmento de la proFO,
para lo cual se utilizaron los oligos PO-CuA y PO-CuB del modo descrito en el apartado de Metodología. Como control de calidad del cDNA,
se amplificó el gen de actina. Las muestras fueron analizadas en un gel de agarosa a 1.5% preparado en amortiguador TAE 1X.

Análisis de expresión de la proFO de D. coccus. Para conocer la expresión del gen proFO-680 en diferentes
estadios del ciclo de vida de D. coccus, se preparó cDNA de ninfa I, ninfa Il y hembras adultas, y esto se ampli-
ficó por PCR. El fragmento amplificado fue del tamaño esperado (680 pb) en todos los casos, aunque con
diferente intensidad (Figura 5). Como control de calidad del cDNA, se usaron oligonucleótidos que amplifican
el gen de actina considerado de expresión constante (Figura 5).

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Discusión
En este trabajo se identificó, a través de la amplifica-
ción por PCR y secuencia del producto, la presencia
de un gen que codifica para la proFO de D. coccus.
El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida
de proFO-680 mostró identidad de 17-43% con las
proFOs descritas para B. mori, An. gambiae, S. bullata
y D. melanogaster. La secuencia de proFO-900, am-
plificada a partir de DNA genómico, mostró la mis-
ma identidad de los genes de proFO de las especies
de insectos mencionados anteriormente. Sin embar-
go, el tamaño de proFO fue mayor en comparación
con la secuencia obtenida a partir de cDNA, lo cual
indicó la existencia de un intrón, éste fue localiza-
do y, a la manera típica, presentó codones de paro
(Figura 4).
Las proFO descritas son moléculas con regiones con-
servadas evolutivamente. La proFO descrita en este
trabajo mostró características comunes de proFO,
incluyendo la presencia de residuos de aminoácidos
conservados en el sitio de unión al cobre, además
de otras dos posiciones conservadas hacia el extre-
mo C- terminal. Estos residuos se conservan princi-
palmente en las proFO de diversos dípteros (Chase
et al., 2002; Müller et al., 1999; Jiang et al., 1997;
Ashida et al., 1998 y Hall et al., 1995).
La proFO se expresó en los estadios analizados del
ciclo de vida de D. coccus, aunque mostró intensi-
dades diferentes en las fases de ninfa I y II respecto
al control de actina, lo que sugiere que la expresión
de este gen varía durante el ciclo de vida. Por otra
parte, dado que se sabe que las proFOs son una fa-
milia multigénica en todos los grupos de insectos
estudiados a la fecha, resulta difícil saber si la ex-
presión observada durante los diferentes estadios
correspondió a la de un solo gen o a la de varios.
Actualmente, trabajamos para obtener la secuencia
completa del gen de la proFO de D. coccus, con el fin
de estudiar sus funciones en el sistema inmune de
este insecto y, por otra parte, también investigamos
si esta enzima modifica al ácido carmínico.*
* Agradecemos el apoyo brindado por la Coordinación de Investi-
gación de la Universidad Simón Bolívar, del Laboratorio de Ento-
mología Molecular del Cinvestav-IPN y de la Fundación Tlapano-
chestli para la elaboración de este trabajo.
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