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Replicación de

Harry Alices-Villanueva, Ph.D.


Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Aguadilla
Replicación de

DNA James Watson & Francis Crick


• Descubrimiento de la DNA double helix

A. 1950’s
B. Rosalind Franklin – foto X-ray de DNA.
C. Watson and Crick – describieron la
molécula de DNA a partir de la data de
Franklin’s X-ray.

James Watson & Francis Crick James Watson & Francis Crick
Rosalyn Franklin

Rosalyn Franklin Pregunta:


• ¿Qué
Qué es DNA?
DNA?

Acido Deoxiribonúcleico
Núcleotido de DNA
(DNA) Grupo
Fosfato
• Está hecho de nucleó
nucleótidos (molécula de
DNA) en DNA doble hélice.
lice. O 5

• Nucleó
Nucleótido:
tido: O=P-O CH2
1. Grupo fosfato O
O
2. Azú
Azúcar de cinco carbonos
N
3. Base nitrogenada Base Nitrogenada
C4 C1 (A, G, C, or T)
• ~2 nm ancho Azú
Azúcar
(deoxiribosa)
deoxiribosa)
C3 C2
Deoxiribosa
DNA Double Helix
“Escalones”
Escalones”

Bases Nitrogena-
Nitrogena-
das (A,T,G or C)

Patas de la
escalera

Fosfato y
esqueleto
de Ribosa

DNA Doble Hélice


5 O 3 Bases Nitrogenadas
3 O
• PURINAS
P 5 P 1. Adenina (A)
5 O
1 G C 3
2 2. Guanina (G) AoG
4 4
2 1
3
O 5 • PIRIMIDINAS
P P
T A 3 3. Timina (T) o Uracilo (RNA)
5
O
4. Citosina (C) T, C o U
O
5
P 3 P

Bases Nitrogenadas Bases Nitrogenadas

AoG AoG

ToCoU ToCoU
PAREO DE BASES PAREO DE BASES
Par de # de enlaces Enlaces de Hidrógeno
Purinas Pirimidinas Bases (H-Bonds)
Adenina (A) Timina (T) A=T 2
G C
Guanina (G) Citosina (C) C G 3

3 H-bonds

G C T A
Regla de Chargaff Pregunta:
• Adenina debe parear con Timina • Si en una muestra de DNA hay 30%
• Guanina debe parear con Citosina Adenina,
Adenina ¿cuánta Citosina está
presente?
• Sus cantidades en una molécula de DNA
deben ser más o menos la misma.
misma.

T A G C

Respuesta: Pregunta:
• Habrá 20% de Citosina.
Citosina • ¿Cuá
Cuándo y donde toma lugar el
proceso bioquí
bioquímico llamado
Adenina (30%) = Timina (30%) replicació
replicación del DNA ?
Guanina (20%) = Citosina (20%)
(50%) = (50%)

Pregunta:
• ¿Cuá
Cuándo y donde toma lugar el
proceso bioquí
bioquímico llamado
replicació
replicación del DNA ?
¿Se acuerdan del ciclo celular?
Synthesis Phase (S phase)
• Fase S en interfase del ciclo celular.
¿Qué etapas debe envolver el
• Nucleos de eucariotes
Fase proceso de replicación o
La replicació
replicación del DNA S
ocurre en la fase S. sintesis de DNA..?
G1 interfase G2

Mitosis
-profase
-metafase
-anafase
-telofase

Replicación de DNA
Un mecanismo debe
existir para que la
hélice sea
originalmente
desenrrollada y
estabilizada a una
forma abierta para que
la sintesis pueda
proceder a lo largo de
ambas hebras.

Replicación de DNA Replicación de DNA


Mientras el Un iniciador o
desenrollamiento y primer de algún tipo
la subsecuente debe ser sintetizado
sintesis de DNA tal que la
proceden, la tensión
polimerización se
que se crea a
ambos extremos pueda lograr.
más abajo en la
hélice debe ser
relajada.
Replicación de DNA Replicación de DNA
Una vez que los Los primers de RNA
primers han sido deben ser
sintetizados, la removidos antes de
sintesis no procede completarse la
en la misma replicación. Los
dirección en ambas gaps
hebras ya que una temporeramente
va 5’  3’y la otra creados deben ser
3’ 5’. llenados con DNA.

Replicación de DNA Replicación del DNA


Los fragmentos de • Origenes de Replicació
Replicación
DNA deben ser 1. Replication Forks:
Forks cientos de regiones en
ligados (unidos) forma de Y de moléculas de DNA
unos a los otros. replicá
replicándose donde nuevas hebras están
formándose. 3’

5’ Molé
Molécula Parental de DNA
Tenedor de
Replicació
Replicación
Ligasa de DNA 3’

5’

Replicación del DNA


• Origenes de Replicació
Replicación
2. Burbujas de Replicació
Replicación:
a. Cientos de burbujas de
replicación (Eucariotes)
Eucariotes).
b. Un solo replication fork
(bacterias).
bacterias).
Burbujas Burbujas
Replicación del DNA
• Separació
Separación de Hebras:
Hebras
1. Helicasa:
Helicasa enzima que cataliza el
desenrollamiento y separación de las
hebras parentales del DNA rompiendo
enlaces de hídrogeno.

2. Single-
Single-Strand Binding Proteins (SSBP):
(SSBP)
proteínas que se enlazan y ayudan a
mantener las hebras separadas.

Replicación del DNA Replicación del DNA


• Separació
Separación de hebras:
hebras Primers:
• Primers:
3. Topoisomerasa:
Topoisomerasa enzima que alivia la 1. Primers de RNA:
RNA antes de que dos hebras
tensió
tensión en la molé
molécula de DNA permitiendo nuevas de DNA puedan ser formadas, deben
rotación. existir primers de RNA para que nuevos
nucleótidos sean añadidos por la DNA
Enzyme Enzyme
Polymerase.
Polymerase

2. Primasa:
Primasa enzima que polimeriza
(sintetiza) el primer de RNA.
DNA

Primers Replicación de DNA


• Síntesis de dos nuevas hebras de DNA:

1. DNA Polymerase:
Polymerase con el primer de RNA en
sitio, la DNA Polimerasa (enzima) cataliza
la sintesis de una nueva hebra de DNA en
la direcció
dirección 5’ a 3’
3’.

5’ 3’

Primer
5’
DNA Polimerasa de RNA
Nucleó
Nucleótido
Recuerden!!!! 5 O Recuerden!!!!! 3
Grupo
Fosfato
3 O
O P 5 P
5 5
O=P-O CH2 O
1 G C 3
2
O 4 4
O 3
2 1
O 5
N P P
Bases Nitorgenadas 5
T A 3

C4 C1 (A, G, C, or T) O

Azú
Azúcar O
5
(deoxiribosa)
deoxiribosa) P
P 3
C3 C2

Hipótesis sobre Replicación de DNA Tres posibles modelos de replicación de DNA

Semiconservativa

Conservativa

Dispersiva

Matthew.S. Meselson y
Replicación de DNA
Franklin.W. Stahl
• Semi-conservativa = cada hebra original de
DNA es un patrón para la nueva hebra
complementaria a la original
• Meselson y Stahl demostraron que la nueva
molecula de DNA sintetizada constaba de
una hebra original (no radioactiva) y de una
nueva hebra (radioactiva) cuando la sintesis
procedía en medio conteniendo nitrogeno
radioactivo.
El Experimento El Experimento
• Crecieron E. coli en un medio de • La diferencia en peso se detectaba al
amonio (NH4+) como fuente de centrifugar. La densidad del DNA
nitrógeno para el DNA y proteínas. determinaba la posición donde se acumulaba
• Hay dos isotopos: 14N y 15N. en el tubo.
• Crecieron E. coli por varias • Entonces transfirieron células vivas que
generaciones en 15NH4+. Este DNA era habián estado creciendo en 15NH4+ a un
medio conteniendo solo 14NH4+ y permitieron
m’as pesado que el normal debido a los
que crecieran por una sola geenración.
‘atomos de 15N.

El Experimento El Experimento
• El DNA en la nueva generación de • Se les permite a las células crecer por
células era exactamente intermediario otra generación.
en densidad entre la generación previa • Resultado: mitad del DNA era normal
y la normal. (14N) y la otra mitad era intermediario
• Conclusión: mitad de los átomos de entre 14N y 15N.
nitrógeno en el nuevo DNA eran 14N y la
otra mitad 15N.
Experimento de Messelson y Stahl

Replicación de DNA Replicación de DNA


• Síntesis de la nueva hebra de DNA:
• Sintesis de la nueva hebra de DNA:
3. Lagging Strand:
Strand tambien es sintetizada de
2. Leading Strand:
Strand sintetizada como un la direcció
dirección 5’  3’, pero en forma
solo polí
polímero en la direcció
dirección 5’  3’. descontinua en contra de la dirección de
replicación.
Leading Strand
5’ 3’
5’ 3’

5’ 3’ 5’
DNA Polymerase RNA Primer
Primer
Nucleó
Nucleótidos Polimerasa de DNA de RNA 5’ 3’

3’ 5’
Lagging Strand

Okazaki Fragments Hebra descontinua


Replicación de DNA
• Síntesis de las nuevas hebras de DNA:
4. Fragmentos Okazaki:
Okazaki series de cortos
segmentos de DNA en la hebra
strand.
descontinua o lagging strand.
DNA
Okazaki Fragment Polymerase
RNA
Primer
5’ 3’

3’ 5’
Lagging Strand

Replicación de DNA Replicación de DNA


• Síntesis de las nuevas hebras de DNA:
5. DNA ligase:
ligase una enzima enlazante que • Síntesis de las nuevas hebras de DNA:
cataliza la formación de un enlace
covalente del extremo 3’ a 5’
5’ entre
6. Proofreading:
Proofreading errores iniciales en pareo de
segmentos a ser unidos.
bases son usualmente corregidos por la
Ejemplo:
Ejemplo: enlaze (unió
unión) de dos fragmentos Okazaki. DNA polymerase.
polymerase
DNA ligase
Okazaki Fragment 1 Okazaki Fragment 2
5’ 3’

3’ Lagging Strand
5’

Replicación Semiconservativa
Replicación de DNA
Molécula original de DNA
• Modelo Semiconservativo:
Semiconservativo:
1. Watson and Crick demostaron:
demostaron: dos hebras
de la molécula parental se separan, y cada una DNA luego de
una ronda de
funciona como un patrón o molde para la
replicación
síntesis de la nueva hebra complementaria.

DNA Template
Parental DNA
DNA luego de
New DNA otra ronda de
replicación
Reparación de DNA Pregunta:
repair:
• Excision repair: • ¿Cuál será la secuencia
1. El segmento dañado es excised por una complementaria de DNA para la
repair enzyme (hay más de 50 repair siguiente secuencia de DNA?
enzymes).

2. La DNA polimerasa y DNA ligase DNA 5’-GCGTATG-3’


reemplazan y enlazan los nuevos
nucleótidos.

Respuesta: Enzimas Importantes

DNA 5’-GCGTATG-3’ • DNA polymerase – una enzima que


cataliza la sintesis de DNA a partir de
DNA 3’-CGCATAC-5’ deoxiribonucleótidos y una hebra molde
(template) de DNA.

Hay varias polimerasas . . .

DNA POL I Arthur Kornberg


• Arthur Kornberg, 1957 • Ganó premio Nobel
en 1959 por su
• Aislaron una enzima de E. coli que
trabajo en aislar
coordinaba la sintesis de DNA in vitro y uma enzima en E.
requería: coli que cataliza la
– Los cuatro deoxiribonucleótidos adición de
trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) nucleótidos de DNA
– Un molde de DNA a DNA pre-
– Si uno de estos faltaba, no había sintesis. existente.
DNA POL I DNA POL I
• Es un polipeptido de 928 aminoacidos • Kornberg creía que esta era la enzima
• La sintesis ocurre en direccion 5’3’ principal de replicación, pero . . .
– Un fosfato en el carbono 5’ se enlaza – La velocidad de sintesis in vivo era m’as
covalentemente al OH—3’ de la rapida que in vitro.
deoxiribosa. – La enzima era mas rápida sintetizando
ssDNA que dsDNA.
– La enzima ademas de replicar DNA lo
degradaba.

Peter DeLucia y John Cairns DNA POL


• En 1969 descubrieron una cepa • DNA POL I
mutante de E. coli deficiente en DNA – Remueve el primer y llena los gaps.
POL I. • DNA POL II
• Esta cepa aún duplicaba su DNA y se – DNA repair
reproducía exitosamente • DNA POL III
• DNA POL I no era la enzima principal – Enzima principal de polimerización
de replicación.

DNA Helicase DNAa, DNAb, DNAc


• Una enzima que participa en replicación Enzimas que inician desenrollamiento
de DNA desenrrollando la hebra cerca de la doble hélice. Abren y
del origen de replicación. desestabilizan la hélice.
Topoisomerasa
• Una clase de enzima que convierte
DNA de una forma topologica a otra.
Durante la replicación de DNA estas
enzimas facilitan el desenrollamiento de
la doble hélice.

Single Strand Binding Protein


• SSBP le da estabilidad a la hebra de
ssDNA mientras prosigue la replicación.

DNA Gyrase
• Una topoisomerasa de DNA que
funciona durante la replicación de DNA
para reducir la tensión molecular
causada por super-enrollamiento. La
girasa produce y luego sella pequeños
rompimientos en la doble hélice.
DNA Ligasa DNAase
• Una enzima que forma un enlace • Una deoxiribonucleasa: una enzima que
covalente entre el extremo 5’de la degrada o rompe DNA a fragmentos o
cadena polinucleótida y el 3’de otra nucleótidos constituyentes.
cadena polinucleótida.

Primasa Resumen
• Enzima que sintetiza el primer de RNA

Resumen
Próximo Tema:

Transcripción
(RNA)

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