TERAPIA GENTICA PARA EL CNCER DE PULMN: TRANSFERENCIA DE GENES P53:

INTRODUCCIN Muchos de los genes implicados en la transduccin de seales, control del ciclo celular y la apoptosis han sido implicados en la etiologa del cncer del pulmn y con la elucidacin de los mecanismos de accin de los productos de estos genes, muchos se han vuelto posibles dianas teraputicas. El gen supresor de tumores p53, normalmente responsable de detectar el ADN daado y/o dirigir la reparacin o cometer una clula a la apoptosis (muerte celular programada), est mutado o alterado en un 50% de los cnceres humanos al pumon. A continuacin le presentaremos un estudio detallado, realizado en un cierto numero de pacientes que presentan un carcinoma localizado en el pulmn con los cuales demostraremos la viabilidad clnica de ADNc de p53 adenoviral en tumores malignos, o premalignos localizados en el pulmn sin efectos secundarios como toxicidad de otros tejidos sanos. El tratamiento consistir en la administracin de liposomas, cisplatino secuencial o la transferencia de genes p53 mediada por adenovirus que actuaran sobre el gen supresor p53 dando como resultado el mejoramiento de este gen y a su vez el del cncer del pulmn Este tratamiento es utilizado para cualquier tamao de clulas, ya sean pequeas o grandes, pero en etapa extensiva. Un dato muy importante para la aplicacin de este tratamiento, es que en dosis mayores si provocara toxicidad, pues estos tratamientos tienden a ser expansivos y el transferir genes supresores como el p53 puede causar apoptosis en clulas buenas causando asi el deterioro de nuestro organismo. En fin, a lo largo de nuestro estudio, demostraremos con hechos que nuestra hiptesis basada en la reparacin del gen p53, daado en el cncer del pulmn, puede ser un alivio para esta enfermedad degenerativa llevando a las clulas malignas a una apoptosis tumoral.

Marco Terico

Cncer:
El cncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce clulas anormales derivadas de los propios tejidos, ms o menos parecidas a las originales de las que proceden, y que pueden comportarse de diferentes modos, pero que en general tienden a llevar a la muerte a la persona que proceden sin el tratamiento adecuado. (Clula cancergenas o cancerosas) cuya malignidad es variable segn rganos y sistemas. En general se caracterizan por escapar al control reproductivo que requera su funcin original, perdiendo sus capacidades originales, y con el tiempo, adquiriendo otras que no les corresponden, invadiendo de forma progresiva y por distintas vas rganos prximos, o incluso a distancia por va linftica o hematgena (por la sangre) con crecimiento y divisin ms all de los lmites normales. (Invasin del tejido circundante y, a veces, metstasis).1 La metstasis es la propagacin a distancia, por va fundamentalmente linftica o sangunea, de las clulas originarias del cncer, y el crecimiento de nuevos tumores en los lugares de destino de dicha metstasis. Causas:

El cncer es generalmente clasificado segn el tejido a partir del cual las clulas cancerosas se originan. Un diagnstico definitivo requiere un examen histolgico, aunque las primeras indicaciones de cncer pueden ser dadas a partir de sntomas o radiografas. Muchos cnceres pueden ser tratados y algunos curados, dependiendo del tipo, la localizacin y la etapa o estado en el que se encuentre. Una vez detectado, se trata con la combinacin apropiada de ciruga, quimioterapia y radioterapia.

Segn investigaciones, los tratamientos se especifican segn el tipo de cncer y, recientemente, tambin del propio paciente. Ha habido adems un significativo progreso en el desarrollo de medicamentos que actan especficamente en anormalidades moleculares de ciertos tumores y minimizan el dao a las clulas normales. El diagnstico de cncer en pacientes est, en gran medida, influenciado por el tipo de cncer, as como por la etapa o la extensin de la enfermedad (frecuentemente en estados iniciales suele ser confundido con otras patologas si no se realizan los diagnsticos diferenciales adecuados). La clasificacin histolgica y la presencia de marcadores moleculares especficos pueden ser tambin tiles en el diagnstico, as como para determinar tratamientos individuales.

Tumor:
Inicialmente, el trmino tumor, se aplic a la tumefaccin, hinchazn, "bulto" o aumento localizado de tamao, en un rgano o tejido. Incluso, el concepto an se aplica cuando se dice que los cuatro signos cardinales de la inflamacin son "tumor, dolor, calor y rubor". Con el transcurso del tiempo se olvid el sentido no neoplsico de la palabra tumor y en la actualidad el trmino es el equivalente o sinnimo de neoplasia; y por lo tanto, se dice que hay tumores benignos y malignos.

Morfologa del cncer Las clulas tumorales tienen una morfologa alterada que depende de la diferenciacin y de la anaplasia. La diferenciacin celular de un tumor es el grado en el que las clulas cancerosas se asemejan a las clulas no cancerosas de las que proceden, tanto morfolgica como funcionalmente. Las clulas sanas que constituyen el organismo estn muy diferenciadas, lo que les permite realizar funciones especficas. Generalmente, los tumores benignos son bien diferenciados y los tipos de cncer varan desde los muy diferenciados hasta los indiferenciados. Un grado de diferenciacin bajo indica que las clulas tumorales son muy diferentes a lo que deberan ser para desarrollar las funciones habituales en el organismo.

La anaplasia es la ausencia de diferenciacin que conlleva a una falta de especializacin o de funcin celular y, generalmente, cuanto ms indiferenciado sea un cncer, ms alta es su velocidad de crecimiento. En general, lo que diferencia un cncer maligno de otro benigno, es la capacidad que poseen sus clulas de lograr una trasvasacin exitosa (o metstatizar), que se define como la capacidad que posee una clula tumoral de infiltrarse al torrente sanguneo (o linftico), mediante la ruptura de molculas de adhesin celular que sujetan a las clulas a la membrana basal, con posterior destruccin de esta ltima. Esta caracterstica que se adquiere luego de sucesivas alteraciones en el material gentico celular, donde es comn observar cromosomas fragmentados, prdida de genes supresores de tumores (como el p53 o el bcl3), receptores de seales mutados autoinductivos (etapa avanzada de diferenciacin), es la que origina el proceso de metstasis; es decir, la invasin y destruccin de tejidos. Dicho proceso de trasvasacin posee una escasa eficiencia, que es del orden de 1 en 10.000 casos. La baja eficiencia se debe principalmente a la actividad del sistema inmunitario.

Por otro lado, cabe destacar que la caracterstica que hace mortales a los cnceres malignos, comparativamente con los benignos (no mortales), es la mencionada capacidad de invasin de tejidos, en donde las clulas tumorales, generalmente cuando se alojan en el parnquima de un rgano, destruyen la arquitectura del mismo, siendo, a su vez, sus residuos metablicos txicos para las clulas sanas adyacentes, causando la eliminacin de este tipo celular. Una capacidad interesante propia de clulas cancerosas invasivas es la produccin de vasos sanguneos (angiognesis) para nutrirse, los cuales son los responsables de la densa red vascular que poseen los tumores (los tumores secretan hormonas responsables de la formacin de extensas redes de capilares y vasos sanguneos nuevos). Esta caracterstica le permite al parnquima tumoral tener un gran aporte de oxgeno y nutrientes, lo cual favorecer su crecimiento y proliferacin a mayor velocidad y distancia. Esta capacidad se encuentra generalmente ausente en neoplasias benignas, no generando tpicamente estos factores angiognicos y en las que adems sus clulas no poseen la capacidad de trasvasarse, por lo cual es de esperar que crezcan hasta un determinado tamao compatible con la cantidad de nutrientes de que disponen. En conclusin, segn recientes trabajos de investigacin, en general, una nica mutacin en el material gentico celular no es la responsable de transformar a una clula sana en cancerosa; por el contrario, se requieren mltiples mutaciones (que a la postre suelen degenerar en aberraciones cromosmicas), las cuales son generadas ya sea por sucesivos ciclos replicativos o por factores externos inductores de la carcinognesis (qumicos, fsicos y/o biolgicos); en donde exista algn dao especficamente en la secuencia deexones de protooncogenes y de genes supresores de tumores, que son los encargados de regular el ciclo celular y la muerte celular programada (apoptosis) respectivamente [en un lenguaje menos acadmico la apoptosis es comparable a un suicidio, con el fin de preservar la integridad celular del tejido conservando en el mismo solo clulas sanas]. Cualquier otra mutacin desencadenar en la transcripcin de genes p53, p21 y p16 responsables, entre otros, de la apoptosis. De esta manera, es posible entonces establecer una relacin entre envejecimiento y cncer por las causas mencionadas, dado a que la mayor parte de los pacientes que padecen cncer tienen edades avanzadas, aunque existen patologas cancerosas tpicamente puerperiles, juveniles o del adulto joven. En etapas tempranas, donde existe una bajo nivel de diferenciacin de estas clulas, se observa que la frecuencia de replicacin es ligeramente mayor a la esperada; pero, an en estas condiciones, las clulas siguen cumpliendo con las funciones normales propias del tejido. Luego, en estados ms avanzados, es posible detectar cambios en la bioqumica celular, donde aparecen enzimas y protenas que no son propias del tipo celular, como nuevas protenas canal (usualmente son las responsables de evacuar selectivamente altas concentraciones de quimioterpicos, y por ende de generar resistencia a los mismos), presencia de telomerasa, gradiente continuo (patolgico) de segundos mensajeros intracelulares que participan en la transduccin de seales, secuencias promotoras del ADN daadas, etc. Tratamiento Del Cncer El tratamiento del cncer se fundamenta en tres pilares: ciruga, quimioterapia y radioterapia. Existe un cuarto pilar llamado terapia biolgica que incluira la hormonoterapia,inmunoterapia, y nuevas dianas teraputicas no citotxicas. El tratamiento del cncer es multidisciplinar donde la cooperacin entre los distintos profesionales que intervienen (cirujanos, onclogos mdicos y onclogos radioterpicos), es de mxima importancia para la planificacin del mismo; sin olvidar

el consentimiento informado del paciente. En todo momento, el apoyo emocional es fundamental y la bsqueda de los posibles detonantes psicoemocionales o psicobiolgicos. A veces, dada la incapacidad actual de la ciencia para curar los tipos de cncer ms agresivos en estados avanzados de evolucin, es preferible renunciar al tratamiento curativo y aplicar un tratamiento paliativo que proporcione el menor grado posible de malestar y conduzca a una muerte digna. En estos casos el apoyo emocional cobra una importancia primordial. En el plan de tratamiento hay que definir si la intencin es curativa o paliativa. La respuesta al tratamiento puede ser:

Completa: Si se ha producido la desaparicin de todos los signos y sntomas de la enfermedad. Parcial: Si existe una disminucin mayor del 50% en la suma de los productos de los dimetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables. Objetiva: Es la respuesta completa o parcial. Progresin: Si aparece cualquier lesin nueva o existe un aumento mayor del 25% en la suma de los productos de los dimetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables. Estable: Si existe crecimiento o reduccin del tumor que no cumple ninguno de los criterios anteriores. Cuando no es posible la medida de las lesiones, los marcadores tumorales son tiles para valorar la respuesta al tratamiento.

Cncer de Pulmn
Es una enfermedad maligna que prolifera directamente en el tejido pulmonar o se extiende hasta el pulmn, a travs del flujo sanguneo o linftico, a partir de otro foco tumoral (metstasis). Se excluye del cncer de pulmn aquellas neoplasias que hacen metstasis en el pulmn provenientes de tumores de otras partes del cuerpo. La enfermedad se produce habitualmente en las paredes internas de los bronquios, y al crecer puede obstruir el paso del aire y alterar la respiracin. Si no se diagnostica a tiempo puede desplazarse hacia otros rganos del cuerpo. Cules son los sntomas del cncer al pulmn? Dificultad Respiratoria Tos, incluyendo tos sanguinolenta Prdida de peso Dolor Torcico Ronquera Hinchazn en el cuello y la cara

Cules son las causas del cncer al pulmn? Tabaquismo: es la principal causa del cncer al pulmn, siendo el 95% de pacientes con cncer de pulmn fumadores y ex fumadores. Con su elevada concentracin de carcingenos, va a parar directamente al aire y es inhalado tanto por los fumadores como por los no fumadores. Efectos del radn: El radn es un gas radiactivo que se halla en las rocas y en el suelo de la tierra, formado por la descomposicin natural del radio. Al ser invisible e inodoro, la nica manera de determinar si uno est expuesto al gas es medir sus niveles. La exposicin al radn combinada con el cigarrillo aumenta significativamente el riesgo de contraer cncer de pulmn. Por lo tanto, para los fumadores, la exposicin al radn supone un riesgo todava mayor. Predisposicin gentica: Se sabe que el cncer puede estar causado por mutaciones del ADN, que activan oncogenes o los hacen inactivos a los genes supresores de tumores. Algunas personas heredan mutaciones del ADN de sus padres, lo que aumenta en gran medida el riesgo de desarrollar cncer. Marihuana: Los cigarrillos de marihuana contienen ms alquitrn que los de tabaco. El humo se inhala profundamente y se retiene en los pulmones por largo tiempo. Adems, los cigarrillos de marihuana se fuman hasta el final, donde el contenido de alquitrn es mayor.

Tipos de Cncer al pulmn: Hay dos tipos de cncer al pulmn y son: Cncer pulmonar de clulas no-pequeas (NSCLC) Los carcinomas pulmonares de clulas no-pequeas se agrupan por razn de que su pronstico y tratamiento son muy similares. Existen tres subtipos principales: el carcinoma de clulas escamosas de pulmn, los adenocarcinomas y el carcinoma pulmonar de clulas grandes. Cerca de un 31% de todos los carcinomas de pulmn se corresponde con un carcinoma de clulas escamosas que, por lo general, comienza cerca de un bronquio central. Comnmente se ve necrosis y cavitacin en el centro del tumor. Los adenocarcinomas representan un 29,4% de todos los tipos de cncer de pulmn. Por lo general se originan del tejido pulmonar perifrico. La mayora de los casos de adenocarcinoma de pulmn estn asociados al hbito de fumar cigarrillos y en pacientes con enfermedades pulmonares previas. Entre aquellos que nunca han fumado, los adenocarcinomas son la forma ms frecuente de cncer de pulmn. Los carcinomas de clulas gigantes representan un 10,7% de todas las formas de cncer de pulmn. Son tumores que crecen con rapidez y cerca de la superficie del pulmn. A menudo son clulas pobremente diferenciadas y tienden a metastatizar pronto.

Carcinoma de clulas pequeas (SCLC) Cerca de un 15% de todos los carcinomas de pulmn se corresponden con un cncer de pulmn de clulas pequeas, tambin llamado carcinoma de clulas de avena. Tiende a aparecer en las vas areas de mayor calibre como en los bronquios primarios y secundarios y crece rpidamente llegando a tener un gran tamao. La clula de avena contiene densos grnulos neurosecretores, es decir, vesculas que contienen hormonas neuroendocrinas, que le da una asociacin con un sndrome endocrino o paraneoplsico, es decir, caracterizado por sntomas no relacionados con el efecto del

tumor local. Aunque es un tipo de cncer que inicialmente resulta ms sensible a la quimioterapia, conlleva un peor pronstico y se disemina mucho ms rpidamente que el cncer pulmonar de clulas no pequeas. Los tumores de pulmn de clulas pequeas se dividen en una etapa limitada y una etapa avanzada o diseminada. Este tipo de cncer est igualmente asociado al tabaquismo.

Localizacin del cncer de pulmn Desde el punto de vista topogrfico predomina la localizacin en el pulmn derecho, en los lbulos superiores y, dentro de stos, el segmento anterior. En segundo lugar se localiza en los lbulos inferiores y en tercer lugar en el lbulo medio y lngula. El tumor de Pancoast es el tumor maligno situado en el pex pulmonar, que aparece en el 4% de los casos y no es una variedad histopatolgica. Segn la localizacin, el cncer de pulmn se clasifica en:

Cncer de pulmn central: aparece a nivel de bronquios principales, lobares y segmentarios (primera, segunda y tercera generacin respectivamente), hasta los de cuarta generacin, es decir preferentemente en y alrededor del hilio pulmonar. El origen traqueal es raro, cerca del 1%. Se inicia con sintomatologa bronquial y son accesibles con el broncoscopio. Representan el 75% de los casos. Son cnceres centrales las variedades epidermoide (clulas escamosas) y el carcinoma indiferenciado de clulas pequeas.

Cncer de pulmn perifrico: aparece a partir de los bronquios de quinta generacin. Se inicia con clnica extrabronquial y no son accesibles con el broncoscopio. El adenocarcinoma es un ejemplo, que suele localizarse en reas muy alejadas, junto a la pleura. Aspecto macroscpico En su desarrollo, el carcinoma pulmonar comienza como un rea de atipia citolgica in situ, que durante un periodo de tiempo no conocido produce una zona de engrosamiento de la mucosa bronquial. A partir de aqu puede seguir uno de varios patrones:

1. Ulceracin tumoral de la mucosa: el pequeo foco, generalmente de menos de 1 cm de dimetro, al progresar adquiere el aspecto de una excrecencia verrucosa que eleva y erosiona el revestimiento epitelial. Tiene bordes mamelonados de contorno irregular. 2. Tumor intrabronquial: forma una prominencia que ocupa la mayor parte de la luz del bronquio. 3. Infiltracin circular estenosante: de crecimiento predominantemente submucoso, aunque suele acabar ulcerndose. 4. Infiltracin peribronquial: el tumor penetra rpidamente en la pared bronquial e infiltra el tejido peribronquial, hacia la carina o mediastino.

Invasin del parnquima: a partir de una de las formas anteriores, puede alcanzar tamaos considerables segn el tiempo transcurrido hasta que se hace el diagnstico, constituyendo una masa slida, de consistencia firme a dura, de color grisceo o blanquecino al corte, con algunas zonas amarillentas y focos hemorrgicos. El tumor crece en un frente amplio produciendo una masa intraparenquimatosa en forma de coliflor que desplaza el tejido pulmonar adyacente.

La necrosis tumoral es frecuente en la variedad epidermoide, con formacin de una cavidad central que termina por infectarse muchas veces. Esta necrosis es expresin de falta de vascularizacin del tumor, que se realiza a travs de los vasos bronquiales, y que apenas permite el aporte sanguneo de las zonas centrales.

reas de hemorragia: aparecen muchas veces asociadas a reas de necrosis tumoral, sobre todo cuando el tumor es prominente, lo que da lugar a un moteado amarillo blanquecino y a reblandecimiento.

Lesiones secundarias: otras lesiones asociadas son la atelectasia distal, la infeccin neumnica tambin distal a la obstruccin bronquial causada por el tumor y las bronquiectasias regionales. Extensin o crecimiento del cncer de pulmn En el momento del diagnstico menos del 20% tienen extensin localizada, el 25% tienen extensin a los ganglios linfticos y el 55% tienen metstasis a distancia. El cncer de pulmn comienza en un punto determinado de la mucosa y a partir de ah tiene un crecimiento hacia el interior y exterior de la luz bronquial, ascendente y descendente a travs de la submucosa y un crecimiento circunferencial, siguiendo un patrn de diseminacin directa llamada infiltracin. Crecimiento submucoso: puede abarcar toda la circunferencia bronquial y sobrepasar los lmites macroscpicos. A mayor crecimiento submucoso, ms irresecable ser el cncer. Si no se puede extirpar un centmetro ms all del lmite macroscpico, el tumor ser irresecable. En su crecimiento el tumor infiltra la pared bronquial, afectando al plexo linftico submucoso, y extendindose despus por el parnquima pulmonar segn los planos intersticiales, incluido el tejido conjuntivo perivascular de los vasos pulmonares.

El crecimiento intrabronquial ser el responsable de la sintomatologa bronquial como tos, hemoptisis, enfisema, atelectasia, etc. El crecimiento extrabronquial ser responsable de la sintomatologa extrapulmonar intratorcica, derivada de la invasin de estructuras como el mediastino, pared torcica, diafragma,venas cavas, pericardio, tumor de Pancoast, etc. La pleura visceral, que inicialmente resiste la propagacin, acaba por ser invadida, infiltrndose entonces diversas estructuras intratorcicas (nervios, pericardio, etc.) o diseminndose por la superficie pulmonar (implantaciones transpleurales) o a la pleura parietal, que si es invadida tambin, rpidamente se ver complicada la evolucin con la progresin del tumor por la pared torcica, con la afectacin de estructuras seas. En este tipo de invasin, hay primero formacin de adherencias pleurales, diseminndose despus las clulas neoplsicas a travs de los vasos linfticos neoformados a partir del plexo linftico subpleural. Esta participacin linftica es muy importante y precoz en los tumores del vrtice pulmonar, en conexin con el sistema linftico perineural del plexo braquial, lo que tendr una traduccin clnica importante. El crecimiento intra y extrabronquial es constante en todo cncer de pulmn. Slo el 20% de los casos, el cncer se diagnosticar en el parnquima pulmonar (localizado), y es el que tiene mejor pronstico. Genes supresores de tumores El cncer es el resultado de una serie de alteraciones genticas que se producen al azar y conducen a la perturbacin de los controles normales de la proliferacin celular que est regulada por protooncogenes que promueven el crecimiento celular y contrabalanceada por genes supresores de tumores. Los proto-oncogenes pueden volverse hiperactivos por mutaciones que tienen un efecto dominante generando los oncogenes que fuerzan al crecimiento de las clulas tumorales. Inversamente, las lesiones genticas de los genes supresores de tumores tienen un efecto inactivador. Estos genes mutados se manifiestan de forma recesiva de manera que, la prdida o inactivacin de ambos alelos conduce al fenotipo neoplsico .Se han utilizado varios criterios para definir los genes supresores de tumores. a) Un alto grado de conservacin evolutiva. b) Habitualmente estn implicados en el control del desarrollo de varias clases de tumores ya que su funcin normal es inhibir o poner freno al crecimiento celular, previniendo el desarrollo de la neoplasia. c) Tienden a ser recesivos, ambos alelos normales deben mutar para transformar clulas normales en tumorales.

d) Estn frecuentemente asociados con la prdida de un alelo resultando en la homocigosidad del gen supresor del tumor, as como de los marcadores que le circundan. e) Las mutaciones en estos genes provocan que la clula ignore uno o ms de los componentes de la red de seales inhibitorias, eliminando las barreras del crecimiento celular y resultando en una tasa ms elevada de crecimiento canceroso controlado. f) Los productos de los genes supresores de tumores funcionan en muy diversas localizaciones celulares. Tradicionalmente la inactivacin de un gen supresor de tumor ha sido explicada por los mecanismos ms sencillos que contribuyen a la perturbacin de la funcin y de la estructura del gen que son las deleciones, mutaciones puntuales e inserciones. Pero existen otros muchos mecanismos que no afectan a la regin codificante del gen pero s a la expresin de la protena supresora tumoral como son las alteraciones de otras regiones gnicas: promotor, secuencias reguladoras, regiones implicadas en la maduracin del ARN. Por otra parte la protena puede no ser funcional debido al transporte inadecuado de la protena supresora tumoral a la localizacin Subcelular donde es funcional. Adems oncoprotenas de origen vrico pueden inducir la degradacin de la protena supresora o inhibir la transcripcin del propio gen. GEN P53: Se trata de un gen supresor que se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 banda 13, y codifica una protena nuclear de 53 Kd. La funcin del P53 en estado normal es la de regulacin del ciclo celular ante un dao del DNA, por lo que se le ha denominado "guardin del genoma". Cuando el DNA se daa, el P53 se acumula en el ncleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 (check point) antes que se duplique el DNA e iniciar su reparacin. P53 va a inducir la sntesis de protenas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs, bloqueando el ciclo celular. Si se repara la lesin el ciclo contina, pero si no se repara se induce la apoptosis de la clula mediante la expresin de genes como bax. La alteracin de la protena P53 produce inestabilidad genmica, siendo las clulas incapaces de evitar la proliferacin o activar la apoptosis, cuando est comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces de acumular las mutaciones para completar la carcinognesis Las mutaciones del P53 se encuentran en aproximadamente la mitad de los tumores humanos malignos. Son fundamentalmente mutaciones por sustitucin, en las que se cambia un aminocido. El P53 aparece mutado en el 70% de los carcinomas colorrectales, el 50% de los carcinomas de pulmn y el 40% de los carcinomas de mama. Es signo de mal pronstico y se suele relacionar con diseminacin y metstasis.

Estructura Varios homlogos del gen p53 se han secuenciado en su totalidad en varias especies. Su organizacin es altamente similar y comparten las caractersticas siguientes:

La presencia de un intrn muy grande (10, 6,1, 6,2, 6,5, 7,7 KB para el hombre, ratn, rata, hmster y Xenopus respectivamente) en el extremo 5' del gen. Para p53 de mamfero, este intrn est situado entre los exones 1 y 2, mientras que en Xenopus se encuentra entre los exones 2 y 3. Su significacin biolgica es totalmente desconocida actualmente. El exn 1 es siempre no-codificante. Se ha demostrado que esta regin podra formar una estructura estable de lazo ("stem-loop") que une firmemente al alelo p53 silvestre pero no al alelo p53 mutante. Esta unin inhibe especficamente la traduccin del mRNA p53 y podra proporcionar los medios para el control del nivel de la protena p53 en la clula. La distribucin de intrones entre estos cinco genes es similar. Los intrones varan de tamao pero se dividen en el gen de una manera muy similar, a excepcin del intrn 6 que est ausente en la rata, y del intrn 3 en el Xenopus que se divide entre los exones 3 y 4 diferentemente. Un pseudogn se ha caracterizado y se ha ordenado en el ratn, correspondiente a una copia del ARNm integrado en el genoma celular despus de la transcripcin reversa. Dos pseudogenes similares tambin se han identificado en la rata pero, hasta ahora, ninguno en humanos. La protena p53 es una fosfoprotena formada por 393 aminocidos y 3 dominios:

Un dominio de activacin de factores de transcripcin. Un dominio que reconoce la secuencia especfica del ADN (dominio central). Un dominio carboxilo-terminal (C-). El 80% de las mutaciones puntuales de p53 que se detectan en los cnceres humanos estn localizadas en el dominio de unin a ADN de la protena FUNCIONES: En 1979, los cientficos descubrieron una protena nueva. Esta protena que, a su vez, poda unirse a una protena transformante (el antgeno T mayor) del virus SV40, se encontraba prevalentemente en

las clulas transformadas (inmortalizadas y potencialmente tumorignicas) por este virus que en las clulas normales. La protena y su gen correspondiente fueron llamados p53, en referencia a la masa de la protena. En clulas normales, el nivel de la protena p53 es bajo porque se encuentra asociada a Mdm2, lo cual induce su ubiquitinacin y destruccin por el proteasoma. Los daos del ADN y otras seales de estrs pueden hacer que p53 no se una a Mdm2 e incrementar su concentracin, permitiendo que realice su funcin de factor de transcripcin. El factor de transcripcin p53 tiene varias funciones importantes: 1) Detencin del ciclo celular Detencin del ciclo celular en el punto de control G1/S o G2/M mediada por p53, cuando se reconoce el dao en el ADN, para evitar su replicacin. Puede considerarse la respuesta principal cuando se produce dao en el ADN. La detencin del ciclo celular en la transicin G1/S se debe a la transcripcin dependiente de p53 del inhibidor de CDKsdenominado CDKN1A/p21. p21 inhibe los complejos CDKciclina y evita la fosforilacin de pRb, de manera que el factor de transcripcin E2F permanece inactivo, y se impide la progresin de la clula hacia la fase S (de sntesis del ADN). Esta "pausa" en la progresin del ciclo celular da tiempo a reparar los daos producidos en el ADN. 2) Activacin de enzimas de reparacin del ADN p53 activa las enzimas de reparacin del ADN para corregir los daos detectados. Uno de sus genes diana transcripcionales, p53R2, codifica para una reductasa de ribonucletidos, que es importante en la replicacin y reparacin del ADN. p53 tambin interacciona directamente con la endonucleasa AP y la ADN polimerasa que estn implicados en la reparacin por escisin. p53 tambin induce ciertas protenas, como GADD45 que colaboran en la reparacin del ADN. Si el dao se repara correctamente, p53 estimula la sntesis de Mdm2, activando su autodestruccin y la progresin en el ciclo celular. Si el dao no puede ser reparado, la clula puede entrar en apoptosis o en senescencia, ambos inducidos por p53. Entrada en senescencia Iniciacin del proceso de senescencia, que es una parada permanente en el ciclo celular, caracterizada por cambios especficos en la morfologa y en la expresin gnica, que la diferencian de la quiescencia o parada celular reversible. La entrada en senescencia requiere la activacin de p53 y/o pRb y la expresin de mediadores como inhibidores de CDK, y suele ser irreversible. Los cambios que se producen no se comprenden an en su totalidad, pero parecen implicar modificaciones epigenticas de la cromatina, como la formacin de bloques de heterocromatina en diferentes loci, como los genes activadores de la proliferacin regulados por E2F. Como todas las respuestas mediadas por p53, la entrada en senescencia puede inducirse por la presencia de diferentes tipos de estrs, como hipoxia, acortamiento de los telmeros o sealizacin oncognica. 3) Activacin de la apoptosis La entrada en apoptosis es el ltimo mecanismo protector, si el dao en el ADN es irreparable, para evitar la proliferacin de las clulas que contienen ADN anormal. p53 activa la expresin de genes pro-apoptosis, como BAX o PUMA. Sin embargo, no est claro cmo decide la clula si debe reparar su ADN o entrar en apoptosis. Parece que p53 presenta mayor afinidad por los promotores de los genes de reparacin del ADN que por los promotores de los genes pro-apoptosis, de manera que primero se

activa la reparacin del ADN. Pero si sta no es efectiva y p53 contina acumulndose, se activaran los genes pro-apoptosis. En resumen, p53 enlaza los procesos de dao en el ADN con reparacin, parada en el ciclo celular y apoptosis. Es por ello que recibe el nombre de "guardin del genoma". Si una clula pierde la funcin de p53, el dao en el ADN no se repara, se acumula en las clulas hijas y stas entran directamente en la ruta hacia la tumorignesis. TERAPIA GENICA CON P53 Puesto que el gen p53 se puede encontrar mutado en casi todos los tipos de cncer y aproximadamente el 50% de todos los cnceres presentan mutaciones en el p53, se han desarrollado estrategias de terapia gnica para suplementar las clulas cancerosas con este gen. La estrategia consiste en transferir el gen p53 funcional a las clulas cancerosas in vivo. Inicialmente (1990) los genes p53 se introdujeron en clulas epiteliales in vitro e inhibieron su transformacin en clulas cancerosas y su toxicidad fue baja. Se han utilizado vectores retrovirales e incluso una expresin muy limitada temporalmente es suficiente para inducir la apoptosis de las clulas. En ratones ha funcionado correctamente, pero el rendimiento de la transfeccin es muy bajo. Para evitarlo se ha propuesto el uso de liposomas. En 1995 comenzaron los primeros ensayos clnicos con la inyeccin directa de los retrovirus en tumores bronquiolares. De 7 pacientes, 3 tuvieron mejora (regresin del tumor) y 1 no present tumor alguno a los 3 meses. Sin embargo es difcil obtener las grandes cantidades necesarias de virus (ms de 10^7 copias) para tratar los tumores muy extendidos. En 2000 se trataron 28 pacientes con inyecciones ecoguiadas de altas dosis de adenovirus con p53. Solo 1 paciente mostr un choque txico de 83 tratamientos. Hubo distintos grados de pequeas mejoras y en 3 pacientes se consider que mejoraron parcialmente. Actualmente la terapia gnica con p53 contina en estado de ensayos clnicos.

RESULTADOS

1) Expresin del gen p53 en cncer

Aumento de los anticuerpos adenovirus

16 14 12 10 8 6 4 2 0 > 8 veces >2>8 veces Aumento de los anticuerpos adenovirus

2) Despus de tres rondas de inmunizacin con adenovirus p53-DC Total de pacientes 28: 16 de 28 pacientes analizados (57.1%) : 14 pacientes (>2<8 veces) aumento de los anticuerpos adenovirus 2 pacientes (> 8 veces) aumento de los anticuerpos adenovirus Discusin: Se han establecido en experimentos preclnicos que p53 podra ser un buen objetivo para la inmunoterapia del cncer. La vacunacin en el desarrollo de p53, las respuestas de las clulas T especificas en un poco ms de la mitad de los pacientes (57,1%).Estos datos indican que, a pesar de nuestros esfuerzos, desde una punto perspectivo inmunolgico, la vacuna fue eficaz en slo la mitad de la pacientes. Hay varios factores que

pueden contribuir a una ptima respuesta inmune: A la mala funcin de las clulas T, clulas T supresin inducida por las clulas T reguladoras.

3) Multiplicidad de la infeccin: Intensificacin del efecto de la eliminacin del tumor por la combinacin de CDDP y Adv. p53 in vitro Discusin: El tratamiento con CDDP o infeccin con dl312 con o sin exposicin previa CDDP no tena efecto sobre el crecimiento celular H1299 in vitro. Sin embargo, H1299 clulas expuestas a una concentracin baja de CDDP (0,062 / ig / ml) 48 horas antes de Adv-p53 infeccin tena una inhibicin del 31% a 60% mayor de clulas la proliferacin de las clulas infectadas slo con Adv-p53. Esta inhibicin fue evidente incluso a los 3 das despus de la transferencia de genes a una MOI de 1 y 5, respectivamente. Los mayores niveles de expresin del gen p53 logrado por esta estrategia de combinacin de la transferencia gnica puede mejorar la induccin de la apoptosis, lo que se traducira la inhibicin de la tumorigenicidad aumentado. En los estudios in vivo, la administracin intraperitoneal de CDDP dio como resultado slo un poco mayor reduccin en el crecimiento tumoral .Tumores inyectados con d1312, con o sin intraperitoneal antes CDDP, mostraron algn grado de retraso del crecimiento. Inyecciones intratumorales de Adv-p53 sin CDDP inhibi el crecimiento del tumor durante e inmediatamente despus del tratamiento, pero estos tumores volvieron a crecer y alcanzado un volumen medio del tumor de 3357 +391 mm 3 32 das despus de la aparicin de la terapia.

400 350 300

Nmero promedio de tumores

250 200 150 100 50 0

4) La inhibicin de la metstasis de pulmn A549 (*) tras el tratamiento con el DOTAP extruido: Chol-p53 complejo. Ratones portadores de tumores A549 en el pulmn que fueron tratados diariamente con un total de seis dosis (50 mg / dosis) con ADN de p53 plsmido, liposoma vaco, lipofectamina-p53 complejo, complejo Chol-CAT, Chol-p53 complejo. Cada grupo estaba compuesto por ocho animales. Discusin: La observacin ms importante en el estudio presentado aqu es que DOTAP extruido: Chol p53 mediada por liposomas y genes FHIT. Este complejo puede suprimir el crecimiento tumoral in vivo cuando se administra localmente y sistmicamente y que esta actividad no est asociada a algn efecto txico a diferencia de los otros complejos y experimentos realizados en el mismo estudio. Nuestros estudios indicaron adems que este sistema de administracin liposomal extruido no est restringido ni por los genes, ni el tipo de tumor. Lo ms importante son nuestros datos que indica que DOTAP extruido, Chol liposomas catinicos basada en la terapia gnica de tumor, puede ser til, ya sea solo o en combinacin con otras estrategias teraputicas en el tratamiento de cnceres humanos in vivo.