ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUA POTABLE DETERMINACION DE CONTROL CALIDAD LOS COLIFORMES TOTALES, FECALES Y

I.

INTRODUCCIN

El crecimiento de la poblacin a nivel mundial y el aumento del uso del agua para Diferentes actividades, ha incrementado el nivel de contaminacin. Esta contaminacin est relacionada con los vrtigos de origen domstico e industrial. En el cauce de los residuos de origen domstico, la contaminacin este representado por altos porcentajes de material orgnico y microrganismos de origen fecal. Estos microrganismos son causantes de enfermedades de origen hdrico, que generan altos porcentajes de mortalidad en la poblacin. Dentro de los microorganismos patgenos se encuentran el grupo de bacterias coliformes Estos Etna formados por dos subgrupos: los coliformes totales y los termo tolerantes. A estos ltimos antes se los denominaba coliformes fecales. El cambio de nombre se debe que se demostr que en el grupo de coliformes que se detectaban en siembras encubadas a temperaturas de 44,5 C y en medios de cultivo especficos, slo una parte del grupo eran bacterias de origen fecal; el resto eran bacterias ambientales. Se les puso entonces el nombre de bacterias coliformes En el grupo de bacterias termo tolerantes est incluida la Escherichia coli, considerada como un organismo indicador de contaminacin fecal. Se ha demostrado que esta bacteria siempre est presente en un nmero elevado en las heces de humanos y animales de sangre caliente y comprende casi 95% de los coliformes en las heces. Por esta razn, la contaminacin de origen fecal puede ser evaluada mediante la determinacin de coliformes termo tolerantes o mediante la presencia de Escherichia .coli. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotermos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

II.

OBJETIVOS

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en una muestra de agua Potable Diferenciar los organismos coliformes totales delos organismos Coliformes fecales. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua.

III. 3.1. Agua potable

MARCO TERORICO

El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran nmero de actividades humanas. Su creciente degradacin por disminucin de su calidad implica la reduccin del nmero de usos que se le da; es por ello, lo que se hace necesario la realizacin de estudios que permitan determinar la calidad dela agua. Los anlisis que se pueden realizar al agua para controlar su calidad son: fsicos, qumicos y microbiolgicos, en esta ocasin se har una determinacin microbiolgica. SE efecte sobre el agua un anlisis mnimo: Coliformes Totales y Fecales; uno normal: los anteriores ms: bacterias aerobias a 37 C, Estreptococos Fecales y Clostridios SulfitoReductores; o completo: los anteriores ms aerobias a 22 C, microrganismos parsitos y/o patgenos; el anlisis realizado ha sido el normal. 3.2. Agua potable Se denomina agua potable o agua para consumo humano, al agua que puede ser consumida sin restriccin debido a que, gracias a un proceso de purificacin, no representa un riesgo para la salud. El trmino se aplica al agua que cumple con las normas de calidad promulgadas por las autoridades locales e internacionales. En la Unin Europea la normativa 98/83/EU establece valores mximos y mnimos para el contenido en minerales, diferentes iones como cloruros, nitratos, nitritos, amonio, calcio, magnesio, fosfato, arsnico, entre otros., adems de los grmenes patgenos. El pH del agua potable debe estar entre 6,5 y 8,5 3.1.1. Dentro coliformes de agua se encuentran caracteres bioqumicos como los

El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioqumicas: aerobias o anaerobias facultativas Y bacilos tambin ser bacilos Gram negativos; no ser esporogonias; IV. LOS COLIFORMES

Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre. 4.1.Los coliformes como indicadores Tradicionalmente se ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura. 41.1. Bacterias que integran el grupo El grupo de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram negativos, con las siguientes propiedades bioqumicas: oxidasa negativo y capacidad de fermentar lactosa, con produccin de gas en 48 horas a una temperatura de 37 C. Los coliformes Se conforman por: Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter

Nota: (No todos los autores incluyen al gnero Citrobacter dentro del grupo coliforme.) 4.2. Coliformes totales y coliformes fecales No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminacin. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales que comprende la totalidad del grupo y los coliformes fecales, aquellos que son de origen intestinal. Desde el punto de vista de la salud pblica esta diferenciacin es importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminacin que presenta el agua es de origen fecal. 4.2.1 Coliformes fecal total Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas como bacilos gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44.5 C y 0.2 C dentro de las 24 y 2 horas. La mayor especie en el grupo de Coliformes fecal es el Escherichia coli. La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminada con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposicin.

Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los niveles recomendados de bacterias coliformes fecales son:

Agua potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua. Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua. 4.2.1.1.Escherichia. coli Es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado Dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Escherichia coli enterotoxignica ETEC Es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios. Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gnerosimilar a la shigelosis. La enfermedad Shigella, se produce una enfermedad presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la mucosa intestinal. Escherichia coli enterohemorrgica EHEC Produce verotoxina, denominada aspor su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia

4.3.Contaminacin fecal humana o animal

El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de contaminacin de origen fecal, alrededor del 99%. No es absoluta porque se han aislado cepas de E. coli que no tienen origen fecal,. Sin embargo, el aislamiento de este microorganismo no permite distinguir si la contaminacin proviene de excretas humanas o animales, lo cual puede ser importante, de origen animal y la de origen humano son idnticas. Sin embargo, algunos investigadores han encontrado que las bacterias del gnero Rodococus se asocian solamente a la contaminacin fecal por animales. 4.4.Escherichia coli y bacterias coliformes fecales termotolerantes Las bacterias del grupo de los coliformes totales que son capaces de fermentar lactosa a 4445 C se conocen como coliformes termotolerantes. En la mayora de las aguas, el gnero predominante es Escherichia, pero algunos tipos de bacterias de los gneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter tambin son termotolerantes Escherichia coli se puede distinguir de los dems coliformes termotolerantes por su capacidad para producir indol a partir de triptfano o por la produccin de la enzima -glucuronidasa. E. coli est presente en concentraciones muy grandes en las heces humanas y animales, y raramente se encuentra en ausencia de contaminacin fecal, aunque hay indicios de que puede crecer en suelos tropicales. 4.5.Coliformes e Higiene de alimentos

4.5.1. En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminacin fecal sino solamente indicadores de calidad. Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas, frmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno. Los coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos. Por ltimo, la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas. 4.6.Coliformes y aguas servidas La prueba de coliformes totales y fecales tambin se utiliza para determinar la calidad bacteriolgica de los efluentes de los sistemas de tratamiento de aguas servidas V. PROCEDIMIENTOS PARA LA COLIFORMES FECALES Y TOTALES DETERMINACION DE

La determinacin de Coliformes Totales y Fecales: Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, Capaz de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales .Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en Heces estn formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Yaque los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. 5.1. Mtodos

5.1.1. filtracin de membrana totales y fecales

para

la

determinacin

de Coliformes

Se va seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tiposDe Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C. 5.1.1.1.PRUEBAS Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que stos crezcan sin restriccin, se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml del agua a la primera serie de tubos, 1 ml de agua a la segunda serie, y 0,1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le Habr aadido un indicador cido-base. Estos tubos se incuban a la temperatura correspondiente se trate coliformes Totales Fecales durante 24 horas. Los Coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar a la con produccin de cido y gas, estos signos sern los que buscaremos. La reaccin ser positiva cuando se produce desprendimiento de gas en La campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad, y el medio vira a color amarillo debido a formacin de cido. una reacion positiva por devil qe sea indicara la presencia de coliformes y se habr qe hacer Prueba confirmativa de IMViC yse aplicara la tcnica del n uemeronas probable(NMP) 5.1.1.2.Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:

En los tubos donde se introdujo 0,1 ml de agua problema, o resultados Positivos en la prueba presuntiva ,se introduce un asa de siembra estril y se toma una porcin que va a sembrarse en estra en una placa Petri con medio EMB Levine. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, adems la combinacin de azul de metileno y eosina permitir diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos. -Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales. -Los Coliformes apareceran como violeta oscuros y si hubiera

Microorganismos lactosa negativos apareceran como colonias incoloras 5.1.1.3.Pruebas IMViC: Las bacterias pertenecientes a la familia Entero bacteriaceae, pueden identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacin, uno de los ms} Conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarroll para clasificar Especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aerbicas o anaerbicas facultativas, Gram negativos, bacilares, no esporgenas que producen cido y gas durante la fermentacin de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas: El triptfano, aminocido suministrado por una peptona adecuada, se descompone en indol por accin de algunos microorganismos

La prctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de Producir indol cuando est en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloracin al reaccionar con l. Se coge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona Se incuba horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales, 24-48 horas, pasado el tiempo de incubacin se sacan los tubos de la estufa y se les aade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar.

Si aparece una coloracin roja indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. 5.1.1.3.1. Rojo de metilo Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampn fosfato. Debido a la acidez producida, el medio virar de amarillo a rojo Considerando la prueba positiva al aadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferencia que, en Vez de aadir indol de kovacs, aadimos Rojo de Metilo. Voges Proskauer Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol producto intermedio en la degradacin de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con -naftol y un producto de descomposicin de la arginina de la peptona, para producir un color rojo. En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB Levine Se incuba a 37 44 C 24-48 horas, luego se aade 1 mL de reactivo de Voges Proskauer,que contiene -naftol y KOH, se aade seis gotas de reactivo omehara y dos de reactivo de Barry, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloracin roja la prueba es positiva 5.1.1.3.2. Citrato: Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como nica fuente de carbono En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estra. Si aparece crecimiento En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estra. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccin de amonaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo. 5.1.2. Tincin de Gram:

5.1.2.1. La cloracin de gram tincin , fundamento comportante en la diferencia de las bacterias se clasifican en dos grandes grupos segn se retengan usado en las tincin que es la violeta o no el colorante de base

Las bacterias gram positivas aparecen con el citoplasma teido uniformen te de color azulo violeta. Las bacterias gram negativas se tien de rojo por el colorante usado como cotrastador fuchina safarina . La diferencia entre unas y otras radica en la composicin qumica de la Pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram negativas es ms delgada y presenta un contenido en lpidos, grasas, diez veces superior que el de las Gram positivas, lo cual dificulta la tincin y la retencin del colorante en el citoplasma. Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincin diferencial, a continuacin observamos con el microscopio 5.1.2.2. Resultado de la determinacin Se han obtenido idnticos resultados tanto en la determinacin de Coliformes totales como fecales y stos han sido: 5.1.2.3. Prueba presuntiva En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccin de cido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior. Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos,2 de los 3 sundos y 1 de los 3 ltimos (viraje del medio y gas); con estos datos vamos a las tablas del nmero ms probable (NMP) y tenemos: Como sta prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas

Confirmativas, de haber resultado negativas las primeras, daramos por terminado el anlisis. 5.1.2.4Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine Colonias de color violeta, tal y esperaba. Se pasa a las pruebas

Como se pasa a pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existente Tras la incubacin han

5.1.2.5. Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al tubo: Indol positivo:el microorganismo produce indol . en iszquierda a derecha un tubo sin inoculacion de bacterias mrtesiltado p ositivoal derecha la figura aaprece de resultado negativo y

5.1.2.6. Rojo de metilo Tras al incubacin de cuatro das se aade el reactivo se colorea de rojo de metilo si es p positivo , el microrganismo su crecimienton En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha.

5.1.2.7.Voges-Proskauer: El microorganismo no produce acetilcarbimol al aadirle el reactivo que se detecta con la aparicin del color rojo, en este caso el resultado es negativo, (tubo del medio). En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha.

5...1.2.8.Citrato tras la encubacionse observa qe el organismono crsciocen el slam de tuvo del centro y el medio no hay virado de color poer lo que mo es xcpaz de optener su fuentede carviono ce citrato una produccin de amonaco que alcalinizara el medio y se habra detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. El tesultado de las pruevasIMViC son ++-- con esta combinacin vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia Coli.

Tincin de Gram Con esta prueba, hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caractersticas y es el mayor indicador de contaminacin fecal en el agua. 5.1.2. Determinacin de Streptococcus Fecales:

PROCEDIMIENTO

Se va seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tipos De Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C.

Organizar e interpretar los resultados Sistema de filtracin Pinzas Mechero Cajas de petri con medio

membrana de 0,45 micrmetros de dimetro

5.1.3.1. PROCEDIMIENTO

FILTRACION

DE MENBRANA

La tcnica de filtro de membrana se fundamenta en la filtracin de un volumen Determinado de muestra (100 mililitros o volmenes menores segn la densidad bacteriana esperada) a travs de un filtro de membrana de 0,45 micrmetros de dimetro de poro, el cual es colocado sobre un medio de cultivo especfico y luego incubado a la temperatura adecuada. El mtodo de filtracin con membrana para la determinacin de coliformes totales y termotolerantes east aceptado poor el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (American Public Health Association-American Water Works Association, 1999), que lo propone como una alternativa para la determinacin de los coliformes totales y termotolerantes. Este mtodo se recomienda para la determinacin de bacterias en muestras de agua potable y agua de origin subterrneo. En una rampa de filtracin estril conectada a vaco. Desenvolver el filtro de la Envoltura con la que se ha esterilizado. Separar el embudo de la base del filtro. Colocar la membrana filtrante sobre el porta filtros de la base del mismo. El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de goma para no lesionarlas. Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y Que esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situada entre el embudo y la base-soporte del filtro. Filtrar 100ml de muestra de agua a travs del filtro. Poner en marcha el sistema de vaco. Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vaco y separar el embudo de la base del filtro. Retirar con pinzas estriles o flameadas la membrana filtrante. Colocar la membrana sobre una placa Petri e incubar en estufa a 37C durante 24 horas. Comprobar resultados a las 24 horas. Facultativas, conocidas como bacterias del cido lctico, integrantes de la flora normal de los animales homeotrmicos. Actualmente se considera que pertenecen al gnero Enterococcus . Todos los Entero cocos presentan alta tolerancia a condiciones

Ambientales adversas altas o bajas temperaturas, deshidratacin, salinidad, luz solar), por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacin fecal en aguas de bao martimas, pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad. Los Streptococcus son abundantes en heces de animales, por lo que Son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la cra de ganado. Nuestra muestra de agua problema est tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba. Los Streptococcus son abundantes en heces de animales, por lo Prueba presuntiva Para determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de Cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida), de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield que es un caldo

En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida sdica inhiben el crecimiento de la flora acompaante, mientras que los Streptococcus Crecen sin restriccin. A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y la cul reacciona con el NH4+ que lleva el medio y complejo verde negruzco. Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra Problema y lo incubamos 24 horas a 37 C. Si aparece ennegrecimiento, la prueba presuntiva es positiva y se pasar a las confirmativas. Los Streptococcus Fecales son bacterias anaerbias o aerbias

Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar De los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siemb en estra mltiple en placas KAA Agar, las que se incuban a 37 C 24-48 horas. Si pasado el periodo de incubacin aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidrlisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales. Otras pruebas confirmativas Tincin de Gram En el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observarn cocos Gram positivos. - Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI

Se trata del caldo Cerebro-corazn que tiene la caracterstica que Contiene una concentracin en NaCl de 6,5%. Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracin en sales minerales, es por lo que son ndice de contaminacin fecal en agua marina, como ya se ha comentado anteriormente. - Prueba de la catalasa: Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno lo que nos indicara que se ha reaccin se ha producido. se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno lo que nos indicara que se ha reaccin se ha producido. se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno lo que nos indicara que se ha reaccin se ha producido. Resultado de la determinacin Aparece un ennegrecimiento en el tubo, la prueba es positiva Los Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina, la cul reaccionan con el NH4+ que lleva y Complejo verde negruzco. esculetina, la cual reaccionan con el NH4+ que lleva y complejo verde negruzco. Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar La prueba resulta positiva: Aparecen colonias rodeadas de halos negros Debido a la hidrlisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales. Tincin de Gram Se observan cocos Gram positivos que teido uniformemente de color azul o violeta. Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI La prueba es positiva, aparece en el medio de cultivo, los Streptococcus han crecido en este La prueba ha resultado negativa, es decir, los Streptococcus no tienen la Prueba de la catalasa: Enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2.medio rico en NaCl.

5.2.MTODO PARA LA DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA COLI POR LA TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MLTIPLE (NMERO MS PROBABLE O( NMP)

Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo Microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases: En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de Sodio el cual permite la recuperacin Encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosa do bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. De los microorganismos daados que sea fase confirmativa. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes Fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas. 5.2.1. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 5.2.1.1Para anlisis de agua

Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de Muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1. 5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durhama. 5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b. 2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c 6 tubos de 13 x100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe 3 tubos de 13 x 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere

5.2.1.2Soluciones y reactivos e indicadores

Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e de gramd colorantes para tincin

Mechero, a, b, c, d, e. Propipeta a. Gradilla a ,b, c ,e. Balanza granatariaa. Stomachera Bolsas para stomacher . Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas de 1.0 ml estriles con tapn de algodna. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d Asa bacteriolgica b,c,d, e Portaobj etosd Microscopio ptico d Termmetro calibrado b Bao de agua a 44.5 0,1C.b Incubadora a 35 2,0Ca. Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca Autoclavea

5.2.1.3. Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 144 h. de iniciada

5.2.1.4.PROCEDIMIENTO . Agua y hielo 1 Prueba presuntiva Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado agitar los tubos tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio

Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay

Formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. 5.2.1.5.Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba Presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. Ajitar los tuvos para su homogenisacion. Incubar a 35 y 2c durante 24 a 48horas .

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.

Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de Organismos coliformes fecales/ 100 mL. Control de calidad Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras .Prueba confirmativa para Escherichia coli Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por Estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas Incubar las placas a 35C por 18-24 h. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos Cortos o cocobacilos Gram-negativos. Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). Produccin de indol Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2

Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera. Prueba positiva. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM). Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa. . Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP). Adicionar 0.6 m L de solucin VP1 y 0.2 m L de solucin VP2 y agitar usar un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h Adicionar 0.6 m L de solucin VP1 y 0.2 m L de solucin VP2 y agitar Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba Positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie Utilizacin del citrato Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar Turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons) El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una Prueba positiva.

Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-umbeliferil--D-glucuronido) Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico 4metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. Prueba confirmativa A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de

gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin ECMUG.

Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms. Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer lalectura. Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli. Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo.

VI.

COCLUSION

El agua constituye un elemento esencial, ya que es indispensable para La vida, por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad. Con este anlisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantial.
El agua constituye un elemento esencial, ya que es indispensable para la vida, por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad. Con este anlisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantial. Como resultado hemos obtenido una gran contaminacin microbiolgica Del agua, donde no debera aparecer ningn tipo de contaminacin puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano, aunque actualmente se conoca la no potabilidad de la misma. Durante aos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua Analizado y comparando resultados vemos que los parmetros biolgicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momento La causa presumible es la ubicacin de unas grandes instalaciones Ganaderas, a pocos metros de distancia, de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originaran la contaminacin. Es normal que aparezca una contaminacin fecal en el agua y la

presencia de Escherichia Coli, que es el mejor indicador de este tipo de contaminacin, as lo confirma.

VII.

BILBIOGRAFIA