5.

BIOTEHNOLOGIA DE OBINERE A TETRACICLINELOR

Tetraciclinele constituie una din grupele de antibiotice deosebit de apreciate din punct de vedere terapeutic. Primul antibiotic din aceast grup, clortetraciclina, a fost izolat din culturi de Streptomyces aureofaciens de Duggar n 1945 i introdus n terapeutic n anul 1948. Oxitetraciclina a fost izolat ceva mai trziu (Kane, Finlay, Sobin, 1949), din lichidele de fermentaie a unei tulpini de Streptomyces rimosus. Tetracilina descoperit n 1952 a fost obinut iniial prin hidrogenerarea selectiv a clortetraciclinei, iar mai trziu prin fermentaia n profunzime a microorganismului Streptomyces aureofaciens. n ultimul timp se studiaz intens tetraciclinele de semisintez caracterizate printr-o aciune terapeutic superioar tetraciclinelor naturale. Dintre compuii introdui n terapeutic se menioneaz minocilina, solvocilina i 6-metilenoxitetraciclina. Datorit spectrului larg de aciune, toxicitii sczute, lipsei generale a fenomenelor secundare, tetraciclinele constituie antibioticele cu cea mai larg "utilizare" terapeutic, consumul lor reprezentnd 55 % din consumul total de antibiotice. Tetraciclinele acioneaz asupra germenilor gram-pozitivi (streptococi, pneumococi, stafilococi), gram-negativi (brucele, shigele), asupra virusurilor i asupra unor protozoare. Ele se prezint sub form de pulberi cristaline, galbene, indore, amorfe, insolubile n ap sub form de baze, solubile sub form de clorhidrai. n soluii apoase se inactiveaz la pH sub 2 i peste 8, stabilitatea maxim fiind n intervalul de pH cuprins ntre 4 i 5. 5.1. Structura i activitatea tetraciclinelor Structura chimic a tetraciclinelor s-a stabilit prin reacii de degradare n mediu bazic, acid sau reductor. Ele conin un sistem ciclic de patru inele condensate liniar, corespunztor scheletului hidronaftacenului (s-a obinut naftacen, II, prin distilare cu pulbere de zinc). Dup stabilirea naturii i locului diferiilor substituieni n molecul, s-a atribuit tetraciclinelor de biosintez (I) urmtoarele structuri: R1 HO R2
8
9

R3
5a
11a
5

N(CH3)2
4a
4

D
10

6a
10a

C
11

B
12

12a

OH 2
1

OH CONH2 II
R1 Cl H H Cl R2 CH3 CH3 H H R3 H OH H H

OH

OH I

Clortetraciclina Oxitetraciclina Tetraciclina 6 - Demetiltetraciclina 6 Demetil 7 clortetraciclina

99

Dup cum se vede, clortetraciclina conine un atom de clor n inelul D poziia 7, oxitetraciclina conine un hidroxil n nucleul B poziia 5, iar tetraciclina are o structur mai simpl, fr halogen n poziia 7 i fr hidroxil n 5. Tetraciclinele pot suferi unele modificri structurale fr pierderea activitii. Astfel, eliminarea grupelor funcionale din poziiile 5, 6, 7 nu afecteaz activitatea fiziologic, iar nlocuirea grupei -OH de la C6 din tetraciclin i oxitetraciclin cu un atom de hidrogen, are repercusiuni nensemnate asupra activitii. Compusul cel mai simplu din seria tetraciclinelor, care mai pstreaz nc activitatea antibacterian, este 6-desoxi-demetiltetraciclin, care nu mai conine nici o grup funcional la atomii de carbon din poziiile 5, 6, 7. Activitatea antibacterian este influenat de modificrile sterice i de poziia anumitor substituieni. Prin eliminarea oxidrilului din poziia 12 a" se obine 12 a"-desoxitetraciclina inactiv, iar deshidratarea grupei 2-carboxiamidic duce la tetraciclino-nitrili cu slab aciune fiziologic. Nitrilii reacioneaz cu morfolin, piperidin, pirolidin, aminoacizi (lizin) dnd produi solubili, cu activitate antibacterian i proprieti terapeutice apreciabile. 5.2. Biosinteza tetraciclinelor Cunoaterea mecanismului de biosintez a antibioticelor din aceast grup este una din problemele cele mai interesante sub raport teoretic i practic deoarece permite gsirea posibilitilor de dirijare a procesului spre formarea n exclusivitate a antibioticului urmrit. Cu toate eforturile depuse, problema nu este complet elucidat. Pentru elucidarea mecanismului de biosintez a antibioticelor ciclice, muli cercettori se sprijin pe teoria acetic a lui Collie i Birch, conform creia moleculele acidului acetic se unesc ntre ele dup modelul cap-coad" i apoi se ciclizeaz prin condensare aldolic (Kleisen). Birch a descris schema ipotetic de formare a sistemelor ciclice simple prin urmtorul mecanism:
R R CO CH2 CO COOH + CH3 COOH + CH3 COOH + CH3 COOH CH2 CO CH2 COOH
H2

- H2O

R CO CH2 CH CH2 CO CH2 COOH OH

R COOH HO HO III OH IV

COR HO

R OH

COR OH

OH

OH V

OH VI

Dac condenseaz un numr mai mare de uniti acetice se obin combinaii mai complexe. Pentru confirmarea ipotezei de mai sus, s-a introdus n mediul de cultur a microorganismelor productoare de tetracicline acid acetic cu carbon marcat i apoi s-au studiat produsele de descompunere a oxitetraciclinei formate. Studiile efectuate cu acid

100

acetic marcat au dus la concluzia c acidul acetic este precursor n biosinteza tetraciclinelor. Carbonul marcat din grupele metilice ale acidului acetic se regsete n molecula oxitetraciclinei n poziiile 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10 a, 11a, 12a, iar carbonul din grupele carboxilice n celelalte poziii (1, 3, 4a, 5a, etc):

R1 HO CH3 COOH
Streptomyces aureofaciens
7

R2
6

R3
5a
5

H H
4a
4

N(CH3)2
A
1

8
9

D
10

6a
10a

C
11

B
12

3
2

OH CONH2

11a

12a

OH

OH

OH

Datorit faptului c radioactivitatea inelului A este mai mic, s-a emis ipoteza c acest inel este format din acid glutamic i acid acetic, conform urmtoarei scheme: NH2 RO C O CH3 RO C O CH3 RO C O CH3 RO C O CH CH2 CH2 COOR HC3 C O OR HC3 C O OR HC3 C O OR HC3 C O OR

2 acetati + 2 acetati + 2 acetati + 1 acetat + 1 glutamat Rezultatele au artat c nici acidul glutamic nu explic scderea radioactivitii inelului A. Recent s-a reuit a se separar cu mutante un produs numit demetilpolicetidamida (VII), care supus apoi unor prelucrri ulterioare a condus la pretetramid (VIII) (nucleul de baz din tetracicline) i la protetron (IX):

101

OH OH O O O O

S - enzim

NH2

Ciclizare prin aldolizare si acilare intermolecular

OH CONH2 OH OH OH VIII OH

O O O O O VII

Calea normal a metabolismului

Ciclizare prin aldolizare si acilare intermolecular

S - enzim

O
+ H2O, O2

OH
O

NH2 O

- enzim

NH2

OH

OH

OH

OH

OH O O IX Protetron

Din protetron (IX) se poate trece uor la pretetramid sau produi nrudii, prin urmtoarele reacii: OH CONH2 OH O OH
O

OH O

NH2 O

OH

OH

x flu e r HI HBr sau fenol Zn pu lb er e

OH VIII

OH

OH CONH2 OH O OH X OH

XI Structura protetronei arat c gruparea carboxiamidic se formeaz ntr-un stadiu timpuriu i c policetidamida are structura propus mai sus. Calea de biosintez de la pretetramid la tetraciclin are un fundament experimental temeinic. Prepararea unui mare numr de derivai de pretetramid a permis testarea lor privind posibilitile transformrii, prin procedee biochimice, n tetracicline. Rezultatele obinute au dus la concluzia c pretetramidele constituie intermediari n biosinteza

102

tetraciclinelor, iar gruparea carboxiamidic i grupa 6-metil este introdus n caten naintea ciclizrii nucleului naftacenic. Dovada principal c 6-metilarea precede ciclizarea, o constituie faptul c obinerea antibioticului 6-metilat depinde de prezena sau absena metilului n poziia 6, n derivaii de pretetramid. Prezena substituientului 7-clor n antibioticul obinut (clortetraciclin) prin transformarea unei pretetramide poate fi explicat fie prin folosirea unui derivat clorurat de pretetramid, fie prin folosirea unui mutant care are capacitatea, genetic determinat, de clorurare. Dac se pleac de la o pretetramid neclorurat i se folosete un mutant de clorurare se obine clortetraciclin, fapt ce demonstreaz c procesul de clorurare are loc dup stadiul de formare a pretetramidei. Confirmarea faptului c intermediarii naftacenici sunt ntr-adevr implicai n biosintez normal a tetraciclinei, s-a obinut i prin descoperirea unei 4-hidroxi-6metilpretetramide (XII), a crui structur a fost stabilit folosind reaciile de oxidare i reducere n diverse condiii (schema I).
Cl CH3 OH CONH2 OH OH OH XIII OH

OH CH 3

N(CH3)2 OH CONH2 O
ol en x f , u HJ efl R

OH

O I

OH

OH

S. aureofaciens

CONH2 OH OH XII O OH OH OH

N aO

OH CH3

OH CH3 Rapid H2O2 + NaOH COOH COOH O XIV

XV

Schema I Prin reducere cu HI, la fierbere n fenol se obine 6-metilpretetramid (XIII) care se oxideaz rapid n soluie alcalin, la aer, ntr-o chinon (XV), iar aceasta la rndul ei se oxideaz uor cu H2O2 n mediu alcalin la acid antro-dicarboxilic 10,10-disubstituit (XIV), 4-hidroxipretetramidele prezint interes prin faptul c sugereaz calea prin care

103

Lent

OH

H2O2 + NaOH

H + Ra O pi 2 la d ca ld

CH3

OH

+ O2 H2 Na H O

gruparea 4-dimetil-amino este introdus n ciclu. n continuare se red calea de trecere de la 4-hidroxipretetramid la tetracicline. (Schema II).
CH3 OH OH O2 OH CH3 O OH CONH2 O Cl2

12a CONH2 OH OH XII OH OH OH OH O XVI

Cl

CH3

O OH NH3

Cl

CH3

NH2 CH3J

OH

OH

O XVII

OH

CONH2 O OH OH VIII O

OH

Cl

CH3

NH

CH3 OH CH3J CONH2

Cl

CH3

N(CH3)2 OH CONH2 O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Schema II

Prin hidroxilarea produs la C12a a 4-hidroxi-pretetramidei se obine 4-cetodedimetilamino-anhidro-tetraciclina (XVI), fapt ce confirm rolul ei n procesul de biosintez a tetraciclinelor. Aceast constatare stabilete n acelai timp c hidroxilarea la C4 precede hidroxilarea la C12a a 6-metilpretetramidei i c clorurarea la C7 are loc ntr-un stadiu ulterior hidroxilrii la C12a. Din 4 ceto dedimetilamino - anhidrotetraciclin se poate ajunge la tetraciclin sau la oxitetraciclin, prin urmtoarele faze: anhidrotetraciclin (XIX), anhidrooxitetraciclin (XX), dehidrotetraciclin (XXI), tetraciclin:

104

CH3

O OH NH3

CH3

N(CH3)2 OH Tetraciclin CONH2 O

CH3 HO
H H

OH

OH O XVI
H2

OH

CONH2 O CH3 H OH N(CH3)2 OH

O2

OH

OH

N(CH3)2 OH CONH2 O

Oxitetraciclin

OH

OH

O XXI

OH

CONH2 O OH O XX O

OH

Toate aceste procese de metilare, aminare, oxidare, reducere sunt realizate enzimatic n procesul de biosintez. Pentru determinarea cantitativ a tetraciclinelor se pot folosi cu succes metode titrimetrice, spectrofotometrice, colorimetrice, electrochimice, refractometrice i cromatografice. 5.3. Tehnologia de obinere a tetraciclinelor Tehnologia de fabricaie a tetraciclinelor const n fermentarea n profunzime a unor tulpini de Streptomyces aureofaciens folosind, pentru dezvoltarea microorganismului i producerea antibioticelor, un mediu complex n a crui compoziie intr, n general, surse de hidrai de carbon, surse de azot (organic i anorganic), sruri minerale, microelemente (ioni metalici), stimulatori, inhibitori, antispumani. Procesul de fermentaie a actinomicetului Streptomyces aureofaciens parcurge trei etape. Prima etap, de cretere intens a miceliului, are loc ntre 20 i 80 - 90 de ore de la nsmnare. Aceast etap se caracterizeaz prin consum rapid de glucoz i asimilarea azotului. A doua etap, care are loc ntre 90 i 120 de ore de la nsmnare, se caracterizeaz printr-o cretere lent a masei microbiene i mprirea miceliului n fragmente. n aceast perioad cantitatea de tetraciclin acumulat n lichidul de cultur este maxim. A treia etap, se caracterizeaz prin creterea cantitii de azot solubil n mediu i prin accelerarea uoar a formrii de NH3 care produce o cretere de pH. Apariia acestei etape indic terminarea procesului de biosintez. Streptomyces aureofaciens este capabil s utilizeze zaharoza, amidonul, glucoza, fructoza i galactoza, ns nu poate utiliza maltoza, lactoza, manoza i sorbitolul. Asimilarea zahrului de ctre S. aureofaciens este reglat de raportul dintre cantitile de zahr i azot din mediu. Dac acest raport este sub valoarea optim procesul de cretere respiraie i producere de antibiotic se desfoar cu viteze mici, iar n final cantitatea de antibiotic biosintetizat este mult diminuat. Factorul intracelular rspunztor de trecerea de la faza de cretere intensiv i asimilarea tuturor elementelor din mediu, la faza de producere a antibioticului, se presupune a fi scderea acidului dezoxiribonucleic (ARN) din protoplasm.

105

Proprietile fiziologice ale miceliului se modific continuu i la aceasta contribuie i coninutul n fosfor al mediilor de cultur. Pe de alt parte, exist suficiente date care cofirm c trecerea de la faza de cretere a S. aureofaciens la faza de biosintez a antibioticului, este determinat n mare parte de concentraia fosforului n mediul de cultur. De asemenea, datele din literatur demonstreaz ca antibioticul este biosintetizat numai de microorganismele ajunse la maturitate, iar ntre concentraia fosforului, viteza de cretere a biomasei i viteza de producere a antibioticului este o strns corelaie (figura 5.1).

Figura 5.1. Dependena vitezei specifice de cretere a masei celulare i a vitezei de elaborare a tetraciclinelor funcie de concentraia de fosfor i durata fermentaiei: I - 16 g fosfor/ml; II - 130 g fosfor/ml; III - 270 g fosfor/ml; IV - 580 g fosfor/ml.

Din figura 5.1 rezult c fosforul stimuleaz procesul de cretere a masei celulare, dar acest efect se manifest numai pn la o concentraie a fosforului de (40 50) 10-6 g/ml, dup care viteza de cretere a masei celulare rmne practic constant. Dac se urmrete influena concentraiei fosforului asupra vitezei de producere a tetraciclinelor, se constat c la concentraii mici stimuleaz acest proces, iar la concentraii mari l inhib (figura 5.1, curba IV). Calculndu-se viteza de cretere a masei celulare cu ecuaia Monod i viteza de formare a tetraciclinelor V cu ecuaia Michaelis Menten, funcie de concentraia fosforului (substrat limitativ) s-a demonstrat c mrind coninutul de fosfor de la 10 10-6 g/ml la 45 10-6 g/ml viteza de cretere a masei celulare crete de la 0,007 la 0,029 h-1, iar viteza de producere a tetraciclinelor scade brusc la creterea sau micorarea concentraiei de fosfor comparativ cu valoarea optim (concentraia optim este 30 10-6 g/ml). Este interesant de remarcat faptul c viteza maxim de producere a tetraciclinelor se obine n culturile care au viteza de cretere a biomasei de 0,02 - 0,03 h-1 (figura 5.2), ceea ce corespunde unei viteze de 3 ori mai mici fa de viteza maxim de cretere a masei celulare (tabelul 5.1).

106

Figura 5.2. Dependena dintre viteza de cretere a masei celulare i viteza de elaborare a tetraciclinelor: a - influena concentraiei fosforului; b - corelaia dintre viteza de cretere a masei celulare i viteza de elaborarea produsului Tabelul 5.1. Vitezele specifice de cretere a biomasei i de acumulare a tetraciclinelor funcie de concentraia de fosfor n culturile de Act. Aureofaciens Indici Glucoza (mg/ml) Azot amoniacal (mg/ml) Fosfor (mg/ml) Viteza specific de cretere, h-1 Viteza specific de acumulare a tetraciclinelor (g/mg/h) Condiii optime pentru creterea biomasei pentru biosinteza tetraciclinelor 11,4; 20,2 11,0; 16,8; 11,0; 16,8 0,87; 0,87 0,46; 0,46; 0,68; 0,68 65; 70 25; 28; 30; 27 0,079; 0,070 0,40; 0,42 0,024; 0,023; 0,021; 0,029 4,80; 4,50; 4,42; 4,22

Prin urmare, procesul de biosintez a tetraciclinelor trebuie condus la viteze mici de cretere a masei celulare, iar aceste viteze se regleaz prin meninerea concentraiei de fosfor la valoarea de (25 - 30) 10-6 g/ml. Asupra vitezei de cretere a masei celulare i de producere a tetraciclinelor influeneaz foarte mult i valoarea pH-ului. Pentru orice sistem de fermentaie a tetraciclinelor influena pK-ului poate fi descris prin una din ecuaiile: = max -

CS CH
2 2

K S + C S C H + K 1C S C H CS K1 C H = max = KS 1 + C + K + CS H 2 CS K3 CH K1 C H = max = KS 1 + + + C 1 + S C C +K K H 2 H 4
CS KH = max = K S + C S K H + C H K OH K OH + 1 CH

(5.1)

(5.2)

(5.3)

(5.4)

107

CS
= max =

K1 C H KS 1 + C +K + CS H 2

KH K H + CH

K OH K OH + 1 2
(5.5)

n care: K1, K2, K3, K4, KH, KOH sunt constante. Alegerea modelului matematic, care descrie cel mai corect influena pH-ului asupra vitezei de cretere a biomasei i de elaborare a tetraciclinelor, se face prin corelare cu datele experimentale.

Figura 5.3. Dependena intensitii respiraiei v, l CO2/ml i pH-ului funcie de concentraia glucozei n biosinteza tetraciclinelor : a - 2 mg/ml; 6 - 23 mg/ml; c - 45 mg/ml

Figura 5.4. Variaia vitezei de cretere a biomasei i de acumulare a tetraciclinelor funcie de pH: a - conform ecuaiei (5.6); b - conform ecuaiei (5.7).

Pentru cazul n care substratul limitativ este glucoza, aceast influen este descris cel mai fidel de ecuaia (5.4). Prin determinarea concentraiei optime a substratului (figura 5.3) i a constantelor KH i KOH i introducerea n ecuaia (5.4) se obin expresiile de calcul a vitezei de cretere a biomsei i a vitezei de formare a produsului:
5,64 10 6 5,64 10 6 + C H 16,6 10 6 16,6 10 6 + 1 CH

= max

(5.6)

108

10 ,6 10 6 v = V 10,6 10 6 + C H

6,1 10 6 6,1 10 6 + 1 CH

(5.7)

unde: max= 1,26 h-1 i V= 1,16 UI/mg miceliu/h. Reprezentarea ecuaiilor (5.6) i (5.7) demonstreaz c datele experimentale se nscriu pe curbele teoretice (figura 5.4), iar valorile optime ale pH-uli pentru creterea biomasei i producerea antibioticului snt cuprinse ntre 6 i 6,7. Necesarul de azot pentru Streptomyces aureofaciens este furnizat de substanele minerale i compuii organici cu azot; se utilizeaz sruri de amoniu, nitrai i substane organice bogate n aminoacizi. De asemenea, n procesul de biosintez se folosesc stimulatori de biosintez, ca de exemplu rodanura de benzil, care stimuleaz procesul de biosintez a clortetraciclinei (aureomicinei). Rodanura de benzil mrete randamentul n clortetraciclin i tetraciclin la tulpinile de nalt productivitate cu 50%. Efectul acestui stimulator este remarcabil n faza I de cultivare i se caracterizeaz printr-un grad mrit de utilizare a fosfatului i o intensificare a respiraiei. Efectul stimulator al rodanurii este mai pronunat la medii cu coninut mai ridicat n fosfat, unde metabolismul zahrului progreseaz rapid i este evident numai dac se adaug la nceputul procesului. Prin urmare, rodanura de benzil nu afecteaz direct viteza reaciilor enzimatice n cursul ciclului de fermentaie, dar produce o anumit modificare metabolic n cursul primelor ore de cultivare. De asemenea, s-a constatat c ionii de clor sunt aceia care dirijeaz i stimuleaz producerea de clortetraciclin; dac se urmrete obinerea tetraciclinei trebuie evitat prezena clorului. Pentru acesta ori se purific mediul de clor, dar metoda este foarte scump, ori se folosete un mediu adecvat, ca de exemplu extract de graminee, obinndu-se pn la 92% tetraciclin, ori se utilizeaz mutani ce blocheaz clorurarea (inhibitori de clorurare). O metod mai comod este efectuarea fermentaiei pe medii obinuite dar folosind substane care inhib clorurarea biochimic, ca de exemplu bromurile, iodurile i unii compui cu sulf. Parametrii optimi ai procesului de fermentaie a tetraciclinelor sunt: temperatura 271C, pH 6,5 - 6,8, viteza de agitare 110 - 120 rot/min, aeraie 0,6 - 0,8 l aer/l mediu/minut, presiunea n fermentator 1,2 - 1,3 ata. Din dinamica procesului de fermentaie, prezentat n figura 5.5, rezult c durata procesului de biosintez este de 125 - 130 de ore i coincide cu epuizarea componentelor mediului de cultur. Dup terminarea procesului de fermentaie mediul se aciduleaz cu acid sulfuric pn la pH 1,5 - 2, se filtreaz pe filtru pres, iar din lichidul obinut se separ tetraciclinele. Pentru separarea tetraciclinelor au fost ncercate metode cromatografice, extracia lichid-lichid i extracia cu solveni organici dintr-un complex al tetraciclinei cu acizi sau baze. Dintre metodele studiate, ultima este aplicabil pe scar industrial, deoarece ofer randamente bune.

109

Figura 5.5. Dinamica procesului de fermentaie a tetraciclinelor

Pentru complexarea tetraciclinei se folosesc curent acizi organici, hexametafosfat, uree i amoniac. Complexul format, fiind insolubil n ap, se filtreaz pe filtru pres i se prelucreaz n vederea obinerii tetraciclinelor pure. Pentru aceasta complexul se trateaz cu acid pn la pH 1,5 - 1,9, pentru solubilizare, dup care se trateaz cu o baz pn la pH 4 - 4,2 cnd precipit tetraciclin brut. Aceasta se filtreaz, se usuc i apoi se supune extraciei cu un amestec de acetat de butil-metanol (10:1). Din soluia de acetat de butil filtrat n prealabil de impuriti, tetraciclina se separ prin adugare de ap desalinat n proporie de 30 - 40% fa de volumul extractului. Tetraciclina cristalizat se filtreaz, se spal pe filtru cu clorur de metilen i se usuc la 40 - 45C. Randamentul de obinere a tetraciclinei pure din complex este de 75 - 80%. 5.4. Derivai ai tetraciclinei Administrarea tetraciclinelor numai pe cale oral nu a permis atingerea unor concentraii terapeutice n timp util, iar un tratament ndelungat cu tetraciclin duce la tulburri gastrice, colite, urticare, eritreme etc. Clorhidraii i srurile de tetraciclin au o slab toleran general i local deoarece sunt insolubile la pH-ul esutului, conducnd la depuneri care provoac leziuni. De aceea, se urmrete obinerea unor derivai de tetracicline solubile la pH-ul fiziologic, cu toxicitate redus i spectru asemntor tetraciclinelor i care pot fi utilizate sub form injectabil fr efecte secundare. O prim clas de compui o constituie complecii metalici cu Ca, Zn, Th:

110

R1 OH CH R2 3

N(CH3)2 OH CONH2

O Th O H HH

O Th

O HH

O HH XXII

O H

Complexul metal-tetraciclin se caracterizeaz prin solubilitate bun, aciune apropiat tectraciclinei i o mare stabilitate. n ultimul timp au aprut noi compui de tetraciclin, obinui, fie prin semisintez, fie prin substituii la gruparea 2-carboxiamidic, fie prin substituie n nucleul aromat. Cei mai importani derivai de tetracicline care substituie la gruparea carboxamid sunt: piridonometiltetraciclina (XXIII), denumit i reverin sau solvocilin, N-hidroxietil-piperazino-tetraciclin (XXIV) i l-lizinometil-tetraciclin (XXV): N(CH3)2 OH OH CONH O XXIII CH2 N CH2 CH2 CH2 CH2

CH2 N CH2 N(CH3)2 OH OH CO O XXIV NH CH2 N CH2

CH2OH CH2 CH2 N(CH3)2 OH OH CO O NH XXV CH2 NH2 (CH2)4 N COONa

Toi aceti produi se obin prin reacia de amino-metilare (reacia Mannich) a tetraciclinelor cu amine corespunztoare. Reacia se efectueaz de obicei n condiii cunoscute i anume: se solv tetraciclina ntr-un solvent potrivit (de preferin alcool alifatic inferior) i se trateaz stoechiometric cu amin secundar i cu aldehid formic:

111

NH

R1 R2 + Tetraciclin + CH2 O

N(CH3)2 OH OH CO O NH CH2 N

R1 R2

Dac n locul aldehidei formice se utilizeaz alte aldehide se obin derivai cu gruparea:

CO

NH

CH R3

R1 N R2

nlocuirea grupei CH3 de la C6 cu H duce la o simplificare a moleculei cu pstrarea activitii antibacteriene i la o cretere a stabilitii la acizi i baze, iar produsul obinut este denumit 6-demetiltetraciclin: R1 OH R2 N(CH3)2 OH CONH2 OH O OH XXVI 6-Demetiltetraciclina (XXVI) se obine prin fermentaie n profunzime n condiii speciale, utiliznd mutani care au mecanismul de metilare blocat, sau introducnd n mediul de cultur inhibitori de metilare cum ar fi: etionina, sulf-oxidul de metionin, metil-metionina, etc. Izolarea i purificarea 6-demetiltetraciclinei se face prin procedeele obinuite de separare i purificare a tetraciclinelor. nlocuirea grupei OH de la C6 cu H, are ca efect simplificarea moleculei, fr o diminuare apreciabil a activitii antibacteriene. 6-deoxitetraciclina se obine prin hidrogenarea catalitic a clorhidratului de tetraciclin n mediu de dimetilformamid-ap (1:1), utiliznd drept catalizator paladiu depus pe crbune. Din masa de reacie se separ 6-deoxitetraciclina cu = 6% i 6-deoxi-6demetiltetraciclina cu = 21%. 6-deoxi-6-demetil-tetraciclina este cel mai simplu compus din clasa tetraciclinelor care are activitate biologic. O

112