UC: Biologia Molecular Farmcia Noturno- 4 Termo

Profa. ILEANA RUBIO

e-mail: ilerubio@gmail.com

Moodle: Biologia Molecular biomol

Seminrios

Moodle: Biologia Molecular biomol

1- Transgnicos (animais ou plantas)- Defensores

2- Transgnicos (animais ou plantas) - Contra

3- Terapia Gnica - Defensores

4- Terapia Gnica - Contra

Aula 2

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR I

Programa

PURIFICAO DE DNA/RNA
ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

Pergunta do projeto: o que vou estudar?

Dogma Central da Biologia

Mutaes, nmero de cpias do gene: DNA

Expresso gnica: RNAm Protena Localizao celular: protena Atividade biolgica: protena

Material a ser utilizado

Cultura de clulas (bacteriana- clulas humanaslevedura etc). Amostra tecidos fresco e congelado
Amostra de tecidos em blocos de parafina Sangue perifrico

Programa

PURIFICAO DE DNA e RNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

Relevncia
Geralmente, a extrao de DNA o primeiro passo de uma anlise molecular:
Identificao de organismos Diagnstico de doenas Sequenciamento Clonagem Testes forenses

Extrao de RNA:
- Determinar expresso gnica

Consideraes Iniciais
Natureza do cido nuclico
DNA ou RNA Procarioto ou eucarioto Nuclear ou de organela Genmico ou plasmidial

Quantidade
Pureza

 O DNA e RNAs esto localizados no interior das clulas

Envolto por todas as estruturas celulares

necessrio isol-lo do contedo celular

DNA
cromossmicoplasmidial

RNAr RNAm RNAt

Eucarionte
DNA Cromatina RNAm
DNA

Citoplasma Membrana plasmtica Parede celular Cpsula

Procarionte
RNAr RNAt

Estratgias de extrao de DNA

1- Desintegrao dos tecidos

2- Extrao e Solubilizao do DNA

3- Processo de purificao
Fracionamento celular Extrao com Fenol Processos cromatogrficos
Troca inica Filtrao em gel Afinidade

Precipitao

1-Desintegrao dos tecidos

Aumento da superfcie de contato Usar foras mecnicas para romper a integridade do tecido e expor as clulas Quanto menor o tamanho dos fragmentos do tecido, maior ser a superfcie de contato e a exposio ao tampo de extrao Logo, mais eficiente ser a extrao

2- Extrao do DNA
Tampo de Extrao

Tem a funo de solubilizar os cidos nuclicos Pode auxiliar na lise das clulas, ncleos e organelas

Pode ocorrer simultaneamente ou no a desintegrao

(adio de Tampo de Extrao antes ou aps a desintegrao)

2- Extrao do DNA
Tampo de Extrao

Principais constituintes
Detergentes Proteases Quelantes de metais pesados Inibidores de nucleases Substncias tamponantes

2- Extrao do DNA
Tampo de Extrao
Detergentes
Dissolvem os lipdios das membranas (celular e nuclear) Dissociam as protenas dos cidos nuclicos Inibem ao das nucleases (desnaturao)
Regio hidrofbica
CH3
| |

No inico
CH3
| |

lauril

aninico
=
O

CH3 -C-CH2 -C

O(CH2 -CH 20)n H

CH3-(CH2)11-O-S-O- Na+
O

CH3 - Br | + CH3- (CH2)15 - N - CH3

|

CH3

CH3 CH3 Triton X-100 ou Nonidet P-40 n = 9 - 10

dodecil sulfato de sdio lauril sulfato de sdio SDS

brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamnio (cetil = hexadecil) CTAB

O
CH3

CH3- (CH2)10 - C - N - CH2 - C

|

CH3
HO

deoxicolato de sdio

lauroil sarcosinato de sdio sarcosil

HO

CH3

lauroil
+ O- Na

sarcosina

O O- Na+

2- Extrao do DNA
Tampo de Extrao
Detergentes
Hidroflica Hidrofbica Hidrofbica

2- Extrao do DNA
Tampo de Extrao
Proteases
Clivam as protenas que se ligam ao DNA e enzimas que degradam DNA e outras protenas.
(Pronase E ou Protenase K)

Inibidores de nucleases
DNases
A grande maioria depende de Mg2+ como cofator EDTA quelante Mg2+ e inibe ao das DNases

RNases
Muito estveis Resistem a desnaturao trmica No requerem cofatores Inibidores extremamente potentes DEPC (cancergeno)

Resultado: uma sopa formada pelos restos celulares, cidos nuclicos e contedo citoplasmtico

3- Purificao do DNA
Solvel (DNA) vs. Insolvel
O extrato obtido separando-se o material solvel (DNA) do material insolvel (restos celulares)
Centrifugao Filtrao

3- Purificao de DNA
DNA vs. outros solutos
Solventes orgnicos

Fenol (pH8,0) / Clorofrmio

Desnatura e extrai as protenas DNA na fase aquosa Protenas na fase orgnica

Dificuldades
Demorado Trabalhoso Txico Perde material

3- Purificao de DNA - Precipitao

Adio de sal (NaCl, NaOAc, NH4OAc, KOAc)
Os ctions monovalentes se ligam aos grupamentos fosfato do DNA, neutralizando suas cargas eltricas Evita a repulso eletrosttica entre as molculas de DNA, permitindo que elas se agreguem e precipitem

Adio de lcool (etanol, isopropanol)

O lcool promove a retirada das molculas de gua que revestem os cidos nuclicos, provocando a compactao das molculas
(grau de compactao: 9X)

Maior compactao, maior agregao

Incubao a -20C
Diminui agitao das molculas Facilita agregao

Centrifugao (30 min, 10.000 rpm, 4C)

DNA pellet

3- Purificao de DNA
Colunas de Troca Inica
(tipo aninica - matriz com carga +)

Slica ou DEAE

DNA se liga a slica

Lavagens sucessivas removem as impurezas DNA eludo da coluna Comparao
Mais rpido DNA mais puro Mais caro

Eluio
O DNA (pellet ou coluna) deve ser dissolvido/eludo em uma soluo de baixa fora inica (gua,TE) Esta soluo pode conter RNase para destruir o RNA presente

Sol I

Sol II

Sol III

Plasmdios
Minipreparao Plasmidial
(MiniPrep)- bactrias Soluo I: TE (lavagem) +lisozima digere certos carboidratos de alto peso molecular da parede celular Soluo II: SDS+ NaOH quebra as clulas e denatura todo o DNA Soluo III: AcK 3M pH~5 renaturao diferencial dos plasmdios Etanol Absoluto: Precipitao gua + RNAse: resuspender o DNA

Extrao de RNA
Controle da contaminao com RNases
Exgena
Manipulao: uso de luvas Solues: tratamento com dietil-pirocarbonato (DEPC) Vidraria: queimar por 3 horas a 250C Plsticos: descartveis e livres de RNase

Endgena
Adio de Inibidores de Rnases H2O DEPC

Lise das clulas: Trizol Separao das fases: Cloroformio Precipitao: Isopropanol

Programa

PURIFICAO DE DNA
ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

Enzima de Restrio
pela descoberta

das enzimas de restrio e suas aplicaes nos problemas de gentica molecular

Nobel de Fisiologia ou Medicina - 1978 Werner Arber
1929

Daniel Nathans
1928 - 1999

Hamilton O. Smith
1931

1968: Arber descreve a presena das enzimas de restrio em extratos de E. coli 1970: Smith descreve a primeira enzimas de restrio que corta o DNA em um stio especfico 1971: Nathans obtm o primeiro mapa de restrio
Smith, H. O. and K. W. Wilcox, A restriction enzyme from Haemophilus influenzae: Purification and general properties (1970 ) J. Mol. Biol. 51: 379-391.

A Guerra Natural
Bactrias vs. Fagos (bacterifagos)

Durante a infeco viral, para se defender, as bactrias precisam destruir o DNA invasor dos fagos sem afetar o seu prprio DNA

A Guerra Natural
As bactrias desenvolveram um sistema de defesa contra DNAs invasores Duas poderosas Armas
As Enzimas de Restrio As Enzimas de Modificao

Enzimas de Restrio
Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em stios especficos (stios de restrio) Tambm chamadas de endonucleases porque cortam o DNA internamente

Enzimas de Restrio
Cada espcie de bactria tem a sua enzima de restrio que reconhece um stio especfico

Mais de 3.000 enzimas de restrio j foram identificadas EcoR1 enzima da Escherichia coli corta em
Exemplo: EcoRI Gnero: Escherichia Espcie: coli Cepa: R 5--- G-A-A-T-T-C ---3 3--- C-T-T-A-A-G ---5

HindIII enzima da Haemophilus influenzae corta em

5--- A-A-G-A-T-T ---3 3--- T-T-C-G-A-A ---5

BglII enzima da Bacillus globiggi corta em

5--- A-G-A-T-C-T ---3 3--- T-C-T-A-G-A ---5

Enzimas de Modificao
Para garantir que apenas o DNA viral (invasor) ser degradado, a bactria modifica o seu prprio DNA nos stios que sero atacados pela enzima de restrio Sistema de Metilao (A ou C)

Enzimas de Modificao

Enzimas de Modificao
A bactria destri o DNA no-modificado com as enzimas de. Restrio, enquanto o seu prprio DNA esta protegido por ao de enzimas de modificao

Sequncia de reconhecimento das Enzimas de Restrio

Reconhece stios bipartidos e corta a distncia Cortam e metilam No disponveis comercialmente

S cortam Corte na sequncia de reconhecimento (4-6pb) (palndromo) ou muito prximo Disponveis comercialmente Cortam e metilam, Corte a 24-26 pb. Reconhecem stios no palindrmicos. No disponveis comercialmente

Stios de Restrio
Tamanho: 4 a 8 pares de base

7 8
Recombinant DNA, Watson e col.

Stios de Restrio
Freqncia em que ocorrem:

4n
onde n o nmero de pares de base no stio de restrio

4-base cutter: 44 =

256 bp

6-base cutter: 46 =

4,096 bp

8-base cutter: 48 = 65,536 bp

Stios de Restrio
So repeties invertidas (Palndromes- Maioria) (comerciais)
socorram me em marrocos subi no onibus

5----- G - A - A - T - T - C ----3
3----- C - T T - A - A - G ----5

Stios de Restrio
Por que um palndrome ?

As enzimas de restrio so dmeros formados por 2 subunidades idnticas

O eixo de simetria da enzima o mesmo da seqncia do DNA

Stios de Restrio

Stios de Restrio
As enzimas de restrio cortam cada fita do DNA na mesma posio do palndrome

Stios de Restrio
Os cortes das enzimas de restrio podem produzir
Extremidades abruptas (bunt-ends) Extremidades coesivas (stick-ends)

Stios de Restrio
As extremidades coesivas podem ser
5- protuberantes (5- overhangs) 3- protuberantes (3- overhangs)

5- protuberante

3- protuberante

BamHI
BamHI

5.ACTGTACGGATCCGCTA.3 3.TGACATGCCTAGGCGAT.5

BamHI
BamHI

5.ACTGTACGGATCCGCTA.3 3.TGACATGCCTAGGCGAT.5

BamHI

5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 3.TGACATGCCTAG GCGAT.5

BamHI

extremidades coesivas
(extremidades 5 protuberantes)

Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI 3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCG GATCCAATC.3 BamHI 3.ACGATCGCCTAG GTTAG.5 5.ACTGTACGGATCCAATC.3 3.TGACATGCCTAGGTTAG.5
BamHI

Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI 3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCA GATCTAATC.3 3.ACGATCGTCTAG ATTAG.5 5.ACTGTACGGATCTAATC.3 3.TGACATGCCTAGATTAG.5
BglII

BamHI BglII

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGATATCGCTA.3 3.TGACATGCTATAGCGAT.5

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3 3.TGACATGCTA TAGCGAT.5

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3 3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
extremidades abruptas
(Podem se ligar com outras molculas de DNA com extremidades abruptas)

Extremidades Abruptas
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3 3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
EcoRV

5.TGCTAGCCCC GGGAATC.3 SmaI 3.ACGATCGGGG CCCTTAG.5 5.ACTGTACGATGGGAATC.3 EcoRV 3.TGACATGCTACCCTTAG.5 SmaI

Reao com enzima de Restrio

1- DNA 2-Tampo ou Buffer especfico da enzima 3- Enzima de restrio 1ul DNA (1ug) 2ul Tampo2 (10X) 1uL EcoRI (1U/uL) 16ul H2O 20uL
Concentrao final na reao

Incubar 2hs 37oC

Tampo= 1X Enzima= mximo 10%

Programa

PURIFICAO DE DNA
ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

DNA Ligase (enzima de modificao)

Quando molculas de DNA com extremidades coesivas se unem, apenas pontes de hidrognio so formadas entre os nucleotdeos complementares Estas pontes de hidrognio no so estveis o suficiente para serem permanentes A DNA Ligase une as extremidades das molculas de DNA e re-estabelece a ligao fosfodiester

Ligao Fosfodiester
3-hidroxila da desoxirribose (nt 1) + grupo fosfato (nt 2)
Fosfato Base nitrogenada

C3

Desoxiribose

C5

DNA Ligase

DNA Ligase

Pareamento das bases complementares

DNA Ligase

Ligao fosofdiester refeita

Programa

PURIFICAO DE DNA
ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

Eletroforese
Definio
Um mtodo usado para separar macromolculas como cidos nuclicos (DNA e RNA) e protenas Mtodo baseado na migrao destas molculas atravs de um suporte sob influncia de um campo eltrico a velocidade de migrao depende do tamanho, da forma e da carga eltrica total da molcula

Eletroforese
A corrente eltrica ao passar atravs do suporte cria um campo eltrico

O DNA tem carga negativa (fosfatos) e por isso repelido do polo negativo (anodo) e atrado pelo polo positivo (catodo)
A corrente eltrica aplicada fora os fragmentos de cidos nuclicos a se mover atravs do suporte

Biologia Molecular, Turner e col.

Eletroforese
Aparato
Cuba de eletroforese Fonte Rack do gel (barquinha) Pentes
Fonte

Cuba Rack

Pentes

Eletroforese
Suporte
Gel para separao dos cidos nuclicos Agarose ou Acrilamida

Funcionam como esponjas (polmero), retardando a passagem das molculas conforme seus tamanhos

Agarose
Polissacardeo linear extrado de algas Repeties de Agarobiose
D-galactose 3,6-anhydro L-galactose
D-galactose 3,6-anhydro L-galactose

Substncia gelatinosa, slida a temperatura ambiente Precisa ser aquecida para gelificar
Temp. fuso: 66C Temp. gelificao: 30C

Agarose
Agarose solidificada porosa, permitindo a migrao dos cidos nuclicos
Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (11 m)

Poli-Acrilamida
Poli-Acrilamida
Acrilamida (linear) Bis-acrilamida (cross-linker)

Possui poros menores que a agarose Ideal par separao de fragmentos pequenos de DNA e protenas

Eletroforese
Tampo de Corrida
Fornece a fora inica para passagem da corrente eltrica

Composio
Agente Tamponante (Tris-HCl) Sal (Borato, Acetato, Glicina) Quelante (EDTA)

Tampo TAE

(Tris - Acetato - EDTA)

Tampo TBE (Tris - Borato - EDTA)

Tampo SB

(Sdio - Borato)

Velocidade de migrao
A migrao dos cidos nuclicos depende apenas do seu tamanho Molculas menores migram mais rpido que as molculas grandes Vai depender tambm
Intensidade do campo eltrico (voltagem) da fora inica do tampo de corrida da concentrao do gel (-)

(+)

Fazendo um gel de agarose

O gel de agarose preparado combinando-se agarose (p) e tampo O tampo o mesmo que ser utilizado na eletroforese (tampo de corrida) Normalmente se usa concentraes de 1 a 3%
p.e. gel 1% (1g de agarose + 100mL de tampo)
Tampo

Agarose

Fazendo um gel de agarose

Agarose insolvel a temperatura ambiente Precisa ser aquecida (>70C) para ser dissolvida (2min. microndas)

Fazendo um gel de agarose

Esfriar o gel (~45C)

Derram-lo no rack (barquinha)

Evitar a formao de bolhas
Os pentes devem ficar submersos no gel Os pentes vo formar os poos onde o DNA ser aplicado

Colocar os pentes

Fazendo um gel de agarose

Quando fria, a agarose polimeriza (gelificao) 30-40 minutos Os pentes devem ser retirados

Fazendo um gel de agarose

Transferir o gel para a cuba de eletroforese

Cobrir o gel com o Tampo de Corrida

Preparando as amostras
Tampo de Amostra
Glicerol (aumenta a densidade)
permite que o DNA permanea no poo

Corante
(Azul de bromofenol ou Xileno Cianol) Permite a visualizao das amostras Permite avaliar o tempo de corrida

Carregando o gel
As amostras so aplicadas em cada um dos poos do gel

Correndo a eletroforese
Ao aplicar um campo eltrico, as amostras iro migrar em direo ao plo positivo

Correndo a eletroforese
O corante migra junto com as amostras, permitindo a visualizao da corrida

(-)

DNA (-)

(+)

Corando o Gel
Radiao

Brometo de Etdio
Corante fluorescente visualizado quando excitado por luz UV Intercalante de DNA Permite visualizao do DNA

Pode ser adicionado ao gel (antes da gelificao) ou o gel pode ser corado aps a corrida Mutagnico

Alternativas para o Brometo de Etdio

SYBR Gold Vantagens
Baratos Menos txicos

SYBR Safe
Gel Ready

Wards - QUIKView DNA Stain Carolina BLU Stain

Desvantagens
Menos sensveis Necessita maior quantidade de DNA no gel Maior tempo de colorao / descolorao

SYBR Gold

QuikVIEW stain

Corando o Gel
Submergir o gel na soluo de colorao Aguardar alguns minutos (20-30) Remover o excesso de corante com gua

Visualizando DNA
Transiluminador de UV

Tamanho dos fragmentos de DNA

(-)

DNA migration

bromophenol blue

(+)

Tamanho dos fragmentos de DNA

Padro de peso molecular
(DNA Ladder )

(-)
12.000 bp
5.000 4.000 3.000 2.000 1.650 1.000 850 650 500 400

Fragmentos de DNA com tamanhos conhecidos

Permite a determinao do tamanho dos fragmentos de DNA submetidos a eletroforese DNA migration

bromophenol blue

300 200 100

(+)

Eletroforese
uma importante ferramenta da Biologia Molecular

Pode ser usada para:

identificar molculas especficas de DNA obtidas aps digesto com enzimas de restrio Comparar genomas Cincia forense

Eletroforese
Pode ser til para a avaliao da integridade de uma amostra de DNA DNA genmico de alta qualidade
>95% alto peso molecular Banda intacta prxima ao topo do gel Pouca evidncia de fragmentos pequenos (smear)

Avaliar se a reao funcionou

Eletroforese
Horizontal Vertical

Gel running

Power Supply

Gel running

Programa

PURIFICAO DE DNA
ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO DNA LIGASE ELETROFORESE SOUTHERN BLOT

Como?
Como saber se uma determinada seqncia de DNA esta presente no genoma de um organismo? Como determinar o nmero de cpias de um dado gene no genoma de um organismo?

Southern Blot
1975: Edwin M. Southern
Eletroforese em Gel + hibridizao

Southern Blot
Para anlise de DNA Geralmente utilizada para determinar presena, tamanho e numero de cpias

Hibridizao de DNA

Por: 1-Aumento de temperatura; 2- PH extremo de pH (pH alcalino) Renaturao: ocorre quando se volta s condies fsico qumicas iniciais (lentamente)

Temperatura de melting
Temperatura na qual 50% do DNA est denaturado

Quanto maior a porcentagem de pares GC, mais difcil a desnaturao

TM = 2C(A+T) + 4C(G+C) Molculas pequenas

Southern Blot Parte I

Extrair o DNA do organismo

(Gel)

Digerir o DNA com uma Enzima de Restrio

Corte freqente (stio de restrio = 4nt)
Sau3A1 - a cada 256 nt Genoma humano 3.3 bilhes de nt ~12 milhes de fragmentos gerados

Eletroforese em gel de agarose

Smear (arrasto)

Southern Blot Parte II

(Transferncia)

Os fragmentos de DNA devem ser transferidos para uma membrana (nylon ou nitrocelulose) com afinidade pelo DNA (carga +) O gel imerso em uma soluo alcalina para desnaturar as molculas de DNA Recoberto pela membrana e por papel absorvente (sanduche) A soluo de transferencia passa atravs do gel arrasta o DNA para a membrana
(capilaridade)

Southern Blot Parte III

(Hibridizao)

Para identificar um fragmento especfico necessrio usar uma sonda que o reconhea Sonda pequeno fragmento simples-fita de DNA complementar a regio de interesse A sonda deve ser marcada com radiao (32P)

ATGGCATGGACC Sonda marcada* GTCATATGTGTTCATGGCATGGACCGAGTCAATATGCGGCT ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::: CAGTATACACAAGTACCGTACCTGGCTCAGTTATACGCCGA

Southern Blot Parte III

(Hibridizao)

Southern Blot Parte III

A membrana contendo o DNA incubada com a sonda A sonda ir parear com a regio complementar a sua seqncia
(regio de interesse)

(Hibridizao)

O excesso de sonda removido atravs de lavagens sucessivas A membrana exposta com um filme de Raio X (Auto-radiografia)

Southern Blot Parte IV

(resultado)

DNA corado com brometo de etdio

Auto-radiografia da membrana hibridizada

Southern Blot
DNA + enzima de restrio Fragmentos de restrio Membrana Gel

Esponja

Soluo alcalina

Digesto com Enzimas de Restrio

Membrana

Eletroforese

Transferncia

Filme Remover excesso de sonda Soluo contendo a sonda Expor com Filme de Raio X

Hibridizao com sonda radioativa

Auto-radiografia

Northern Blot
No foi inventado por uma pessoa chamada Northern Semelhante ao southern blot, s que no gel so submetidas a eletroforese amostras de RNA e no de DNA Utilizado na anlise de RNAs Geralmente utilizada para determinar
o tamanho de um transcrito a presena de um transcrito (tecido-especificidade ou distribuio temporal) a quantidade de transcrito produzido (nvel de expresso gnica)

Sonda: fragmento de DNA (sem ntrons) ou de RNA O RNA deve ser desnaturado (evitar estrutura secundria)

A eletroforese deve ser em condies desnaturantes

Northern Blot
Avaliando a presena de um transcrito em diferentes tecidos de um organismo (expresso
gnica espacial)
Gel de agarose corado com brometo de etdio

Auto-radiografia aps hibridizao com sonda redioativa

Northern Blot
Avaliando a quantidade de transcrito produzido em um determinado tecido ao longo do tempo (expresso gnica
temporal)
12 h 48 h 96 h

aps tratamento com fator de diferenciao celular

Westhern Blot
No foi inventado por uma pessoa chamada Westhern

Semelhante aos Southern e Northern blots, s que no gel so submetidas a eletroforese amostras de protenas e no de DNA ou RNA
Utilizado na anlise de PROTENAS Geralmente utilizada para determinar
o tamanho de uma protena a presena de uma protena a quantidade uma protena produzida A integridade de uma determinada protena

Sonda: anti-corpo

Westhern Blot
tumor 2 tumor 3 tumor 1

p53
tubulin

normal

Avaliando a presena de uma protena em diferentes tecidos e a sua integridade

Westhern Blot

Gentica Humana Ileana Rubio UNIFESP

Com anticorpos marcados

Exerccios
1- Voc gostaria de analisar os nveis de expresso do gene que codifica a protena A de um fungo em resposta ao estresse hipertrmico. Que metodologias poderia utilizar? 2- Escreva como prepararia as solues para extrair DNA de plasmdio de bactria (miniprep). As solues pedidas no protocolo so as seguintes: Sol I: 50mM de Glicose (PM 180,16g/mol), 10mM EDTA (PM 372.24), 25mM TRIS pH 8. Sol II: 0,2M NaOH, 1% SDS Sol III: NaAc 3M pH4.8, ajustar com cido actico glacial. O laboratrio possui as seguintes solues em stock: TRIS pH8 1M; SDS 0,5M; os outros reagentes esto em p.

3- Voc fez uma digesto com BamHI e outra com BamHI e SspI (ambos stios nicos) do plasmdio pUC18. Quantas bandas voc espera aps uma eletrofores em gel de agarose, qual o tamanho de cada uma delas

Plasmdios

Minipreparao Plasmidial (MiniPrep)

1,5mL

1- Incular a bacteria contendo o plamdio em 3mL de meio de cultura 2- No dia seguinte tranferir 1,5mL para tubo epp Centrifugar 30 seg 12000rpm Descarta o sobrenadante 3- Adicionar 300ul sol 1 (TE) (resuspender)

3mL

4- Adicionar 300ul sol 2 (NAOH)

Inverter 4 X Incubar 5 min Temp Amb 5- 300ul sol 3 (KAc 3M pH=5) Inverter 4 X Incubar 5 min gelo 6- Centrifugar 10 min 12000rpm 4oC

7- Transferir o sobrenadante para tubo limpo

8- Purificar por coluna, precipitao