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PRODUO DE ENZIMAS MICROBIANAS

PRODUO INDUSTRIAL DE ENZIMAS A produo de enzimas em escala industrial se faz por fermentao. A figura 1 mostra o conjunto de processos necessrios produo de enzimas comerciais. Considerando o processo fermentativo como referncia, posto que ele concorre para a produo do produto alvo, pode-se denominar os demais como processos a montante (upstream) ou a jusante (downstream). PROCESSOS A MONTANTE (upstream) da fermentao Poucos so os processos prvios fermentao, no caso da produo de enzimas, um dos mais importantes o preparo do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculo com a cultura estoque liofilizada. Controles nas transferncias para observar os seguintes aspectos: - presena de contaminao; - infeco por bacterifagos; - proliferao de mutantes de menor eficincia. O nmero de transferncias deve ser reduzido ao mnimo possvel.

Cultura estoque

Crescimento em frascos agitados

Pr-inoculo fermentador Fermentador principal

Preparo do meio

esterilizao

separao concentrao purificao acabamento

O PROCESSO FERMENTATIVO A linhagem microbiana utilizada industrialmente fruto de trabalho de melhoramento e portanto sigilosamente protegida.

2 A manuteno da linhagem requer um trabalho constante de microbiologia. Cuidados importantes estocagem e manuteno para reproduo de resultados experimentais em trabalhos de pesquisa. Do ponto de vista industrial, os m. sint., so muito caros, a opo feita por meios que contenham mat. Primas da agroindstria. Meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrognio, subst. Minerais e fatores de crescimento. Composio do meio de cultivo usado industrialmente (sigilosos). A literatura indica os constituintes empregados. Fontes de carbono e energia farinhas amilceas, licores de milho, soja, melaos. Fontes de nitrognio farinha de peixe, gelatinas, licores de milho e soja. Fatores de crescimento e micronutrientes: extrato de levedura, licor de milho, farinhas de sementes oleaginosas. Fermentao: Fermentadores, mecanicamente agitados. Meios concentrados pode conduzir a elevada viscosidade. Com isso a energia gasta para agitao e aerao pode incidir sobre o custo final do produto. A utilizao de tais meios, pode provocar formao de espuma (utilizar antiespumantes). Produo industrial de enzimas ocorre em fermentadores capacidade 10.000 a 100.000 litros, modo descontnuo (batelada). Fermentadores apresentam: - camisas ou serpentinas internas para aquecimento e refrigerao; - sistema de medidas sensores de pH, temperatura, oxignio dissolvido, espuma. Durao 30 a 150 horas (ferment. Em bat para prod de enz.). Atividade enzimtica parmetro de controle mais importante para finalizar fermentao. Quando esta muito demorada (tempos de resposta longos), outros parmetros de processo so utilizados para caracterizar o fim do processo de fermentao (pH, oxignio dissolvido). Importante O trmino de fermentao no apenas ditado pelo valor de atividade enzimtica; outros fatores como: - caractersticas do caldo para promover a recuperao eficiente da enzima; - durao do ciclo operacional para melhor aproveitamento da planta industrial;

3 so determinantes para a otimizao do tempo de fermentao. PROCESSO A JUSANTE (downstream) da fermentao A figura mostra as etapas envolvidas na recuperao e processamento ps fermentao. No diretamente comercializado caldo fermentado livre de clulas, sem processamento adicional. Muito comercializado a enzima de interesse recuperada do caldo fermentado , purificada at um certo grau. Etapas de separao e purificao: Finalidade: - remover substncias txicas Para a obteno de preparao enzimtica de uso farmacutico, processos mais sofisticados de purificao, como as separaes cromatogrficas, so utilizadas. ETAPAS INICIAIS DE SEPARAO E CONCENTRAO Enzimas: - o caldo resfriado a ~ 50 C, com o objetivo de - assegurar condies de estabilidade do produto; - evitar crescimento de mos contaminantes; - pH ajustado para valor timo da atuao da enzima produzida. Separao das clulas: - pode ser feita : - centrifugao; - filtrao. Fungos centrifugao; Bactrias e leveduras prvia floculao (cloreto de sdio); eficiente; baixo custo. A filtrao, como alternativa a centrifugao utilizao de filtros prensa, filtros rotativos vcuo. Soluo concentrada filtrao em meio filtrante de celulose preparado enzimtico lquido diludo e acondicionado com estabilizantes da atividade enzimtica embalado para comercializao. ETAPAS FINAIS DE PRODUO: PURIFICAO E ACABAMENTO partir da obteno de um concentrado enzimtico: Concentrado lquido produto bruto comercializvel em certos mercados. Diversas razes (aplicao, transporte, estocagem) pode ser prefervel a obteno de um preparado enzimtico bruto na forma slida.

4 O concentrado deve ser seco vcuo ou por atomizao (spray drying). Produto final no pode apresentar baixa granulometria, pois a risco de gerao de poeira (sade dos trabalhadores manuseiam as preparaes em p). Aglomerao para obter partculas maiores, faixa de 200 500m. Para obter maior grau de pureza submeter o concentrado lquido a tcnicas de fracionamento e purificao. Tcnicas que utilizam membranas: - ultrafiltrao; - microfiltrao; - osmose inversa. Desvantagem - no apresentam alta seletividade. Portanto utilizado em combinao com outras tcnicas ou nas etapas de concentrao de solutos. Tcnicas cromatogrficas Busca de maior grau de pureza do produto Cromatografia de troca inica utiliza resinas a base de celulose, gis de dextrana. Alta seletividade, porm tempos de processamento elevados. Cromatografia de filtrao em gel critrio de separao tipo e tamanho da molcula. Utiliza polmeros de ligao cruzada com dimetros de poros estabelecidos e apresenta alta seletividade. Cromatografia de afinidade baseia-se na ligao bioespecfica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores). Alta seletividade, aplicada em laboratrio (restrio) Exemplos de protenas purificadas por processos cromatogrficos: - insulina; - malato desidrogenase; - glicoquinase. Grau de purificao desejado est associado aplicao do produto. No mercado: Disponveis - preparaes pouco purificadas para uso tcnico ou industrial; - preparaes de alto grau de pureza para uso analtico ou farmacutico.