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Bioqumica
INGENIERA AMBIENTAL.
INDICE
Bioqumica ambiental ............................................................................................. 3 Caracterizacin de la asignatura (Aportacin al perfil de la carrera ........................ 3 Objetivo(s) general(es) del curso ............................................................................ 3 Intencin didctica................................................................................................... 3 Normas de laboratorio para esta materia. ............................................................... 4 Practica 1 Propiedades inicas de los aminocidos................................................ 5 Practica 2 Identificacin de aminocidos y protenas .............................................. 8 Practica 3 Cromatografa en capa fina y/o papel................................................... 11 Practica 4 Determinacin aproximada del punto isoelctrico de una protena ...... 14 Practica 5 Solubilidad y desnaturalizacin de protenas ....................................... 16 Practica 6 Actividad de la amilasa sobre el almidn .............................................. 18 Practica 7 Identificacin de carbohidratos ............................................................. 21 Practica 8 Separacin de plsmidos en geles de agarosa .................................... 25
Objetivo(s) general(es) del curso Conocer la composicin molecular de los materiales biticos, analizar los fenmenos bioqumicos identificando la relacin entre la estructura qumica y funcin de los sistemas biolgicos, y vinculndolos con el estudio integral y comprensin del metabolismo para su aplicacin en el aprovechamiento de recursos biticos.
Intencin didctica.
Se organiza el temario, en siete unidades, introduciendo al estudio de la bioqumica su Aplicacin e importancia en la primera unidad, as como conocimiento general de la estructura, funcin e importancia de las biomolculas como bases moleculares para la vida, y a los procesos metablicos durante el desarrollo de las ltimas cinco unidades. Se inicia el curso con los antecedentes histricos y conceptuales de la bioqumica, permitiendo comprender la importancia del estudio de los procesos bioqumicos que ocurren al interior de la clula independientemente del material biolgico de que se trate, se hace un recorrido a travs del tiempo sobre los avances y aportaciones de esta disciplina al estudio cientfico y ciencias relacionadas, se analizan diversos artculos con rigor cientfico sobre temas de actualidad en donde se est aplicando la bioqumica y se brindan los contenidos conceptuales sobre la estructura qumica, clasificacin, reactividad, funcin e importancia de las biomolculas que servirn de fundamento para la comprensin de los procesos bioqumicos.
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CONSIDERACIONES IMPORTANTES Normas de laboratorio para esta materia.
La puntualidad y asistencia al laboratorio son obligatorias. Una falta sin justificar equivale al incumplimiento del instrumento a evaluar y por lo tanto no se recibir el reporte de prctica.
No se puede abandonar la sesin de prcticas sin permiso. Antes de empezar la prctica el profesor realizara las indicaciones pertinentes para el buen funcionamiento de la misma. Es obligacin del alumno: Traer su bata blanca de manga larga. Sin esta no se permitir el acceso al laboratorio. Leer previamente la prctica del manual proporcionado por el profesor Ante cualquier duda preguntar al profesor. Comprender los aspectos tericos y experimentales correspondientes para el buen funcionamiento de la prctica. Trabajar solo en la mesa que se le ha asignado Al inicio de la prctica se entregara material de laboratorio a cada equipo y ser su obligacin mantenerlo limpio y libre de deterioro. En caso de deterioro de algn material avise a su profesor. Al trmino de cada prctica el alumno lavara el material y lo dejara en donde se le indique, adems deber dejar su mesa de trabajo ordenada y limpia.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: bioqumica ambiental No. Prctica: 1 Titulo de la Prctica: Propiedades inicas de los aminocidos
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titular la muestra con NaOH 1N de la misma manera que para la titulacin con cido hasta que el pH de la solucin llegue a12. Observe y registrela solubilidad de la muestra durante la titulacin. Tambin titular a 20 ml de agua (blanco) con NaOH 1N hasta pH 12.0 de manera similar que el primer blanco. Reporte 1.- Hacer una tabla de resultados para cada titulacin: Muestra con NaOH, Agua con NaOH, Muestra con HCl, Agua con HCl. 2.- Dibujar la curva de titulacin verdadera siguiendo el siguiente procedimiento: Para determinar la curva de titulacin verdadera de cualquier sustancia, se debe medir cunto cido o base se consume al titular el solvente (agua) en cada pH y entonces restar esta cantidad de la cantidad total de cido o base consumida para alcanzar ese pH: Titulacin del lado cido. Construccin de la grfica El siguiente ejemplo con el lado cido de la titulacin de un aminocido ilustra uno de varios de los mtodos disponibles para corregir por dilucin. Para la muestra y el blanco de agua, graficar el volumen del cido adicionado contra el pH alcanzado (Fig. 1).
De la grfica o de los datos originales, preparar una tabla como la Tabla 1. Restar el volumen del cido requerido para llevar el blanco de agua a cualquier pH del volumen del cido requerido para llevar la muestra al mismo pH. La diferencia representa la cantidad de cido consumida en la titulacin de la muestra solamente. Usando los datos de su tabla, graficar el pH contra el nmero de equivalentes de cido necesario para titular la muestra del aminocido a cualquier pH (ver Fig. 2).
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Fig. 2 representa la cantidad de cido requerida para titular un grupo ionizable Titulacin del lado bsico. Para corregir por dilucin el lado bsico de la curva se puede aplicar un mtodo similar. Preparar una curva de titulacin completa y corregida para el aminocido titulado. Tabla 1.
El nmero de equivalentes de cido o base consumidos al pasar a travs de la inflexin de una curva, como en la Fig. 2, representa la cantidad de cido requerida para titular un grupo ionizable en la cantidad del aminocido que se ha ensayado. El punto final de la titulacin se debe reconocer como el punto en que se eleva (o cae) drsticamente el pH con la adicin del titulante. Este punto generalmente se determina con ms precisin de la curva de titulacin del aminocido con la base. Cuestionario 1. Usando la ecuacin de Henderson Hasselbalch, calcular el pKa de cada grupo ionizable titulado. 2. Coincide con el pKa reportado en los libros? 3. Como se podra confirmar la identidad del aminocido? 4. Dibujar la curva que se esperara en la titulacin del cido asprtico y la que se esperara en la titulacin de la lisina, sealando las especies predominantes en cada regin. Bibliografia 1. Clark, J.M and R. L. Switzer. 1977. Experimental Biochemistry. W.H. Freeman and Company
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Materia: Bioqumica ambiental Titulo de la Prctica: Error! Marcador no definido.
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Materiales y mtodos Materiales cido ntrico concentrado hidrxido de sodio 10M cido sulfrico concentrado cloruro mercrico 0.2 M (HgCl2) acetato de plomo 0.2 M (PbC2H3O2) ninhidirina al 0.1% sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) tartrato doble de sodio y potasio (NaK C4H4O6.4H2O) Hidrxido de sodio 10%, polvo de magnesio cido oxlico, cido actico glacial. Muestras: solucin de aminocidos y de protenas 30 tubos de ensaye de 18x150 6 pipetas de 5 ml 2 pipetas de 10 ml 1 mechero 1 gradilla 1 pinzas para tubo de ensaye.
Preparacin de los reactivos Reactivo de Hopkins-Cole: Colocar 10 g de polvo de magnesio en un matraz erlenmeyer de 1 litro y aadir agua destilada hasta que cubra completamente el magnesio. Agregar lentamente 250 ml de una solucin saturada en fro de cido oxlico, agitar bien enfriando si es necesario. Filtrar y acidificar con cido actico glacial, diluyendo a 1 litro con agua destilada. Reactivo de Milln: Disolver 10 g de mercurio en 20 ml de cido ntrico fro. Cuando la disolucin se completa y haya cesado el desprendimiento de humos pardos, adicione 60 ml de agua. Despus de varias horas, decantar el lquido sobrenadante y guardar en un frasco obscuro. Preparacin alternativa: Prepare una solucin v/v de sulfato mercrico al 15% en cido sulfrico al 15%. Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de tartrato de sodio y potasio en 500 ml de agua en un matraz volumtrico de 1 lt. Adicionar 300 ml de hidrxido de sodio al 10% y aforar a 1l con agua destilada. Ninhidrina: Disolver 0.1 g de ninhidrina en 100 ml de n-butanol Mtodos Reaccin de cido glioxlico (Reaccin de Hopkins-Cole).Coloque 2 o 3 ml de muestra en un tubo de ensaye y adicione igual volumen de solucin de cido glioxlico, CHO COOH.H2O (reactivo de Hopkins-Cole) y mezclar. Inclinar el tubo y permitir que 5 6 ml de cido sulfrico concentrado resbale lentamente por las paredes del tubo, llegando al fondo y estratificando. Observe el color producido en la zona de contacto entre los dos lquidos. Si el color no aparece despus de unos minutos, el tubo puede girase suavemente para producir un mezclado suave de los lquidos en la interfase.
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Prueba de Milln: A 2 ml de la muestra aada 5 gotas de reactivo de Milln, mezcle bien y caliente cuidadosamente durante 30 segundos sobre una pequea flama. El reactivo produce un precipitado blanco que por la accin del calor se torna un color rosado o rojo ladrillo. Un exceso de reactivo produce un color amarillo que no es una prueba positiva. Prueba Xantoproteica: Agregue cuidadosamente 1 ml de cido ntrico concentrado, a 3 ml de cada una de las muestras. Mezcle bien y caliente ligeramente a la llama del mechero, observando el color desarrollado. Enfre la solucin al chorro del agua y cuidadosamente aada gota a gota y con agitacin NaOH 10M o NH4OH conc. hasta que el lquido sea fuertemente alcalino. observe el color. Reaccin de Biuret: Aada 1 ml del reactivo de Biuret a 5 ml de las muestras y mezcle bien. Anote los colores desarrollados por cada una de las disoluciones. Reaccin de la ninhidrina (reaccin con hidrato de tricetohidrindeno):En una serie de tubos de ensaye, coloque 3 ml de las muestras y adiciones 0.5 ml de la solucin de ninhidrina al 0.1%. Mezcle bien y caliente a ebullicin directamente a la llama del mechero. Dejar enfriar. Si la prueba es positiva se desarrolla un color azul. La muestra debe tener un pH entre 5 y 7. Se puede usar unas gotas de piridina o de cristales de acetato de sodio para ajustar el pH. Precipitacin con sales metlicas. (a) Tomar 3 ml de la muestra y alcalinizar ligeramente con NaOH diluido, enseguida agregar 5 gotas de cloruro mercrico y observar. (b) Tomar 3 ml de la muestra y alcalinizar ligeramente con NaOH diluido , enseguida agregar 5 gotas de acetato de plomo 0.2 M y observar. Cuestionario 1. Dibujar la estructura de los aminocidos tirosina, triptofano, fenilalanina, y de los aminocidos ensayados. 2. Da un ejemplo (usando frmulas qumicas) de la reaccin que se lleva a cabo entre uno de los aminocidos (cualquiera) que usaste y los reactivos que usaste para identificarlos (Prueba de Milln, Reaccin de la ninhidrina etc.). 3. Si tienes tres muestras biolgicas no etiquetadas, en la cual una de ellas es un carbohidrato, otra un lpido y otra una protena; cual prueba usaras para identificar rpidamente cual es la protena?. Bibliografa 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice.1st edition. Waveland Press, Inc. USA.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: Bioquimica ambiental No. Prctica: 3 Titulo de la Prctica: Cromatografa en capa fina y/o papel
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Materiales y mtodos Materiales Estufa bomba de vaco aspersor placas de slica gel y/o tiras de papel para cromatografa, secador para pelo micorpipetas cuba para cromatografa vaso de precipitados Ninihidrina Butanol cido actico glacial aminocidos Mtodos Preparacin del disolvente : Mezclar butanol, cido actico glacial y agua en la siguiente proporcin: 60: 15: 25, por volumen. Preparacin del revelador Solucin de ninhidrina: disolver 200 mg de ninhidrina en 100 ml de acetona. Se conserva en el refrigerador. Solubilizacin de los aminocidos Se solubilizan en agua. Algunos aminocidos ser necesario solublizarlos en soluciones reguladoras que estn a pH alejados del pKa del aminocido y evitar de esta forma su precipitacin. Preparacin del soporte (Papel o slica gel) Se marca en el papel o en la placa, la lnea base con lpiz y se marcan los puntos donde vaya a colocarse los aminocidos tipo y la muestra problema, identificndolos con una marca. Se coloca en cada una de las marcas 10 l de aminocido respectivo y 10 l de la muestra problema, se seca con una los aminocidos y de la muestra y se secan. Previo a esta preparacin, se colocan 30 ml del disolvente sobre la cuba de cromatografa y se deja que se sature sta con el disolvente. Una vez saturada se coloca la placa o el papel dentro de la cuba y se deja que se desarrolle el cromatograma (Importante: Dejar el que el solvente suba por capilaridad). Una vez desarrollado mrquese el frente del disolvente con lpiz. Squese en una estufa sin sobrecalentar. Una vez seco el papel o la placa se asperja con solucin de ninhidrina y se calienta en una estufa para desarrollar color. Localcense las mancas de color morado, estas representan las posiciones de los aminocidos que reaccionaron con la ninhidrina.
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Figura 3 Procedimiento ilustrado RESULTADOS a) Medir la distancia desde la lnea base al centro de las manchas. b) Medir la distancia de la lnea base al frente del disolvente c) Calcular los Rf de los aminocidos tipo y de la muestra problema d)Corresponden los Rf d su muestra con los aminocidos tipo? Compare con lo obtenidos por sus compaeros. e) Dibujar un esquema del cromatograma obtenido, indicando los nombres de los aa localizados Cuestionario 1. Que tipo de separacin se biolgica recibi el primer nombre de cromatografa. 2. Que otros tipos de cromatografa existen. 3. Porque los aminocidos usados en la prctica muestran diferentes Rfs Bibliografa 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: Bioquimica ambiental No. Prctica: 4 Titulo de la Prctica: Determinacin aproximada del punto isoelctrico de una protena
cido actico 0.01N cido actico 0.1N cido actico 1N casena en acetato de sodio 0.1N
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Mtodos Rotular los tubos de ensaye para poder identificar cada una de las soluciones a observar. Agregar agua a cada tubo basndonos en la tabla. Agregar Ac. Actico 0.01N a los tubos 1 y 2. Agrega Ac. Actico 0.1N a los tubos 3 a 8. Al tubo 9 agregar solamente Ac. Actico 1N. A cada uno de los tubos agregar Casena en acetato de sodio 0.1N. Mezclar cada uno de los tubos agitado suavemente. Anotar las observaciones que se presenta despus de mezclar las soluciones. Utilizando el pHmetro obtener cada uno de los pH de cada solucin. Despus de tener las observaciones y obtener el pH de cada uno de los tubos determinar el punto isoelctrico aproximado de la caseina. Cuestionario 1. Cual es el punto isoelctrico de la casena reportado en la literatura? 2. Porque la casena se precipit en mas de un tubo?. 3. Que es la proteonmica. 4. Cual es la metodologa que sirve como caballito de batalla para estudios proteonmicos?. Bibliografa 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: Bioquimica ambiental No. Prctica: 5 Titulo de la Prctica: Solubilidad y desnaturalizacin de protenas
HNO3, NaOH, Cloruro de Mercurio Nitrato de Plata cido Pcrico cido Tricloroactico.
Mtodos Desnaturalizacin de albumina con cidos y bases fuertes Prepara 3 ml de H2SO4 con un 1ml de Albmina, igualmente hacerlo con los reactivos HNO3 y el NaOH. (cidos fuertes y alcalinos). Agitar los tubos y observar si se presenta solubilidad. Desnaturalizacin de albumina con metales pesados Preparar 1ml de Cloruro de Mercurio con 2 ml de Albmina, e igualmente hacerlo con Nitrato de Plata. Agitar los tubos de Ensaye con los reactivos y ver si se solubilizan.
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Desnaturalizacin de albumina con cido Pcrico y Tricloroacetico En tubos de Ensaye agregar 1 ml de cido Pcrico con 2 ml de Albmina. Hacer lo mismo con el cido Tricloroacetico. Calentarlos a bao mara por 5 min y despus dejarlos enfriar por 5 min ms y hacer observaciones de cada tubo. Hacer observaciones. Adicin de limn y cido clorhdrico a la leche.Coloca en dos vasos de precipitado un poco de leche. A uno adicionales unas gotas de limn y al otro unas cuantas gotas de HCl concentrado. Anota tus observaciones. Cuestionario 1. Menciona tres mtodos para precipitar protenas. 2. Cuando una protena se desnaturalizada, puede seguir actividad biolgica?. 3. Porque se forman grumos en la leche cuando adicionas el limn o el HCl?.
Bibliografa 1. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: Bioqumica ambiental No. Prctica: 6 Titulo de la Prctica: Actividad de la amilasa sobre el almidn
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Materiales y mtodos Materiales 7 Tubos de ensaye bao mara, placa de porcelana excavada gradilla tres pipetas de 1 ml dos pipetas de 5 ml dos pipetas de 10 ml 3 pipeta pasteur 1pinzas para tubo
Almidn 1% en regulador de fosfatos 0.02 M Glucgeno 1% en regulador de fosfatos 0.02 M regulador de fosfatos 0.02 M, solucin de NaCl 0.5 N solucin de amilasa pancretica al 1% o amilasa salival solucin de lugol.
Metodologa Prepare una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de acuerdo a la siguiente tabla, utilizando 5 diluciones diferentes de enzima comercial o saliva:
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Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1 minuto despus de adicionada, haga la prueba de gota del contenido de cada tubo con solucin diluida de yodo (lugol).Transcurridos 10 minutos, haga las determinaciones cada dos minutos hasta que la prueba sea negativa. Hacer las lecturas comparando con el tubo testigo. ANOTE EL TIEMPO INICIAL Y FINAL DE LA DIGESTIN EN CADA TUBO. En el reporte (Resultados) indique el tiempo necesario para que la reaccin sea completa en cada tubo y calcule las Unidades de Amilasa en cada tubo, definiendo una Unidad de amilasa como: nmero de mililitros de solucin de almidn al 1% que pueden ser hidrolizados en 30 min, por 1 ml de extracto puro, en condiciones de pH y temperatura que se haya trabajado. Cuestionario 1. Haz los clculos para determinar las unidades de amilasa. 2. Explique como demostraste que el almidn fue totalmente transformado en sus subproductos al reaccionar con la amilasa? 3. Que son las Unidades (enzimticas). Todas son iguales o varan con el tipo de sustrato que usas?. 4. Como afecta el NaCl en la actividad de la amilasa?. 5. En el ser humano, donde podemos encontrar amilasa? 6. Cual es el pH en el cual la actividad de la amilasa es ptima?. 7. Haga un esquema de la estructura de amilosa y de amilopectina 8. Describa un mtodo para determinar azcares reductores.
Bibliografa Voet, D., and J.G. Voet. 1995. Biochemistry. Second Edition. John Wiley & Sons,
Inc. U.S.A Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third edition.
Addison Wesley Longman Inc. USA. Stryer, L. 1995. Bioqumica. Cuarta edicin. Editorial Reverte. Barcelona Espaa.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing.Amb. Yeralda Tapia Rojas Materia: Toxicologia ambiental Titulo de la Prctica: Identificacin de carbohidratos
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(e) Prueba del cido Mcico: Esta prueba consiste en diferenciar la galactosa de las dems aldohexosas por formacin de un cido sacrico que es el cido msico. El cido sacrico cristalino es insoluble en HNO3 diludo. El HNO3 concentrado oxida los dos carbones terminales de las aldohexosas formando los correspondientes cidos sacricos. En general, los cidos sacricos son solubles en HNO3 diluido, pero el cido msico es insoluble en cido diluido. Prueba de Selliwanoff: Es una reaccin coloreada que es especfica para cetosas. En solucin de HCl concentrado, las cetosas sufren una deshidratacin para producir derivados del furfural con ms rapidez que como lo hacen las aldosas. Posteriormente los derivados del furfural forman complejos con el resorcinol para producir color. Consecuentemente los grados relativos del color desarrollado en una solucin que contiene azcar, HCl y resorcinol, proporciona evidencia sobre si el azcar es una aldohexosa o cetosa. Las cetosas generalmente producen un color rojo. En las condiciones que se efecta la prueba, todas las cetosas que pueden estar unidas en enlace glucosdico quedarn en libertad y originarn reaccin positiva. (g) Formacin de osazonas: Los carbohidratos fructosa y glucosa dan las mismas osazonas por su arreglo especial semejante. La manosa no forma osazonas en solucin acuosa, pero en su lugar forma una fenilhidrazona insoluble. Cada osazona tiene un punto de fusin determinado, aunque no es muy til para su diferenciacin pues vara en pocos grados. Algunos cristales presentan una forma lo suficientemente diferenciada para identificar el carbohidrato. El tiempo de formacin es diferente para cada carbohidrato. La prueba se basa en que los azcares reductores se condensan con reactivos como la fenilhidracina en fro formando una fenilhidrazona. A 100 C y en presencia de un exceso de fenihidracina se lleva a cabo otro tipo de reaccin en donde participan los tomos de carbono nmero 1 en las cetosas, dando lugar a la formacin de osazonas. Materiales y mtodos 40 tubos de ensaye vidrio de reloj vaso de precipitado 2 pipetas de 10 ml gradilla 5 portaobjetos mechero 1 pinza para tubo de ensaye tripi tela de asbesto Microscopio agitador de vidrio hielo. Reactivos Naftol etanol al 95 % yodo yoduro de potasio acetato de cobre, cido actico concentrado, orcinol, cido clorhdrico concentrado, cloruro de fiero, resorcinol, cido sulfrico concentrado, cido ntrico concentrado, clorhidrato de fenilhidracina, acetato de sodio, solucin de carbohidratos: glucosa, galactosa, fructosa, sacarosa, lactosa y almidn.
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Preparacin de reactivos Reactivos de Molish: Disolver 10 g de naftol en 100 ml de etanol al 95% Reactivo de Lugol: Moler y mezclar finamente en un mortero 50 g de yodo y 100 g de yoduro de potasio. Disolver con agua destilada y aforar hasta un volumen de 1 litro. Reactivo de Bradford: Disolver 13.3 g de acetato cprico con 200 ml de agua y filtrar si es necesario, aadir 1.9 ml de cido actico concentrado. Reactivo de Bial: Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml de HCl concentrado y aadir de 20-30 gotas de una solucin acuosa de cloruro frrico al 10%. Reactivo de Silliwanoff: Disolver 0.5 g de resorcinol en 100 ml de HCl diluido 1:2. Ensayos Nota. Antes de realizar las pruebas, elabore una tabla de manera que en la primera fila escriba el nombre de las muestras de carbohidratos y en la primera columna el nombre de la prueba a efectuarse, dibuje dos columnas adicionales: una para escribir las observaciones y la otra para resumir el resultado indicando si la prueba fue positiva o negativa. Prueba de Molish Prepare una serie de 6 tubos de ensaye en una gradilla, a cada uno adales 2 ml de las soluciones a prueba. Enseguida adicione 5 gotas del reactivo de Molish y agite. Luego incline cada tubo y deposite cuidadosamente por las paredes del tubo 2 ml de cido sulfrico concentrado. La aparicin de un anillo rojo violeta en la interfase indica la presencia de carbohidratos en la solucin. Prueba de Lugol. A una serie de 6 tubos transfiera 2 ml de cada una de las soluciones de prueba. Acidifique las muestras con 5 gotas de HCl 1 M. Luego adicione 1 gota de lugol. La aparicin de un anillo rojo violeta en la interfase indica la presencia del carbohidrato en la solucin. Prueba de Barford. Coloque 5 ml de reactivo de Barford en cada tubo de una serie de 6 tubos de ensaye, adicione 1 ml de los carbohidratos a prueba y caliente a Bao Mara hirviendo durante 2 minutos, saque los tubos, djelos reposar y anote sus observaciones. Prueba de Bial. Prepare una serie de 6 tubos de ensaye y coloque 5 ml de reactivo de Bial a cada tubo. Adicione 2 ml de la solucin de carbohidrato y caliente suavemente las soluciones en un mechero hasta la aparicin de un color verde o bien hasta que las primeras burbujas alcancen la superficie. Un color azul verde en la solucin a prueba indica un resultado positivo. Prueba del cido mcico. Esta prueba se efectuar solamente con soluciones de galactosa al 3% y de lactosa al 3%. Coloque 5 ml de las soluciones en 2 tubos de ensaye, adicione 2 ml de HNO3 concentrado, mezcle y caliente los tubos en bao de agua hirviente durante 60 a 90 minutos con agitacin ocasional para eliminar gas amarillo generado. Finalmente
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introduzca los tubos en baos de hielo, induciendo la cristalizacin raspando las paredes internas de los tubos con una varilla de vidrio. Observe los cristales formados y dibjelos. Prueba de Selliwanoff. Es una serie de 6 tubos de ensaye coloque 5 ml de una muestra de carbohidrato. Acidifique la solucin con 10 gotas de cido actico glacial y adicione 3 gotas de fenilhidrazina ( 0.4 g de clorhidrato de fenilhidrazina) y una pequea porcin de acetato de sodio slido. Disuelva con agitacin y caliente en un bao de agua durante 5 minutos. Enfre los tubos y observe al microscopio los cristales formados. Resuma sus observaciones en una tabla e interprete los resultados. Cuestionario 1. Escribe la reaccin qumica que sucede entre el reactivo de Molish y uno de los carbohidratos que usaste. 2. Qumicamente que es lo que pasa en la reaccin entre el cido mcico y la galactosa? (Reaccin qumica). 3. Escribe la reaccin qumica que sucede entre el reactivo de Barford y uno de los carbohidratos que usaste?. 4. Que es un azucar reductor y uno no reductor?. Cual es el reactivo que tradicionalmente (mas comn) se emplea para saber si es reductor o no reductor?. Bibliografa 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA. 3. Voet, D., and J.G. Voet. 1995. Biochemistry. Second Edition. John Wiley & Sons, Inc. U.S.A 4. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA. 5. Stryer, L. 1995. Bioqumica. Cuarta edicin. Editorial Reverte. Barcelona Espaa.
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Divisin de Carrera de: Ingeniera Ambiental Docente: Ing.Amb. Yeralda Tapia Rojas Subtema: Materia: Toxicologia ambiental No. Prctica: 8 Titulo de la Prctica:Separacin de plsmidos en geles de agarosa
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Preparacin del gel de agarosa Preparar un gel de agarosa al 0.8% en solucin reguladora de TAE. Para esto, pesar 0.8 gr de agarosa y adicionar 100 ml de TAE. Fundir en horno de microonda, dejar enfriar un . (IMPORTANTE: Usar guantes ya que el bromuro de etidio el carcinognico). Colocar la agarosa en la base de la cmara en la que se ha colocado previamente un peine y ha sido sellada. Despus de que el gel se ha gelificado, quitar el peine y colocarlo en la cmara de electroforesis, los pozos debern estar en el polo negativo. Separacin de los plsmidos Con una micropipeta de 10 o 20 l, en un pedazo de parafilm mezclar la muestra de plmidos con gotas del buffer de carga. Poner la muestra en los pozos del gel de agarosa y separar las muestras a 100 V, durante un tiempo de 45 minutos a 1 hora . Observar el en un transiluminador de luz UV
Figura 4. Separacin de DNA en geles de agarosa. (A) El DNA mezclado con el buffer de carga es cargado en los pozos del gel. (B) La cmara de electroforesis es conectada a una fuente de poder y el DNA es separado. Cuestionario 1. Cuantas formas del plsmido observaste?. Como se llaman?. 2. Tu muestra de plsmidos est contaminado con RNA?. 3. Que carga le da al DNA el TAE. 4. Con relacin al buffer de carga, para que sirve el glicerol?. 5. Quien migra mas rpido y cuantas veces, el azul de bromofenol o el xylencianol. 6. Aproximadamente a cuantas Kilobases migra el azul de bromofenol y el xylencianol. 7. Como puedes determinar el tamao de un plsmido?. Bibliografa 1. Becker, J.M., G.A. Caldwell, E.A. Zachgo. 1996. Biotechnology. A laboratory course. Second edition. Academic Press , USA 2. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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