KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah polihidroksi aldehid atau polihidroksiketon dan meliputi kondensat polimer-polimernya yang terbentuk. Nama karbohidrat dipergunakan pada senyawa-senyawa tersebut, mengingat rumus empirisnya yang berupa CnH2nOn atau mendekati Cn(H2O)n yaitu karbon yang mengalami hidratasi. Namun demikian nama ini sebenarnya kurang tepat karena hidrat (H2O) yang melekat pada gugus karbon bukanlah sebagai hidrat yang sebenarnya, misalnya tidak dapat dipisahkan atau dikristalkan tersendiri yang terlepas dari gugusnya. Secara alami, ada tiga bentuk karbohidrat yang terpenting, yaitu : 1. Monosakarida Sangat sedikit terdapat di alam karena tidak digunakan sebagai bahan simpanan makanan. Bahan monosakarida yang terdapat dalam perdagangan umumnya dibuat melalui proses hidrolisa bahan polisakarida. Bahan monosakarida untuk makanan dan obat-obatan misalnya glukosa dan fruktosa sering dibuat dari jagung, ketela, dan lainlain. 2. Oligosakarida Bentuk yang paling umum dari oligosakarida adalah disakarida (terdiri dari dua unit monosakarida) yang terjadi dari proses kondensasi dua molekul monosakarida. Contoh yang paling umum dari disakarida adalah sukrosa (atau sakarosa). 3. Polisakarida Merupakan kelompok karbohidrat yang paling banyak terdapat di alam. Merupakan senyawa makromolekul yang terbentuk dari banyak sekali satuan (unit) monosakarida. Jumlah polisakarida ini terdapat jauh lebih banyak daripada oligo maupun monosakarida. Sebagian dari polisakarida membentuk struktur tanaman yang tak dapat larut misalnya selulosa dan hemiselulosa. Sebagian lagi membentuk senyawa cadangan pangan berbentuk pati dalam tanaman atau glikogen pada sel-sel hewan. Sebagian lagi membentuk gum (atau gom), pektin, dan derivat-derivatnya. A. Sifat-sifat Karbohidrat Mono dan disakarida memiliki rasa manis oleh sebab itu golongan ini disebut gula. Glukosa (gula anggur) dan fruktosa (gula buah) adalah contoh monosakarida yang banyak dijumpai di alam. Sukrosa (gula tebu, gula bit) dan laktosa (gula susu) adalah kelompok disakarida yang juga manis. Rasa manis dari gula-gula ini

disebabkan oleh gugus hidroksilnya. Trihidroksi (gliserol) dan polihidroksi lain juga berasa manis. Sedangkan polisakarida tidak terasa manis karena molekulnya sedemikian besarnya sehingga tidak dapat masuk ke dalam sel-sel kuncup rasa (taste bud) yang terdapat pada permukaan lidah. Semua jenis karbohidrat baik mono, di maupun polisakarida akan berwarna merah apabila larutannya (dalam air) dicampur dengan beberapa tetes larutan -naphthol (dalam alkohol) dan kemudian dialirkan pada asam sulfat pekat dengan hati-hati sehingga tidak tercampur. Warna merah akan tampak pada bidang batas antara campuran karbohidrat dengan -naphthol dan asam sulfat pekat. Sifat ini dipakai sebagai dasar uji kualitatif adanya karbohidrat dan dikenal sebagai uji Molisch. Warna biru kehijauan akan timbul apabila larutan karbohidrat dicampur dengan asam sulfat pekat dan anthrone. Warna ini timbul karena terbentuknya furfural dan hidroksi furfural sebagai senyawa derivat dari gula-gula. O OH C

C naphthol H2 anthrone

H C HC O Furfural

H C C CHO HO H2C

H C C O

H C C CHO

Hidroksimetilfurfural

B.

Analisa Karbohidrat

Dalam ilmu dan teknologi pangan, analisa karbohidrat yang biasa dilakukan misalnya penentuan jumlahnya secara kuantitatif dalam rangka menentukan komposisi suatu bahan makanan, penentuan sifat fisis atau kimiawinya dalam kaitannya dengan pembentukan kekentalan, kelekatan, stabilitas larutan dan tekstur hasil olahannya. Dalam ilmu gizi, sangat penting untuk mengadakan analisa biologis (bioassay) senyawa-senyawa karbohidrat dalam kaitan peranannya membentuk kalori, pencegahan penyakit (diabetes, karies gigi, kegemukan, dll), serat kasar dalam percernaan (dietary fibers) dan sebagainya. Dalam bidang bioteknologi, analisa yang dilakukan untuk menetukan jenis dan perubahan kimiawi yang dialami karbohidrat selama proses fermentasi misalnya menjadi sangat penting untuk menentukan kondisi proses yang optimal. Dalam bidang kimia murni, analisa dilakukan misalnya untuk penentuan struktur polimer karbohidrat, bentuk rantai polimer yang lurus dan sebagainya. Sedangkan dalam biokimia, analisa karbohidrat dapat meliputi analisa perubahan-perubahan yang terjadi selama proses biologis, peranan dan fungsinya dalam pembentukan boimolekul atau kaitannya dengan struktur sel. C. Persiapan sampel Sebelum dilakukan analisa karbohidrat terlebih dahulu bahan dibebaskan dari zat-zat pencampur dan dilakukan penjernihan terhadap larutan yang akan dianalisa. Lipida dan khlorofil dihilangkan dengna ekstraksi menggunakan ether. Supaya selama menghilangkan zat-zat pencampur tidak terjadi inversi dan hidrolisa dari sukrosa oleh asam-asam organik yang ada dalam bahan makanan atau pertanian, maka selama ekstraksi ditambah kalsium karbonat untuk menetralkannya. Apabila dalam bahan banyak mengandung enzim yang dapat menghidrolisa gula maka harus ditambahkan merkuri khlorida untuk mencegah hidrolisa atau ekstraksinya dilakukan dengan alkohol (ethanol 80%) dan sampel dipanaskan selama 30 menit. Zat penjernih yang dipakai harus mempunyai sifatsifat yang menguntungkan yaitu antara lain dapat mengendapkan zat bukan gula tanpa mengabsorbsi atau memodifikasi zat-zat gula; dalam keadaan berlebihan tidak mengganggu ketepatan analisa dan hasil pengendapan harus mudah dipisahkan dari larutannya. Penentuan Karbohidrat

Zat penjernih yang dapat digunakan pada Analisa Karbohidrat: Timbal asetat, dapat mengendapkan asam organik, asam amino, protein, polifenol Alumunium hidroksida, dapat mengendapkan zat koloid Kieselguh, dapat mengendapkan zat koloid Campuran merkuri nitrat dan alkali, terutama dipakai untuk mengendapkan protein yang berasal dari jaringan daging. Penukar ion juga sering dipakai untuk menghilangkan asam amino yang Poliamida, gelatin ataupun polivinil polipirolidon biasa digunakan untuk Potasium ferrisianida (K3Fe(CN)6 3 H2O) dan biasanya dicampur dengan terdapat dalam larutan gula. menghilangkan zat warna dalam larutan. ZnSO4. 7 H2O serta dibuat basis dengan NaOH. Kedua garam tersebut disebut reagen Carrez I dan II, dipakai untuk mengendapakan protein. Asam trikhloroasetat atau asam fosfotungstat, dapat digunakan untuk Campuran Ba(OH)2 dan ZnSO4, bisa dipakai dalm analisa karbohidrat cara Campuran merkuri nitrat dan alkali, terutama dipakai untuk mengendapkan protein pada umumnya. Somogyi. Zat tersebut untuk mengendapkan protein yang berasal dari susu. mengendapkan protein yang berasal dari jaringan daging. Asam trikhloroasetat atau asam fosfotungstat, dapat digunakan untuk Poliamida, gelatin ataupun polivinil polipirolidon biasa digunakan untuk Penukar ion juga sering dipakai untuk menghilangkan asam amino yang Dari sekian banyak zat yang dapat digunakan, timbale asetat merupakan salah satu bahan yang paling banyak dipakai dalam penjernihan larutan gula yang akan dianalisa. Hal ini karena sifat timbale asetat yang cukup efektif dalam mengendapkan asam amino, protein, tannin, asam organik pada umumnya. D. Uji Kualitatif Karbohidrat mengendapkan protein pada umumnya. menghilangkan zat warna dalam larutan terdapat pada larutan gula.

Banyak cara untuk mengetahui adanya karbohidrat dalam suatu bahan antara lain :

Uji Molisch Karbohidrat oleh asam sulfat pekat akan dihidrolisa menjadi monosakarida dan selanjutnya monosakarida mengalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi furfural atau hidroksi metil furfural. Fufural atau hidroksi metil furfural dengan alfa naftol akan berkondensasi memebntuk senyawa kompleks yang berwarna ungu. Apabila pemberian asam sulfat pada larutan karbohidrat yang telah diberi alfa naftol melalui dinding gelas dan secara hati-hati maka warna ungu yang terbentuk berupa cincin pada batas antara larutan karbohidrat dengan asam sulfat. HC HC O Furfural OH CH H C C=O C O Hidroksi metil furfural C C=O HC CH

Alfa naftol Dehidrasi pentosa oleh asam akan dihasilkan furfural, dehidrasi heksosa menghasilkan hidroksi metil furfural dan dehidrasi ramnosa dihasilkan metil furfural. Uji Seliwanoff Peristiwa dehidrasi monosakarida ketosa menjadi furfural lebih cepat dibandingkan dehidrasi monosakarida aldosa. Hal ini dikarenakan aldosa sebelum mengalami dehidrasi lebih dahulu mengalami transformasi menjadi ketosa. Dengan demikian, aldosa akan bereaksi negatif pada uji Seliwanoff. Pada pengujian ini furfural yang terbentuk dari dehidrasi tersebut dapat bereaksi dengan resorcinol membentuk senyawa kompleks berwarna merah.

OH

OH Resorcinol (1,3 dihidroksi benzen) Sebagai zat untuk dehidrator dapat digunakan asam khlorida 12% atau asam asetat atau asam sulfat alkoholik. Uji Anthrone Karbohidrat oleh asam sulfat akan dihidrolisa menjadi monosakarida dan selanjutnya monosakarida menalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi furfural atau hidroksi metil furfural. Selanjutnya senyawaan furfural ini dengan anthrone (9, 10-dihidro-9-oxoanthracene) membentuk senyawaan kompleks yang berwarna biru kehijauan. Uji Benedict Gula reduksi dangan larutan Benedict (campuran garam kuprisulfat, Natrium sitrat, Natrium karbonat) akan terjadi reaksi reduksi oksidasi dan dihasilkan endapan berwarna merah dari kupro oksida. O R C H + CuO Cu2O +R C O OH

Uji Barfoed Larutan Barfoed (campuran cupri asetat dan asam asetat) akan bereaksi dengan gula reduksi (monosakarida) sehingga dihasilkan endapan merah kuprooksida. Dalam suasana asam ini gula reduksi yang termasuk dalam golongan

disakarida memberikan reaksi yang sangat lambat dengan larutan Barfoed sehingga tidak meberikan endapan merah kecuali pada waktu percobaan yang diperlama. Uji ini untuk penunjukkan gula reduksi monosakarida. Uji Iodin Karbohidrat golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan iodin dan memberikan warna spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya. Amilosa dengan iodin akan berwarna biru; amilopektin dengan iodin akan berwarna merah violet; glikogen maupun dextrin dengan iodin akan berwarna merah coklat. Uji Pembentukan Osason Aldosa ataupun ketosa dengan fenilhidrasine dan dipanaskan akan membentuk hidrason atau osason. Senyawa ini terjadi karena gugus aldehid ataupun ketonik dari karbohidrat berikatan dengan fenolhidrasin. Reaksi antar senyawaan tersebut merupakan reaksi oksido-reduksi, atom C yang mengalami reaksi adalah atom C nomer satu dan dua dari aldosa atau ketosa. Fruktosa dan glukosa menunjukkan osason yang sama. Uji Fehlings Larutan Fehlings yang terdiri dari campuran kupri sulfat, Na-K-tartrat dan Natrium hidroksida dengan gula reduksi dan dipanaskan akan terbentuk endapan yang berwarna hijau, kuning-orange atau merah tergantung dari macam gula reduksinya. E. Uji Kuantitatif Karbohidrat

Cara yang dapat digunakan untuk menentukan banyaknya karbohidrat dalam suatu bahan antara lain : Cara Kimiawi Metoda oksidasi dengan kupri : Metoda ini didasarkan pada peristiwa tereduksinya kupri-oksida menjadi kupro oksida karena danya gula reduksi. Reagen yang digunakan merupakan campuran kupri sulfat, Na-karbonat dan asam sitrat (reagen Luft), atau

campuran kupri sulfat dan K-Na-tartrat (reagen Soxhlet). K-Na-tartrat berfungsi sebagi pencegah terjadinya pengendapan kupri oksida yang ada dalam reagen. Pada kedua macam reagen tersebut yang berfungsi sebagai oksidator adalah kuprioksida yang dengan gula reduksi akan mengalami reduksi menjadi kuprooksida dan mengendap berwarna merah bata. Jumlah endapan kuprooksida ekuivalen dengan banyaknya gula reduksi yang ada. Kuprooksida yang terbentuk dapat diketahui dengan menimbang setelah dikeringkan atau dengan melarutkan kembali dan selanjutnya dititrasi. Selain dengan cara tersebut juga dapat dengan menentukan kelebihan kuprioksida yang ada dalam larutan sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi. Selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi adalah ekuivalen dengan kuprioksida yang terbentuk. Penentuan gula reduksi dalam larutan yang sering digunakan adalah sebagai berikut : Cara Luff Schoorl Pada penentuan gula cara Luff Schoorl, yang ditentukan bukannya kuprooksida yang mengendap tetapi dengan menentukan kuprioksida dalam larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan sampel gula reduksi (titrasi sampel). Penentuannya dengan titrasi menggunakan Na-tiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel ekuivalen dengan kuprooksida yang terbentuk juga ekuivalen dengan jumlah gula reduksi yang ada dalam bahan atau larutan. Reaksi yang terjadi selama penentuan karbohidrat cara ini mula-mula kuprioksida yang ada dalam reagen akan membebaskan iod dari garam K-iodida. Banyaknya iod yang dibebaskan ekivalen dengan banyaknya kuprioksida. Banyaknya iod dapat diketahui dengan titrasi manggunakan Na-tiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi sudah cukup maka diperlukan indikator amilum. Apabila larutan berubah warnanya dari biru menjadi putih berarti titrasi sudah selesai. Agar perubahan warna dari biru menjadi putih dapat tepat maka penambahan amilum diberikan pada saat titrasi hampir selesai. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi blanko dan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang sudah tersedia yang menggambarkan hubungan antara banyaknya Na-tiosulfat

dengan banyaknya gula reduksi. Pada tabel IV.1 tersebut dapat diketahui jumlah gula reduksi yang ada dalam larutan. Reaksi yang terjadi dalam penentuan gula cara Luff dapat dituliskan sebagai berikut :

R H2SO4

COH

+ CuO + CuO + 2 KI

Cu2O CuSO4 CuI2 Cu2I2

+R + H2O + K2SO4 + I2

COOH

CuSO4 2 CuI2 I2

+ Na2S2O3

Na2S4O6 + NaI

I2 + amilum = biru

Cara Munson-Walker Penentuan gula cara ini adalah dengan menentukan banyaknya kuprooksida yang terbentuk dengan cara penimbangan atau dengan melarutkan kembali dengan asam nitrat kemudian menitrasi dengan tiosulfat. Jumlah kuprooksida yang terbentuk ekivalen dengan banyaknya gula reduksi yang ada dalam larutan dan telah disediakan dalam bentuk tabel Hammond hubungan antara banyaknya kuprooksida dengan gula reduksi. Tiap 1 ml Natiosulfat (39 gram, Na2S2O3 5H2O/1) sesuai dengan 11,259 mg Cu2O Cara Lane-Eynon Penentuan gula cara ini adalah dengan cara menitrasi reagen Soxhlet (larutan CuSO4, K-Na-tartat) dengan larutan gula yang diselidiki. Banyaknya larutan contoh yang dibutuhkan untuk menitrasi reagen Soxhlet dapat diketahui banyaknya gula yang ada dengan melihat pada tabel Lane-Eynon. Agar supaya diperoleh penentuan yang tepat maka reagen Soxhlet perlu

distandarisasi dengan larutan gula standar. Standarisasi ini dikerjakan untuk menentukan besarnya faktor koreksi dalam menggunakan tabel Lane-Eynon. Pada titrasi reagen Soxhlet dengan larutan gula akan berakhir apabila warna larutan berubah dari biru menjadi tidak berwarna. Indikator yang digunakan pada cara ini adalah methilen biru. Contoh perhitungan : Sebanyak 10 ml regaen Soxhlet misalnya memerlukan titrasi gula standar (konsentrasi 2,5 mg/ml) sebanyak 21 ml. Jadi total gula reduksi yang diperlukan untuk mereduksi 10 ml reagen Soxhlet adalah 21 x 2,5 mg = 52,5 mg. Padahal pada tabel menunjukkan untuk 21 ml larutan gula invert tertera 51,0 mg, jadi faktor korekjsinya adalah 52,5 : 51,0 = 1,03. Bila pada titrasi sampel memerlukan 20 ml maka dalam bahan terdapat gula invert sebanyak 50,9 x 1,03 = 52,427 mg. Dalam 100 ml larutan sampel terdapat gula invert = 100/20 x 52,427 mg = 262,135 mg Tabel IV.1 Penentuan glukosa, fruktosa, dan gula invert dalam suatu bahan **) ml Thio. *) 0,1 N Glukosa, invert mg C6H12O6 fruktosa, gula ml Thio. *) 0,1 N Glukosa, invert mg C6H12O6 33,0 25,7 38,5 38,5 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,0 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 fruktosa, gula

1. 2,4 2,4 13. 2. 4,8 2,4 14. 3. 7,2 2,5 15. 4. 9,7 2,5 16. 5. 12,2 2,5 17. 6. 14,7 2,5 18. 7. 17,2 2,6 19. 8. 19,8 2,6 20. 9. 22,4 2,6 21. 10. 25,0 2,6 22. 11. 27,6 2,7 23. 12. 30,3 2,7 24. *) ml 0,1 N Thio = titrasi blanko titrasi sampel **) analisa dengan metoda Luff Schoorl

Metoda oksidasi dengan larutan ferrisianida alkalis Cara ini berdasarkan peristiwa tereduksinya ferrisianida menjadi ferrosianida oleh senyawaan gula reduksi. Jumlah ferrosianida yang terbentuk ekuivalen dengan jumlah gula reduksi dalam sampel. Ferrosianida yang terbentuk dapat dihitung sebagai selisih atau perbedaan antara ferrisianida yang ditambahkan dengan jumlahnya setelah terjadi reaksi reduksi. Reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut : 2 K3Fe (CN)6 + 2 KI 2 K4Fe(CN)6 + I2 Bila ke dalam campuran zat yang dianalisa tersenut diberikan ion Zn++ misalnya dalam bentuk Zink sulfat maka ferrosianida yang terbentuk akan diendapkan sebagai senyawaan kompleks yang reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut : 2 K4Fe (CN)6 + 3 ZnSO4 K2Zn3 [ Fe(CN)6 ]2 + 3 K2SO4 endapan Menentukan gula reduksi cara ini dapat ditentukan berdasarkan jumah iodin yang dibebaskan dengan menitrasi menggunakan Natrium-thiosulfat standar. Jumlah iodine ekuivalen dengan gula dan dapat dihitung berdasarkan jumlah thio yang dipergunakan untuk titrasi. Bila diketahui tiap milliliter thio standar ekuivalen dengan sejumlah gula reduksi (berdasar percobaan standarisasi) maka mudah diketahui dan dihitung gula yang ada dalam sampel. Titrasi ini mempergunakan indicator amilum dimana akhir titrasi ini adalah tepat hilangnya warna biru dari iod-amilum. Cara lain untuk menentukan jumlah gula cara oksidasi dengan ferrisianida adalah dengan menentukan jumlah ferrosianida dengan ceric sulfat menggunakan indicator phenantroline atau ditentukan secara kalorimetri. Selain itu, juga dapat dilakukan dengan titrasi menggunakan larutan gula dan indicator yang dipakai adalah asam pikrat atau methilen biru. Pada cara ini digunakan pula titrasi standarisasi menggunakan larutan gula standar terhadap ferrisianida yang digunakan. Penentuan gula dengan cara oksidasi dengan larutan ferrisianida alkalis lebih baik daripada oksidasi dengan larutan kupri sulfat karena reagen ferrisianida dalam alkali lebih stabil dan ferrisianida yang terbentuk lebih stabil daripada kuprooksida. Kelemahan cara ini adalah ferrisianida mudah direduksi

oleh

senyawaan

reduksi

baik

gula

maupun

bukan

gula

sehingga

penunjukkannya kurang tepat. Metoda iodometri Iodin dalam medium yang alkalis dapat terkonversi dengan cepat menjadi hipoiodida. Hipoiodida dapat mengoksidasi aldosa, sedangkan untuk ketosa hanya sedikit yang mengalami oksidasi. Larutan sampel ditambah iodine encer dan NaOH kemudian dicampur secepatnya (karena iodin dapat berubah menjadi iodat dan tidak reaktif terhadap gula dalam larutan alkalis). Setelah itu diasamkan dengan asam khlorida atau asam sulfat dan dibiarkan beberapa menit. Kemudian kelebihan iodine dititrasi dengan larutan thiosulfat standar. Reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut : Titrasi sampel O R C H + I2 + 3 NaOH I2 (sisa) + 2 Na2S2O3 I2 + amilum O R C ONa + 2 NaI + 2 H2O Na2S4O6 + 2 NaI iod-amilum (biru)

Titrasi blanko I2 (total) + 2 Na2S2O3 Na2S4O6 + 2 NaI

Dalam keadaan optimal dan kondisi terkontrol hanya = 1 % dari ketosa yang ada dalam sampel teroksidasi sehingga tidak mempengaruhi dalam penentuan aldosa. Untuk memperbesar ketelitian penentuan cara ini maka adanya zat yang dapat mempengaruhi harus dihilangkan misalnya etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format, dan Urea. Zat zat tersebut dapat bereaksi dengan iodin. Cara Ensimatis a. Penentuan glukosa dan fruktosa

Dasar penentuan cara ini adalah glukosa dan fruktosa difosforilasikan menjadi glukosa-6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase (HK) dan Adenosin-5-trifosfat (ATP). 1. Glukosa + ATP 2. Fruktosa + ATP G-6-P + ADP F-6-P + ADP

Dengan adanya enzim glukosa-6-fosfat dehidrogenase (G6P-DH), G-6-P dioksidasi oleh Nikotinamida Adenin Dinukleotida (NADP) menjadi glukonat6-fosfat G6P-DH 3. Glukosa-6-fosfat + NADP Glukosa-6-fosfat + NADPH + H+

Jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan banyaknya glukosa yang bereaksi sehingga NADPH inilah yang diukur dengan spektrofotometer pada serapan sinar dengan panjang gelombang 334 atau 340 atau 365 nm. Setelah reaksi (3) selesai, F-6-P perlu diubah menjadi G-6-P dengan bantuan enzim fosfoglukosa isomerasi (PGI) PGI 4. Fruktosa-6-fosfat Glukosa-6-fosfat

Glukosa-6-fosfat dengan NADP membentuk glukonat-6-fosfat dan NADPH. Jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan jumlah fruktosa yang ada. b. Penentuan laktosa dan galaktosa Dasar penentuan laktosa dan galaktosa dengan enzim adalah laktosa dapat dihidrolisis menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim galaktosidase dan air. Selanjutnya galaktose dioksidasi oleh Nikotinamida Adenin-Dinukleotida (NAD) menjadi asam galatonat dengan bantuan enzim galalosa dehidrogenase (GAL-DH) -galaktosidase Laktosa + H2O GAL - DH Galaktosa + NAD Asam galatonat + NADH + H+ Glukosa + galaktosa

Jumlah NADH yang terbentuk setara dengan jumlah laktosa yang ada. Kenaikan jumlah NADH diukur dari serapan sinar pada panjang gelombang 334,340 atau 365 nm Cara Khromatografi Penentuan karbohidrat dengan cara khromatografi adalah dengan mengisolasi dan mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu campuran. Isolasi karbohidrat ini berdasarkan prinsip pemisahan suatu campuran berdasarkan atas perbedaan distribusi rationya pada fase tetap dengan fase bergerak. Fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas, sedangkan fase tetap dapat berupa zat padat atau zat cair. Apabila zat padat sebagai fase tetapnya maka disebut khromatografi serapan, sedang bila zat cair sebagai fase tetapnya disebut khromatografi partisi. Dalam khromatografil ekstrak yang akan ditentukan karbohidratnya perlu dimurnikan dan dijernihkan. Selain itu senyawa-senyawa anorganik yang ada harus dihilangkan misalnya dengan jalan melewatkan ekstrak di dalam suatu alat penukar ion (ion exchanger). Perlakuan ini dikerjakan untuk mencegah terjadinya tailing misalnya pada khromatografi kertas atau khromatografi lapis tipis. Tailing menyebabkan kesukaran dalam analisa kuantitatif selanjutnya. Untuk mengurangi tailing dapat dikerjakan dengan nelarutkan kembali zat-zat yang terabsorbsi pada zat penyerap (absorbent) dengan mencuci menggunakan asam. Selain itu dengan melakukan elusi terhadap pelarut secara bertahap dengan fase bergerak (mobil) yaitu pelarut yang lebih polar. Di dalam analisa khromatografi kertas atau lapis tipis diukur besarnya Rf (Retardation factor) tiap komponen karbohidrat yaitu perbandingan jarak perpindahan molekul zat dengan jarak perpindahan pelarut, Rf = Jarak perpindahan molekul zat Jarak perpindahan pelarut Harga Rf tiap jenis gula adal tertentu untuk suatu perlakuan yang sama. Nilai R f suatu jenis gula dipengaruhi oleh berbagai factor antara lainmacam zat pelarut, suhu, ukuran bejana, macam fase tetap dan sifat zat yang dianalisa. Dengan

demikian dalam mencantumkan harga Rf dari suatu zat harus dicantumkan pula kondisi analisanya. Salah satu contoh penentuan karbohidrat yang akan diuraikan adalah khromatografi kertas. Khromatografi kertas Penentuan karbohidrat cara ini merupakan cara yang sederhana yaitu menggunakan kertas yang tersusun oleh selulosa murni sebagai penyokong fase tetap (air). Selulosa merupakan zat inert sehingga dapat digunakan sebagai zat penyangga. Kertas yang digunakan untuk khromatografi merupakan ikatan serabut-serabut selulosa yang saling berhubungan dengan ikatan hydrogen, dan di antara sel terdapat air sebanyak kurang lebih 2 5%. Kertas yang dipakai adalah kertas Whatman yang dapat dibedakan menjadi 3 berdasarkan kecepatan merambat zat yaitu cepat, sedang, dan lambat. Biasanya dipakai kertas whatman dengan kecepatan sedang yaitu whatman no. 1. Kertas yang akan digunakan harus disimpan dalam tempat yang kering, bersih dan bebas dari gas atau uap terutama yang mempunyai affinitas tinggi terhadap selulosa serta dalam ruang yang tertutup. Pada garis besarnya penentuan karbohidrat secara kromatografi kertas dilakukan sebagai berikut : kawat pengembang

kertas botol pengembang spot pelarut Pertama kali dibuat potongan kertas ukuran tertentu sesuai dengan kebutuhan. Sampel yang telah disiapkan diteteskan pada salah satu ujung kertas dengan menggunakan mikro pipet sehingga diperoleh spot yang bulat. Agar diperoleh spot yang cukup besar konsentrasinya maka penetesan sampel

dilakukan 3 4 kali dengan cara penetesan berikutnya setelah penetasa pertama sudah kering. Spot yang terbentuk harus sekecil mungkin karena spot yang besar akan menyebabkan pemisahan tidak sempurna atau terjadi tailing. Selanjutnya kertas dimasukkan ke dalam wadah yang berisi zat pelarut tertentu sehingga kedudukan kertas tegak lurus dan spot berada kurang lebih 1 cm di atas permukaan pelarut. Pelarut yang digunakan dapat berbentuk larutan murni atau campuran. Untuk penentuan gula-gula sederhana pelarut yang dipakai adalah campuran butanol : asetat : air atau propanol : asam asetat : air atau asam asetat : pyridin : air dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Campuran pelarut tersebut pada umumnya terdiri atas pelarut organic air dan asam atau basa. Setelah wadah ditutup dan dibiarkan beberapa lama maka pelarut akan merambat pada kertas sampai pada ujung kertas yang lain untuk itu perlu diberi tanda batas akhir perambatan pelarut pada kertas. Apabila pelarut sudah merambat sampai tanda tersebut maka kertas diambil dan dikeringkan. Perlu dicatat pada pemilihan pelarut yang digunakan sebaiknya tidak memberi reaksi warna pada kertas. Agar supaya antara fase tetap, fase bergerak dan molekul zat yang akan dipisahkan. Setelah kertas menjadi menjadi kering maka untuk mengetahui adanya pemisahan antara zat-zat yang ada perlu diidentifikasi. Deteksi dan identifikasi gula-gula dalam kertas khromatografi dapat dilakukan dengan cara fisis atau kimiawi. Secara fisis dapat dilakukan dengan menyinari kertas dengan sinar ultraviolet dengan panjang gelombang sinar 254 nm 370 nm. Dapat pula dengan cara kimiawi yaitu dengan menyemprotkan larutan kimia tertentu misalnya anilinphtalet atau m-phenyleneidamine atau perak nitrat untuk gula reduksi. Untuk gula non reduksi dapat menggunakan naphotoresorsinol dalam asam fosfat. Larutan phloroglusinol dan asam khlorida dapat digunakan untuk aldosapentosa (memberikan warna violet); ketopentosa (hijau tua); ketoheksosa (kuning coklat) dan dengan methyl pentose memberikan warna hijau. Selain larutan tersebut di atas pula dipakai uap iodin. Reagen kimia tersebut pada kertas d ruang asam karena dapat mengganggu kesehatan operatornya. Kemudian setelah dikeringkan akan timbul noda berwarna dan dapat dihitung Rf-nya dan dapat ditentukan macam gulanya sesuai dengan standar gula yang digunakan.

Cara Optik (fisis) Penentuan karbohidrat dengan cara fisis antara lain dengan menentukan indeks biasnya menggunakan refraktrometer. Ada beberapa model refraktometer yang dapat dipakai antara lain refraktometer Abbe. Alat ini mempunyai keunggulan antara lain : 1. mempunyai skala indeks bias cukup lebar intervalnya, yaitu antara 1,30 1,75 2. sampel yang digunakan sangat sedikit, yaitu beberapa tetes 3. ketelitiannya sampai 0,0002. Indeks bias suatu zat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu panjang gelombang sinar dan suhu pengukuran. Indeks bias dapat digunakan untuk identifikasi dan determinasi kemurnian suatu bahan dan komposisi suatu campuran homogen yang diketajui konstituennya. Indeks bias dinyatakan dengan notasi artinya : pengukuran indeks bias pada suhu 20OC dengan menggunakan

sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis. Penentuan karbohidrat dengan Polarimeter Karbohidrat bersifat optis aktif sehingga dapat dianalisa secara polarimetri hal ini disebabkan karena molekul penyusun karbohidrat mempunyai susunan yang asimetri sehingga mempunyai kemampuan untuk memutar bidang sinar terpolarisasi. Putaran optic dapt diukur dengan secara menggunakan polarimetri polarimeter/sakharimeter. Analisa gula/karbohidrat

mempunyai keuntungan antara lain sampel tidak mengalami kerusakan dan dapat dilakukan dengan cepat. Untuk memperoleh hasil yang diteliti harus diperhatikan : a) b) c) Larutan harus jernih dan tidak berwarna Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif, Konsentrasi sampel pada daerah yang optimum untuk alat yang

sehingga perlu penjernihan sebelumnya bersangkutan, tidak terlalu pekat ataupun encer. Pada penentuan gula cara polarimetri mendasarkan pada hukum Biot yaitu kapasitas rotasi untuk tiap individu gula adalah sebanding dengan konsentrasi

larutan dan panjang cairan dalam tabung, dan dapat dirumuskan sebagai berikut :

[] t D C I

: putaran/rotasi spesifik : suhu pengukuran (C) : sinar natrium (589 nm) : sudut putar yang diamati : konsentrasi ( g sampel dalam 100 ml pelarut ) : panjang tabung (dm)

Penentuan Sukrosa Penentuan sukrosa dapat langsung ditentukan jumlahnya dengan cara Polarimeter atau dengan refraktometer seperti yang telah diuraikan pada pasal di depan. Selain itu dapat dianalisa dengan cara kimia yaitu dengan menentukan gula reduksi yang dihasilkan setelah sukrosa dihidrolisa denagan asam atau dengan enzim. Penentuannya dapat secara Luff Schoorl, MunsonWalker, iodometri atau cara enzimatis atau spektrofotometri. Hidrolisa sukrosa akan dihasilkan 2 mol gula reduksi yang berupa fruktosa dan glukosa yang dapat dituliskan sebagai berikut : C6H22O11 + H2O Sukrosa BM = 342 C6H12O6 Fruktosa BM = 180 + C6H12O6 Glukosa BM = 180

Setelah diketahui jumlah gula reduksi yang dihasilkan dari hidrolisa sukrosa maka dapat dihitung jumlah sukrosa yaitu dengan mangalikan dengan suatu faktor sebesar 0,95. Faktor ini diperoleh dari perbandingan BM sukrosa dengan BM dua molekul gula reduksi Faktor konversi = BM sukrosa 2 BM gula reduksi = 342 2 x 180 = 0,95

Penentuan Pati Pati disusun oleh amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polisakarida yang linier sedangkan amilopektin adalah yang bercabang. Tiap jenis pati tertentu disusun oleh kedua fraksi tersebut dalam perbandinga yang

berbeda-beda. Pati jenis jenis yang rekat (addesif) amilosa pada pati berkisar 20-30%. Pati pada beras dan sorgum (cantel) sebagian terbesar penyusunnya adalah amilopektin. Pemisahan antara fraksi amilosa dan amilopektin dapat menggunakan elektrodialisa atau dengan n-butanol atau thymol. Amilopektin larut dalam n-butanol sedangkan amilosa tidak larut. Amilosa memberikan warna biru dengan larutan iodine dan amilopektin memberikan warna merah violet. Untuk penentuan kadar pati dalam suatu bahan dapat dikerjakan dengan menghidrolisa pati dengan asam atau ensim sehingga diperoleh gula reduksi. (C6H10O5)m + m H2O pati BM = 162 m m C6H12O6 m glukosa BM = 180 m

Setelah diketahui jumlah gula reduksi hasil hidrolisa pati tersebut maka dapat dihitung jumlah pati yaitu dengan mengalikan dengan suatu faktor konversi sebesar 0,90. Faktor konversi ini diperoleh dari perbandingan berat molekul pati dengan jumlah berat molekul gula reduksi yang dihasilkan. Faktor konversi = = BM m x 162 m x 180 = 0,90 Selain cara di atas, penentuan pati dapat ditentukan dengan cara mulamula pati diekstraksi dan didispersikan menjadi suatu larutan koloidal hingga terpisah dari zat lainnya. Pati yang terdapat dalam dispersi tersebut dapat ditentukan dengan jalan pengendapan dan dilakukan penimbangan. Pati bersifat tidak larut dalam air sehingga mudah dipisahkan dari zat lainnya. Pada bahan yang mengandung lemak dan protein yang tinggi pati dapat direaksikan lebih dahulu dengan alkali sehingga membentuk senyawa alkohol kompleks yang bersifat tidak larut dan secara langsung dipisahkan dan ditimbang. Untuk bahan yang berasal dari tanaman yang banyak mengandung berbagai macam polisakarida lain, ekstraksinya dijalankan dengan dua tahap yaitu pertama dengan alkohol etanol (etanol 80%), kedua dengan asam perklorat. pati m . BM gula reduksi

Selanjutnya pati terekstrak diendapkan dengan iodin dan akhirnya senyawa kompleks pati-iodin ini didekomposi dengan alkali. Penentuan selanjutnya dapat dikerjakan dengan cara kimia atau secara gravimetri. Penentuan serat kasar Serat kasar adalah senyawaan yang tidak dapat dicerna dalam organ pencernaan manusia maupun binatang. Dalam analisa penentuan serat kasar diperhitungkan banyaknya zat-zat yang tak larut dalam asam encer ataupun basa encer dengan kondisi tertentu. Langkah-langkah yang dilakukan dalam analisa adalah: Defatting, yaitu menghilangkan lemak yang terkandung dalam sampel menggunakan pelarut lemak. Digestion. Terdiri dari dua tahap yaitu pelarutan dengan asam dan pelarutan dengan basa. Dilakukan dalam keadaan tertutup pada suhu terkontrol (mendidih) dan sedapat mungkin dihilangkan dari pengaruh luar. Penyaringan harus segera dilakukan setelah digestion selesai karena penundaan penyaringan dapat mengakibatkan lebih rendahnya hasil analisa karena terjadi perusakan serat lebih lanjut oleh bahan kimia yang dipakai. Serat kasar sangat penting dalam penilaian kualitas bahan makanan karena angka ini merupakan indeks dan menentukan nilai gizi bahan makanan tersebut. Kandungan serat kasar dapat digunakan untuk mengevaluasi suatu proses pengolahan sehingga persentase serat kasar dapat dipakai untuk menentukan kemurnian bahan atau efisiensi suatu proses.