Unidade IV Interaces microrganismo-planta: Rhizobium e a fixao de azoto

Dorit Schuller

bactrias

do

gnero

1. O papel dos microrganismos no ciclo do azoto 2. A fixao de azoto na relao simbitica planta Rhizobium 3. Isolamento de Rhizobium a partir de ndulos de razes de plantas leguminosas

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1. O papel dos microrganismos no ciclo do azoto

O azoto um elemento qumico necessrio a todos os organismos vivos para a sntese de protenas, cidos nucleicos e outros compostos. A atmosfera terrestre contm quase 80% de azoto molecular (N2) gasoso. A maioria dos organismos vivos s consegue usar azoto fixado, que azoto na sua forma reduzida (em combinao com hidrognio), na forma de amnia. O ciclo do azoto, conforme ilustrado na figura 4.1, um ciclo contnuo, constitudo por uma srie de processos que convertem azoto molecular gasoso em substncias orgnicas e que voltam a libert-lo na natureza. As plantas verdes, os maiores produtores de matria orgnica, usam o nitrato (NO3-) ou a amnia (NH4+) do solo, que so assimilados em forma de prtidos. Os

animais, sendo consumidores e organismos heterotrficos, alimentam-se da matria vegetal e transformam os compostos orgnicos azotados, nas suas prprias macromolculas azotadas. Os microrganismos decompositores quebram os compostos azotados dos excrementos de animais (ureia e cido rico) e degradam tambm as protenas de organismos mortos, libertando ies amnia. Em solos com concentraes suficientemente altas de oxignio ocorre um processo designado por nitrificao, constitudo por duas transformaes qumicas. Primeiro, as bactrias do gnero Nitrosomonas oxidam amnia (NH4+) a nitritos (NO2-), que depois so transformados por bactrias do gnero Nitrobacter em nitratos (NO3-), a forma de azoto mais usada pelas plantas. Em solos com baixas concentraes de oxignio, e na presena de bactrias desnitrificantes, ocorre um processo designado por desnitrificao caracterizado pela transformao de nitrato em azoto gasoso molecular, o qual libertado para a atmosfera, conduzindo assim ao empobrecimento de solos em compostos azotados. A grande quantidade de azoto molecular (N2) atmosfrico no pode ser utilizado pelas plantas. No entanto, existem bactrias fixadoras de azoto, que transformam o azoto molecular em amnia, encontrando-se em associao simbitica com plantas (por exemplo, Rhizobium ou Frankia) ou no (por exemplo, Azotobacter ou Clostridium). Cerca de 1,7 a 7,0 kg de azoto so fixados anualmente numa rea de 1 hectare (mdia mundial).

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Azoto atmosfrico (N2) Protena animal Protena vegetal

Fixao de azoto

Excreo Decomposio

Amonificao
Rhizobium, Azotobacter, Frankia, Clostridium

Amnia (NH4+)

Nitrato (NO3-)

Nitrosomonas

Nitrobacter

Nitrificao
Nitrito (NO2-)

Microrganismos do solo

Desnitrificao

Figura 4.1 - Ciclo do azoto.

2. A fixao de azoto na relao simbitica planta Rhizobium

As plantas leguminosas como as ervilheiras, feijoeiros ou tremoceiros tm geralmente ndulos nas suas razes (Figura 4.2). Uma bactria do gnero Rhizobium infecta as razes das plantas leguminosas, levando formao de ndulos onde ocorre a fixao de azoto. Trata-se de uma relao simbitica, uma vez que o sistema enzimtico bacteriano fornece azoto reduzido (NH3) planta, que por sua vez disponibiliza nutrientes para o metabolismo bacteriano. Rhizobium um gnero bacteriano que ocorre no solo, tem uma estrutura regular e oval, e a fixao de azoto ocorre apenas quando se associa a uma planta hospedeira. Neste caso, a bactria adquire uma forma celular irregular e designada por bacteroide (Figura 4.2). A interaco entre a planta hospedeira e Rhizobium inicia-se pela libertao de certos compostos pelas clulas da raiz, que estimulam a multiplicao das clulas bacterianas na rizosfera. Outros compostos funcionam como mediadores de

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reconhecimento entre a planta e as bactrias, uma vez que uma determinada estirpe de Rhizobium pode infectar apenas certas espcies de plantas leguminosas. Rhizobium leguminosarum biovar viciae infecta apenas razes de ervilhas, enquanto que o trevo a planta hospedeira de Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. O desenvolvimento do ndulo um processo caracterizado por uma interaco/regulao muito complexa de grupos de genes da planta hospedeira e da bactria.

A A B

Figura 4.2. Representao esquemtica da formao de um ndulo bacteriano na raiz da ervilheira. A raiz de ervilheira com ndulos. B Corte transversal de dois ndulos. C clula contendo grupos de bacteroides envolvidos por uma membrana. D processo de infeco da raiz na parte terminal dos pelos radiculares.

A fixao de azoto por Rhizobium um processo de grande relevncia para a agricultura. Certas plantas leguminosas como a soja so componentes fundamentais para a alimentao de animais. Estas plantas so capazes de crescer bem em solos pobres, onde o azoto insuficiente para suportar o crescimento de outras espcies de plantas. Aps a colheita, as razes das plantas leguminosas so degradadas nos solos, libertando compostos orgnicos azotados em quantidade suficiente para permitir o bom desenvolvimento de outras plantas em cultivos futuros. Os agricultores aproveitam esta fertilizao natural, alternando entre culturas de plantas leguminosas e no-leguminosas,

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minimizando assim o uso excessivo de adubos comerciais, que contribuem de modo significativo para a poluio de lagos e de rios. Trabalhos de investigao actuais tm como objectivo a insero de genes que codificam para enzimas envolvidas na fixao de azoto em cereais, como por exemplo trigo, milho e arroz. Deste modo, ser possvel minimizar o uso de fertilizantes e aumentar o teor proteico das plantas de cultivo.

3. Isolamento de Rhizobium a partir de ndulos de razes de plantas leguminosas

A fixao de azoto ocorre apenas nos ndulos das razes e no na bactria que vive livre no solo. A incapacidade de Rhizobium fixar azoto quando se encontra na forma livre, pode ser demonstrada verificando a ausncia de crescimento num meio sem azoto (neste caso um meio sem extracto de levedura). No laboratrio, o exterior do ndulo deve ser quimicamente esterilizado e o ndulo esmagado para libertar as bacteroides. O extracto inoculado num meio de cultura com agar, que contm fontes de azoto, carbono, e alguns sais minerais. No ndulo activo, que fixa azoto para a planta, encontram-se cerca de 6 x 109 bacteroides, e o interior apresenta uma cor rosa/avermelhada. O interior dos ndulos jovens, que ainda no fixam azoto, branco ou acinzentado.

Procedimento

1. Corte um pedao de uma raiz com cerca de 1 cm, que tenha pelo menos um ndulo, usando uma lmina. Lave com gua para remover a terra. 2. Colocar vrias gotas de lcool a 70 % (p/v) numa caixa de Petri estril usando uma pipeta de Pasteur (a pipeta no necessita estar estril para esta operao). Transferir o pedao da raiz para a caixa de Petri usando uma pina e deixar imerso no lcool durante 2 minutos. As manipulaes a seguir devem ser realizados em asspsia 3. Transferir cerca de 15 ml de gua estril para uma caixa de Petri usando uma pipeta de Pasteur estril e uma tetina.

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4. Transferir o ndulo para a gua estril na caixa de Petri com o auxlio de uma pina esterilizada (mergulhada em lcool e depois flamejada). 5. Rejeitar a gua da caixa de Petri e colocar novamente gua esterilizada. Repetir este processo de lavagem para remover o lcool residual. 6. Pipetar algumas gotas de gua estril para uma nova caixa de Petri e introduzir a poro de raiz usando uma pina estril. Macerar os ndulos usando uma pina esterilizada at obter um lquido leitoso. Colocar a pina num recipiente com desinfectante. 7. Esterilizar uma ansa e retirar um pouco do ndulo macerado e riscar numa placa de meio MYEA. Voltar a flamejar a ansa. Preparar outra placa de meio MA (meio sem fonte de azoto). Inverter as placas e incubar temperatura ambiente durante 3 a 4 dias. 8. Tratar de forma adequada do material contaminado. 9. Desenhar um ndulo. 10. Montar numa lmina com uma gota de gua um corte transversal de um ndulo e desenhar a observao ao microscpio.

Interpretao de resultados

- Crescimento de Rhizobium nos meios MA e MYEA A fixao de azoto ocorre apenas no ndulo, na situao de simbiose entre a planta e Rhizobium. Uma vez isoladas a partir dos ndulos, as bactrias perdem a sua capacidade de fixar azoto atmosfrico, e crescem apenas em meios de cultura com uma fonte de azoto apropriada, como o extracto de levedura que faz parte dos constituintes do meio MYEA. As colnias de Rhizobium so brancas, apresentando uma superfcie lisa e brilhante (Figura 4.3-A). As colnias com outras morfologias no so consideradas como pertencendo a este gnero, tratando-se de contaminantes intracelulares do ndulo ou de outros microrganismos do solo que no foram removidos pelo tratamento de desinfeco e de lavagem.

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Figura 4.3 - A) Colnias de Rhizobium em meio MYEA; B) Ausncia de crescimento de Rhizobium em meio MA.

Material biolgico Plantas leguminosas (ervilha, feijo, trevo) com ndulos na raiz.

Material de laboratrio

Material geral (por grupo de trabalho) 1 Bico de Bunsen ou lamparina 1 Ansa 1 Tetina Lminas e lamelas 1 Pina de metal 1 Marcador 3 caixas de Petri esterilizadas 1 pipeta de Pasteur esterilizada Solues (por grupo de trabalho) gua desionizada esterilizada (ca. 100 ml) Desinfectante lcool 70 % (v/v) (ca. 20 ml)

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Meios de cultura (por grupo de trabalho) 1 placa de meio MYEA 1 placa de meio MA

Composio e preparao de meios de cultura Meio MYEA (Manitol-Yeast Extract Agar) Manitol 10,0 g Hidrogenofosfato de potssio 0,5 g Cloreto de sdio (NaCl) 0,1 g Extracto de levedura 1,0 g Sulfato de magnsio heptahidratado 0,2 g Dissolver os compostos em 1 l de gua e acertar o pH a 7,0. Seguidamente adicionar r Carbonato de clcio 0,3 g Agar 15,0 g Autoclavar a 121C durante 15 min. Verter placas tendo o cuidado de distribuir o CaCO3 (no dissolvido) de maneira uniforme antes de verter as placas. Meio MA (Manitol Agar) Como o meio MYEA, mas sem adio de extracto de levedura.

Tpicos de discusso

1. Que tipos de plantas possuem ndulos nas suas razes? 2. Qual a designao para esta relao entre a planta e as bactrias? 3. Qual a vantagem desta interaco para a planta e para as bactrias? 4. Qual o objectivo do tratamento da raiz com etanol? 5. Por que motivo foram inoculadas as placas com os dois meios de cultura diferentes? 6. Qual o resultado esperado no que respeita o crescimento microbiano nos dois meios de cultura?

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WWW

http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/nitrogen.htm http://academic.reed.edu/biology/Nitrogen/