A.YerlikayaMolekülerBiyoloji2011 (Sy 68 Den Başla) PDF

MOLEKLER BYOLOJ
Do. Dr. Azmi YERLKAYA Dumlupnar niversitesi Fen Edebiyat Fakltesi Biyoloji Blm Ktahya 2011
MOLEKLER BYOLOJ;
Canllk olaylarn molekler dzeyde inceleyen bilim dal olarak tanmlanr. Daha spesifik olarak tanmlamak gerekirse proteinler, karbonhidratlar, lipidler ve nkleik asit gibi biyomolekllerin yaplarn ve fonksiyonlarn inceleyen bilim daldr. zellikle, DNAnn replikasyonu, transkripsiyonu, hcre dngs, protein sentezi ve parcalanmas gibi hcre canllnn temelini oluturan ve srekliliini salayan olaylar molekler seviyede incelenerek aklamak molekler biyolojinin en temel hedeflerinden biridir.
Molekler Biyolojiye Gsterilen lginin Baz Nedenleri

1. Hastalklara etkili tedavi yntemlerinin gelitirilmesi ancak hcredeki organellerin, molekllerin ilevlerinin anlalmas ile mmkn olabilir. rnein, orak hcreli anemi, hemoglobin genindeki tek bir adenin baznn timin ile mutasyonu sonucu ortaya kmaktadr. Sistik fibrosis, sistik fibrosis transmembran konduktor proteini kodlayan gende bir sistin baznin timin ile deitirilmesi sonucu normalde 1493 amino asit olan proteinin, sentezin erken durmas sonucu 493 amino asit olarak sentezlendii iin erken paralanmakta ve ilev grmemektedir. Tmr basklayc protein p53deki mutasyonlara kanserlerin %50sinde rastlanmaktadr. Bu da hcrenin kontrolsz bir ekilde oalmasna neden olmaktadr. 2. Genetik Mhendisligi gibi bir bilim dann ortaya kmasn salamtr. Bu bilim sayesinde istenilen karakterlere sahip (daha verimli veya dayankl bitki, hayvan) trler elde etmek mmkn olmaktadr. 3. nslin, somatostatin ve interferon gibi bir ok proteinin bol miktarda ve ucuz retilmesi sayesinde hastalklarn tedavisi kolaylamtr.
Molekler Biyoloji Alanndaki Baz nemli Bilimsel Gelimeler

1909: Gen kavram ilk kez Danimarkal Biyolog Wilhelm Johnansen tarafndan nerildi. 1941: Amerikali Beatle ve Tatum gen fonksiyonun protein retmek olduunu ispatladlar. Bir gen bir enzim. 1944: Avery genetik bilginin proteinler deil DNA tarafndan tandn ortaya koydu. 1953:Watson ve Crick X-ray analiz sonularna dayanarak DNAnin ift-sarmal model yapsn buldular. Kornberg DNA polimeraz enzimi buldu. Nirenberg, Ochoa ve Khorana genetik kodu zdler. DNA klonlama teknikleri Boyer, Cohen ve Berg adl bilim adamlarnn laboratuarlarnda gelitirildi. 1977: Sanger DNA sekans tespiti iin metot gelitirdi. Palmiter ve Brinster transgenik fare elde ettiler. 1984: Mullis ve arkadalar polimeraz zincir reaksiyonu gelitirdiler.
PROTENLER
Vcuttaki organik vcut arlnn %17si
maddelerin
%50si,
ok fazla alt birimin (amino asitler) zinciriyle meydana gelen makromolekllerdir 20 amino asitin farkl dizileri ile oluurlar Amino asitlerin sonundaki amino ve karboksil gruplar arasnda peptid ba oluur
Proteinlerdeki baz amino asitlerin yaps

Yan grub (R) elektriksel ykne gore gruba ayrlmstr: nonpolar, polar ve iyonize.
Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.
Selenosistein, 21. Amino Asit Ve Salk in nemi

Selenosistein glutation peroksidaz ve thioredoksin reduktaz gibi organizmay oksidatif hasardan koruyan enzimlerde bulunmaktadr. Glutation peroksidaz hidrojen peroksiti (H2O2)yi suya dntren reaksiyonu katalizleyerek H2O2nin zararl etkilerini ortadan kaldrmaktadr. Ayrca son zamanlarda yaplan almalar HIV-1 virsnn de seleproteinleri kodlad kefedilmi ve AIDS hastalarnn kanlarnda ok dk selenyum miktarnn olduu grlmtr. Bu bireylerin kalp kas hasarlarna ok yatkn olduu bilinmektedir. AIDS hastalarnn plazmalarnda selenyum miktarnn azalmas hcrelerde seleproteinlerinin miktarnn ok dmesine yol amaktadr. Bu sebeple, AIDS hastalarnn bu nemli enzimleri sentezlemeye devam etmeleri iin selenyum destekli diyetler almalar tavsiye edilmektedir.
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/trna.htm
Peptid ba sentezi
Peptid ba ile birleen amino asit dizisine polipeptid denir. Eer 50 ve daha az amino asit varsa peptid, 50den daha fazla amino asit birlemesi ile oluan molekle ise protein denir.
Bir proteinin yaps; 1) Zincirdeki amino asit says ve 2) Amino asitlerin dizili sras ile belirlenir.
Bir proteinin boyutlu yaps; 1) Amino asit zincirinin blmleri arasndaki hidrojen balar, 2) Zincir boyunca polar ve iyonize blgeler arasnda oluan iyonik balar, 3) Nonpolar blgeler arasnda oluan Van der Waals balar ve 4) ki amino asit arasnda oluabilen kovalent yapl dislfit balar ile ekillenir.
Proteinlerdeki sekonder yaplarn oluumu
Tersiyer yap, miyoglobin
Primer yap
Kuarterner yap: Bir ka altbirimin birlemesi ile oluur, hemoglobin
NKLEK ASTLER

Vcut arlnn %2si Genetik bilgiyi tayan molekllerdir DNA (deoksiribonkleik asit) hazr genetik bilgiyi depolar RNA (ribonkleik asit) spesifik bir polipeptid zinciri iin gerekli kodlamay salar Alt birimleri nkleotidlerdir
Her nkleotid; 1) Bir fosfat grubu, 2) 5 karbonlu bir eker ve 3) Baz olarak bilinen bir halka yapsndan oluur. Purin bazlar adenin guanin Pirimidin bazlar timin sitozin urasil
DNA ekeri deoksiribozdur Adenin, guanin, sitozin ve timin bulundurabilir ift heliks yapsnda iki nkleotid zinciri vardr Zincirler purin ve pirimidin bazlar arasndaki hidrojen balar ile tutunur Balanma hep adenin-timin, guanin-sitozin eklinde olur RNA ekeri ribozdur Tek zincirden oluur Timin yerine urasil ierir
deoksiribonkleotid
ribonkleotid
DNA ift sarmal yapya sahiptir. ki zincir A-T ve G-C arasndaki hidrojen balar ile bir arada tutulur.
HCRE
Hcre: organizmann en temel yapsal ve fonksiyonel birimidir. Bir insan vcudu trilyonlarca (100 trilyon) hcreden meydana gelmektedir. En ilkel hcre, prokaryotik hcredir (bakteriler ve arkeobakteriler); rnein, bakteri ve siyanobakteriler (mavi-yeil algler olarak da bilinirler). Prokaryot hcrelerde ekirdek bulunmaz, bu nedenle kaltsal materyal DNA, hcre sitoplazmasnda dank olarak bulunur. Gelimi hcrelerde grlen birok organel prokaryotlarda bulunmaz. Buna ramen baz bilim adamlar yaamn en az 3.8 milyar yl nce ve yer krenin oluumundan 750 milyon yl sonra ortaya ktn savunmaktadrlar.
leri yapl hcreler ise karyotik hcreler denir. karyotik hcrelerin DNA genetik materyali bir ekirdek zar ile evrilmitir. ok sayda farkl organelleri mevcuttur. Prokaryotlar dnda kalan tm canllara ait hcreler karyot hcre tipindedir (prokaryot ve karyotlar arasndaki baz farklar iin Tabloyu inceleyiniz). karyotlar, genel olarak hayvan, bitki, mantar ve protista olarak drt grupta incelenirler. Baz bilim adamlar kartyolarn da 2.7 milyar yl nce - prokaryotlarn oluumundan 1 ila 1.5 milyar yl sonra ortaya ktna inanmaktadrlar.
Hcre Molekler Yaklam, G. M. Cooper ve R. E. Hausman: eviri Ed. Meral Sakzl ve Nee Atabey, 2006
Baz nesnelerin ve canllarn boyutlar

nsan yumurtas (oosit) 200 mikron Balk yumurtas 5 mm Tavuk yumurtas 30 mm Beyin hcrelerinin en k 4-5 mikron apndadr
Ik mikroskobu ile 0.2 m ile 100 m apnda olan objeler gzlenebilir. Elektron mikroskobu ile 0.1 nm ile 100 m arasndaki objeler incelenebilir.
http://peer.tamu.edu/curriculum_modules/cell_Biology/module_1/whatweknow.htm
Virsler, Viroidler ve Prionlar? Daha nce bahsedildii gibi hcre yaamn temel birimidir. Tm organizmalar hcrelerden olumutur ve hcreler canl varlklardr. Bir varln canl saylabilmesi iin, reyebilmesi, beslenebilmesi, solunum yapabilmesi ve dier canllarla veya evresindeki hcreler ile srekli bir iliki ierisinde olmas gerekir, ancak byle bir varla canl denebilir. Bu nedenler, bilim insanlar zellikler virslerin canl m veya cansz m olduklar konusunda hala bir ittifak salayamamlardr.
Virsler baz hallerde canl gibi davranrken dier baz hallerde tam bir "inorganik" madde gibi davranr. En temel haliyle bir virs, kapsit adl bir protein rt iinde bulunan genetik maddeden (DNA veya RNA olabilir) oluur.
Principles of Genetics, D. P. Snustad ve M. J. Simmons, 2010.
Virsler, Viroidler ve Prionlar? (devam) Virsler, kendi balarna replike olmayan hcre ii parazitler olarak tanmlanrlar. En basit ekliyle virsler bir protein klfla sarlm olan genomik nkleik asitten (DNA veya RNA) ibarettir. Virsn oalmas enfekte hcrelerin metabolizmasna bal olduu iin virsler ile yaplan almalar hcre biyolojisinin birok temel konusuna aklk getirmitir. Bakteri virsleri ile yaplan almalar molekler genetiin temel mekanizmalarnn anlalmasna byk katk salamtr, bitki virsleri ile (ttn mozaik virs) yaplan almalar RNAnn da genetik materyal olduunu gstermitir.
Virsler, Viroidler ve Prionlar? (devam) Her biri genetik materyal olarak DNA ya da RNA ieren birok farkl hayvan virs vardr (Tablo). RNA genomuna sahip olan virslerin ou enfekte ettikleri hcrelerde RNA kalbndan yeni RNA kopyalar sentezleyerek oalrlar. Buna karn, retrovirs olarak adlandrlan hayvan virs ailesi RNA genomu iermelerine ramen enfekte ettikleri hcrelerde genomlarnn bir DNA kopyasn sentezlerler. Baz hayvan virsleri ile enfeksiyon konak hcreyi ldrmek yerine normal hcreyi kanser hcresine dntrr. lk kez Peyton Raous tarafndan 1911de izole edilen virsler ile yaplan almalar sonucu baz virslerin kansere yol at bulunmutur. Virslerin sebep olduu baz insan kanserleri: servikal ve dier anogenital kanserler (papilloma virsleri), karacier kanserleri (hepatit B ve C virsleri), baz lenfoma trleri (Epstein-Barr virs ve insan T-hcresi lenfotropik virs). Virsler ile indklenen bu kanserler dnya apndaki kanser olgularnn yaklak %20sini oluturur.
Virsler, Viroidler ve Prionlar? (devam) Viroidler ise virs benzeri RNA moleklleri olup bir protein klf ile evrilmemilerdir. Baz bitki ve hayvanlarda enfeksiyonlara sebep olan halkasal RNAlardr. Patates Spindle Yumru Viroidi (Potato Spindle Tuber Viroid) tanmlanan ilk viroid olup 359 nkleotid uzunluunda bir RNAdr. Yine prionlar, bir dier enfeksiyon neden olan ajan olup hibir nkleik asit iermeyip sadece proteinden olumaktadr. Prionlar, 1982 ylnda Stanley Prusiner tarafndan kefedilmitir ve 1997 ylnda bu kefinde dolay Nobel dl almtr. Prionlar nrodejeneretif hastallarda sorumludurlar: bunlardan bazlar, insanlardaki Creutzfeldt-Jakob hastal ve kuru, srlardaki deli dana hastal ve koyunlardaki scrapiedir.
RNA
HCRE BYOLOJS ARATIRMALARINDA KULLANILAN BAZI ARALARI Ik Mikroskopu Hcrelerin ou plak gzle grlmeyecek kadar kk olduklarndan hcre almalar arlkl olarak mikroskop kullanm gerektirir. Daha ncede belirtildii gibi hcrelerin kefi mikroskobun gelitirilmesi ile salanmtr. Robert Hook 1665de basit bir k mikroskobu ile bir ie mantar parasn gzlemleyerek hcre szcn kullanmtr. Gnmz k mikroskoplar objeleri yaklak bin kez bytme kapasitesine sahiptir. ou 1 ile 100 m apnda olan hcreler k mikroskopu ile grntlenebildii gibi nkleus, kloroplast ve mitokondri gibi byk hcre ii organeller de grlebilir. Fakat, k mikroskoplar hcre yapsnn ok ince ayrntlarnn grlmesi iin gl deildir. Bunun iin rezolsyon bir mikroskobun kk mesafelerle ayrlm objeleri ayrt etme kapasitesi bytmeden daha nemlidir. Bir k mikroskobunun rezolsyonu yaklak olarak 0.2 mdir. Birbirine bu mesafeden daha yakn olan iki cisim birbirinde ayrt edilmez, tek bir cisim gibi grlr.
Ik mikroskobunda rezolsyon aadaki forml yardmyla hesaplanr: 0,61 Rezolsyon = NA , grnen n dalga boyudur. 0.4 ila 0.7 m arasndadr. Ik mikroskobu iin 0.5 m civarnda sabittir. NA, nmerik aklk rnekten getikten sonra mikroskop merceine giren k konisinin bykldr. NA ise yle hesaplanr: NA = sin , n rnek ile mercek arasnda yol aldn ortamn krma indeksi: Hava iin 1.0dr; immersiyon ya lensi iin 1.4dr. Maksimum alfa as 90o olduu iin sin = 1dir. Bu deer formle konulduunda rezolsyon 0.2 m olarak hesaplanmaktadr. 0,61 x 0.5 = 0.22 m Rezolsyon = 1.4
Nmerik aklk Ik toplayc mercekle rnek zerine odaklanr ve daha sonra mikroskobun objektif merceiyle toplanr. Nmerik aklk, objektif merceine gelen k konisinin asyla () ve mercekle rnek arasndaki ortamn (genellikle hava veya immersiyon ya) krma indeksi ile belirlenir.
FARKLI MKROSKOP ETLER Birka farkl k mikroskop teknii bulunmaktadr: En basiti n direkt olarak getii ve hcrenin farkl blgelerinin ayrt edilmesi kapasitesine dayanan aydnlk-alan mikroskopisidir. Canl hcreleri grntlemek iin kullanlan dier yaygn mikroskop eitlerinden bazlar, faz-kontrast mikroskopisi ve differansiyel interferans-kontrast mikroskopisidir. Her iki mikroskopide de hcrenin farkl blgeleri arasndaki younluk ve kalnlk farkllklarn sonutaki kontrast farkllklarna dntren optik sistemler kullanlr. Her iki mikroskopta canl boyanmam hcrelerin daha gelimi grntlerinin elde edilmesini salar.
Canl hcrelerin mikroskopta incelenmesi nsan yanak hcrelerinin (A) aydnlk-alan, (B) faz-kontrast ve (C) diferansiyel-interferanskontrast mikroskopisi ile elde edilen grntleri.
Floresans mikroskopisi, molekllerin hcre iindeki dalmn incelemek iin yagn olarak kullanlan olduka duyarl dier bir mikroskopi yntemidir. Canl veya sabitlenmi hcrelerin iindeki ilgilenilen molekl iaretlemek iin bir floresan boya kullanlr. Floresan boya, bir dalga boyunda absorblayp, ikinci bir dalga boyunda yayan molekldr. Floresant madde ile iaretli rnek nce bu floresant boyay eksite eden bir nla uyarlr ve daha sonra bu floresant molekln farkl bir dalga boyunda yayd k ikinci bir filtre yardmyla belirlenir. Floresan mikroskopisi hcre ierisindeki eitli molekllerin aratrlmas amacyla kullanlr. Bunlardan bir tanesi, zgl bir proteini hedefleyen antikorlar floresant boyalarla iaretleyerek proteinin hcre ii dalmnn aratrlmasdr.
Floresans mikroskopisi (devam)

A) Ik bir eksitasyon filtresinde geirilerek, floresant boyay ekzite eden dalga boyundaki k (rn. mavi) seilir. Dikronik ayna , incelenecek rnein zerine yanstr. Daha sonra rnein yayd k (rn. yeil) dikronik ayna geerek boyann yayd dalga boyundaki seecek olan ikinci bir filtreye ular. Bu filtre yardmyla floresant boyann yayd k seilir. B) DNAs mavi, sitoplazmadaki mikrotblleri yeile boyanm bir kertenkele akcier hcresinin floresans mikroskop grnts.
Floresans mikroskopisi (devam) Green Floresant Protein (GFP) ile iaretlenmi bir proteinin floresant mikroskopisi. GFP ile birletirilen bir mitokondri proteinin, kltrdeki insan hcrelerine aktarldktan sonra floresant mikroskobu ile grnts. GFP, 238 amino asitten oluan bir protein olup mavi a maruz brakldnda yeil floresans yaymaktadr. Denizanasndan elde edilmektedir.
Hcreyi Bileenlerine Ayrmak
Hcreyi oluturan eitli bileenlerin ilevlerini tanmlamak iin mikroskopi teknikleri tek bana yeterli olmamaktadr. Biyokimyasal ilemler ve dier birok ilem iin hcrelerin organellerini ve dier ksmlarn izole etmek gerekir. 1940 ve 1950li yllarda Albert Claude, Chrsitan de Duve ve arkadalar tarafndan gelitirilen diferansiyel santrifgasyon yntemi hcre bileenlerini boyut ve younluklarna gre ayrmaktadr. Hcreyi alt bileenlerine ayrmann admlar aada sralanmtr: 1. Plazma zarnn paralanmas. Bunun iin ultrasonikatr ve mekanik homogenizatr kullanlabilir.
2. Paralanm hcre sspansiyonu (lizat ya da homogenat olarak adlandrlr) ok yksek hzlarda (100,000 rpm zeri) eviren bir ultrasantrifj yardmyla bir dizi santrifgasyonla alt bileenlerine ayrlr. Dk devirde paralanmam hcreler ve nkleus gibi byk hcre ii organeller ker.
Hcreyi Alt Bileenlerine Ayrmak (devam) Bu ekilde dk hzdaki bir santrifjle oluan keltiden zengin bir nkleus fraksiyonu elde edilirken dier hcre bileenleri spernatanta (geri kalan zeltide) asl durumda kalr. Spernatan daha sonra yksek devirde santrifjlenerek mitokondriler, lizozomlar, peroksizomlar veya kloroplastlar ktrlr. Daha da hzl devirlerde yeniden santrifjlenmesi ile plazma ve endoplazmik retikulum paralar ktrlr, en yksek devirde evrildiinde son olarak ribozomlar ktrlr. Geride sadece sitoplazmann znen ksm (sitozol) kalr.
Hcreyi Bileenlerine Ayrmak (devam) Hcreler patlatlr ve hcre alt bileenleri artan hzlarda bir dizi santrifgasyonla ayrlr. Her santrifjlemeden sonra tpn dibindeki km olan organeller alnr, ve spernatan daha yksek devirlerde evrilerek byk organeller ktrlr.
Hayvan Hcre Kltrleri Prokaryotlarn aksine karyot hcrelerin laboratuar ortamnda retilmesi ok zordur. Fakat hzl gelien molekler biyoloji teknikleri yardmyla birok hayvan ve bitki hcre eidi kltrde oaltlmakta ve hcre geliimi, farkllamas, gen yaps ve fonksiyonlarnn aratrlmasnda byk katk salamaktadrlar. Hcre kltr, in vitro artlarda (vcut dnda) hcrelerin bytlmesini ifade eder. eitli karyotik hcre kltr bulunmaktadr: 1. Primer hcre kltrleri 2. Sekonder hcre kltrler 3. mmortal (lmsz) hcre kltrleri
Hayvan Hcre Kltrleri (devam) Primer hcre kltrleri donr (verici) organizmadan direkt elde edilen balang hcrelerdir. rnein beyaz kan hcreleri veya insan fibroblast hcreleri. Bunlar kltr ortamnda bir veya iki blnme gerekletirebilirler, sonuta yalanrlar ve lrler.
Sekonder hcre kltrleri ise in vitro artlarda 50-100 blnme geirebilirler, fakat sonunda yalanrlar ve lrler.
mmortal hcre kltrleri, primer ve sekonder hcre kltrlerinin aksine ortam artlar elverili olduu srece sonsuza kadar blnebilirler. mmortal hcreler transforme hcreler olarak da bilinirler. lk elde edilmi olan lmsz insan hcre hatt HeLa hcreleridir. Bu hcreler 1952 ylnda serviks kanserine yakalanm olan bayan Henrieatta Lacksten alnmtr. Bayan Lacks daha sonra kanserden lmesine ramen hcreleri halen hayatta ve aratrmalarda kullanlmaktadr.
Hayvan hcre kltrlerinin elde edilii
Hcrenin Kompartmanlar
ekirdek (nkleus) sitoplazma

sitozol (en geni kompartman, organel disindaki sivi
kismi)
organeller
MEMBRANLAR
nsan vcundaki en nemli yapsal elemandr. Tm hcreyi sard gibi (plazma zar) ou organellerin etrafn da sarmaktadr. Membranlar yoluyla maddelerin hcre iine giri-k ile hcre iinde sitozol ile organeller aras hareketi dzenlenir. Birok ilevi olmasna ramen, en temel evrensel grevi, molekllerin hareketinde seici bir bariyer olmas (seici-geirgen, baz molekllerin geiine izin verirken bazlarna izin vermemesi).
Plazma membrannn ilevleri

Hcre iin seici geirgen bir bariyer oluturmas

Hcrenin komu hcrelere balanmas Komu hcrelerden kimyasal sinyallerin alnmas
Hcre iskeletini oluturan filament yaplarnn tutunmas
Plazma membrannn yaps Tm membranlarn temel yaps ierisinde proteinlerin gml olduu ift katl lipid tabakas eklindedir:
- Lipid tabakas birok polar molekln geiini nler, proteinler bu maddelerin seici geii iin yollar oluturur. - Hcre membran, %50 lipid ve %50 proteinden oluur. - Mitokondri zar ise %75 proteinden olumaktadr. - Sinir hcrelerinin zarlarnda ya oran daha yksektir.
Membran Yaps
Tm membranlar proteinlerin iinde gml olduu ift katl lipid molekllerinden oluur. Lipid tabakas, polar ve iyonlarn geiini engeller, proteinler ise bu tr molekllerin lipid bariyerinden geebilmeleri iin kanallar oluturmaktadrlar.
Membran lipidleri
Fosfolipidler ierir; Polar-hidrofilik fosfat ucu da; polar su moleklne ekiminden dolay. Nonpolar-hidrofobik ya asitleri ise ie bakar. Amfipatik molekllerdir (bir ucu ykl, dier ksmnda ise nonpolar uzun iki ya asiti vardr). Fosfolipidleri birbirine veya membran proteinlere baglayan balar yoktur. Her molekl birbirinden bamsz bir ekilde hareket etmektedir. Dolaysyla, lipid ift tabakas, sv bir karaktere sahiptir.
Plazma zar ayrca kolesterol ierir; Plazma membrannda fazla, Organel membranlarnda azdr. Akkanln korunmasn salar. Fosfolipidlere gre daha az amfipatiktir. Polar grubu yzeyde, nonpolar ksm ise ite ya asitleri birleiktir. Kolesterol azlnda membran katlamaktadr.
Membranlarda grlen balca lipid eitleri

Hemen hemen tm membranlarn temel yapsal nitesi iki tabakal fosfolipidten oluur. Baz biyolojik membranlar birbirinde farkl 100den fazla fosfolipid eidi iermektedirler. En ok bulunan lipid tipleri ve yzdeleri aadaki Tabloda grlmektedir.
Molekler Biyoloji, Ed. Ahmet Yldrm, Fevzi Bardak, Mehmet Karata, Bahattin Tanyola, Nobel Yaynevi, 2007
Lipid ift tabakasnda baz fosfolipidler ve kolesteroln dalm
Membran Proteinleri
ki eit membran proteini vardr: ntegral Membran Proteinleri: ou tm membran boyunca uzanr ve baz maddelerin kar tarafa getii kanallar olutururken, dierleri kimyasal sinyallerin tanmasndan sorumludur. Fosofolipidlere gibi amfipatiktirler. Polar gruplar yzeyde, nonpolar ksmlar ise ite nonpolar ya asitleri ile birleiktir. Membran boydan boya geenlere transmembran protein de denir. Su ve iyonlarn geiini salayan kanallar meydana getirirler. Periferik Membran Proteinleri: Daha ok sitoplazmik tarafta yer alp, hcrenin ekli ve motilitesi ile ilgili grev alrlar. Amfipatik deillerdir. Bu nedenler nonpolar lipidlere balanmazlar. ntegral membran proteinlerin polar yzeylerine balanrlar. Hcre zar ayrca lipid ya da proteinlere balanan ok az karbonhidrat ierir. Bu karbonhidratlar ekstraselller ksmda glikokaliks denilen bir eker tabakas oluturur. Karbonhitratlarn spesifik olarak plazma zarnn hcre d yzeyinde, periferal proteinlerin hcre ii yzeyinde ve lipid ift tabakasnn her bir yarsnda lipidlerin miktar ve eit olarak biraz deismesinden dolay hcre zar asimetrik yapya sahiptir.
Plazma zar proteinlerinin zar iinde hareketini gsteren deney

Membran proteinlerinin lipid ift tabakas iinde serbeste hareket ettikleri ilk defa 1970de Larry Frye ve Michale Edidin tarafndan yaplan deneyler ile gsterilmitir. Aratrmaclar, yaptklar deneyde nce fare ve insan hcrelerini birletirerek (fzyon) bir hibrid hcre elde etmilerdir. Deneyde insan ve fare proteinleri floresant boyalarla iaretli antikorlar ile iaretlemilerdi ve floresant mikroskop ile proteinlerin hareketi incelenmiti. Birlemenin ilk zamanlarnda fare ve insan proteinleri hibrid hcrenin farkl yarlarndayd. Ancak 40 dklk inkbasyon sonunda proteinlerin hibrid hcrede eit olarak dald grlmtr. Bu sonu, proteinlerin lipid ift tabakas iinde serbest hareket ettiklerinin bir kantdr. Fakat baz proteinler hcre iskeletini oluturan proteinlere tutunduklar iin lipid ift tabakas iinde hareketleri kstlanmtr.
Molecular Biology of the Cell, 2002, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.
Membran Proteinleri ntegral proteinler
Hcre d
Periferal proteinler
Hcre ii
Sv-mozaik model
Akkan ve asimetrik zellikleri nedeniyle membran yaplarna uygun grlen genel tanmlama.
HCRELERARASI BALANTILAR
(Lateral Yzey Farkllamalar)
Hcreleraras balant blgeleri, hcrelerin ortak hareket
etmelerini ve haberlemelerini salayan hcre zarnn yan yzeyinde meydana gelen sitoplazmik uzantlardr. Hcreler
arasndaki balanmay u gruplara ayrabiliriz:

1. 2. 3. 4.
Tight junction - sk balant Atherens balantlar - zonula adherens Desmozom (iki hcre arasndaki mesafe 20 nm) Gap junction - aralkl balant (iki hcre arasnda 2-4
nm mesafe vardr).
Sk balantlar (tight junction) Sk balantlar, epitel hcreleri arasnda moleklleri ve iyonlarn serbeste gemesine engelleyen balantlardr. kinci olarak sk balantlar lipidlerin ve zar proteinlerinde serbest difzyonunu engelleyerek plazma zarn apikal ve bazolateral blmlere ayrr. Apikal ve bazolateral blgelerdeki zellemi transport sistemlerini birbirinden ayrr. Plazma zarnn apikal ksmndaki glikozu aktif olarak barsak lmeninden alan bir tayc protein bulunurken, kan dolamna aktaran tayc bazolateral blmde bulunmaktadr. Bylece glikoz aktif olarak emilir, barsak epitel hcreleri iinde biriktirilir ve daha sonra bazolateral taraftaki bir tayc tarafndan kolaylatrlm difzyon ile kan dolamna aktarlr. Sk balantlar olmasayd bu tayclar birbirinden ayrlmayaca iin bu ekilde barsak lmeninde kana doru bir tama gereklemezdi.
Sk balantlar (devam) Sk balantlar, bitiik hcrelerdeki transmembran proteinlerden okludinler ve klodinler arasndaki etkileimlerle oluur.
Atherens balantlar Kaderinlerin araclk ettii kararl hcre-hcre balantsdr. Atherens balantlarda kaderin proteinleri kateninler araclyla aktin filamenlerine balanr. Sk balantnn gerisinde hcreleri kesintisiz kuaklar biiminde sararak birbirine tutundurur. Atherens balantlar hemen sk balantlarn altnda bulunurlar.
Desmozomlar Hcreleri birbirine tutunduran dme eklindeki balant birimleridirler. Sk balant ve atherens balantlarn gerisinde bulunurlar. Desmozomlarda, kaderin ailesi yelerinde desmogleinler ve desmokolinler, desmoplakinlere balanrlar. Desmoplakinlerde hcre iindeki ara filamentlere balanrlar.
Kaderinler
Kaderinler, tek bir transmembran blge ierir ve yukarda anlatld zere -kateninler (atherens balantlarda) veya desmoplakinler (desmozomlarda) ile birleerek hcre iskletine balanr. Kaderinlerin eidi bulunur:
E-kaderin, epitel hcrelerin yzeyinde bulunur ve E-kaderin kayb epitel hcre kkenli kanserlerin gelimesine neden olmaktadr.
N-kaderin, sinir hcrelerinde bulunur.

P-kaderin ise plasenta hcrelerinde bulunur. Atherens ve desmozomlarda kaderinler homofilik etkileime rnektir.
Molecular Biology of the Cell, 2002, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter
Hcre-Hcre yapmasna, hcre yzey reseptrleri farkl mekanizma ile araclk ederler. Bunlar, homofilik balanma, iki komu hcrede ayn molekller araclk eder, heterofilik balanma, komu hcreler farkl proteinler arasndaki etkileim ile balanrlar, Kpraracl balanma, komu hcreler arasnda balanma hcre yzey reseptrlerinin birbirlerine salglanan ve bir kpr vazifesi gren bir molekl araclyla salanr.
Selektinler
Selektinler, kanda hcre-hcre yapmasna araclk etmektedirler. Beyaz kan hcrelerin kan ile doku arasndan gebe bir hayat yaamaktadrlar. Bu zellikleri selektinlere baldr. Selektinler, kanda hcre-hcre aras balantlara araclk eden Ca2+ baml karbonhidrat balayan hcre yzey proteinleridir (karbonhidrat balayan proteinlere lektinler de denir). Selektinlerin de en az eidi vardr: P-selektinler, kandaki plateletlerde, E-selektinler, endotel hcrelerinde, L-selektinler, beyaz kan hcrelerinde bulunur. Selektinler integrinler denilen dier bir transmembran proteinler ile etkileerek beyaz kan hcrelerinin kan terk etmesine ve dokuya g etmesine yardmc olur. Selektinler ile integrinler arasndaki balant heterofilik balanmaya rnektir.
A) selektinlerin yaps ve B) ilevleri
Aralkl balant -gap junction

Konneksin
Komu hcrelerin sitoplazmalarn balayan protein kanallardr. aplar ok kktr. Elektriksel aktivitenin iletimi (rnek = kas) ya da kimyasal habercilerin (cAMP , Ca2+) geiine izin verir.
Aralkl balant -gap junction (devam)

Gap junctionlar, konneksin proteinleri ile oluturulur. Konneksinler, 20 ile 60 kDa arasnda proteinler olup plazma membrann 4 sarmal yap ekilde kat ederler. Amino ve karboksil ular sitoplazmik taraftadr. Gap junctionlar, her biri 6 alt birimden oluan 2 adet hemikonneksonnun (her bir yarm kanala konnekson denir) birlemesiyle oluur. Bu sayede 2 hcrenin sitoplazmas arasnda iletiim kurulur.
http://en.wikipedia.org/wiki/Connexin
HCRE LE MATRKS ARASINDAK BALANTILAR

(Bazal Yzey Farkllamalar) ki tip hcre-matriks balants vardr: 1. Fokal adhezyonlar 2. Hemidesmozomlar Fokal adhezyonlar, fibroblast gibi eitli hcreleri hcre d matrikse balar. Bu hcre-matriks balants integrinlerin -alt birimlerinin sitoplazmik blmleri ile talin ya da vinklin gibi aktine balanan proteinler araclyla aktin filametlerine balanarak hcre matrikse balanr. ntegrinler, hcrelerin hcre d matrikse tutunmasndan sorumlu balca hcre yzey reseptrleridir. ve alt birimleriyle simgelenen iki alt birimden oluan transmembran proteinler ailesidir. Bilinen 18 ve 18 alt biriminin kombinasyonlarndan oluan 20den fazla farkl integrin tanmlanmtr.
A) ntegrinlerin yaps ve B) Fokal adhezyon balants.

ntegrinler, ve ile simgelenen iki transmembran alt biriminden oluan bir heterodimerdir. Alfa alt birimi iki deerlikli katyonlar (M2+) balamaktadr. Fokal adhezyolarda aktin filamentleri -aktinin, talin ve vinklin gibi proteinler araclyla integrinlerin -alt birimlerine tutturulur.
B
-aktinin Vinklin Talin
Hemidesmozomlarda, integrin (64), plektin araclyla aktinle deil ara filamentler ile birleir. 64 integrin, ayrca laminine balanr ve bylece hemidezmozomlar epitel hcrelerini bazal laminaya sabitler.
Hcreleraras ve hcre-matriks arasndaki balantlarn yerleimi
Balant
Sk balant
lev
Epitel hcrelerini biribirine balayarak hcreler arasnda madde geiini nler. ki hcrenin aktin filamentlerini birbirine balayarak hcrelerin doku iinde Atherens balant dzenlenmesini ve hcre tabakalarnn devamlln salar. ki hcrenin ara filamentlerini birbirine balayarak hcrelerin doku iinde dzenlenmesini ve hcre tabakalarnn devamlln salar. Aralkl balantlar Kk molekllerin bir hcreden dierine geiini salar. Hemidesmozomlar Hcreleri alttaki bazal laminaya balar. Fokal adhezyonlar Hcreleri alttaki bazal laminaya balar. Desmozom
HCRE SKELET
Membranla evrili birok organele ilave olarak ou hcre eitli filamentler ierir. Filamentlerin hcre iinde oluturduklar as yapya hcre iskeleti denir. Filamentleri dier baz grevleri: 1. Hcrenin eklini belirlemek 2. Hcre hareketleri saglamak. 3. Hcreye destek olurlar. 4. Hcre ierisinde kimyasal habercilerin tanmas. 5. Kromozomlarn yavru hcrelere ayrlmasna yardmc olurlar. Hcre iskeleti temel filamentten oluur: Mikrofilamentler (aktin, tm hcrelerde bulunur, hcre iskeletini en nemli parasdr, 7 nm.) Orta Filamentler (mekanik strese maruz kalan hcrelerde youn olarak bulunurlar, keratin, laminin, vimentin gibi proteinler, 10 nm) Mikrotbller (tblin proteininden oluur, kromozomlarn hcre blnmesi srasnda ayrlmasnda ve ayrca hcre hareketlerini salar). Hcre iinde kimyasal habercilerin vezikller iinde sinir ularnda tanmada da grev alr, 24 nm.)
Hcre iskeletini oluturan mikrofilament ve hcre icinde madde tanmasnda grev alan mikrotbller
Thibodeau&Patton; Anatomy&Physiology, 1993.
Aktin Filamentleri Ana hcre iskeleti proteini aktindir. Aktin proteini, aktin filamentlerine polimerleir, yaklak 7 nm apnda ve birka mikrometre uzunluundadr. Hcre iindeki aktin filamentleri mikrofilamentler olarak da adlandrlr. Aktin filamentleri ok sayda protein ile etkileerek as bir yap oluturur. Aktin ilk olarak 1942 ylnda toplam hcre proteinlerinin yaklak %20sini oluturduu kas hcrelerinde izole edilmitir. Balangta sadece kas kaslmasnda grevi olduu dnlse de gnmzde tm karyot hcrelerinde en fazla bulunan protein (%5-10 civarnda). Mayalarda sadece bir aktin geni vardr, fakat memelilerde en az alt farkl aktin geni vardr. Aktin moleklleri 375 amino asitlik (43 kDa) globler (G) proteindir, aktin moleklleri polimerize olarak filamentz (F) aktin oluturur.
Aktin filamentlerinin polimerlemesi
Aktin filamentleri (devam)
Aktin filamentleri hcrede aktin demetleri veya aktin a eklinde bulunmaktadr. Aktin demetleri daha nce bahsedildii gibi mikrovilluslarda bulunmaktadr ve aktin demetleri fimbrin denilen 68 kDaluk bir protein ile birbirine tutturulmaktadrlar. Aktin anda ise aktin filamentleri flamin denilen 280 kDaluk dimerik bir protein ile birbirine tutturulmaktadrlar.
Aktin a ve filamin
Aktin demeti ve fimbrin
Aktin filamentleri (devam) Aktin filamentleri hcre zarnn altnda ok youndurlar. Bu aktin a dier baz proteinler ile birlikte hcrenin eklini ve hareketi gibi ok sayda aktivite ile ilikilidir. Eritrosit hcrelerinde, aktin spekrin denilen tetramerik bir protein ile birlikte plazma zarnn altnda hcre iskeletini oluturan temel yapy oluturmaktadr. Eritrositlerde mikrotbller ve ara filamentler yoktur. Eritrositlere bikonkav disk eklini veren asl belirleyici faktrdr aktin temelli hcre iskeletidir. Spekrin-aktin a ile plazma zar arasndaki balant ankrin olarak adlandrlan hem spektrine hem de bir transmembran protein olan band 3 proteinin sitoplazmik blmne balanan bir protein ile salanr. Spekrin-aktin a ile plazma zar arasndaki bir dier balant protein 4.1 ile salanr.
Aktin filamentleri (devam)
Eritrositleri morfolojisi
Eritrositlerde hcre iskeletinin plazma zar ile balants
Ara Filamentler Ara filamentler 10 nm apndadrlar. Bu boyut hcre iskeletinin iki temel eleman olan aktin filamentleri (7 nm) ve mikrotbller (25 nm) arasndadr. Aktin filamentleri ve mikrotbllerin aksine ara filamentler hcre hareketlerine dorudan katlmazlar. Bunu yerine hcre ve dokulara ounlukla mekanik destek salayarak yapsal rol oynarlar. Ara filamentlerin in vivo roln gsteren ilk deneyler 1992 ylnda Elaine Fuch tarafnda gsterilmitir. Aratrclar, normal keratin oluumunu bozan bir mutant keratini farelere aktararak transgenik fare elde ettikten sonra normal keratin oluumunun bozulduu grlm. Transgenik farelerin ounun doumdan sonraki 24 saat iinde ldkleri grlmtr. Hayatta kalanlarn ise deri srtnmesi gibi orta iddetteki mekanik travmalar takiben epidermal hcrelerin kaybedildii ve deride kabarck eklinde anomalilerin olutuu gzlenmitir.
Ara Filamentler (devam)
Fuchs ve arkadalar daha sonra transgenik farelerde gzlene bu bozukluun epidermolizis bulloza simpleks ad verilen insan deri hastalna benzer olduunu belirlediler. Bu deneyler keratinin epitel hcrelere mekanik destek saladn direkt kantdr. Benzer deneylerde motor nron hastalklarnda zellikle amiyotrofik lateral skleroz (ALS)da nrofilament bozukluklar olduu grlmtr. Stephan Hawkingi de etkileyen hastalk olan ALS motor nron kayb ile sonulanmaktadr. ALS ve dier tipteki motor nron bozukluklarnda nrofilamentlerin birikiminde ve yaplanmasnda bozukluklar ile karakterize edilir. Transgenik farelerde NF-L ve NF-H fazla retiminin ALSye benzer bir durumun gelimesine yol amaktadr.
Keratin proteinin ilevinin deneysel gsterimi
Ara filamentleri oluturan proteinler ve bulunduklar hcreler
Mikrotbller Mikrotbller yaklak 25 nm apnda, sert, ii bo silindirik yaplardr. Aktin filamentleri gibi mikrotbllerde hcre iinde devaml yaplanp ayrabilen dinamik yaplardr. Hcrenin eklinin belirlenmesinde, hcrenin yer deitirmesinde, organelleri ve nrotransmitterlerin tanmasnda ve mitoz srasnda kromozomlarn ayrlmas gibi eitli grevleri vardr. Fibrz proteinlerden oluan bir ok ara filament aksine mikrotbller tbln denilen globler bir proteinden olumutur. Tbln birbiri ile ok benzeyen -tbln ve -tbln denilen iki proteinde oluan dimerik bir proteindir. nc bir tbln olan -tbln spesifik olarak sentrozomlarn yapsnda yer alr ve mikrotbl yaplanmasnda kritik rol oynar. Mikrotbller (aktin filametleri gibi) iki farkl ucu olan polar molekllerdir. Hzl byyen uca art u; yava byyen uca ise eksi u denir.
Mikrotbller (devam)
Polimerleme GTPye baldr. GTP bal tbln monomerleri mikrotblnn art ucuna eklenirken GTPnin hidroliz edilmesi ise tbln molekllerinin komu molekllere olan balanma eilimini zayflatr ve daha sonra GDP bal tbln ayrarak hzl depolarizasyona ve mikrotbln ksalmasna yol aar. Mikrotbllerin mitozdaki merkezi rolleri nedeniyle mikrotbl yaplanmasn etkileyen ilalar kanser tedavisi iinde ok yararldr. Kolisin ve kolsemid tbln proteinine balanarak mikrotbl polimerlemesini engelleyen iki ilatr. Yine vinkristin ve vinblastin seici olarak hzl blnen hcrelerin oalmasnn durdurduu iin kanser kemoterapisinde kullanlan iki ilatr. Taksol ise mikrotbl yaplanmasn engellemek yerine stabilize ederek hcre blnmesini durdurur. Taksol da antikanser tedavisinde kullanlan nemli bir ilatr.
Mikrotbllerin yaps
Alfa ve beta tblnler polimerleerek mikrotblleri oluturur. Her bir silindirik yap 13 adet tbln moleklnn birlemesi ile meydana gelir.
Mikrotbller (devam) Mitoz srasnda mikrotbller kromozomlarn ayrlmasndan ve yavru hcrelere dalmndan sorumlu olan mitotik ii oluturmak zere kopyalanm sentrozomlardan darya doru uzanr. Mikrotbllerin eksi ular sentrozomlarda tutulur.
Mikrotbller (devam)
Daha ncede belirtildii gibi mikrotbller hcre iinde nrotransmetitter ieren vezikllerin ve organellerin tanmasnda da grevlidirler. Bu tamada ATP enejisini kullanan iki byk motor protein olan kinezinler ve dineinler nemli grev stlenmilerdir. ou kinezi mikrotbl zerinde art uca doru; dineinler ise eksi uca doru hareket eder. Kinezinleri art uca doru hareketi vezikllerin ve organellerin hcre gvdesinde uzaa doru, aksonlarn ularna doru tanmasn; dineinlerin eksi uca doru hareketi ise ters ynde endozidik vezikllerin aksonda hcre gvdesine doru tanmasn salar.
Mikrotbller (devam)
Mikrotbl motor proteinlerinin hareketi
EKSTRASELLLER MATRKS (HCRE DII MATRKS)

ok hcreli canllarn dokularndaki hcreler, hcre dna salglanan proteinler ve polisakkaritlerden oluan bir hcre d matriks iine gmldr. Hcre d matriks, hcreler arasndaki boluklar doldurur. Hcreleri ve dokular birbirine balayan kompleks bir yapdr. Ba doku; deri, tendonlar, kkrdak ve kemik gibi ba dokusu eitlerinin byk blm hcre d matriksten oluur. Epitel dokuda hcrelerin zerine yerletii ince levhams bir tabaka olan bazal lamina bir hcre d matriks rneidir. Bazal lamina, epitel hcrelerine destek salayan bir tabakadr. Hcre d matriksin dier baz grevleri unlardr: 1. 2. 3. 4. Su tutarak, yumuak doku gerginliini ayarlar. Mineral tutarak, iskelet dokusunun salamlk ve sertliini salar. Byme faktrlerini barndrr. Hcrelerin yapmasn, gn ve oalmasn dzenler.
Altnk, D., 2008, Ekstraselller matriks-ba doku biyokimyas, Ders Notlar, ADTF Biyokimya AD, Aydn
Epitel hcreleri, ince bir tabaka olan bazal lamina zerine yerleirler. Bazal laminann altnda ounluunu fibroblast hcrelerin salglad hcre d matriksten oluan gevek ba dokusu bulunur. Hcre d matriks jel benzeri polisakkarit temel maddesi ierisine gmlm ipliksi yapsal proteinler ierir.
Bazal lamina bir hcre d matriks rneidir.
Kollajen
Ekstraselller matriksin en nemli yapsal proteini kollajendir. Kollajen en az 19 farkl yesi bulunan byk bir protein ailesidir. polipeptid zincirinin halata benzer bir yap oluturmak zere birbirlerine skca doland sarmal bir yapya sahiptir. Kollajenin sarmal yapsnn olumasnda tekrarlayan Gly-X-Y amino asit dizisi byk neme sahiptir. Sarmal yapnn olumas her amino asitte bir glisin amino asidinin bulunmas gerekir. X pozisyonunda sklkla prolin ve Y konumunda ise hidroksiprolin sklkla bulunmaktadr.
Kollajen (devam)
Kollajen, tendonlarda, kkrdakta, kemiklerin organik matriksinde ve gzn korneasnda nemli miktarlarda bulunan bir proteindir. Kollajen, hayvan dokularnda en bol bulunan proteindir; memeli hayvanlarn vcut arlnn %6sn, tm vcut proteinlerinin %30unu oluturur.
Karacierde Aortada Kkrdakda Kemikte % 4 %10 %50 %23 orannda bulunur
Kollajen (devam) Kollajen, hcrede znr nc molekller olan prokollajen olarak sentezlenir. Prokollajen salglandktan sonra kollajen oluturmak zere prosekans kesilir ve aralkl diziler halinde bir araya gelerek kollajen fibrillerini meydan getirirler. Kollajen fibrilleri, l sarmal yapdaki lizin ve hidroksilizin yan zincirleri arasnda kovalent balarn olumasyla meydana gelir.
Elastin
Elastin, ba dokunun dier nemli bir fibriler proteinidir. Yaklak 750 amino asit uzunluunda olup olduka hidrofobiktir. Kollajen gibi prolin ve glisin asndan zengin fakat kollajenin aksine karbonhidrat grublar ve hidroksilizin iermez. Elastin biyosentezi iin nce ribozomlarda proelastin sentezlenir. Proteolitik ilemden sonra oluan znr formadaki tropoelastin (elastin nc formu) ekstraselller arala salglanr ve elastin fiberleri oluturur. Tropoelastin, elastin fibrillerinin polipeptit alt nitesidir. Salglanan tropoelastin moleklndeki lizin kalntlarnn yan zincirleri arasnda oluan kovalent balarla (kollajendeki aralkl yan yana dizilen liflerin aksine) as bir yap oluturur. Elastin a gerildiinde genileyen braklnca da eski haline dnen bir lastik bant gibi davranr. Akcier bol miktarda elastin liflerine sahiptir, her nefes alta geniler ve her nefes verite eski haline tekrar dner.
Glikozaminoglikanlar (GAG)
Hcre d matriksin yapsal proteinleri, tekrarlayan disakkarit birimlerinden meydana gelen glikozaminoglikanlar (GAG) ierisinde gmldrler. Disakkarit birimlerinde birisi ya N-asetilglukozamin ya da N-asetilgalaktozamindir, ikinci ise genellikle glukronik asit veya iduronik asittir. Hiyalronan hari bu ekerlere slfat grubu eklenerek modifiye edilmilerdir. Bu sebeple GAGler negatif ykldrler. Pozitif ykl iyonlar balayarak su molekllerini tutar ve jel olutururlar. Hiyalronan tek uzun zincirli bir polisakkrit iken dier GAGler %95 orannda polisakkarit ve geri kalan miktarlar ise proteinden olumaktadr. Bunlara proteoglikanlar da denmektedir. yi tanmlanm proteoglikanlardan bir tanesi kkrdan nemli bileenlerinden olan agrekandr. Agrekan, yzden fazla kondroitin slfat zinciri ve 250 kDa civarnda bir proteinden oluan 3000 kDa byklnde bir proteoglikandr.
Fibronektin Fibronektin, her biri 2500 kadar amino asit ieren iki polipeptid zincirinden oluan dimerik bir glikoproteindir. Her bir monomer dislfit bayla balanarak dimerik bir protein oluturulur. Hcre yzeyindeki reseptr proteinlere (rn., integrinler) baland iin hcreleri hcre d matrikse balamaktadr. ntegrinlere ek olarak fibronektine kollajen ve heparan slfat proteoglikanlardan sindekana da balanmaktadr. Bir glikoprotein olup 440 kDa arlndadr. Fibronektin, hcre yapmasnda, gnde ve farkllamasnda nemli roller oynamaktadr. ntegrinler, fibronektinde bulunan RGD tripeptid yaps (arginin, glisin, aspartik asit) zerinden balanr. Fibronektin-integrin etkileiminin tmr gnde, invasyonda ve metastazda nemli olduu bilinmektedir.
Fibronektin dimerin yaps ki polipeptid monomeri C-ucu yaknnda dislfit ba ile birbirine balanmtr.
Bazal Lamina ve Laminin

Daha ncede belirtildii gibi bazal lamina 40-120 nm kalnlnda epitel hcrelerinin tabann deyen bir tabakadr. Ayrca kas hcreleri, ya hcreleri ve schwann hcreleri (periferik sinirlerde aksonlarn etrafn saran miyelin tabasn oluturan hcrelerdir) etrafn da sarmaktadrlar. Bbrek glomerls hcrelerinin arasnda ise seici bir filtre gibi ilev grmektedir. Olgun bazal lamina, tip IV kollajen, heparan slfat perlekan, glikoproteinlerde laminin ve nidojen ierir. Laminin, , ve denilen polipeptid zincirinden olumaktadr. Bu polipeptid zincirleri dislfit balar ile birbirine balanmlardr.
Bazal lamina eitleri
A)Laminin yaps ve B) bazal laminadaki dier proteinleri ile etkileimi

A) Laminin altbirimleri , ve dislfit balar ile birleerek t eklinde bir yap oluturmaktadrlar. Her bir polipeptid zinciri 1500den fazla amino asit iermektedir. B) Bazal lamina, proteinler arasndaki spesifik etkileimler sonucu olumaktadr. Etkileimler kollajen IV, laminin, nidojen ve proteoglikan perlekan arasndadr.
Bazal laminadaki protein-protein etkileimi
Laminin yaps
HCRENN
ORGANELLER
MTOKONDR

ki membranla sarldr Hcrenin balca enerji kaynadr Az miktarda DNA ierirler. Enerjiye ok ihtiya duyan hcrelerde saylar 1000 kadar olabilir, daha az aktif olan hcrelerde ise bu say dktr. Mitokondrinin yapsnda protein boldur, lipidler daha azdr.
Thibodeau&Patton; Anatomy&Physiology, 1993.
Mitokondriler karyotlarda enerji retimi iin kritik bir role sahiptirler. Pirvat ve ya asitleri sitozolden alnr ve mitokondri matriksinde asetil CoAya dntrlr. Asetil CoA daha sonra sitrik asit dngsyle CO2ye oksitlenir.
Mitokondri Genomu
Mitokondrilerin yaplanmas nkleer genom tarafndan kodlanan ve sitozolden alnan proteinlerle birlikte, kendi genomlar tarafndan kodlanan ve organel iinde sentezlenen proteinleri de gerektirir. Mitokondri genomu ile Rickettsia prowazekii bakterisi genomu arpc ekilde benzerlik gsterir. Rikettsialar mitokondriler gibi yalnzca karyot hcreler iinde oalabilen bakterilerdir. Benzer yaam tarzyla tutarl olarak Rikettsia ve mitokondrilerin genomik DNA dizileri, bugnk mitokondrilerin genetik sistemlerinin kken ald ortak bir atay belirler. Btn hcrelerde genom ayn byklkte deildir. Canldan canlya deiir. nsan ve hayvanlarda 16 kb iken mayada 80 kb, bitkilerde 200 kbdir. Arabidopsis thaliana bitkisinin mitokondri DNAs 367 kb iken yalnzca 32 protein kodlar. Kromozomal DNAdan farkl olarak mitokondri DNAs daireseldir ve histon proteinleri yoktur. Mitokondri DNAs toplam nukleer DNAin %1i kadardr. nsan mitokondri DNAsnda intron bulunmamasna ramen, baz bitki ve fungus trlerinde intron vardr. Bakteri kromozomlarnda intron bulunmamaktadr. Kloramfenikol bakteri ve mitokondri protein sentezini durdururken okaryotik ribozomlarda protein sentezini durdurmaz. Mitokondrial proteinlerin %95i kromozomal DNA tarafndan kodlanr. ATPaz, sitokrom b, sitokrom c oksidaz proteinlerinin baz altbirimleri mitokondri DNAs tarafndan baz altbirimleride kromozomal DNA tarafnda kodlanr.
RBOZOMLAR

Membran yoktur Protein sentezinin yapld yerlerdir Endoplazmik retikuluma tutunmu halde ya da sitoplazmada serbest olarak bulunabilirler
ENDOPLAZMK RETKULUM (ER)

En yaygn sitoplazmik organeldir ve bir membranlar a eklinde grlr. Granll ER Sitoplazmik yzeyinde ribozomlar bulunur; buralarda yaplan proteinleri dier organellere datmakla grevlidir. Dz ER Ya asidi ve steroid sentezi ile ilgili enzimler ierir, kas kaslmas iin de kalsiyum iyonu depolayabilir.
Ayn hcrede hem granll hem de dz ER bulunabilir. Hatta miktarlar hcrenin o anki aktivite durumuna gre deiebilir.
GOLG AYGITI APARATI - SSTEM

Yass membran keseleri ve vezikller yumadr. Genel olarak nkleusa yakn ve bir tek golgi vardr. ER'dan gm ieren boyalarla boyanmasyla ayrlr, ilk defa 1898 ylnda talyan bilim adam Camillo Golgi, gml boya ile sinir hcrelerinde st ste dizilmi plakalar tanmladndan, bu yapya, bilim adamnn ismine atfen "Golgi Aygt" dendi. Yeni sentezlenen proteinleri biriktirme, konsantre etme ve salg veziklleri haline getirme gibi ilevleri vardr. Bunun yaynda, golgi aygt lipit metabolizmasnda zellikle de glikolipid ve sfingomyelin sentezinde rol oynar. ERde sentezlenen seramid daha sonra golgide kullanlarak, glikolipidler ve sfingomyelin sentezlenir. Sfingomyelin fosfotidilkolinden seramide bir fosforilkolin grubunun aktarmyla sentezlenir.
levsel ve yapsal olarak bariz bir polaritesi bulunmaktadr. Bir utaki membran yap bileenleri ve kalnlk bakmndan dier utakinden farkldr. Bu nedenle bir u alc dier u gnderici rol oynar.
ERden gelen proteinler dbkey yapda ve genellikle nkleusa bakan tarafta yerleik, cis yznden (giri yz) giri yaparlar. Sonra golgi i yapsndan geerek ibkey trans yznden (k yz) karlar.
NKLEUS - EKRDEK
En byk organeldir. ki ayr membran ve bu membran da dzenli aralklarla porlar bulunur. Nkleer por kompleksi olarak adlandrlan bu yap kk polar molekllerin, iyonlarn ve makromolekllerin (protein ve RNA) nkleus ile sitoplazma arasnda tanmn gerekletirildii kanallardr. Nkleer por kompleksi 120 nm apnda olup molekler arl 125 milyon daltondur (ribozomun 30 kat byklndedir). Ve nkleoporin denile 50den fazla protein ierir. Proteinler ve RNA gibi byk molekller bu porlardan geebilmektedir. Bir memeli ekirdek zar 3000-4000 adet por kompleksi iermektedir. Kromatin olarak bilinen ve hcre blnmesi srasnda kromozomlar oluturan DNA iplikiklerini ierir; bu ekilde genetik bilgiyi depolar. Nkleusun i zarnn altnda nkleer lamina bulunmaktadr. Nkleer lamina ekirdee yapsal destek salayan as bir rgdr ve laminler ad verilen proteinlerden olumaktadr. Btn laminler 60-80 kDa arlnda olup ipliksi proteinlerdir.
Nkleer por kompleksin ekirdek zarnda dzenlenii
NKLEOLUS - EKRDEKK
Nkleus ierisinde membranla evrili olmayan bir yapdr. RNAy oluturan genleri ieren spesifik DNA moleklleri ile ilikilidir. ribozomlarn alt birimlerinin sentezi burada gerekleir.
LZOZOM
Hcrenin (hidrolitik) sindirim merkezidir. Hcre iine alnan l hcre artklar, bakteriler, ya da hcrenin kendi eskiyen elemanlarn sindirir. Tek bir membran ile evrilidir. Tipik bir hcre bir ka yz lizozom ierebilir. Fagositik aktivite gsteren hcrelerde boldur. 40dan fazla hidrolitik enzim ierirler. Genel olarak lizozomal enzimler asit pHda aktiftirler. Enzimleri gERde sentezlenir. Enzimler golgi kompleksinde deiiklie urar ve paketlenirler. Hi sindirim olayna karmam olanlara PRMER LZOZOM, sindirime katlm olanlara ise SEKONDER LZOZOM denir.
Lizozomlardaki hidrolitik enzimler
PEROKSZOM
Yapsal olarak lizozomlara benzer, fakat bileimi farkldr hidrojen peroksit ve serbest radikallerin ykm gibi ilevleri vardr Mitokondri gibi oksijen tketirler, fakat bu oksijen ATP retiminde deil, serbest radikallerin yok edilmesinde kullanlr. Kk zarla evrili organellerdir. Enzimleri serbest ribozomlarda sentezlenir. Genomlar olmamasna karlk blnerek oalrlar. Birok insan hcresinde 500 kadar peroksizom bulunur. 50 kadar enzim bulundururlar. zellikle ierdikleri KATALAZ enzimi ok nemlidir. Katalaz hcre metabolizmas sonucu oluan H2O2 yi H2O ve O2 ye evirerek zararsz hale getirir. Ayrca rik asit, amino asitler, purinler, metanol ve ya asitleri gibi eitli substratlar peroksizom ierisinde yklrlar.
SENTROZOM
1988de Theodore Boveri tarafndan tanmlanmtr. Mitoz srasnda mikrotbller, kromozomlarn ayrlmasnda ve yavru hcrelere dalmndan sorumlu mitotik ii oluturmak zere kopyalanm sentrozomlardan darya doru uzanr. Birok hayvan hcresi sentrozomu birbirine dik yerlemi bir ift sentriyol ierir. Sentriyoller dokuz adet erli mikrotblden oluan silindirik yaplardr. Bitki hcrelerinde sentriyol yoktur ama mikrotbller oluur. Hayvan hcrelerinde sentriyollerin uzaklatrlmas, sentrozom ieriinin dalmas ve mikrotbl dnmnde gecikmelere neden olur.
Protein Trafii Ve Tanmas Bilindii zere karyotik hcreler prokaryotik hcrelerden zarla evrili bir ekirdee ek olarak yine zarla evrili organellere sahip olmalar ile ayrlrlar. Bu organeller farkl hcresel grevlerin yapld hcre ii blmelerdir. Bu sebeple bu zel blmelerde grev yapan proteinlerin doru tanmas olduka kritiktir. Protein trafii ve snflandrlmasnn ilk aamas protein sentezi srasnda gerekleir. ER, golgi, lizozom, plazma zar veya hcre dnda grev yapan proteinler ER zarna bal olan ribozomlarda gerekleir. ekirdek, mitokondri, kloroplast veya peroksizomlara gnderilen proteinlerin sentezi ise sitoplazmadaki serbest ribozomlarda yaplr.
Protein Trafii ve Snflandrlmas

Serbest ribozomlarda sentezlenen proteinler ya sitoplazmada kalr ya da mitokondri, kloroplast, peroksizom veya ekirdee ynlendirilir. ERa bal ribozomlarda sentezlenen proteinler ise sentez devam ederken nce ER lmenine girerler, daha sonra ya ERda kalr veya golgiye geer, baz proteinler golgide kalr geri kalanlar ise vezikller araclyla lizozomlar, plazma zar veya hcre dna tanrlar.
The Cell, A Molecular Approach. Geoffrey M Cooper.
Endoplazmik Retikuluma Hedeflenen Proteinler

Daha ncede bahsedildii gibi lizozom, plazma zar veya hcre dna tanan proteinler nce ERa hedeflenirler. Bu proteinler amino ularnda bulunan sinyal sekans araclyla ERa hedeflenirler. lk olarak David Sabatini ve Gunter Blobe 1971 ylnda ER bu tutunma sinyal sekansnn yeni sentezlenen proteinlerin amino ucundaki bir amino asit dizisi olduunu gstermilerdir.
ekil: Yukardaki byme hormonu sinyal sekansnda grld gibi yaklak 20 amino asit uzunluundadr ve ou sinyal sekans bazik amino asitleri (rn., arj ve liz) izleyen hidrofobik amino asitlerden olumaktadrlar.
The Cell, A Molecular Approach. Geoffrey M Cooper, 2000.
Proteinlerdeki sinyal sekans sentez esnasnda gzkr-gzkmez sinyal sekans tanyan partikl (SRP) tarafndan tannr ve balanr. SRP, 6 tane polipeptid ve bir de kk RNAdan (srpRNA) oluur. SRPnin sinyal sekansna balanmas protein sentezini durdurur ve ER zarndaki SRP reseptrne balanarak tm kompleksin (SRP, ribozom ve uzayan polipeptid zinciri) ERa hedeflenmesini salar. ERdaki reseptre balanma SRPnin ribozom ve sinyal sekansndan ayrlmasn neden olur. Ribozom daha sonra ER membranndaki translokasyon kompeksine balanr ve sinyal sekans membran iindeki kanaldan geirilir. Mayalarda ve memelilerdeki translokasyon kanal Sec61 proteinleri denilen proteinden olumaktadr. Ribozomun SRPden Sec61 kompleksine aktarlmas sentezin tekrar balamasn salar.
Sinyal sekans tanyan partikl (SRP)nin yaps. SRPnin bir ucu sinyal sekansa dier ucu da ribozoma balanarak translasyonu durdurur. SRPdeki RNA ribozomlardaki rRNAlar ile olan etkileimi salamaktadr. SRPnin sinyal sekans tanyan blgesi ise byk bir ksmn metionin olan hidrofobik amino asitlerden olumaktadr.
Proteinlerin SRP Ve Sinyal Sekans Aracl le ERa Hedeflenmesi

Protein, ER membranndan geerken sinyal sekans sinyal peptidaz enzimi tarafndan kesilir ve polipeptid ER lmenine braklr.
Tek-geili Membran Proteinlerin Zara Yerlemeleri

Yukarda anlatld gibi mitokondri, kloroplast ve peroksizomlara gnderilen proteinlerin translokasyonu posttranslasyonel yani sentez tamamlandktan sonra gerekleir; fakat ER membranndan translokasyon (aktarm) translasyon esnasnda (ko-translasyonel) gerekleir. Bu ribozomlarn dier organellere deil de neden ERa balandklarn aklar. Membrana yerleen proteinlerin translokasyon ilemi znr proteinlerin tanmasna gre daha komplekstir. Membrana yerleen proteinlerin translokasyon ilemi znr proteinlerin translokasyonunda olduu gibi N-terminal sinyal sekans araclyla balar; fakat polipeptid zincirindeki ek bir hidrofobik segment tm polipeptid zinciri transloke edilmeden nce transfer ilemini durdurmaktadr. Bu dur-transfer sinyali proteini membrana demirlemektedir. Bu proteinlerin zar geen blmleri genellikle hidrofobik olup 20-25 amino asitten oluan -sarmal yapsndadr.
Proteinlerin Mitokondriye Tanmas

ERa veya hcre dna hedeflenen proteinlerin aksine mitokondriye tanan proteinler ribozomlardan ayrldktan ilk birka saniye veya dakika ierisinde matrikse alnrlar. Birok mitokondri proteini, ERa hedeflenen proteinler gibi 20-35 amino asitlik ncdiziler (sinyal sekanslar) araclyla hedeflenir ve matrikse alndktan sonra kesilip atlrlar. Bu nc-diziler tanma iin zorunlu ve yeterlidirler. Genetik Mhendislii teknikleri ile herhangi bir sitozolik proteine eklendiinde mitokondri matriksine bu proteinleri ynlendirebilir. Farkl matriks sinyal sekanslar incelendiinde bu proteinlerin ortak bir zelliinin amfipatik -sarmal yapda olduklarn gstermitir. Yani, sarmaln bir tarafnda pozitif ykl amino asitler bulunurken kar tarafnda hidrofobik amino asitler kmelenmitir. Mitokondri sinyal sekans. Art ykl amino asitler (krmz) heliksin bir tarafnda bulunurken hidrofobik (sar) amino asitler kar tarafta bulunmaktadr. Bu amfipatik -sarmal yap mitokondri yzeyinde spesifik reseptr proteinler tarafndan tannmaktadr.
Mitokondri Membranndaki Tayc Kompleks

Mitokondri membrannda protein translokasyonuna ok alt-birimli protein kompleksleri araclk etmektedirler. Bunlar TOM ve TM kompleksleridir. Tom, (translocase of outer membrane) mitokondri d membrannda (outer membrane); TM (translocase of inner membrane) ise mitokondri i membrannda (inner membrane) aktarmdan grevlidir ve TM22 ve TM23 olarak adlandrlan iki kompleksi vardr. TOM kompleksi, tm ekirdek tarafnda kodlanan mitokondri proteinlerin tanmasnda sorumludur. Balangta sinyal sekans ieren proteinleri iki membran arasndaki bolua (intermembran) aktarmaktadr ve transmembran proteinlerin ise d membrana yerlemelerine yardmc olmaktadr. TM23 kompleksi daha sonra bu proteinlerin bazlarn mitokondri matriksine tar ve transmembran proteinlerin bazlarn da i zara yerlemelerine yardm eder. Mitokondri membranndaki nc bir kompleks olan OXA ise mitokondri matriksinde sentezlenen proteinlerin i zara yerlemelerine araclk eder.
TOM, TM ve OXA ok alt-birimli (multimerik) protein kompleksleridir. TM23 kompleksi biraz farkl olup her iki membran da kat etmektedir.
Proteinlerin Nkleusa Tanmas

Daha nce bahsedildii gibi nkleusta grev yapan proteinler sitoplazmada bulunan serbest ribosozomlarda sentezlenmektedir ve sentez bittikten sonra nkleusa tanmaktadrlar. Bu proteinler arasnda histonlar, DNA polimerazlar, RNA polimerazlar, transkripsiyon faktrler, ve dier birok protein bulunmaktadr. ekirdek proteinleri ekirdekten alnp sitoplazmaya tekrar konulduklarn hzl bir ekilde tekrar ekirdekte biriktikleri grlmtr. Bu proteinler ekirdee nkleer yerleim sinyalleri araclyla hedeflenmektedirler. Bu sinyaller yalnzca ekirdek proteinlerinde bulunmaktadrlar. lk nkleer yerleim sinyali Alan Smith tarafndan 1984 ylnda tanmlanmtr. Nkleer lokalizasyon sinyelleri sitozolik proteinlere eklendiinde bu proteinleri ekirdee ynlendirir. SV40 T-antijeninde olduu gibi bazik amino asitlerce zengin (lizin ve arjinin) ksa dizilerdir.
Molecular Biology of the Cell, 2002, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. Hcre Molekler Yaklam, G. M. Cooper ve R. E. Hausman: eviri Ed. Meral Sakzl ve Nee Atabey, 2006
Proteinlerin Nkleusa Tanmas (devam)
Lizin amino asitlerince zengin olan SV40 virs normal T-antijeni, ekirdekteki grev yap yere tand T-antijeninin tanyan antikor ile yaplan immnofloresan deneyinde grlmektedir Fakat, lizin amino asitlerinden biri treonin ile deitirildiinde mutant T-antijeni sitoplazmada kalmaktadr.
Molecular Biology of the Cell, 2002, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walterc
Proteinlerin Nkleusa Tanmas (devam)

Proteinlerin nkleer por kompleksinden tanmasnda iki nemli protein grev almaktadr: biri nkleer tanm reseptr dier de Ran proteinidir. Nkleer tanm reseptrne karyoferin de denir. ki tip nkleer tanm reseptr vardr: importinler proteinleri sitoplazmadan ekirdee, eksportinler de ekirdekten sitoplazmaya doru tar. Tamann birinci aamasnda sitoplazmadaki ekirdek proteinin NLSna importin/Ran/GDP kompleksi balanr. kinci aamada protein/importin/Ran/GDP kompleksi nkleer por kompleksinin sitoplazma tarafndaki filamentlerine balanr. nc aamada bu kompleks nkleer por kompleksi boyunca ilerler. Drdnc aamada ekirdekteki guanin nkleotid deiim faktr (RanGEF) Ran zerindeki GDPyi GTP ile deitirir ve tanan protein ekirdekte serbest kalr. Beinci ve son aamada importin/Ran/GTP kompleksi ekirdekteki porlardan sitoplazmaya tekrar kar ve Ran zerideki GTP RanGAP (GTPaz aktive edici protein) ile GDPye hidroliz edilir ve importin/Ran/GDP kompleksi yeni bir protein tamak hazr hale gelir.
KROMATN YAPISI VE KROMOZOMLAR
DNA ve proteinlerden oluan komplekslere kromatin denir. Kromatin, DNAnn yaklak iki kat kadar protein ierir. Blnme esnasnda kromatin younlaarak kompakt bir hal alarak kromozomlar oluturur. Kromatin yapsndaki temel protein histondur. Be temel tip histon vardr. Bunlar H1, H2A, H2B, H3 ve H4dr. Histonlar negatif ykl DNA moleklne balanmay kolaylatran bazik amino asitler (lizin ve arjinin) asndan zengin kk proteinlerdir. Histonlar, 11 ile 21 kDa arasnda molekuler agrlklara sahiptirler ve bazik amino asitler (arjinin ve lizin) tum amino asitlerin 1/4n olutururlar. Yukarda da belirtildii gibi molekler arlk ve amino asit kompozisyonuna gre 5 gruba ayrlrlar:
Histone
H1 H2A H2B H3 H4
MA (kDa)
21 13.9 13.7 15 11
A. Asit #
223 129 125 135 102
Liz (%)
29.5 10.9 16 9.6 10.8
Arj (%)
1.3 9.3 6.4 13.3 13.7
Kromatinin temel yapsal birimi nkleozomdur. lk defa Roger Kornberg tarafndan 1974 ylnda kefedilmitir. Nkleozom kefine yol aan deneyler unlardr: 1. Kromatinin miktrotoksik nkleaz (DNAy paralayan enzim) ile ksmi ykm yaklak 200 baz iftlik (b) uzunluunda DNA paralarnn ortaya kmasna neden olmutur. Fakat plak DNAnn (protein bal olmayan DNA) ayn ekilde ykm rastgele byklkte DNA paralarnn olumasna yol amtr. Bu sonular, kromatin zerindeki proteinlerin DNAy nkleazlara kar koruduu ve proteinlerin bal olduu durumlarda yalnzca 200 blik blgelerde DNAnn nkleazlara hassas olduunu gstermektedirler. 2. Elektron mikroskopisi analizleri kromatinin boncuk eklinde bir grnm olduu ve bu boncuk eklindeki yaplarn yaklak 200 blik aralklarda yerletiini gstermitir.
Kromatinin Yapsal Organizasyonu

Nkleozom, 8 adet histon proteininden oluan bir ekirdek proteinden meydana gelmektedir. Nkleozomun ekirdek yaps kpr ilevi gren DNAnn bir nkleaz ile ksmi sindiriminden sonra serbest kalmaktadr. Nkleaz, nkleozom etrafna sarlm olan DNAya saldramamaktadr. Nkleozom, protein ve DNA bileenlerine ayrldktan sonra nkleozom ekirdek yap etrafndaki DNAnn uzunluu belirlenebilir. Bu DNAnn uzunluu ise 146 bdir.
Nkleozomun elektron mikroskopisindeki grnts

Agaroz jel elektroforezinde kromatinin nkleaz enzimi ile ksmi ykm sonucu elde edilen DNA fragmanlarnn grnts. Nkleozom ekirdek yaplar arasndaki bala DNA zellikle nkleaz sindirimine hassastr ve 200 blik fragmanlar oluur
Histonlar, DNAya rasgele balanmamaktadr. Daha ok belli noktalarda DNAya balanmaktadrlar. Baz durumlarda DNAda A=T baz iftinin zengin lokal blgelere histonlarn baland grlmektedir.
http://alchemy.chem.uwm.edu/classes/chem501/Handout/501Handout24.pdf
Kromatin Organizasyonu
Kromatin organizasyonunda ilk aama nkleozom oluumudur. Her bir nukleozom sekiz histon proteini (oktamer) kopyasna sahiptir: 2 tane H2A, 2 H2B, 2 H3 ve 2 H4 proteini vardr. ve bir adette H1 histon proteininden oluan 200 baz ifti uzunluunda DNAnn paketlendii bir yapdr. DNAnn ekirdekte paketlenmesinin birinci aamasn gstermektedir.
Principles of Biochemistry, Lehninger, Nelson, Cox, 1993
Nkleozomlar 200 bde bir tekrarlanr, 146 b, nkleozom etrafn skca sarar, geri kalan ise nkleozomlar arasnda kpr vazifesi gorr. Histon H1 nkleozom ekirdeinde (kor blgesi) bulunmaz ounlukla linker (kprye) balanr. Nkleozomlar H1 proteinleri yardmyla,11nmlik ipliksi yaplar oluturur. Bu srada DNA serbest haline gre yaklak 5-10 kat younlamtr. Kromatinin doal ilevsel yaps bu 11nmlik iplikiklerin yeniden katlanmalar yapmas ve her dnmde yaklak 6 nkleozom yer alacak ekilde oluan 30nm apndaki yapdr. Bu yap H1 histonlarn kendi aralarndaki etkileimi ile sabit durumda kalr. Bu aamada DNA yaps en az 6 kat daha younlamtr.
Kromatin Organizasyonu (devam)

DNAnn nkleozomlara paketlenmesi yaklak 11 nm apl kromatin liflerinin olumasn salar. Bu kromatin daha ileri dzeyde katlanarak alt nkleozom kapsayan ve 30 nmlik bir ap olan sarmal bir lif meydana getirir. Youn olmayan ve ekirdek iinde dalm olan kromatine kromatin denir. Genlerin ou kromatinde bulunur ve transkripsiyonun daha aktif olduu yerdir. Heterokromatin ise kromatinin %10nu oluturan transkripsiyonel olarak inaktif olan kromatindir. Heterokromatin olduka younlamtr. Prokaryotik hcreler genellikle tek kromozomludur ve kromozomlar emberseldir. Aksine, karyotlarn genomlar her biri dorusal bir DNA molekl ieren ok sayda kromozom ierir.
Baz canllardaki DNA bykl ve kromozom saylar
nsan Kromozomlar nsan genomunun tam nkleotid dizi yaklak 3 x 109 baz iftinden olumaktadr. Bu insan genomu 45 ila 280 Mb DNA kapsayan 24 kromozoma dalmtr (22 otozom ve 2 cinsiyet kromozomlar).
GENETK MATERYAL
Canllarda biyolojik bilgiyi depolayan ve nesilden nesile tayan molekller genetik materyal veya genetik madde olarak tanmlanr. Genetik materyali Nkleik asitler oluturur. ki tip nkleik asit vardr: deoksiribonkleik asit (DNA) ve ribonkleik asit (RNA). Hemen hemen tm canllarda DNA genetik materyaldir, fakat baz virslerde RNA genetik materyaldir. rnein HIV ve TMV.
DNAnn Genetik Materyal Olduunu Dsndren lk Deneyler

1. Meisherin Deneyleri 1869 ylnda ilk defa lkositlerden nukleus izole ederek nuclein adn verdigi bir madde tespit etti. Bu maddenin yksek bir molekl arlna sahip olduunu, fosfat ierdiini ve protamin denilen bazik bir protein ile birlikte bulunduunu belirledi. Protaminin daha sonralar, lizin ve arginin gibi bazik amino asitlerce zengin bir protein olduu ve DNAnn nukleusta paketlenmesinde grev yapt anlald. Protamin artk histon olarak bilinmektedir.
2. Griffith Deneyi
1928 ylnda Griffithin Streptoccus pneumoniae ile yapt deneyler DNAnn genetik materyal olduuna dair ilk bulgulardr. S. pneumoniae, pneumonia ya (zatre, akcier enfeksiyonu) neden olan bakteridir, R (rough, ptrl) S (smooth, dz) olmak zere iki tip suu vardr. Sonu: Istlarak ldrlm S tipi bakterilerde mevcut hastalk etkeni olan maddenin patojen olmayan R tipi bakterilere geerek, R tipi bakterileri S tipine dntrd sonucuna varld. Bu olaya transformasyon ad verildi. Ancak transformasyona neden olan maddenin ne olduu bu deney ile anlalmad.
An Introduction to Genetic Analysis, Griffiths, AJF., Miller, JH., et al., 1996
3. Avery Deneyleri
1944 ylnda Avery ve arkadalar Griffithin deneylerini daha ileri sevide aratrarak transformasyona neden olan maddeyi aratrdlar. nce stlarak ldrlm S tipi bakteriden DNA izole ettiler ve R tipi bakteriler ile kartrdlar ve farelere enjekte ettiler. Sonu olarak, farelerin yine ldn grdler. Bu deney transformasyona neden olan maddenin DNA olduunu kesin olarak gstermesine ramen baz aratrclar buna itiraz ettiler. Buna neden olarak ise DNAnn saf olmadn, proteinler ile birlikte bulunduunu ve genetik bilginin proteinler tarafndan tandn ileri srdler.
Avery bu itirazlar aadaki deney ile rtt
S-tipi bakteriden izole edilen DNA
+ + + +
+ + +
Tripsin-Kimotripsin
Ribonukleaz Deoksiribonukleaz Canl R tipi bakteri
+
+
Her tpten biraz karm fareye enjekte edilir. 1, 2 ve 3. tpten alnan rneklerin fareleri ldrd, 4 nolu tpn ise fareyi ldrmedii grld. Sonu: Genetik bilgi DNA tarafndan tanr.
4. Hershey ve Chase Deneyi

DNAnin genetik materyal olduunu ispatlayan ikinci deney 1952 ylnda yaplmtr. Bu alma E.coli faji kullanlarak yaplmtr. Faj proteinlerinde metionin ve sistin iermelerinden dolay S (kkrt) ihtiva eder. Fakat fosfor proteinlerde bulunmaz. DNA da ise fosfor bulunur, S bulunmaz. Virsler 35S izotopu veya 32P izotopu ile iaretlendikten sonra E.coliyi enfekte ettiler.
iaretlenmi faj DNAsi
32P ile
32P
Deneyi
35S
Deneyi
ile iaretlenmi faj protein klf

35S
Bakteri hcresi
Bakteri DNAs Santrifj yaplarak radioaktif fajlar uzaklatrlr
32P
ieren yeni virsler elde edildi
Virsler radioaktivite iermemektedirler
NKLEK ASTLER

Vcut arlnn %2si. Genetik bilgiyi tayan molekllerdir. Hcrenin nukleustan baka ksmlarnda da (mitokondri, kloroplast) bulunmaktadr. 2 eit nkleik asit vardr: 1. DNA (deoksiribonkleik asit) genetik bilgiyi depolar. 2. RNA (ribonkleik asit) spesifik bir polipeptid zinciri iin gerekli kodlamay salar. Arac rol oynar. DNAnn iki rol vardr: 1. Kendini replike ederek kaltsal bilgi gelecek nesillere aktarr. 2. RNA meydana getirerek protein sentezini kontrol eder. Alt birimleri nkleotidlerdir
Ribonkleik asit Genel olarak eit RNA vardr. 1. mRNA (messenger/elci RNA) DNAdaki genetik ifreyi ribozomlara tayarak protein sentezini kontrol eder. 2. rRNA (ribosomal RNA) Ribozomlarn %65ni oluturur. Yapsal rol ve ayrca enzimatik rolu vardr. 3. tRNA (transfer RNA) Protein sentezi (translasyon esnasnda amino asitleri ribozomlara tar. Nkleik Asitlerin Kimyasal Yaps Hem DNA hem de RNA nkleotidlerin polimerizasyonu ile oluan makromolekllerdir. Yani DNA ve RNAnn yapta (monomeri) nkleotidler.
Her nkleotid 3 moleklden meydana gelir: 1) bir fosfat grubu, 2) 5 karbonlu bir eker ve 3) Azotlu baz Azotlu bazlar iki gruba ayrlr. a) Pirimidin bazlar b) Purin bazlar
NH 2 N O N H
Sitozin
O HN O N H
Urasil
Pirimidin bazlar
2 azot atomu ieren, 6 kenarl halkasal bir molekldr. Nkleik asitlerin yapsnda bulunan nemli pirimidin baz: Timin, Sitozin ve Urasildir.
O HN O N H
Timin
N3
2
4 5 1 6
CH3
N
Pirimidin baz
Purin Bazlar Bir pirimidin (iki azot iceren altgen) ve bir imidazol (5 kenarli) halkasinin birlemesi ile oluur. Numaralama ilemi bu kez pirimidin halkasndaki ikinci azottan balar.
NH 2 N N
Adenin
N N H
O
N1
2
6 5 3 4
N
7 9 8
HN H2N N
Guanin
N N H
N
Purin Baz
Purin bazlari adenin ve guanin hem DNA hem de RNA yapisinda bulunurlar
Tautomerizasyon
Ortam pHsna gre keto veya enol formda bulunabilirler. Bu deiiklie tautomerizm denilir.
O HN O N H
N NH
OH
N H
Urasil keto formu
Urasil enol formu
Purin ve pirimidin bazlar 260 nmde UV n gl bir ekilde absorbe etmektedirler; bu zellik nkleik asitlerin kantitatif analizlerine olanak vermektedir. Dier zellikleri ise serbest olarak suda ok az znen zayf bazik molekller olmalardr. Az miktarda modifiye olmu bazlarda grlebilir; bunlar 5-metilsitozin, 6-metiladenin ve 2-metilguanin.
Nkleotidlerin Yaps Bir azotlu bazn 5 karbonlu bir eker (pentoz) ile birlemesiyle oluan yapya nkleozit (nukleosit) denir. Baz ile eker N-glikozidik ba ile balanrlar. Fosforik asitin de nkleozitlerin yapsna katlmasyla nkleotidler oluur.
Nkleozit = Baz + eker Nkleotid = Baz + eker + Fosfat
Glikozidik ba
5 4 CH2OH
NH 2 N N N
5 CH2OH
N O
1 2 OH
O
1 2
3 OH
OH
OH
Ribonukleozit
Adenozin
NH 2 N N N
5 CH2OH
N O
1 2 H
5 4
CH2OH
O
1 2 H
3 OH
3 OH
Deoksiribonukleozit
Deoksiadenozin
Adenin
NH2
Ester ba
N O O P O O P O O O N P O O 5 4 CH2 O
1 3 OH 2 OH
Adenozin monofosfat (AMP) Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP)
Nkleozit ve Nkleotidlerin Okunuu

RNA Baz Adenin Guanin Timin Nkleozit Adenozin Guanozin DNA
Urasil
Sitozin
Uridin
Sitidin
Nkleotid Nkleozit Nkleotid Adenilat Deoksiadenozin Deoksiadenilat Adenozin monofosfat (AMP) Deoksiadenoizin monofosfat (dAMP) Guanozin monofosfat (GMP) Deoksiguanozin Deoksiguanozin monofosfat (dGMP) Timidin Timidilat Timidin monofosfat (dTMP) Uridilat Uridin monofosfat (UMP) Sitidilat Deoksisitidin Deoksitidilat Sitidin monofosfat (CMP) Deoksitidin monofosfat (dCMP)
Nkleotidlerin yapsndaki fosfat pH: 7 de Hlerini brakti iin (-) ykl hale geer. Bu nedenle nkleotidler kuvvetli asidik zellik gsterirler.
Nkleotidlerin Grevleri DNA ve RNAnn yapsn olutururlar. Yksek enerjili bileikler olutururlar. rnein, ATP. Koenzimleri olutururlar. Koenzim A (CoA)- asetil grub taycs, NAD ve FAD elektron ve hidrojen tayclar. Kimyasal haberci olarak ilev grrler. cAMP. Baz molekllerin sentezinde (rnein, glikojen).Uridin difosfat glikoz ile birleerek UDP-glikoz meydana getirir ve glikoz daha sonra glikojen sentezinde kullanlr.
1. 2. 3. 4. 5.
cAMP (siklik AMP) etkisini cAMP-baml protein kinaz (A-kinaz) enzimine balanarak gstermektedir. A-kinaz enzimi 4 alt birimden olumaktadr (2 regulator, 2 katalitik alt birim). cAMP regulator alt birimlere balanarak yapsal deiikliine sebep olur ve bu iki alt birimin kompleksten uzaklamasn salar. Serbest kalan katalitik birimler aktive olarak dier baz proteinleri fosforile ederek bu proteinlerin de aktive olmasn salar. Bu proteinlerden bir tanesi glikojen metabolizmasnda rol alan glikojen fosforilaz enzimidir.
skelet kasnda cAMP tarafndan uyarlan glikojen ykm
DNA ve RNAnn Molekler Yaps, Benzerlikler Ve Farkllklar

Hem DNA hem de RNA nkleotid yaptalarndan (monomer) oluur. DNA ekeri deoksiribozdur Adenin, guanin, sitozin ve timin bazlar bulundurur Baz tek iplikli virsler hari btn canllarda DNA ift iplikli heliks yapdadr Zincirler purin ve pirimidin bazlar arasndaki hidrojen balar ile tutunur Bazlar arasndaki eleme adenin-timin, guanin-sitozin eklinde olur DNA hemen hemen btn canllarda kaltsal bilgi tasycsdr. RNA ekeri ribozdur Tek zincirden oluur Timin yerine urasil ierir RNA genelde tek iplikli fakat baz RNA virslerinde ve tRNAda ksmi olarak baz blgelerde ift iplikli blgeler vardr. Baz virslerde kaltsal bilgi taycs olmasna ramen genelde DNAdaki bilginin proteinlere evrilmesinde arac rol oynar.
Yapsnda riboz ekeri bulunduran nkleotidlere ribonkleotid, deoksiriboz bulunduranlara ise deoksiribonkleotid denilir.

DNA deoksiribonkleotidlerin, RNA ise ribonkleotidlerin polimerizasyonu ile oluan polinkleotidlerdir. Bu polimerizasyon, nkleotidlerin 3 karbon atomuna bal olan OH grubu ile bir sonraki nkleotidin 5 karbon atomuna bal olan fosfat grubu arasnda bir fosfodiester ba kurulmas ile gereklesir. Nkleotidler arasnda fosfodiester ba tekrarlanmasyla lineer polinkleotidler meydana gelir. Zincirin 5 serbest ucunda fosfat 3 serbest ucunda ise hidroksil (OH) grubu bulunur. Hem DNA hem de RNAda eker fosfat zincirin omurgasn (iskeletini) oluturur.
Fosfodiester ba nkleik asitlerdeki nkleotidleri birbirine balar

NH2
NH2
N
N O N O P O O 5 4 2 H CH2 O 1 3 OH N
O O P O
O P O O
O
O N
P O
5 4
CH2 O 1 3 OH H 2
NH2
Kural olarak nkleik asit sekans her zaman 5 3 ne doru yazlr. Nkleik asitler farkl ekillerde gosterilebilir:
N N
N O N O P O O 5 4 CH2 O 1 3 2 H
NH2
Fosfodiester ba
O
O P O
O
O
N
5 4
CH2 O 1 3 OH H 2
pA-C-G-T-COH, pApCpGpTpC, veya pACGTC. En yaygn olan ise ACGTC. Burada Adenin 5 de sitozin ise 3 bulunmaktadr. Ksa nkleotid zincirlerine oligonkleotid, 50 ve daha fazla nkleotid iceren zincirlere polinkleotid denir. Fosfodiester ban hidroliz eden enzimlere nkleaz. Deoksiribonkleazlar DNAy, ribonkleazlar ise RNAy hidroliz eder. 3de OH grubu bulunmayan bir nkleotid DNA veya RNA sentezinin durmasna neden olur. rnein, AZT trifosfat AIDS tedavisinde kullanlan bir nkleotid ve 3OH hidroksil grubu bulunmad iin zincire eklendikten sonra bir sonraki nkleotidin eklenmesini durdurur.
DNA veya RNA nkleotid birimleri arasnda fosfodiester ba kurulmas ile sentezlenir
Watson-Crick DNA Modeli
1.
2. 3. 4.
1953 ylnda James Watson ve Francis Crick DNAnin boyutlu yapsn kefettiler, ve 1962 ylnda bu baarlarndan dolay Nobel dl verildi. Bu keiflerine Erwin Chargraffin 1942 ylnda yapm olduu calmalar nemli katkda bulunmutur. Chargraff bir ok tr uzerinde yapt calmalardan u sonular ckarmt: Trler arasnda baz kompozisyonu deismekte, ve birbirine benzemeyen trler olduka farkllk gsterirken, yakn akrabalar arasnda daha az farkllk gzlenir. Ayn trn farkl dokularndan izole edilen DNA ayn baz kompozisyonuna sahiptir. Bir trn baz kompozisyonu, yalanma, beslenme veya evresel etkenler ile deimez. Btn DNAlarda, tr fark gzetmeksizin, Adenin says Timine, Guanin says ise sitozine eittir. Dolaysyla, purin says pirimidinlerin saysna esittir (A+G=C+T). Bu ilikiler, Chargraff Kural olarak bilinir ve DNAnn boyutlu (3D) yapsnn aydnlatlmasnda anahtar rol oynamlardr.
Watson-Crick DNA Modelinin zellikleri

double heliks (ift sarmal) yapdadr. Yani, komplementer olan iki polinukleotid zincirinin ortak bir eksen etrafnda saa doru dnerek oluturduu heliks bir yapdr. 2. ki polinukleotid birbirine anti-pareleldir. Her bir zincir birbirine zt yonde ilerler. Bir zincirin 5 ucu ile kars komplementer zincirin 3 ucu ayn yerdedir. 3. eker ve fosfat grublar heliksin d tarafnda, bazlar ise i ksmda bulunurlar. Nedeni ise eker ve fosfatn hidrofilik, bazlarn ise ksmen hidrofobik olmalardr. 4. Heliksin ap 20 , ayn zincirdeki komsu bazlar arasndaki mesafe 3,4 (angstrom) dur. Sarmaln tam bir dnnda 10 baz ifti vardr ve mesafe ise 34 dur. 5. ift sarmal hidrojen balar, Vander Waals ile birbirine tutunur. Adenin ile Timin arasnda iki hidrojen, Guanin ile Sitozin arasnda hidrojen ba vardr. A-T, ve G-C baz iftlerine komplementer baz veya Watson-Crick baz ift denilir. DNAdaki fosfat grublar pH 7 de iyonize olmasndan dolay negatif ykldr bundan dolay DNA bir asittir. Hcrede DNAnn negatif yk proteinler, metal iyonlar veya poliaminler ile ntralize edilmektedir.
1. DNA
DNA zincirleri komlementer ve antipareleldir
DNA Heliks Yaps ve Bazlar Arasndaki Hidrojen Balar
Fosfat ve eker grublar heliksin d ekseninde, bazlar ise i eksende yer alr.
P Atomu 3 O Atomu
DNA Formlar
B DNA formu Watson-Crick DNA yaps B DNA formu olarak bilinir. Double heliks saa doru dner. Fizyolojik artlarda ve hcrelerde gzlenen DNA formudur. Her tam dnte 10 b (bp) vardr. A DNA formu Double heliks saa doru dner. Her tam dnte 11 b vardr. B formuna gre daha ksa ve geni bir apa sahiptir. Su konsantrasyonun azald solsyonlarda gzlenir. Canl hcrelerde bulunduuna dair pheler vardr. Z DNA formu Sol el ynnde dn yapan heliks bir yapya sahiptir. Her bir sarmaln tam dnnde 12 b vardr. DNAnn omurgas zig-zag yapan bir grnme sahiptir. Tekrarlanan pirimidin ve purin (rnein, CGCGCG) ieren blgelerde grlr. Hem prokaryotlarda hem de karyotlarda Z DNA formu ieren ksa bolgeler bulundugu tespit edilmi fakat ilevleri hakknda bir bilgi bulunmamaktadr.
DNA SEKANS TAYN

DNAdaki bazi dizisi tespitinin onemi:
1. 2. 3. 4. 5.
Mutasyonlarn tespiti ve genetik hastalklarn molekler temelinin anlalmasnda Protein sentezinden sorumlu (exon) blgelerin belirlenmesinde Hastalk nedenlerinin nceden tahmin edilmesinde Genetik kontrol blgelerinin belirlenmesinde Adli tpta faili mehul olaylarn aydnlatlmasnda DNA sekans tayininde kullanlan iki metot: Maxam Gilbert metodu -1977 ylnda Harvard niversitesinde gelitirilmistir. DNA 32P ile iaretlendikten sonra DNAdaki bazlar spesifik olarak kimyasal maddeler ile modifiye edilir ve piperidin ile krlrr; elde edilen DNA fragmentleri poliakrilimid gel elektroforezde ayrtrlarak sekans belirlenir. G: Dimetil sulfat (DMS) G bazi metile ederek piperidine ile DNAnin krlmasn salar. A+G: DMS + asit ile muamele edililirse DNA hem G hem de A bazlarnn bulunduu yerlerde krlr. C+T: DNA hidrazin ile muamele edilirse piperidin ilave edildikten sonra C ve T bulunduu yerlerde krlr. C: 1.5 M NaCl solusyonunda hazrlanm olan hidrazin ile muamele edilirse sadece C olduu yerlerde krlr.
Sanger (dideoxy) Metodu

Sanger metodu gnmzde en ok kullanlan DNA sekans tayini metodudur. DNA polimeraz enzimi tarafndan komplementer bir DNA sekans sentezlenmektedir. DNA polimeraz, DNA sentezlemek iin serbest bir 3-OH grubuna ihtiya duyar ve 3OH grub ile aada grlen dGTP nkleotidinin alfa fosfat grubu arasnda fosfodiester ba kurarak DNA sentezini salar. Bir sonraki nkleotid ise bu eklenen guanozin nkleotidin 3OH grubuna eklenerek zincirin uzamas devam eder.
Primer 5 3
O O PO O O PO O O P O O CH2 H H O
N N N N
OH CTAAGCTCGACT
dGTP
O N
Normal DNA sentez mekanizmasi
HH
OH H 3'
Sanger metodunda dideoxy nkleotid trifosfatlar (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) kullanlmaktadr. ddNTPin 3ndeki oksijen atomu karld iin DNA zincirine eklendikten sonra bir sonraki nkleotidin eklenmesi iin ddNTPta bir OH grubu olmad iin zincire eklenemez ve DNA sentezi durur.
5 3 OH CTAAGCTCGACT
O O PO O O PO O O P O
N
ddGTP
O N N N
Sanger dideoxy metodunda DNA sentezini durdurmak icin kullanlan mekanizma
O CH2 H H H 3' O
N
HH H
Sanger Metodu
GATTCddG
Otomatikletirilmi Sanger Metodu

5 3
OH DNA polimeraz + 4 dNTP, bir ddNTP (ddCTP) ddNTPlar floresant boya ile boyanmlardr
ddC
Her biri farkl bir renk veren floresant boya ile boyanm ddNTPlar eklenir.
Manuel metot ile bir aratrmac ylda 50,000 baz belirlerken, otomatikletirilmi Sanger metodu ile 10,000 baz bir gnde belirlenebilir.
Poliakrilamid gel elekroforez ile boyanm segmentler ayrtrlr ve bilgisayar ile boyal segmentler srasna gre okunarak DNA sekans belirlenir
ACACGTTAGTGCT
Otomotikletirilmi Sanger Metodu ile elde edilen Chromotogram

Farkl renklerde grlen her peak bir baz gstermektedir.
Her peak zerindeki rakamlar bazn bulunduu pozisyonu gstermektedir
ddGTP = siyah ddATP = yeil ddTTP = krmz ddCTP = mavi
DNA ve RNA yapsnn karlatrlmas
Denatrasyon ve Renatrasyon
Komplementer baz iftleri arasnda hidrojen balar krldnda DNA zincirleri biribirinden ayrlr bu olaya denatrasyon denir. Denatrasyonda fosfodiester balar krlmaz. Fosfodiester balar s ve pH deiikliine dayankldr. DNA ift sarmaln %50sinin eridii (zld) s deerine erime scakl (melting temperature, Tm) denir. Ortam pHsna ve iyon konsantrasyonuna gre deiir. G-C oran ne kadar yksek olursa Tm deeri de o kadar yksek olur. Bunun nedeni ise G-C arasnda hidrojen ba olmasdr. A-T ieren DNA blgeleri genellikle daha kolay erirler (zlrler). Denatrasyon farkl scaklklarda 260 nanometrede UV absorbe etme zelliinden yararlanlarak izlenir. Her bir trn DNAs kendisine zg karakteristik bir Tm deeri vardr. Birbirinde ayrlm DNA iplikleri Tm deeri altnda braklrlarsa ift sarmal DNA yeniden meydana gelir bu olaya Renaturasyon (Annealing) denir.
Tm: 4(G+C) + 2(A+T) Tm Hesaplan 5-ATGTGTGCCGCTATGCATGCGAGA-3 oligonukleotidin Tmsi u ekilde hesaplanr: Tm: 4(13) + 2(11) = 74oC
Baz Trlerdeki DNA Miktar Baz ifti says 5x103 48x103 4.7x106 2x108 3x109
SV40 Lambda () E.coli Drosophila Insan
E.coli, ift sarmal, sirkler tek bir DNA moleklne sahip. Bu DNAsi 1.7 mm olup E.coli hcre uzunluunun 850 kat kadardr. Bu da DNAnn hcre iinde sk bir ekilde katlandn gsterir. Drosophila E.coliye gore 25 kat, tek bir insan hcresi ise 650 kat daha fazla DNA bulundurur. Tek bir insan hcresinin DNA uzunluu 2 m. nsanlarda 1014 (100 trilyon) hcre olduuna gre bir insandaki DNAnn tm uzunluu 2x1011 km olduu ortaya kar. Dnyann evresi 4x104 km. Dnya ile Gnes arasndaki mesafe 1.5x108 kmdir. Kk bir hesaplama yaparsak insan DNAsnn dnyann etrafn 5x106 defa saracak uzunlukta ve Gne ile Dnya arasnda 1333 defa gidip gelecek uzunlukta olduu anlalr.
Replikasyon
Genetik bilginin nesilden nesile tanmas iin ncelikle DNA miktarnn iki katna kmas ve daha sonra kopyalanan DNAnn yavru hcrelere eit olarak aktarlmas ile gereklesir. DNA replikasyonu ilk defa Watson ve Crick tarafndan semikonservatif (yar korumal) bir ekilde kopyaland nerilmi ve daha sonra Meselson ve Stahl tarafndan deneysel olarak ispatlanmtr. nce komplementer olan iki DNA zinciri birbirinden ayrlr, ve ayrlan her bir DNA kalp (template) olarak kullanlarak komplementer zincirler DNA polimeraz enzimi aracl ile sentezlenir. Sentezlenen bu ift iplikli DNA moleklnde biri eski (kalp) DNA dieri ise yeni sentezlenen komplementer DNAdr. Kalp DNAnn yars korunduu iin bu tur replikasyona semikonservatif replikasyon denir. Meselson ve Stahl tarafndan ispatlanmtr. Meselson ve Stahl E.coli bakterisini 15N ar izotopu ieren besiyerinde DNAsndaki nitrojen (azot) atomlarnn tmnn 15N ar izotopu ile iaretlenene kadar rettiler. Daha sonra bakteriler 14N hafif izotopu ieren besiyerine transfer edildiler. Bu besiyerinde bakteriler bir nesil veya iki nesil retildikten sonra DNA izole edildi ve CsCl de santrifuj edilir. Ve sadece 15N izotopunda retilen veya 1 veya 2 nesil retilen bakterilerden elde edilen DNA larn CsCl de oluturduklar bantlarn yerleri belirlendi. Sadece ar izotop (15N) bulunduran orijinal (kaltsal) DNA tpn alt ksmnda bir bant oluturur. 1. jenerasyon (nesil) retilen bakteri DNAsi tpn ortalarnda ve 2 jenerasyon retilen bakteri DNAs ise tpnde iki bant oluturduu; bunlardan birisini ortada dieri ise tpn st ksmnda olduu grlyor. Eer DNA replikasyonu tam korumal olsayd sadece iki bant elde edilirdi: biri ar dieri ise hafif izotop ieren bant. Fakat Meselson ve Stahl deney sonucu elde edilen farkl bant DNAnn semikonservatif olduunu gstermitir. 1 nesil sonra iki hibrid DNA elde ediliyor: Bunlardan biri atasal DNA (ar DNA) dieri ise yavru (yeni) DNA zincir (hafif zincir).
1958 Meselson ve Stahl: DNA Replikasyonu Semikonservatif Biyolojideki en guzel deneylerden bir tanesi!
DNA izole edilir ve CsCl (sezyum klorur) de santrifuj edilir.
DNA replikasyonu orijinde balar ve ift ynl (bidirectional) ilerler

DNA replikasyonunun balad ve spesifik nkleotidlerin bulunduu blgelere replikasyon orijini denir. Bu blgeler, zlmeleri kolay olan A=T baz ifleri bakmndan zengindir.
Replikasyon her iki ynde ilerledii iin oluan Y eklindeki yapya replikasyon catal denir. Bakterilerde bir replikaston orijin, iki replikasyon atal vardr. karyotlarda ise ok sayda replikasyon orijini ve replikasyon atal vardr.
Replikasyon yar kesintili (Semidiscontinous) olarak her zaman 5 3 ynnde ilerler Yeni bir DNA zinciri her zaman 5 3 ynnde sentezlenir. DNAnn antiparelel olmasndan dolay kalp DNA 3 5 ynnde okunur ve karsna komplementer zincir 5 3 ynnde sentezlenir.
5 3 3 3 5
5 3
3 -5 kalp DNAda sentez RNA primeri ile balar ve bu zincir kesintisiz devam eder. Bu DNA ipliine kesintisiz (lider) zincir denir 5-3 kalp DNAda ise yeni DNA kesintili, dubleks kalp DNA zldke replikasyon atalna ters ynde ilerler. Bu DNA ipliine kesintili (geride kalan-lagging) zincir denir. Her bir yeni sentezlenen kesintili zincirdeki DNA fragmentine Okazaki fragmenti denir.
Replikasyon Proteinleri ve Enzimleri

Helikaz enzimi tarafndan znen DNA zincirleri SSB (single stranded binding protein tek zincirli DNAya baglanan protein) ile tekrar stne katlanmas nlenir. Dubleks DNA birbirinde ayrldktan sonra RNA primaz enzimi tarafndan RNA primeri sentezlenir. Primer kalp DNAya komplemter olan ve nkleotidlerin DNA polimeraz tarafnda eklenmesi icin serbest 3OH ihtiva eden RNA segmentidir. DNA polimeraz daima var olan bir zincire nkleotid ekleyebilir. Dolaysyla primer olmadan DNA sentezi balamaz.
DNA polimeraz
Ilk DNA polimeraz 1957 ylnda, Arthur Kornberg tarafndan kefedildi. DNA polimeraz I tek bir polipeptid zincirinde olumakta farkl enzimatik aktiviteye sahiptir: a. 5 3 DNA polimerizasyon aktivitesi b. 3 5 ekzonukleaz aktivite c. 5 3 ekzonukleaz aktivite. DNA polimeraz her 105 nkleotidte bir nkleotid yanl eklemektedir. Eer yanl bir nkleotid eklendiyse 3 5 ve 5 3 ekzonukleaz aktiviteleri sayesinde yalns elemi nkleotid karlr ve polimerizasyon tekrar devam eder. Bu aktivite hata okuma (proof reading) olarak bilinir. Bu ekzonukleaz yardm ile 109 ile 1010 nukleotidde bir hata yaplmaktadr. 5 3 ekzonuleaz aktivitesi karlms DNA polimeraza Klenow fragmenti denilir.
E.colide farkl DNA polimeraz vardr

DNA polimeraz I II III Altbirimleri 1 4 10 3 5 aktivite var var var 5 3 aktivite var yok yok Polimerizasyon hz (nt/s) 20 7 1000 DNA polimeraz I RNA primerlerini karr ve oluan boluu doldurur. Daha ok DNA tamirinde grevlidir. DNA polimeraz II DNA tamirinde daha ok gorev almaktadr. DNA polimeraz III esas DNA sentezini katalizleyen enzimdir.
DNA Polimeraz III altbirimleri: Multimerik protein olup en az 10 altbirimden olumaktadr. Polimerizasyon () ve hata okuma () aktiviteleri farkl altbirimlerdedir.
DNA ligaz
RNA primerleri karldktan sonra ilk olarak iki fragment birbirine DNA ligaz enzimi tarafnda birbirine balanr. Ligaz 2 nkleotid arasnda fosfodiester ba kurarak boluu kapatr. T4 DNA ligaz enzimi rekombinant DNA teknolojisinde gen klonlanmasnda kullanlan en nemli enzimlerden bir tanesidir. DNA Ligaz enzimi mekanizmas
Principles of Biochemistry, Lehninger, Nelson, Cox, 2. Bask, 1993
DNA Topoizomerazlar
DNA zincirleri biribirinden helikaz enzimleri ile ayrlrken replikasyon atal nnde dmler meydana gelir. Bu dmler topoizomeraz enzimleri tarafndan DNAnn hzla dndrlmesi ile zlr. nce DNAy bir endonkleaz enzimi gibi krarlar daha sonra DNAy dndrerek eski haline getirirler ve tekrar bir ligaz enzimi gibi birletirirler. 2 eit vardr: topoizomeraz I ve topoizomeraz II. E.colide, topoizomeraz II ye DNA giraz (gyrase) denir.
Replikasyonda rol alan protein ve enzimler
Telomer
Dz, lineer olan DNA ularna telomer denir. ounlukla, bu blgelerde bir DNA zincirde TxGy formunda olan tekrarlanan oligonukleotid sekans ve kar komplementer zincirde ise tekrarlanan CyAx sekans ierirler, x ve y 1 ile 4 arasnda deimektedir.
DNA replikasyonun bir primer ile balama zorunluluunda dolay, telomer replikasyonu biyolojik bir problem olarak grlmektedir. DNA ularnda primerlerin karlmas ve normal DNA sekans ile deitirilmesi ozel bir mekanizma olmakszn imkanszdr. Bu problem telomeraz denilen enzimin kromozom ularna telomer eklemesi ile zlmektedir. Telomeraz hem RNA hem de proteinden oluan bir enzimdir. RNA yaklak 150 nt den olumaktadr ve tekrarlanan CyAx kopyalar bulundurmaktadr. Telomeraz enziminin bu RNA ksm kalp olarak kullanlarak DNA zincrinin TxGy zincirinin sentezlemesini salar. Yani telomeraz yapsndaki RNA kalbna komplementer olan bir DNA zincirini sentezlemektedir. Telomer sentezi 5 -> 3 ynnde ilerler. Telomeraz aktivitesinin kaybolmas hcre lmne neden olmaktadr. Hcre kltrndeki fibroblast hcrelerinin telomer uzunluu ile hcre ya arasnda doru bir orant vardr. Bu da telomer ksalmas ile yalanma arasnda bir iliki olup olmad sorusunu akla getirmektedir.
Telomer replikasyonu
Telomerazn yapsnda bulunan RNA, kalp olarak kullanlarak atasal DNAnn 3 ucu uzatlr. Telomeraz bu sebeple bir reverse (ters) transkriptaz enzimine benzemektedir.
DNA Tamiri
DNAdaki hasarlar RNA ve proteinlerde deiimlere yol amaktadr. Bu hasarlar, ayrca transkripsiyon veya replikasyonu da durdurabilir ve mutasyonlarla sonulanabilir. Mutasyonlar, DNA replikasyonu esnasnda kendiliinde (spontan) olabilecei gibi eitli kimyasallar veya radyasyona maruz kalma sonucu da ortaya kmaktadr. Spontan DNA hasar sonucu adenin, guanin, veya sitozin deaminasyona urayabilirler. Ayrca, prin baz ile deoksiriboz ekeri arasndaki ban krlmas DNAda prinsiz (AP) blge brakan deprinasyon sonucu mutasyon oluabilir. Daha nce de belirtildii gibi replikasyon srasnda DNAda 109 veya 1010 nkleotitde bir hata meydana gelmektedir. Hasar onarlamaz ise, bir sonraki DNA sentezi srasnda hatal elemeler, kalc deiikliklere (mutasyonlara) neden olabilmektedir. Radyasyon veya kimyasallarla uyarlan DNA hasar UV (rn., timinlerin siklobtan halkasyla birletii) pirimidin dimeri oluumunu indkler. Alkillenme DNA bazlarna metil veya etil gruplarnn eklenmesidir ve kimyasal ajanlar ile uyarlr. Guanin O6 pozisyonda alkillenmesiyle O6-metilguanin oluur. Birok karsinojen ise (rn., benzo-()piren DNA bazlar ile reaksiyona girerek DNAya byk kimyasal gruplar ekler.
DNAdaki spontan hasarlar
Radyasyon ve kimyasallarla uyarlan DNA hasarlarna rnekler
DNA Tamir Mekanizmalar

1. Direkt Tamir Mekanizmalar Fotoreaktivasyon O6-metilguanin tamiri 2. Kesip-karma Tamirleri (eksizyon) Baz eksizyon tamiri (BER) Nkleotid eksizyon tamiri (NER) Mismatch (yanl eleme) eksizyon tamiri (MER) 3. Hata-eimli DNA tamiri 4. Rekombinasyonal tamir
Direkt Tamir Mekanizmalar DNAy fazla deitirmeden hatann dorudan giderilmesi sz konusudur. DNA hasar, enzimler tarafndan dorudan onarlmaktadr. Fotoreaktivasyon UV radyasyonuna zg olarak DNA da, ayn sarmalda yan yana, ya da sarmallarda karlkl olarak kovalent balanmayla pirimidin dimerleri (en ok timin-timin, daha az oranda sitozinsitozin ve sitozin-timin dimerleri) oluur. Bakterilerde onarm sistemlerinden birini oluturan fotoliyaz enzimi, DNAdaki bu dimerleri karanlkta tanr ve balanr, ancak kta aktive olarak bu kovalent oluumu koparr (fotoreaktivasyonal enzim onarm).
Timin dimerlerinin fotoreaktivasyon ile direkt tamiri

UV-uyarlan timin dimerleri fotoreaktivaston ile tamir edilebilir. Siklobtan halkas grnr ktan elde edilen enerji yardmyla fotoliyaz enzimi ile krlmaktadr. Bu mekanizma E. coli, maya, ve baz bitki ve hayvanlarda bulunurken insan dahil dier birok trde bulunmamaktadr.
O6-metilguaninlerin tamiri DNAdaki yanl metillenen bazlarn CH3 gruplarn, kendi yapsndaki sistein birimlerine geri dnmsz olarak balayarak hatay dzeltir. En fazla metillenen baz guanin bazdr. Ve O6-metilguanin metiltransferaz enzimi tarafndan yok edilmektedir. Bunu yaparken enzim de geri dnmsz olarak inaktive olur ve ilevsiz kalr.
Bylece bu onarmda enzimin zgnl kadar says da nem kazanmaktadr.
O6-metilguanin tamiri: O6-metilguanin metiltransferaz, metil grubunu O6-metil grubundan kartarak, enzimin aktif merkezinde yer alan bir sisteine aktarr.
Kesip-karma tamirleri (eksizyon) Direkt tamir mekanizmalar aksine kesip-karma tamir mekanizmalar hem prokaryot hem de karyotlar iin daha genel ve daha nemlidirler. Hasarl DNA, baz veya nkleotidler halinde karan tip kesip-karma tamir mekanizmas bulunmaktadr. Bu tamir sistemi 3 temel basamak ierir: Hasar tannr ve enzimatik olarak bir nkleaz tarafndan kesip karlr. - DNA polimeraz ile oluan boluklar doldurur. - DNA ligaz fosfodiester ba kurar ve boluk tamamen kapanr.
Baz eksizyon tamiri (BER)

Baz eksizyon tamiri, DNA bazlarnn doal hidrolizi veya kimyasal ajanlar nedeni ile oluan uygun olmayan bazlarn tamiri ile ilgilidir.
Spontan veya kimyasallarla olan deaminasyon veya iyonize radyasyon ve oksidatif hasar sonucu oluan baz deiikliklerine spesifiktir (urasil, hipoksantin, 3-metiladenin vb.). Urasil ieren DNAnn tamiri hasarl tek bazlarn tannarak DNA moleklnden uzaklatrld baz-karma tamirine en iyi rnektir. DNAda urasil iki ekilde ortaya kar: 1) urasil DNA sentezi srasnda nadiren timin yerine geebilir. 2) urasil DNAda sitozin deaminasyonu ile oluabilir.
DNAdaki urasil DNA omurgasndaki deoksiriboz ile baz (urasil) arasndaki N-glikozidik ba koparan DNA glikozilaz tarafndan karlr. DNA glikozilaz aktivitesi sonucu apirimidinik veya aprinik bir blge (AP blgesi olarak adlandrlr) oluur. Benzer AP blgeleri normal koullar altnda da oluur. rnein, bir insan hcresinde her gn 1000 kadar prin baznn kaybolmas sonucu AP blgeler olutuu tahmin edilmektedir. Bu blgeler nce AP endonkleaz tarafnda kesilir ve deoksiriboz ksm deoksiribozfosfodiesteraz ile uzaklatrldktan sonra boluk DNA polimeraz ile doldurulur ve DNA ligaz ile kapatlr.
Baz-karma tamiri
Sitozinin deaminasyonu ile urasil oluur ve guaninin karsna gelir. DNA glikozilaz ile urasil ve deoksiriboz arasndaki ba kesilir. DNAda bazsz bir deoksiriboz (AP blgesi) oluur. Bu nokta, DNA zincirini kesen AP endonkleaz tarafndan tannr. Kalan deoksiriboz deoksiriboz fosfodiesteraz ile uzaklatrlr. Oluan boluk DNA polimeraz tarafndan doldurulur ve DNA ligaz ile yeni bir fosfodiester ba kurulur.
Nkleotid eksizyon tamiri (NER) DNA'nn sarmal yapsnda geni bozulmalara neden olan DNA lezyonlar NER sistemi ile onarlr. BERde bazlar tek olarak kesip karlrken, NERde hasarl bazlar oligonkleotid paralar olarak kesip karlr. Hasarl bazlarn (rn., timin dimerleri) lezyon ieren oligonkleotid ile birlikte uzaklatrlmas nedeniyle bu yaygn DNA onarm nkleotid-karma tamiri olarak bilinir. E. Colide nkleotid karma tamiri gen rn (uvrA, B ve C) tarafnda katalizlenir. UvrA hasarl blgeyi tanr, ve UvrB ve UvrCyi bu blgeye doru eker, srasyla 3 ve 5 taraflarda 12 ile 13 bazlk bir oligonkleotid keser ve karr. UvrABC kompleksi oligonkleotid karma zelliinde dolay eksinkleaz olarak da bilinir.
Timin dimerlerinin nkleotid-eksizyon ile tamiri

Hasarl DNA tannr ve timin dimerlerinin Her iki yanndan 3 ve 5 nkleazlar tarafndan kesilir.
Helikaz ile blge alr, hasarl baz ieren oligonkleotid uzaklatrlr.
Oluan boluk DNA polimeraz ile doldurulur. Ligaz tarafndan DNA paralar arasnda fosfodiester ba kurulur.
Nkleotid-kesip karma tamiri, maya kemirgen ve insanlar da dahil birok trde mevcuttur. nsanda, DNA tamir genleri, genellikle DNA hasarn onarm asndan kusurlu kaltmsal hastalklar barndran bireylerde yaplan almalarla tanmlanmtr. Bu hastalklardan en ok allan, 250,000 kiiden birini etkileyen nadir bir genetik hastalk olan Xeroderma Pigmentosum (XP)'dur. Bu hastal tayan bireyler, UV na ar duyarldrlar ve gne gren vcut blgelerinde yaygn deri kanserleri gelitirirler. James Cleaver 1968de XP hastalarnda elde edilen hcreler ile yapt deneylerde bu hcrelerin nkleotid karma tamir yeteneinde yoksun olduunu gsterdi. Bu bulgu DNA tamiri ile kanser arasndaki ilikiyi gsteren ilk bulgulardan biridir. Cockayne sendromu ve trichothiodystrophy insanlarda grlen ve DNA tamirindeki kusurlardan kaynaklanan dier iki hastalktr.
Memeli hcrelerinde nkleotid-kesip karma tamiri

DNA hasar (rn., timin dimeri) XPC/hHR23B kompleksi tarafnda tannr. XPB ve XPD helikazlar barndran TFIIH (yani her iki faktr TFIIHn altbirimidir) ve XPG hasarl blgeye ekilir. XPB ve XPD ile DNAnn almasndan sonra hasarl blge XPA ile doldurulur. XPF/ERCC1 kompleksi bu blgeye gelir ve DNA XPF/ERCC1 ve XPG endonkleazlar ile kesilir ve hasarl olginkleotid karlp uzaklatrlr. XPF/ERCC1 ve XPG srasyla DNAy hasarl blgenin 5 ve 3 yerlerinde kesen endonkleazlardr. Oluan boluk daha sonra DNA polimerazlar tarafndan doldurulur ve DNA ligaz ile fosfodiester ba kurulur.
Hcre, Molekler Yaklam, G. M. Cooper, R. E. Hausman, ev. Ed., Merak Sakzl ve Nee Atabey, 2006.
Transkripsiyon-elikli tamir Bu tamir mekanizmas aktif olarak transkribe edilen gen ierisindeki hasarn tamir edilmesini salar. Bu tamir mekanizmas, ilk olarak memeli hcrelerinde ve E. colide transkribe olan DNA ipliklerinin olmayanlardan oranla daha hzl tamir edildiini gsteren deneyler ile gsterilmitir. DNA hasar transkripsiyonu basklandndan transkripsiyon ve DNA tamirin e zamanl gereklemesi, aktif olarak eksprese olan gen hasarlarnn ncelikli onarlmasn salar. E. colide transkripsiyon-elikli tamir mekanizmas, transkripsiyona urayan DNA ipliinde hasardan tr duraksayan RNA polimerazn tannmasn gerektirir. ncelikle, duraksam olan RNA polimeraz, TFIIH ve XPG proteinlerinin hasarl blgeye gelmesini salayan transkripsiyon-tamir eleme faktrleri denilen CSA ve CSB tarafndan tannr. TFIIH ve XPG proteinlerin hasarl blgeye gelmelerinden sonra XPF/ERCC1 ve XPA arlr ve bunu hasarl olginkleotidin karlmas izler.
RNA polimeraz 1. RNA polimeraz, transkribe olan DNA ipliinde hasarla karlatnda duraksar. 2. Duraksam olan RNA polimeraz CSA ve CSB (transkripsiyon-tamir eleme proteinleri) tarafndan tannr ve hasarl DNAya TFIIH (XPB, XPD) ve XPGnin gelmesini salar. 3. Geri kalan ksm genel nkleotid-karma tamir mekanizmasyla gerekletirilir.
- XPA ve XPF/ERCC1 kompleksinin arlr

- Hasarl oligonkleotid karlr. - DNA polimeraz ile boluklar doldurulur. - DNA ligaz ile balanty tamamlanr.
Mismatch (yanl eleme) eksizyon tamiri (MER) DNA polimeraz, replikasyon srasnda hata okuma (proofreading) yeteneine sahiptir. Mismatch eksizyon tamiri (MER), hata okuma sonras bile kalan yanl elemeleri tamir eden mekanizmadr. Bir yanl eleme bulunduunda, bu sistemdeki enzimler, spesifik olarak, yeni replike olmu DNA ipliinde hatal baz bulup karr ve hatann dzeltilmesini ve orijinal sekansn korunmasn salarlar.
E.colide hatal eleme onarm sisteminin, atasal DNA iplii ile yeni sentezlenen DNA ipliini birbirinden ayrt edebilme yetenei, bu bakterinin DNA'snn, GATC dizilerinde yer alan adeninlerin 6-metiladenin oluturmak zere metillenmesi esasna dayanr. Metillenme replikasyondan sonra meydana geldii iin, yeni sentezlenen DNA iplikleri metillenmez ve bylelikle yanl-eleme onarm enzimlerince spesifik olarak tannabilir. Yanl eleme onarm, hatay alglayan ve MutH ve MutL olarak adlandrlan dier iki protein ile kompleks oluturan MutS proteiniyle balar. MutS ve MutLnin insandaki edeerlerindeki mutasyonlar yaygn bir kaltsal kolon kanseri tipinin (kaltmsal polipsiz kolorektal kanser veya HNPCC) ortaya kmasndan sorumlu olmalar bu tamir sisteminin nedenli nemli olduunun bir gstergesidir. HNPCC en yaygn kaltsal hastalklardan birisidir, her 200 kiiden birini etkilemektedir.
Yanl eleme (mismatch) tamiri

Yanl eleme ve GATC sekans MutH ve MutS proteinleri tarafndan tannr. MutL proteini MutS ve MutH proteinleri birletirmektedir. MutH proteini metile olmam yeni sentezlenmi GATC sekansndaki Gnini 5 ksmndan krar. DNA helikaz II, ekzonkleaz ve SSB proteinleri birlikte yeni sentezlenmi olan DNA segmentini krlan nokta ile yanl elenmi blgenin biraz tesinde karrlar. Boluk DNA polimeraz III tarafndan doldurulur ve entik DNA ligaz enzimi ile kapatlr. karyotlar, E. coli ile benzer yanl eleme tamir sistemine sahiptir.
Principles of Biochemistry, Lehninger, Nelson, Cox, 1993
Hata-eimli tamir
DNA hasarnn yksek oranda olduu ve dier tamir mekanizmalarnn baarl olamad durumlarda devreye giren acil cevap sistemidir. DNA replikasyonu hasarl blgeye geldiinde durur. Fakat, hcreler birka sra d zellemi DNA polimerazlar ile hasal blge zerinden replikasyonu devam ettirebilirler. Bu polimerazlar ile hatal bazlarnda eklenmesi olasl artt iin buna hata-eimli tamir ad verilmektedir. lk hata-eimli polimeraz 1999 ylnda E. colide bulunmutur. Bu enzim DNA polimeraz Vdir ve ar UV radyasyonu sonucu oluan timin dimerleri zerinden yeni DNA sentezini gerekletirmektedir. karyotlarda da benzer hata-eimli DNA polimerazlar saflatrlm ve bugne kadar insanda 9 tane hata-eimli DNA polimeraz belirlenmitir. Bu enzimlerin normal DNA polimerazlara kyasla hata yapma oranlar 100 ila 10,000 kat daha yksektir.
Hata-eimli DNA tamir mekanizmas

Normal replikasyonda DNA polimerazlar timir dimerleri ile karlatnda dururlar. Fakat daha nce de belirtildii gibi DNA polimeraz V (pol V), bu tr hasarlar tanr ve replikasyonun devam etmesini salar. DNA polimeraz V ile yaplan replikasyonlarda yeni sentezlenen DNAda yksek oranda hata bulunmaktadr.
Rekombinasyonel tamir
DNA hasar dier tamir sistemleri ile tamir edilememise, replikasyondan sonra aktif olan mekanizmadr.
Bir lezyon bulunduran DNA replike olurken, DNA polimeraz nce lezyonda duraklar. Hasarl blgeyi de iine alacak ekilde boluk brakarak atlar ve senteze devam eder. Bu tamir sistemi RecA proteinine ihtiya duyar. RecA, ATP hidrolizi yardmyla hasarsz komplementer zincirde bulunan sekans transfer etmektedir. Komplementer zincirde oluan boluk DNA polimerazDNA ligaz enzimleri sayesinde doldurulur. Halen bulunan lezyon dier tamir sistemleri ile onarlr. Bu tamir sistemine postreplikatif tamir de denir.
Rekombinasyonel tamir
Timin dimerleri replikasyonu engeller fakat, DNA polimeraz bu lezyonu aar ve dimerin biraz aasndan tekrar senteze balarlar. Sonuta yeni sentezlenmi olan zincirlerin birisinde bir boluk oluur. Rekombinasyonel tamir ile boluk rekombinasyon yoluyla hasarl olmayan atasal DNA ile doldurulur. Atasal zincirde oluan boluk ise bu defa yeni zincirin kalp olarak kullanlmas ile doldurulur. Timin dimerleri daha sonra nkleotidkma tamir sistemi ile tamir edilir.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Kary Mullis tarafindan 1984 yilinda kefedilmitir. PCRin kefedilmesi molekler biyolojide bir devrim olarak ifade edilmi ve Dr. Mullise Nobel odl verilmitir. Yeterli miktarda DNA bulunmamas, az miktarda bir doku bulunmas ve hatta tek bir hcreden DNAnn milyonlarca defa oaltlmas (amplifikasyon) PCR ile mmkndr. Insan genom projesi bu teknik ile basaya ulamtr. PCR u asamalardan olumaktadr:
Denatrasyon: Dubleks DNAnn (ift iplikikli DNA) yksek scaklkta tek iplikiklere ayrlmas 2. Hibridizasyon (Annealing): Primerlerin uygun scaklkta hedef DNAya balanmas. 3. Amplifikasyon (Extension): DNA polimeraz ile primerin 3 OH grubuna nkleotitlerin eklenerek DNAnn uzatlmas:
1.
Bir tbe oaltlmak istenilen DNA, scakla dayankl DNA polimeraz, iki primer ve drt tur dNTP eklenerek reaksiyon gerekletirilir. DNA polimeraz olarak Taq DNA polimeraz kullanlr bu enzim yksek scakla dayankl Thermus aquaticus bakterisinden elde edilmektedir. DNA 95oC de 5 dakika denatre edilerek ift iplik DNAnn ayrlmas salanr. Sonra scaklk 50-60 oCye drlerek primerlerin 30 s gibi ksa bir srede hedef DNAya balanmas (annealing) salanr. nc ve son aamada Taq DNA polimeraz 72oCde ortamdaki dNTPlar primerlere ekleyerek 5 3 ynnde uzatarak polimerazasyonu tamamlar. Bu aamadan oluan reaksiyon 30-35 defa tekrarlanarak DNAnn yeterli miktarda ogaltlmas salanr. Son olarak DNA etidium bormid ile boyanr, agaroz gel elektroforezde ayrtrlr ve UV ile grntlenerek incelenir.
Primer Dizayn
1. 2. 3. 4. 5.
Primer: 15-30 nt uzunluunda oaltlmak istenilen hedef DNAya komplementer, dNTPlerin eklenmesi iin serbest 3OH grubu bulunan DNA semgenti. Primer dizayninda dikkat edilmesi gereken noktalar: Primer uzunluu (15-30 nt) % GC oran (% 40-60) Erime scak (Tm, 52-65 oC) Hairpin oluturup-oluturmad (sekonder yaplar oluturmamal) Her iki primerin Tm arasndaki scaklk fark 5oCden fazla olmamal
% GC =
G+C
Primer uzunlugu
x100
5-ATGTGTGCCGCTATGCATGCGAGA-3 primerinin
% GC oran =
13 24
X100 = 54
Erime scakl (Tm): Primerin DNAya %50 hibridize olduu scaklk

Tm: 4(G+C) + 2(A+T) Tm: 4(13) + 2(11) = 74oC Annealing scakl, Tm scaklndan 5oC dk olmaldr.
Primer uzunluunun 25 ntden fazla olmas durumunda Tm hesaplayan bilgisayar programlarnn kullanlmas daha uygundur.
Primer Dizayn
-globin geninin oaltlmas iin kullanlan primerler yeil renk ile koyulatrlmtr.
-globin DNA sekans
PCRda kullanlan DNA kayna

DNA, tek bir sa teli, bir deri hcresi, iskelet kalntlar, enfeksiyon numuneleri, veya tek bir kan damlasndan elde edilebilir. Bir damla kandan yaklak 1 g DNA elde edilebilir. PCR iin 0.5 ng yeterlidir.
PCR kullanm alanlar: 1. Adli tpta sulunun bulunmasnda ve babalk tayininde: Her bireyde hiperdeiken blgeler (HVR) olarak bilinen polimorfik blgeler veya deiken sayda tekrarlanan blgeler (VNTR) vardr. Bu blgeler bireyden bireye deikenlik gstermektedir. DNAdaki bu farkllklarn incelenmesi DNA parmak izi teknii olarak (DNA fingerprinting) bilinir. Bu deikenlik gsteren blgeler PCR ile oaltlr ve DNA sekans analizi yaplarak sulanan kisi DNAs ile olay mahallinde bulunan sa kl, kan veya deriden elde edilen DNA sekans karlatrlarak sank tespit edilebilir. 2. DNAdaki mutasyonlarn belirlenmesinde: DNAdaki mutasyonlar bir cok genetik hastala neden olmaktadr. Yaklak 3500 genetik hastaln her biri tek bir gende meydana gelen mutasyonlardan kaynaklanmaktadr. Bu hastalklardan bazlar: sistik fibrosis, orak hcreli anemi, -talasemia, fenilketonuria, hemofili. Kanser bir genetik hastalk olduu iin bir ok kanser trlerinin tehiside de PCR kullanlmaktadr. Akcier, gs, noroblastoma, retinoblastoma, mesane ve kolon kanserlerinde p53, RB, Ras, myc, Neu proteinlerindeki mutasyonlarn kansere neden olduu belirlenmitir. 3. Patojen mikroorganizmalarin saptanmasnda
TRANSKRPSYON
DNA da bulunan bilgiler RNA ve proteine dntrlmesi ilemine gen ekspresyonu (ifadesi) denir. Gen ekspresyonu iki basamakta gerekleir: transkripsiyon ve translasyon. Transkripsiyon DNAdaki bilginin (informasyonun) DNA zincirlerinden bir tanesine kompementer olan RNA zincirine dntrlmesi olayna denir. Daha nce de belirtildii gibi esit RNA sentezlenmektedir: mRNA: plipeptid sentezi iin amino asit dizisini belirleyen RNA seknasn tar. tRNA: uygun amino asitleri uzayan polipeptidlere tamaktadr. rRNA: proteinlerle birleerek ribozomlar oluturur. RNA, RNA polimerazlar tarafindan sentezlenir. Bu enzim ribonukleosid 5-trifosfatlar kullanarak RNA polimeri oluturur. RNA polimeraz ribonukleotidleri RNA zincrinin 3OH sonuna ekleyerek uzatr, bylece DNA sentezinde olduu gibi zincir 5 -> 3 ynnde ilerler. Dubleks DNAyi kalip olarak kullanir ve yalnizca DNA zincirlerinde bir tanesini kullanir bu zinciri 3 -> 5 ynnde okur.
5 CGCTATAGCGTTT3 kalp olmayan (nontemplate) (+) zincir 3 GCGATATCGCAAA5 kalp (-) zincir 5 CGCUAUAGCGUUU3 RNA transkripti Ve Watson-Crick baz elemesine gre nkleotidler seilir. Yani sitozin karsna guanin, adenin karsna urasil, timin karsna ise adenin konulur. DNA polimerazlarn aksine RNA polimerazlar primere ihtiya duymaz. Fakat RNA sentezi promoter denilen spesifik blgelerde balar.
Prokaryotik RNA Polimerazlar

E. coli 500 kDa arlnda 5 farkl altbirimden oluan bir RNA polimeraz vardr. 5 altbirimin birlikte oluturduu aktif enzime holoenzim denir.
Kor enzim
Sigma altbirim
Holoenzim
E. colinin btn RNAlar bu enzim tarafndan sentezlenir. Altbirimlerin grevleri: Alfa () Promoter blgesine balanmada etkili olduu sanlyor. Beta () Esas polimerizasyonu salayan altbirim. Ribonukleotidleri birbirine balayarak RNA zincirinin uzamasn salar. Sigma () Promoter blgesine enzimin skca balanmasn salar. Deiik sigma altbirimleri vardr. Hangi genin transkribe olacan salar. Eer sigma altbirimi yoksa RNA polimeraz rastgele herhangi bir DNA blgesine balanr. evre artlarna gre farkli sigma altbirimleri kor (ekirdek) enzime balanr. Omega (): Grevi tam olarak bilinmemektedir.
karyotik RNA Polimerazlar

karyotlarda farkl RNA polimeraz vardr: RNA polimeraz I: 28S, 18S ve 5.8S ribozomal RNAlar sentezler. RNA polimeraz II: Protein sentezinde kullanlacak olan mRNAlar sentezler. RNA polimeraz III: tRNA ve 5S rRNAlar sentezler. Hem prokaryotik hem de karyotik RNA polimerazlarn 3 -> 5 ekzonukleaz aktiviteleri olmad iin 104 ile 105 ribonukleotid de bir hata yaparlar (transkripsiyon hatalar yksektir).
Transkripsiyon Mekanizmas
RNA polimerazlarin baland ve transkripsiyonun balad blgelere promoter denir. Birok bakteri promoterlerin analizi sonucu RNA sentezinin balad blgeden (+1 olarak numaralanr) 10 ile 35 baz cifti nnde korunan ve aralarnda benzerlik grlen iki DNA blgesinin olduunu gstermitir. Bu -10 olarak numaralanan DNA blgesinde 5-TATAAT-3 (pribnow kutusu) sekans; -35 olarak bilinen blgede ise 5-TTGACA-3 sekans bulunmaktadr.
TTGACA TATAAT
Transkripsiyonun balad yer
-35
-10
+1
Transkripsiyon Mekanizmasi (devam)
Transkripsiyonun nemli eleman varlnda gerekleir: 1. Kalp DNA. 2. Ribonukleotidler (ATP, GTP, CTP, UTP). 3. RNA polimeraz enzimi. RNA holoenzimi DNAya balanr ve -35 promoter blgesinde kapal kompleks oluturur. -10 blgesine doru ilerler ve yaklak 17 ntlik bir blgeyi zerek ak kompleksi oluturur. Bu zlen blgeye daha sk balanr. mRNA sentezi baladktan bir ka ribonukleotid sonra sigma faktr holoenzimden ayrlarak serbest kalr ve RNA polimeraz promoter blgesinden ileriye doru ilerler. DNA kalb 3 -> 5 ynnde okunur ve RNA sentezi 5-> 3 ynnde ilerler. RNA sentezi RNA polimerazn DNAdan ayrlmasn tetikleyen bir sekansa ulaana kadar devam eder. Bu tamamlayc (terminasyon) sinyallerden bir tanesi kalp DNAda bulunan 15-20 nt kadar adenin ieren blgenin poli(U) bolgesine transkribe edilmesi sonucu hairpin (sac tokasi) sekonder yapsn oluur ve bu yap DNA-RNA kompleksini destabilize ederek (zayflatarak) RNA transkribinin ayrlmasn tetikler.
RNA transkripsiyon mekanizmas
Transkripsiyon Terminasyonu (tamamlanmas)
Transkripsiyon Faktrleri karyotik RNA polimerazlar promoter blgelerini dorudan tanmazlar. RNA polimerazlarin promotoru tanmas ve DNAya balanmasn salayan proteinlere transkripsiyon faktrleri denilir. Prokaryotlarda sigma faktr transkripsiyon faktr grevini yapmaktadr. RNA polimeraz I, II ve III farkli RNA sentezledikleri iin farkl promotorlara balanrlar ve dolaysyla farkl transkripsiyon faktrlerine balanrlar. RNA polimeraz II, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH ve TFIIJ proteinlerine ihtiya duyar.
RNA lenmesi Transkripsiyon sonucu tip RNA sentezlenir: mRNA, tRNA ve rRNA. karyotlardaki hemen hemen tm RNAlar sentezlendikten sonra bir dereceye kadar ilenmeye tbi tutulurlar. Yeni sentezlenmi ve ilenmemi olan RNA moleklne primer (ncl) RNA denir. En nemli ilenme olaylar unlardr: 1. mRNA splicing (intronlarn karlmas) 2. mRNAya 5 kep eklenmesi 3. mRNAya poli (A) kuyruu eklenmesi. mRNA ilenmesi: Bakterilerde bir proteini kodlayan gen kesintisiz olmasna ramen, karyotlarda protein kodlayan DNA bolgeleri (ekzonlar) 100-200 nt de bir intron denilen protein kodlamayan blgeler ile kesintiye uramaktadr. ntronlar primer transkriptten kesildikten sonra eksonlar birletirilerek fonksiyonel aktif mRNA oluturulur.
Primer Transkript ve lenmesi
ntronlar nasl kefedildi?

ekilde ovalbmin geninde bulunan intronlarn kefedilmesinde kullanlan metotlar anlatlmtr. Deneyde, olgun mRNA ve bu mRNAyi sentezleyen DNA karlatrlarak intronlar kefedimitir. Deney u ekilde yaplmtr: Gen ieren DNA denatre edildikten sonra, bu genin kodlad ilenmi mRNA varlnda renatre ediliyor. Oluan DNA-RNA hibrid molekl elektron mikroskobu ile incelendiinde baz DNA blgelerin mRNA ile hibridize olmad iin tek zincirli halat eklinde yaplar olarak grlmtr. Bu blgeler (intronlar) ilenmi mRNAdan karld iin DNAda hibridize olaca komplementer blgeler bulunmadndan elektron mikroskobunda ak bir ekilde grlmektedir.
ntron eitleri
Drt eit intron vardr: Grup I baz rRNA genlerinde, Grup II baz bitki ve mantar mitokondri ve kloroplast genlerinde, Grup III mRNA primer transkriptlerinde, Grup IV ise bazi tRNA transkriplerinde bulunur. Grup I ve Grup II intronlar self-splice olurlar (yani kendi kendilerine kesilip karlrlar: herhangi bir protein enzime ihtiya duymazlar). Grup I intronlar Tetrahymena thermophiliada 1982 ylnda Thomas Cech tarafndan kefedilmi ve bu kefinden dolay Nobel dl almtr. Bu keif btn enzimler proteindir olgusu rtmtr.
Grup I intron splicing mekanizmas

Grup I intron splicing iin (intronlarn kesilip, ekzonlarn birletirilmesi ilemi) kofaktr olarak guanozin molekl kullanlr. Guanozin moleklnn 3OH grubu intronun 5 ucunda bulunan nkleotidin 5 fosfat grubu ile 3,5 fosfodiester ba kurduktan sonra intron 5den kesilir ve 5 ekzonun 3OH grubu 3 ekzonun 5 fosfat gubuna saldrarak oluan fosfodiester ba ile ekzonlar birletirilir ve intron serbest kalr. Grup IIlar dardan bir kofaktr yerine intron iinde bulunan bir adenozin molekl intron kesilmesinde kullanlr.
mRNA primer transkriplerinin splicing mekanizmas

Splicing yerleri (intron-ekzon snrlar) birok karyotik mRNAda korunmutur. Nkleer mRNAlar Grup II intronlar gibi halata benzer bir yap oluturarak splice olurlar. Fakat, Grup I ve Grup II intronlar aksine kendi kendilerine splice olmazlar. Splice olmak iin kk nkleer RNAlar (small nuclear RNAs - snRNAs) denilen RNAlara ihtiya duyarlar. 5 tane snRNA, splice mekanizmasna katlmaktadr. Bunlar U1, U2, U4, U5 ve U6 olarak adlandrlrlar. 106-189 nkleotid uzunluklarndadrlar.
5 kep ilenmesi
karyotik mRNAlarn hemen hemen tamamnn 5 ucunda 7-metilguanozin bulunur. 7-metilguanozin mRNAnin 5 ucunda bulunan nkleotide 5,5-trifosfat ba ile balanmtr. Metil grubu S-adenosilmethioninden elde edilmektedir. ekilde, A) 5 kep yaps ve B) 5 kep sentezi srasndaki enzimatik reaksiyonlar grlmektedir
Poli (A) ilavesi mRNA transkriptinde poli (A) ilave edilecek olan blgeyi gsteren sinyal sentezlenene kadar transkripsiyon devam eder. Bu sinyal gzktkten sonra riboendonukleazlar mRNAyi bu blgede krar ve poliadenilat polimeraz enzimi 20-250 nt arasnda adenilat ieren poli (A) kuyruu ekler.
Transkripsiyon sonras dier baz modifikasyonlar

O
Riboz N H
O H3C H2N N N N N Riboz

HN O
HN O N
H H H H Riboz
1- metilguanozin (m1G)
Psdouridin ()
Dihidrouridin (DHU)
O HN N N N Riboz
nozin (I)
Reverse Transkripsiyon
Genetik bilgi bazen RNAdan DNAya doru akabilir. Bu ileme reverse transkripsiyon denir. Baz virsler reverse transkriptaz denilen RNA-ynlendirilmi DNA polimeraza sahiptirler. Enfeksiyon srasnda virs RNA genomu DNAya kopyalanr. Ayn enzim oluan RNA-DNA hibrid moleklndeki RNA zincirini paralar ve DNA zincirine komplementer ikinci bir zincir sentezler. Dubleks DNA karyortik hcrelerin genomuna eklenir ve elverili artlarda virs genleri aktif hale gelerek transkribe edilirler ve yeni virsler oluur.
Reverse Transkriptaz
Reverse transkriptaz enzimi farkl reaksiyon katalizlemektedir: 1. RNA kullanarak DNA sentezi 2. RNA ykm 3. DNA kullanarak DNA sentezi DNA sentezi iin primere ihtiya duyar ve primer olarak virs iinde bulunan bir tRNA molekl kullanr. DNA sentezi dier DNA polimeraz ve RNA polimerazlar gibi 5 3 ynndedir. RNA polimerazlar gibi reverse transkriptaz da 3 5 ekzonukleaz hata okuma aktivitesi yoktur. 20 000 nt de bir hata yapmaktadr. Bu hata orann ok yksek olduunu virsn neden ok hzl deitiini ve neden ilalara dayankl suslarn ortaya ktn aklamaktadr. Reverse transkriptaz, mRNAdan komplementer DNA (cDNA) sentezledii iin gen klonlanmasnda en ok kullanlan enzimlerden biridir. cDNA kullanarak genin kodlad protein snrsz bir ekilde elde edilebilir.
HIV reverse transkriptaz inhibitorleri

Molekler biyoloji teknikleri kullanlarak DNA ve RNA biyosentezindeki kimyasal reaksiyonlarnn aydnlatlmas AIDSe neden olan HIV virsun hayat dngsnn anlalmasna ve AIDSe yakalanan insanlarn hayatlarnn uzatlmasna olanak salamtr. Bu ilalardan birisi AZTdir. 1985te AIDS tedavisinde etkili olduu anlalmtr. Reverse transkriptaz enzimine balanmakta ve virsn uzayan DNA zincirine eklendikten sonra serbest 3OH grubu olmad iin virs DNA sentezi durmaktadr. Yeni sentezlenen dier baz ilalar (rnein, dideoksiinozin) benzer etki gstermektedirler.
PROTEN SENTEZ (TRANSLASYON)

Proteinler, DNAda depolanm olan genetik bilginin biyolojik aktivitelerini yerine getiren molek llerdir. Tipik bir hcrede binlerce protein vardir; her biri farkl bir gen tarafindan kodlanmakta ve her birinin farkl bir grevi vardr. Bu grevlerden bazilar: Yapsal grev (kollajen, keratin) Enzimatik reaksiyonlar kataliz ederler Tamada (hemoglobin, lipoproteinler) Depo olarak (feritin) Harekette (aktin, miyozin) Savunmada (antikor, fibrinojen, trombin) Membranlarda madde almn kontrol ederler (Na+K+ ATPaz pompasi, Ca2+ ATPaz, glukoz permeaz) Bazi proteinler hakkinda veriler M.A Amino asit says Insulin 5,733 51 Hemoglobin 64,500 574 RNA polimeraz I (E.coli) 450,000 4100 Albumin 68,500 550 Ubiquitin ~8,500 76 S-adenosylmethionine decarboxylase ~38,000 ~345 Proteinler 20 farkl amino asit yaptalarndan olumulardr. Butun amino asitlerde alpha () karbona bal bir karboksil grup, bir amino grup, bir hidrojen ve her amino asit farkl olan bir yan grup (R) bulunur. Iki amino asit kovalent ba ile birleerek bir dipeptid molekl oluturur. Bu ba genellikle peptid ba olarak bilinir.
H H2N C H Glisin O C N H CH3 C COOH H Alanin
Peptid ba
20-30 amino asitin birlemesiyle peptid: 50 ve daha fazla amino asitin birlemesi ile proteinler oluur. Proteinlerin molekl arlklar ounlukla kDa (kilodalton) olarak belirtilir. 10,000 M.A = 10,000 dalton = 10 kDa
mRNA transkripsyondan sonra nemli modifikasyona ugramaktadr

1.
2.
5 kep eklenmektedir. mRNAnn 5 ne GTP moleklnden guanil transferaz enzimi ile guanozin monofosfat grubu transfer edilir daha sonra bir metil grubu S-adenosilmetioninden guanin moleklne transfer edilir. Ayrca iki metil grubu daha birinci baz ve ikinci baza s-adenosilmetioninden transfer edilir. mRNAnin 3 grubuna poli (A) sekansi (100-200 nt) poli-A polimeraz enzimi tarafndan eklenir. 5-kep ve poli (A) kuyrugu ribonukleazlara karsi mRNAyi korur ve translasyonda nemli rol oynarlar.
5 AAAAAAAAAA-3
3.
Intronlar karlarak exonlar birletirilir.

5 m7G ve poli (A) eklenir m7G
(A)n
m7G5
Splicing m7G5 mRNA (A)n
(A)n
intron
mRNA DNAdan genetik bilgiyi harften olusan bir ifre ile tar
Proteinlerin farkl amino asit kombinasyonlarnda olumas nedeni ile, genetik ifrenin iki nkleotitten olumas halinde yalnzca 16 farkl kod (42 = 16) meydana gelebilir; bu da 20 amino asiti kodlamak icin yeterli deildir. Fakat nkleotitten olumas halinde 64 (43 = 64) farkl ifre (kodon) meydana gelebilir. Bu durumda her amino asit iin birden fazla kodon mmkndur. 64 kodonun 61 amino asit kodlarken 3u stop kodondur (amino asit kodlamaz). mRNA daki her nkleotit (bir kodon) bir amino asit kodlar. Metionin ve triptofan hari dier amino asitler iin birden fazla kodon vardr. Losin, arginin ve serin amino asitlerinin her bir iin alt kodon vardr. Bundan dolay genetik kod dejenere olarak bilinir; yani bir amino asit birden fazla kodon tarafndan kodlanabilir.
mRNAda bulunan amino asit ifreleri (Genetik Kod)

ekil 15.2. Genetik ifre. Protein sentezi AUG kodonu tarafnda kodlanan metionin ile balar. Stop kodonlar UAA, UAG ve UGA protein sentezinin bitiini iaret ederler. DNAnn kodlayan kolunun sekansn bulmak iin UT ile deitirilmelidir. DNAda ATG (metionin kodonu) ile balayp stop kodona (TAA, TAG veya TGA) kadar olan sekans open reading frame (ORF) olarak adlandrlr ve ounlukla protein veya peptid kodlayan blgedir. Tir, tirozin; Tri, triptofan; Los, Losin; Liz, lizin; Gli, glisin Ser, serin; Arg, arjinin; Fen, fenilalanin
Genetik kod kimyasal metotlar ile sentezlenen mRNAlar ile zlmtr. Bir tpe protein sentezi iin gerekli olan molekller (tRNA, ribozom, amino asitler, ATP ve GTP) eklendikten sonra sentetik mRNA bu karma ilave edilir ve sentezlenen peptitler incelenir. rnein, poli (U) mRNA eklendikten sonra sadece fenilalanin ieren polipeptitler sentezlendii grlm; Bu da UUU kodonun fenilalanin sentezlediini ortaya koyar. Poli (A) nin polilizin sentezledii gzlenmi. Dier kodonlar benzer ekilde Nirenber ve Khorana adl bilim adamlar tarafindan belirlenmitir.
5 AUG GCU UGU UUA CGA AUU 3 mRNA sekans okunduunda -Met-Ala-Sis-Los-Arg-IlePolipeptiti sentezlenir
Protein Sentezi
20 amino asitin her biri spesifik bir aminoasil-tRNA sentetaz enzimi tarafndan spesifik bir tRNAya balanr. 20 amino asit iin 20 amino asil tRNA sentetaz ve 20 ya da daha fazla tRNA vardr. tRNAlar tek zincirli RNAlar olup zincir ii Watson-Crick baz iflemesi (yani A=U ve GC) sonucu yonca yapra eklinde boyutlu yaplar olutururlar. ounlukla 73-93 ntden oluurlar. Ayrca ribotimidin, dihidrouridin ve psodouridin gibi modifiye olmu nkleotidler ierir. Yandaki ekilde de grld gibi amino asitler adenosin nkleotidin 3-OH grubuna aminoasil tRNA sentetaz enzimi tarafndan transfer edilirler.
Akseptr blge
D kolu
TCG kol
Antikodon kol
Protein Sentezi
karyotlarda btn proteinler metionin amino asiti ile balarlar. Prokaryotlarda ise formilmetionine ile balar. lk nce eIF2-GTP proteini karyotik initiation faktor 2) Met-tRNAya balanr. eIF3 ve eIF1A ise 40S ribozomal altbirimine balanarak (43S) 60S ile kompleks kurmasn engeller. 43S kompleksi mRNA ya balanr. eIF4F (eIF4A, eIF4E ve eIF4G proteinlerinden olusur) 5-kepe balanarak 5 den balayarak ilk AUG kodonunu taramaya balar. Bu arada nndeki sekonder yaplar eIF4Anin RNA helikaz aktivitesi ile eritilir. Ilk AUG kodonun bulunmas zerine eIF2 proteinine bal bulunan GTP hidroliz edilir ve eIF2 bu kompleksten ayrlr. eIF2 ayrldktan sonra yeni bir protein sentezine katlmas iin zerinde bulunan GDP, GTP ile deitirilmesi gerekir bu grev ise eIF2B protein tarafndan gerekletirilmektedir. eIF2 ayrldktan sonra 60S ribozome altbirimi 43S kompleksine katlarak 80S kompleksini oluturur. 40S ribozomal altbiriminde bir peptidil (P) bir de aminoasil (A) yeri vardr. Ilk amino asit (metionin) peptidil blgesine balanr. Ikinci amino asit ise aminoasil blgesine elongasyon (uzatma) faktrleri (eEF) tarafndan getirilir. Peptidil ve aminoasil blgelerinde bulunan amino asitler arasnda peptid bann 23S rRNA tarafndan (bakterilerde bulunur) sentezlenmesi ile peptid zinciri uzamaya balar. Peptidil blgesindeki amino asit A blgesinde bulunan amino asite aktarlr. Bu elongasyonun 3nc aamasnda 80S ribozom kompleksi ileriye doru hareket eder ve dipeptit moleklnn P blgesine gelmesini salar. Daha nce P blgesine bulunan ve serbest kalan tRNA molekl ise ribozom kompleksini terk eder. Bu ekilde A blgeside yeni bir amino asit iin yer alm olur. Ribozom kompleksinin UAG gibi stop kodonlara ulamas sonucu bu kodonlara balanan sonlandrc faktrler [RF faktorleri (release faktorleri)] ile polipeptid ile tRNA arasnda ba hidroliz edilir ve protein sentezi sona erdirilir. 80S kompleksi 40S ve 60S birimlerine ayrlarak yeni bir protein sentezine balarlar.
Protein sentezi balama aamas
Protein sentezi uzama aamas
AUG kodonu protein sentezini balatan kodondur

RNAda birden fazla AUG kodonu olmasna ramen Shine-Dalgarno sekansna en yakn olan AUG kodon protein sentezini balatan kodondur. Shine-Dalgarno sekans 16S rRNA ile baz iflemesi yaparak ribozomlarn mRNAya balanmasn ve protein sentezini balatmada direkt katkda bulunur. Protein sentezinin balamas iin bu sekans zorunludur.
karyotlarda, balama faktrleri (eIF4F) mRNAda 5-kepe balanr ve mRNAy tarayp ilk bulduu AUG kodonda protein sentezi balamasna ramen AUG kodonu etrafnda bulunan baz nkleotitler protein sentezinde nemli rol oynamaktadrlar. Bu sekans Marilyn Kozak tarafndan kefedilmi olup Kozak sekans olarak bilinir. Bu sekanstaki herhangi bir mutasyon protein sentezini nemli derecede drmektedir. mRNA 5-ACCAUGG-3 Kozak sekans
Polizom
Tek bir mRNA ounlukla birden fazla ribozom tarafndan protein sentezi iin kullanlr ve ayn mRNAdan ok sayda protein sentezlenir. Birden fazla ribozomun mRNA zerinde oluturduklar kmelere polizom denilir.
Protein sentezi esnasnda amino asitler bir nceki amino asitin karboksil grubuna eklendii iin protein sentezi NH2 COOH ynnde ilerler.
Prokaryotik ve karyotik ribozomlar arasndaki farklar
Proteinlerin Olgunlatrlmas: Katlanmas ve Posttranslasyonel lenme

Proteinlerin grevlerini yapmalar ve kullanlabilir hale gelmeleri iin sentez sonrasnda boyutlu yaplarnn olumas ve bir takm modifikasyonlara uramalar gerekir. Daha ncede belirtildii gibi proteinlerin boyutlu konformasyonlar amino asitlerin yan gruplar arasnda oluan etkileimler (hidrojen ba, iyonik ba, hidrofobik ba, dislfit ba) sonucudur. Fakat son zamanlarda yaplan almalar proteinlerin katlanmasnda baka proteinlerin aktivitelerine de ihtiya duyulduunu gstermitir. Dier proteinlerin katlanmasna yardmc olan bu proteinlere aperonlar denir. Protein katlanmas amin asit dizisi tarafndan belirlenmektedir. aperonlar yalnzca sentez srasnda proteine balanarak hatal katlanmay nler ve sentez bitmeden amino ucunda yanl katlanmalar nler. Protein sentezi bittikten sonra yeni protein ribozomdan ayrl ve boyulu yapsna doru bir ekilde katlanr. aperonlar ayrca proteinlerin katlanmam halde sitozolden organellere rnein mitokondriye tanmasnda araclk ederler.
Protein katlanmasnda aperonlarn grevi
Posttranslasyonel Modifikasyonlar
Baz yeni proteinler ise bir takm posttranslasyonel (sentez sonras) modifikasyonlara uramadan aktif biyolojik formlarn alamazlar. Prokaryot ve karyotlarda grlen baz posttranslasyonel modifikasyonlar aadadr: Sinyal sekansn karlmas. Amino-ucu veya karboksil-ucu modifikasyonlar. Baz amino-ucu ve karboksil-ucu sekanslar enzimatik olarak karlabilir ve bu nedenle son ilevsel proteinde grlmemektedirler. karyotik proteinlerin %50' sine yakn bir ksmnda amino-ucundaki amino asitin amino grubu traslasyondan sonra asetile edilmektedir. Baz amino Asit modifikasyonlar. Serin, treonin ve tirozin gibi amino asitlerin hidroksil gruplar enzimatik olarak ATP tarafndan fosforile edilmektedir
1. 2.
3.
Posttranslasyonel modifikasyonlar (devam)

4. 5. Karbonhidrat yan gruplarnn eklenmesi. Lipid gruplarn taklmas. rnein, prenil gruplar (14 karbonlu miristik asit, 15 karbonlu farnesil, 20 karbonlu geranil veya 16 karbonlu palmitat). Ras onkogenine farnesil grubun taklmas membrana tutunmasna yardmc olmaktadr. Farnesil grubu sistein yan zincirine ilave edilmektedir. Ras onkogeninin karsinojenik aktivitesi bu lipid grubunun eklenmesi bloke edildiinde ortadan kalkmaktadr Bu nedenle kanser tedavisinde bu posttranslasyonel modifikasyon yolunun inhibitrleri zerinde byk ilgi vardr.
Posttranslasyonel modifikasyonlar (devam)

6. 7. Prostetik gruplarn eklenmesi. asetil-CoA karboksilazdaki biyotin molekl ve sitokrom c'deki hem gruplar rnek olarak verilebilir. Proteolitik ilenme. Aada da detayl bir ekilde anlatld gibi birok protein, rnein, inslin, tripsin, kimoptripsin balangta byk inaktif prekrsr (nc) proteinler eklinde sentezlenmektedirler. Bu nc molekller proteolitik olarak kesilerek son aktif formlarna dnrler. Dislfit balarn olumas. karyotik hcrelerde hcre dna gnderilen proteinlerde ounlukla sistein kalntlar arasnda dislfit kprleri olumaktadr.
8.
PROTEN YIKIMI
Protein ykm (degredasyon ya da proteolizis) hcre iinde ya da dnda ilev gren proteazlar tarafndan gerekletirilmektedir. Hasarl, anormal proteinlerin hcre iinde birikmesini engellemek ve amino asitlerin geri dnm iin proteinlerin hcre iinde devaml yklmas gerekir. Hcre iin protein ykmn salan balca iki nemli protein ykm yolu vardr. 1. Lizozomal yol. Daha ncede anlatld gibi lizozomlar hidrolitik enzimler ieren membranla evrili organeller olup hcre iinde makromolekllerin sindirilmesi iin kullanlmaktadr. Yaklak 40 eit hidrolitik enzim iermektedirler (proteazlar, nkleazlar, lipazlar, glikozidazlar ve fosfolipazlar). Lizozomda endositoz ile hcre iine alnan proteinleri ykan katepsin olarak bilinen yaklak 50 hidrolitik proteaz vardr. Lizozomlarda yklan maddeler lizozomlara farkl yoldan ulamaktadr. 1. Endositozdur. 2. Otofaji 3. Baz proteinlerin yzeyinde bulunan KFERQ sinyal sekans aracl ile KFERQ sekans (K, lizin; F, fenilalanin; E, glutamik asit; R, arginin ve Q ise glutamin amino asitidir). 2. Ubiquitin-proteozom yolu. Ubiquitin-proteozom yolu hcre iindeki hasarl, yanl katlanm ve ksa-mrl proteinlerin ykmda nemli rol oynayan bir dier proteolitik yoldur. Hcre iindeki proteinlerin %80ne yakn bu yol tarfnda yklmaktadr. Hedef proteinler yklmadan nce ubiquitin ile (76 amino asitlik bir protein) ile iaretlenirler. Daha sonra hedef protein zerinde bir poliubiquitin zincir oluturulduktan sonra poliubiquitine olmu protein 26S proteozoma ynlendirilir. 26S proteozomda iaretlenmi olan hedef protein peptidlere kadar yklrlar.
Ubiquitin-proteozom yolu.
MUTASYONLAR
DNAda kendiliinde veya eitli etkenler ile meydana gelen deiikliklere mutasyon denir. Mutasyon tayan hcreye mutant, mutasyona neden olan faktre ise mutajen denir. Bir organizmann doada bulunan mutasyon iermeyen formuna da yabanitip denir. Mutasyonlar genler zerinde daha detayl bilgiler elde edilmesine ve genetik mekanizmalarn ileyii hakknda daha detayl bilgiler elde edilmesine yardmc olurlar. Ayrca, genlerde meydana gelen mutasyonlar yeni allellerin olumasna yol aabilecei iin eitliliin artmasn da salar. Mutasyonlar grupta incelenir: 1. Kromozom says deiiklikleri. Mitoz veya mayoz srasnda nondisjunction (kromozomlarn ayrmamas) kromozom saysnda grlen bir ok mutasyonu nedenidir. Bu anormal kromozom durumlarna aneuploid de denir. Baz aneuploidi eitleri unlardr: a) Monosomi. Bir bireyin eksik bir krozomoma sahip olmas. Normalde her kromozomda 2 tane bulunurken bu durumda baz spesifik kromozomlarda tek bir tane bulunmaktadr (2n 1 olarak gsterilir). Tek kromozom da denir. Turnmer sendromu rnek olarak verilebilir. 44 otozom + 1 X kromozom bulunmaktadr. b) Trisomi. Bir bireyin fazladan bir kromozoma sahip olmas. (2n + 1 olarak gsterilir). Klinefelter sendromu ve down sendromu (21. kromozom trisomisi) verilebilir.
Aneuploid Gametlerin Kkeni

Mayoz blnme srasnda meydana gelen nondisjunction aneuploide neden olur.
Griffiths, A.J., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M., An Introduction to Genetic Analysis, 6. Bask, 1996.
MUTASYONLAR (devam)
2. Kromozom yaps deiiklikleri. Bir kromozom parasnn dier bir kromozom zerinde tanmas sonucu veya bir para kayb sonucu oluurlar.
http://members.cox.net/amgough /Fanconi-genetics-genetics
3. Gen yaps deiiklikleri. Genler ve kromozomlar ya somatik hcrelerde ya da gametik hcrelerde mutasyona urayabilirler. Bu deiiklikler srasyla somatik mutasyonlar ve gametik mutasyonlar olarak adlandrlr. Somatik mutasyonlar yavru hcrelere veya yeni nesillere aktarlmazlar, bireyin lmyle yok olurlar. Gametik mutasyonlar reme hcrelerinde meydana gelirler yeni nesillere aktarlrlar ve yavrunun tm hcrelerinde yer alr.
Mutant Tipleri
Mutasyonlar eitli yollar ile anlalabilir. Bazlar ok hassas yntemler ile rnein baz biyokimyasal yntemler ile anlalabilir. Baz mutasyonlar ise ok iddetli olup bireyde morfolojik kusurlara ile veya bireyin lmne neden olabilir. Dolaysyla mutasyonlar mutant tiplerine gre de u ekilde snflandrlabilir: 1. Biyokimyasal mutasyonlar. Bir organizmann herhangi bir biyokimyasal veya sentez reaksiyonun gereklememesine neden olan mutasyonlara denir. 2. Morfolojik mutasyonlar. Organizmann d durumunu etkileyen mutasyonlara morfolojik mutasyonlar denir. 3. Letal mutasyonlar. Organizmann lmne yol aan mutasyonlara letal mutasyonlar denir. 4. Koullu mutasyonlar. Etkisi yalnz belirli artlarda grlen mutasyonlara koullu mutasyonlar denir. Isya duyarl mutasyonlar bu gruba girer. Isya duyarl mutant bir organizma dk derecedeki bir scaklkta geliebilir, fakat kstlayc ortamda yaayamaz. 5. Loss-of-function mutasyonlar. Bir mutasyon, bir genin kritik ilevini ortadan kaldrp inaktive ettii zaman loss-of-function mutasyonu denir. 6. Gain-of-function mutasyonlar. Mutasyonlar rastgele yaplan genetik deiimlerdir ve ounlukla genlerde ilev kab mutasyonlarna yol aarlar (loss-of-function). Fakat, nadiren olarak rastgele olan mutasyonlar bir gene yeni bir ilev kazandrabilir. Bu durumda bu mutasyonlara gain-of-function mutasyonu denir. Heterozigot durumunda ounlukla dominanttr. Homozigot durumunda organizma yaayabilir de yaamayabilir de.
Yldrm, A., Bardak, F., Karata, M., Tanyola, B., Molekler Biyoloji, 2010. Nobel Yaynevi. Griffiths, A.J., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M., An Introduction to Genetic Analysis, 6. Bask, 1996.
Loss-of-function mutasyonu. Heterozigot durumunda yabani tip protein hala yaplmaktadr ve ounlukla yabani-tipte bir fenotip iin yeterlidir. Fakat homozigot durumunda gen tamamen ilevsizdir.
Gain-of-function mutasyonu. Yeil renk ile gsterilen protein yeni bir ilev kazanmtr. Heterozigot durumunda muhtemelen dominant olarak davranr. Homozigot birey ise yaamayabilir.
Griffiths, A.J., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M., An Introduction to Genetic Analysis, 6. Bask, 19 96.
MUTASYONLAR (devam)
Daha nce belirtildii gibi mutasyon, DNA sekansnda meydana gelen deiikliklerdir. Mutasyonlarin gen kodlayan DNA blgelerinde meydana gelmesi sonucu proteinlerin amino asit sekanslarnda deiiklikler meydana gelir. Bu deiiklikler proteinin yapsn deitirecei gibi aktivitesininde komple kaybolmasna neden olabilir. rnegin, proteinlerin boyutlu yaplarnn positif ykl amino asitler (lizin, arjinin) ile negatif ykl amino asitler arasnda oluan hidrojen balar ile belirlenmektedir. Eer bazik lizin amino asiti dier polar bir amino asit ile (metionin) deiitirilir ise protein sahip olduu boyutlu yaps lokal olarak ya da tamamen (eer ok sayda mutasyon varsa) bozulur. Proteinlerin yapsnn belirlenmesinde nemli rl olan hidrophobik ba oluumuna katlan amino asitlerden bir tanesinin (valin, alanin, glisin, prolin, losin) polar bir amino asit ile (serin, sistin, glutamine, asparajin), positif ykl veya negatif ykl (aspartik asit, glutamik asit) bir amino asit ile deitirilmesi yapsnn bozulmasna neden olur. Bu da aktivitenin kaybolmasna neden olur. Mutasyonlar spontan (kendiliinden) bir ekilde DNA polimerazn yaptii hatalardan kaynakland gibi (E.coli DNA polimeraz 109 nkleotitde bir hata yapmaktadr) DNAdaki nkleotidlerdeki bazlarn bir grub kaybetmesi sonucuda meydana gelebilir. Sitozinin amino grubunu kaybetmesi sonucu urasil, 5-metilsitozinin amino grubunu kaybetmesi ile de timin olusabilir.
NH 2 N O N H
Deaminasyon
O HN O N H
Sitozin
Urasil
Mutasyon eitleri
1. Nokta Mutasyonlar a. Yanlis Anlamli (Missense) Mutasyonlar b. Anlamsiz (Nonsense) Mutasyonlar c. Sessiz (Silent) Mutasyonlar 2. nsrsiyon ve Delesyon Mutasyonlar 1. Nokta Mutasyonlar: DNA da bir bazn (rnein adenin baznn) baka bir baz (T, G veya C) ile deitirilmesidir. Eer, bir purin (A veya G) baz bir pirimidin (C veya T) ile deitirilirse buna transversiyon mutasyon; eger bir purin baz diger bir purin baz ile degitirilirse buna transisyon mutasyon denilir. Ayn ekilde bir pirimidine diger bir pirimidine baz ile deitirilirse bir transisyon mutasyonu meydana gelir. a. Yanl anlaml (missense) mutasyon: Gendeki bir baz deiiklii sonucu mRNAdaki kodon deiir ve normalden farkl bir amino asit kodlanr. rnek olarak orak hcreli anemi de grlen mutasyon verilebilir. GAG kodundaki adeninin timin ile deitirilmesi sonucunda hemoglobinin beta zincirindeki altnc amino asit olan glutamik asit valin amino asiti ile deitirilmesi. Homozigot durumunda ldrc olan bu hastalk heterozogit durumunda bireyi stma hastalndan korur. b. Anlamsz (nonsense) mutasyonlar: Bir amino asit kodonun STOP kodonlarndan birine deimesidir (UAA, UAG, ya da UGA). Bunun sonucunda protein tam olarak sentezlenmez; eksik sentezlenen protein fonksiyon grmez. rnein bir kistik fibrisis hastasnda 1609uncu nkleotitdeki sitozinin timinin ile deitirilmesi sonucu CAG kodonu STOP kodonuna dnm ve normalde 1480 amino asitlik olan protein 493 amino asit olarak sentezlenmitir.
c. Sessiz (silent) mutasyonlar: Baz amino asitler birden fazla kodon tarafndan kodlanabilirler. rnein serin amino asiti iin 6 farkl kodon vardr. TCT kodonundaki nc bazn (yani T) diger bir baz ile deitirilmesi halinde (rnegin A, G ya da C) oluan yeni kodon tekrar serin kodlayacaktr. nk TCT gibi TCA, TCG ve TCC de serin kodlamaktadrlar. Bu mutasyon proteinde bir degiiklik meydana getirmediinden dolay sessiz (etkisiz) mutasyon olarak bilinmektedir. 2. nsrsiyon ve Delesyon Mutasyonlar: nsrsiyon: DNAya fazladan baz eklenmesi; delesyon ise DNAdan baz karlmasdr. Bu tr mutasyonlar gende frameshift (yani ereve kaymasna) yol at iin sentezlenen protein deersizdir. rnein aadaki DNA sekans normalde Glutamik asit, Prolin, Glutamin ve Lsin amino asitlerini sentezlemektedir. Bu DNA sekansndan n nkleotid yani guanin delesyona uradn farzedelim; bu delesyon sonucunda aada da grld zere frameshiftten dolay proteinin amino asit dizisinde farkl amino asitler grlmektedir.
. GAG CCG CAA CTT. DNA sekans
Glu Pro Gln Ls Sentezlenen protein Guanin nukleotidi delesyona uruyor ve frameshift ten tr DNA sekans aadaki ekilde okunuyor ve protein dizisinde deiiklik meydana gelmektedir.
. GA CCG CAA CTT. Yeni DNA sekans

Asp Arg Asn Yeni sentezlenen protein
Mutajenesis DNA sekansinda mutasyon elde etmek olarak bilinir. Mutasyonlar kimyasal veya fiziksel yollarla olusabilir. Mutasyonlara neden olan ajanlara mutajen denilir. Baz kimyasal ve fiziksel mutajenler: 5-bromouracil - AT GC ve GC AT transisyonuna neden olur.
Timin
O HN O N H CH3
5 Bromo urasil
O HN O N H Br
5 Bromo urasil hem timin hem de sitozin gibi davranarak A veya G ile eslesebilir ve GC veya AT transisyonlarina neden olur. Molekul yapisi timin bazina benzedigi icin timin analogu (baz analoguda) denir.
5-bromourasil ile yaplan mutajenesis mekanizmas
2-aminopurine Timin yerine geer ve sitozin ile elesir ve AT GC transisyonuna neden olur. Nitrosasiti - GC AT ve AT GC mutasyonlarna neden olur. Amino grubu ihtiva eden bazlar (A, G ve C) deaminasyona uratarak mutasyona neden olur. Etilmetan sulfonat (EMS) - GC AT TA CG EMS DNAdaki genellikle guanin ve timin bazlarna alkil (etil) gruplar ekleyerek mutasyona neden olur. Akridin ve EtBr Hidrofobik zelliklerinden dolay hidrofobik olan bazlar arasnda girerler ve replikasyon esnasnda fazladan baz eklenmesine ve delesyonuna neden olur. Bu da erceve kaymas (frameshift) mutasyonu ile sonulanr.
O N OH Nitrosasiti H N H O S O CH3
C2H5 OH O Hidroksilamin Etilmetan sulfonat (EMS)
Restriksiyon Enzimleri Kullanarak Mutasyon Yapmak

Restriksiyon enzimleri ile ilgili DNA segmenti kolay ve hzl bir ekilde modifiye etmek mmkndr. Bir gende hem delesyon hem de insersiyon yapilabilir.
Belirlenmi Nokta Mutasyonlar

u ana kadar anlatlan mutagenezis methodlarnn baz dezavantajlar: 1) kimyasal mutajenler ile mutasyonlar rastgele yapld iin proteindeki herhangi bir amino asit mutasyona urayabilir. 2) Restiksiyon enzimleri ile yaplan delesyon veya insrsiyon da ise erceve kaymas olaca iin mutasyon yaplan blgeden sonraki amino asit sekans tamamen deiecektir. Ayrca gen iinde tek bir defa kran uygun restriksiyon enzimi bulmak bu metodun dier bir zorluklarndandr. Belirlenmi nokta mutasyonlar bir proteindeki herhangi bir amino asit deitirme imkan vermektedir. Bu metod iin mutasyonu tayan bir oligonukleotit primeri (16-30 nt) dizayn edilir ve geni tayan tek zincirli plazmid DNAsna hibridize edilir (balanr). Daha sonra bu primer DNA polimeraz enzimi ile uzatlr ve oluan heterodupleks DNA (bir normal zincir ve bir mutasyon ieren DNA zinciri) bakteri hcrelerine aktarlr. Bu hcre iinde DNA replike olunca her iki zincirde de mutasyon elde edilir.
Polimeraz zincir reaksiyonu ile mutasyon yapm
Yldrm, A., Bardak, F., Karata, M., Tanyola, B., Molekler Biyoloji, 2010. Nobel Yaynevi.
Fiziksel Mutajenler
Is, UV ve X-nlari bu gruba girer. UV primidin dimerlerine neden olur. Primidin dimerleride DNA replikasyonu ve transkripsiyonu engeller. UV hasarn en yaygn formu timin dimerleridir. Bu ayn zincirdeki iki komu timin baznn kovalent olarak birlemesi ile oluur. DNAdan SOS tamir mekanizmasi ile karlmasna ramen tamir esnasnda bu sistem hassas olmad iin mutasyona neden olabilir. E.colide uvrABC endonukleaz enzimi pirimidin dimerlerini tanr ve dimeri 5 ucundan 8 nt, 3 ucundan 4 nt uzaktan fosfodiester balarn keser ve karrr. Boluk DNA pol I enzimi tarafndan doldurulur ve DNA ligaz enzimi ile fragmentler en son birletirilir. Bu endonukleaz enziminin hasarl olmas veya sentezlenememesi durumunda gne nana duyarllk oluur ve pirimidin dimerleri tamir edilmez. Bu durumda xeroderma pigmentosum denilen deri kanseri ortaya kmakta ve hastalar 30 yandan nce metastazdan dolay lmektedirler.
GEN FADESNN KONTROL

ok hcreli bir organizmadaki farkl hcreler hem yap olarak hem de ilevsel olarak ok farkldrlar. Bir nron ile bir lenfosit hcresini karlatrdmzda, ikisinin ayn genoma sahip olduunu dnmek olduka zordur. Bu nedenle ilk zamanlar bilim adamlar hcre farkllamas srasnda baz genlerin kaybolduunu dnmlerdir. Fakat u an hcre farkllamasnn gen kayb nedeniyle deil gen ifadesindeki deiiklikten kaynaklandn biliyoruz. Gen ifadesi (ya da ekspresyonu) bir gendeki bilginin ilevsel bir gen rnne dntrlmesi ilemine denir. ok hcreli bir organizmadaki hcreler farkl RNA ve proteinler biriktirerek birbirlerinden farkllamaktadrlar. Bunu, DNA sekansn deitirmeden yapmaktadrlar. Farkllama srasnda genomun bozulmadn, korunduunu gsteren bir ka deney aadaki ekilde gsterilmitir. Tam farkllam bir kurbaa deri hcresinden elde edilen ekirdek, ekirdei karlm olan bir kurbaa yumurtasna enjekte edildiinde normal bir embriyo ve kurbaa yavrusu tekrar meydana gelmektedir.
Bir memeli nron ile bir lenfosit hcresi. Nronlar, sinir sistemi hcreleri olup elektriksel bir sinyal iletirken, lenfositler beyaz kan hcreleridir ve immn sistemde grevlidirler. Her ikisi de ayn genoma sahip olmalarna ramen farkl RNA ve proteinler retmektedirler.
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter, Molecular Biology of the Cell, 2002
Farkllam bir hcre tam bir organizma oluturmak iin gerekli tm bilgiye sahiptir. Bu da farkllama srasnda gen kabnn olmann ispatdr.
karyotik gen ekspresyonu 6 aamada kontrol edilebilir:
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Transkripsiyon aamas RNA ilenme aamas RNA tanmas aamas Translasyonel kontrol aamas mRNA ykm aamas Protein aktivitesi ve ykm aamas
Transkripsiyon Kontrol
Gen ifadesi, 6 farkl aamada kontrol edilmesine ramen transkripsiyon ou gen iin en nemli aamadr. Transkripsiyon kontrol negatif veya pozitif olabilir. Negatif reglasyonda represr molekl operatr blgesine balanr ve transkripsiyonu engeller. Pozitif kontrolde ise aktivatr bir molekl promoter blgesinde RNA polimeraz ile etkileir ve transkripsiyonu balatr.
Prokaryotlarda reglatr proteinler transkripsiyonu kontrol eder.

Lak Operonu
E. colide bir represr ve bir aktivator protein lak operonun transkripsiyonunu kontrol etmektedir. Operon, ortak bir promoter ile kontrol edilen gen topluluuna denir. Lak operonu, laktozun hcre iine alnmas ve ykm iin gerekli olan proteinleri kodlamaktadr. Laktoz operonu onemli ksmdan oluur: Regulator blge (represr), kontrol blgesi (promoter ve operatr) ve yapsal genler (-galaktozidaz, galaktozid permeaz ve galaktozid transasetilaz). Laktoz operonu hem Negatif Reglasyon hem de Positif Reglasyona tabii olmaktadr. Besiyeri ortamna laktoz konulduunda, -galaktozidaz, galaktozid permeaz ve galaktozid transasetilaz enzimlerinin miktarnda byk bir art olur. nce bir miktar laktoz allolaktoz denilen bir indkleyiciye evrilir. Allolaktoz, operatr blgesindeki represr proteinine balanr ve onu uzaklatr. Bundan sonra RNA polimeraz promoter blgesine balanr ve transkripsiyonu balatr.
Lak Operonu (devam)

Ayrca, laktoz operonu pozitif kontrol altndadr. Pozitif reglasyon, cAMP (siklik adenozin mono fosfat) miktarnn artmasna baldr. cAMP miktar artt zaman katabolit aktivatr proteinine (CAP) balanr ve CAP de RNA polimerazn promotere sk bir ekilde balanmasn uyarr. CAP, RNA polimeraz aktivitesi 50 kat arttrmaktadr.
Pozitif Reglasyon
CAP
Negatif reglasyonda, reglatr bir proteinin rn transkripsiyonu durdurmak iin elzemdir. Pozitif reglasyonda ise reglatr genin rn transkripsiyonu balatmak iin gereklidir.
Lak Operonu (devam)

Glukoz hcreye girdii zaman cAMP miktar der ve RNA polimeraz promotera balanamaz. Glukoz seviyesi azaldnda ise cAMP miktar artar ve CAPye balanr ve transkripsiyonu stimle eder. Lak operonu sadece glukozun olmad ve laktoz olduu durumlarda en st dzeyde aktive olur.
karyotlarda Transkripsiyon Kontrol

karyotlarda gen ifadesi ounlukla transkripsiyonun balama amasnda denetlenir. Bakterilerde olduu gibi karyotik hcrelerde transkripsiyon DNAda spesifik dizilere balanan genel transkripsiyon faktrlerine ek olarak aktivatrler veya represrler ile denetlenir. Transkripsiyon balama aamasnda nce TFIIDnin T ve A bakmnda zengin olan bir blgeye (TATA kutusu olarak bilinir) balanr. Daha sonra, dier transkripsiyon faktrleri ve RNA polimeraz IInin balanmasyla transkripsiyon balama kompleksi oluur. Bu aamadan sonra TFIIH helikaz aktivitesi ile DNAy zer ve RNA polimeraz II transkripsiyona balar. RNA polimeraz IInin karboksil ucunda (C-ucu) yine TFIIH tarafndan fosfatlanmas (TFIIHn helikaz aktivitesine ek olarak protein kinaz aktivitesi de vardr) dier transkripsiyon faktrlerinden ayrlmasna ve RNA polimeraz IInin DNAdan ayrlmadan uzun bir mesafe boyunca transkripsiyon yapmasna yardmc olur.
Transkripsiyon balama aamasnn kontrol: TFIID ve TFIIHn grevi
Transkripsiyon Aktivatr Ve Represrlerin Grevleri Aktivatrler, RNA polimeraz ve genel transkripsiyon faktrlerinin transkripsiyon balama blgesinde toplanmalarna yardmc olurlar. Transkripsyon aktivatrleri bamsz ileyen iki farkl blgeden oluurlar: DNAya balanan blge ve aktivasyon blgesi. DNA balanan blgelerde 4 farkl motif grlmektedir (motif, polipeptid zinciri ierisinde spesifik boyutlu yaps olan bir blgedir). Bunlar; inko parmak blgeleri (steroid hormon reseptrlerinde ve Sp1 transkripsiyon faktrnde grlmektedir, 2 adet sistein ve 2 adet histidin amino asitlerinin inko atomu balayarak parmak eklinde yaplar oluturur). Sarmal dn sarmal blgeleri (E. coli katabolit aktivatr proteininde (CAP) Lsin fermuar (yedi amino asit arayla yerlemi drt veya be lsin ierir) Sarmal ilmek sarmal
1.
2. 3. 4.
Transkripsiyon Faktrlerinde Ve Aktivatrlerinde Grlen Motifler
inko parmak motif
Lsin fermuar motif

Sarmal dn sarmal
Sarmal ilmek sarmal
Transkripsiyon Aktivatrlerinin Grevleri

Daha ncede belirtildii gibi transkripsiyon faktrlerinde iki blge bulunmaktadr: DNA balayan blge ve transkripsiyon aktivasyon blge. DNA balayan blgenin grevi transkripsiyon faktrlerinin ve aktivatrlerinin DNA zerinde doru yere balanmasn salamaktr. Transkripsiyon aktivasyon blgesinin grevi ise proteinprotein etkileimleri ile transkripsiyonu uyarmaktr.
Baz transkripsiyon aktivatrleri transkripsiyonu ok uzak blgelerden aktive edebilirler. lk olarak 1979 ylnda aktivatrlerin promoterdan binlerce nkleotid uzaktan transkripsiyonu arttrabilecekleri kefedilmitir.
Aktivatrlerin balandklar DNA blgelerine enhancer (ykseltici) denilmitir. Bu enhancerlarn promotern yukarsnda veya aasnda bulunmalarnn fark etmedii grlmtr her iki yerden de transkripsiyonu arttrmaktadrlar.
Peki, o zaman nasl oluyor da enhancerlar transkripsiyonu ok uzak noktalarda ve oriyentasyona bakmakszn arttrmaktadrlar? Aadaki modelde de grld gibi aktivatrlerin enhancera balanmas enhancer ile promoter arasndaki blgenin ilmek oluturduu ve bylelikle transkripsiyon faktrlerini ve RNA polimeraz yakna getirdii grlmektedir. Sonu olarak transkripsiyon binlerce nkleotid uzaktan arttrlmaktadr.
Aktivatr ve enhancer aracl transkripsiyonun arttrlmas
Transkripsiyonu Etkileyen Dier Faktrler
Histon asetillenmesi: karyotik kromozomlarda DNA plak olarak grlmez. DNA, histon proteinler ile sarlarak nkleozom birimleri halinde paketlenmitir. Youn olmayan ve transkripsiyonel olarak aktive olan kormatine kromatin, youn olan transkripsiyona uramayan kromatine ise heterokromatin denir. DNAnn nkleozomlarda paketlenmi olmas hem RNA polimeraz hem de transkripsiyon faktrlerinin DNAya ulamalarna engel tekil eder. Histonlarn asetillenmesi, histonlarn DNAya balanmasn zayflatr ve transkripsiyon faktrlerinin DNA ya balanmasn kolaylatrmaktadr. Asetillenme histonlarn net pozitif ykn zayflatt iin DNAya daha zayf balanmalarna yol aar. Histonlar sadece asetillenme ile deil serin birimlerinde fosfatlanmas, lizin ve arginin amino asitlerinde metillenmeleri ve ubiquitin (76 amino asitlik protein) ile DNAya olan balanmalar zayflatlabilir veya arttrlabilir.
Histon asetilasyonu ile transkripsiyonun dzenlenmesi

Asetilasyonun 2 fonksiyonu vardr: 1. Pozitif ykl lizin rezidlerini (kalntlarn) ntralize eder. 2. Histon ular ile yapsal proteinler arasndaki balantlar destabilize eder.
Hipoasetilasyon: Nkleozomlar aras gl balantlar
Hiperasetilasyon Nkleozomlar aras zayf balantlar: Histon ular DNAy snrlamaz ve transkripsiyon faktrleri DNAya balanabilir.
DNA metilasyonu ile transkripsiyonun kontrol

Herhangi bir substrat moleklne metil grubunun eklenmesine metilasyon denir. Tranksipsiyon DNA metilasyonu ile de kontrol edilir. nsan genomunda 20.000 ile 25.000 arasnda gen olduu tahmin ediliyor ve genellikler bu genlerin yukarsnda CpG dinkleotidleri (promoter blgesinde) yer almaktadr. nsan genomunda yaklak 30.000 CpG blgesi yer almaktadr. Buradaki Clerin (sitozinlerin) metillenmesi transkripsiyon aktivatrlerinin balanmasn engelleyerek transkripsiyonun azalmasna yol aar.
NH2 N O N H
Sitozinin yaps
NH2
Metilasyon
N N H
CH3 H
Hcre Molekler Yaklam, G. M. Cooper ve R. E. Hausman: eviri Ed. Meral Sakzl ve Nee Atabey, 2006 Principles of Genetics, D. P. Snustad, M. J. Simmons, 2010
5-metilsitozinin yaps
5-metil sitozin varl, bulunduu kromozom blgesinde lokalize olan genlerin sessizlemesine yol aar. DNAnn sitozin baznda metilasyonu ve bunun akabinde histon deasetilasyonu kromantin kondensasyonuna ve gen basklanmasna yol aar. Metilasyon, DNA metiltransferaz enzimi, deasetilasyon ise histon deasetilaz tarafndan gerekletirilir.
MT: DNA Methyltransferase MeCP2: Methyl-CpG-binding domain HDAC: Histone Deacetylase
DNA metilasyon deiimlerinin 2 genel tipi gzlenmektedir:
1. Hipermetilasyon
2. Hipometilasyon
Hipermetilasyon
DNAdaki sitozin veya adenin bazlarnda metilasyonun ykselmesidir. Bata tmr supresr (basklayc) genler olmak zere genomda hayati fonksiyonu olan pek ok gen hipermetile hale getirilerek sessizletirilir; DNA tamir genleri, hcre dngs reglatrleri ve apoptozis ilikili genler gibi.
Sadece promoter alannn yaknndaki veya iindeki metilasyon gen sessizlemesiyle sonulanr.
Hipometilasyon Sitozin veya adenin bazlarnda metilasyonun azalmas durumudur. Kanser hcre genomlar da gze arpar bir ekilde global hipometilasyona urarlar. Habis bir hcre normal halinden %20-60 daha az genomik 5-metil sitozin ierebilir. Bu metil grubu kayb, kodlayc alanlar ile intronlarn hipometilasyonu ve tekrarlayc dizilerin demetilasyonu sebebiyle gerekleir. Hipometilasyon kanser oluumuna proto-onkogenlerin aktivasyonu ile katkda bulunur.
RNA lenmesi Alternatif-kesip ekleme ile gen reglasyonu

Bir tek gen birok intron ve ekzon ierebilir. Ekzonlar farkl farkl yollardan kesilip eklenebilir. rnein bir gen 10 ekzon ierebilir. Bu genin kodlad mRNAlarndan biri 1-9 arasndaki ekzonlar, bir dieri 1-8 arasndaki ekzonlar ierebilir. Buna alternatif splicig (alternatif kesilip-eklenme) denir.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Modules/MolBioReview/alternative_splicing.html
RNA lenmesi Alternatif-kesip ekleme ile gen reglasyonu (devam)

Alternatif kesip-eklemeye en iyi rneklerden bir tanesi ayn pre-mRNAnn alternatif kesilip- eklenmesiyle Drosofilada dii ve erkek bireylerin belirlenmesidir. Drosofila da cinsiyet belirlenmesinde anahtar rol oynayan transformer (tra) proteini yalnz diilerde eksprese edilir. Transformer pre-mRNAs ekzona sahiptir. Erkeklerde U2AF denilen kesip-ekleme faktr ad verilen bir protein tra pre-mRNAsnda ekzon 1in yakndaki bir 3 kesim blgesine baland iin UAG DUR kodonu ieren bir DNA blgesinin olgun mRNA grlmesine yol aar ve protein sentezi erken sonlad iin tra protein retilmez. Fakat, diilerde SXL denilen protein bu yakn 3 kesim blgesini kapatt iin U2AF proteini daha aa bir 3 kesip blgesine balanr ve fonksiyonel bir tra proteinin sentezlenmesini salar.
Tom Maniatis & Bosiljka Tasic Nature 418, 236-243(11 July 2002)
Gen ekspresyonu mRNA ykm hz ile de kontrol edilebilir. Protein sentezine hem 5-kep hem de poli(A) kuyruu katlmaktadr. Balama faktrleri ile poli(A) balayan protein arasndaki etkileim sonucu mRNA dairesel bir ekil almaktadr. Bu eklide poli(A) kuyruu ykmdan korunduu iin daha verimli bir tanslasyon yaplmaktadr. Protein sentezi yaplmad zaman DAN enzimi (deadenylating nuclease, deadenile-edici enzim) poli(A) kuyruunu 3-5 ynnde ykmaktadr.
Gen ifadesinin translasyon ve mRNA ykm ile kontrol (ferritin ve transferin reseptr sentezi) Demir eksikliinde, akonitaz (demir yant-eleman-balayan protein) ferritin mRNAs zerindeki demir yant elemanna (IRE) balanr ve translasyonu engeller. Buna karn, akonitaz transferin reseptrnn mRNAsnn 3 ucuna yakn bir yerde olan demir yant elemanna da balanr ve transferin reseptr mRNAsnn ykmn engeller ve transferin reseptr sentezlenir. Ferritin, demir depolayan hcre ii bir proteindir. nsan, bakteri, alg ve bitki gibi tm organizmalarda bulunan bir proteindir. Transferin ise plazma glikoproteinlerinden olup demir tanmasnda sorumludur. Demir eksikliinde
Demir varlnda
Demir miktar yeterli ise akonitaz her mRNAya da balanamamaktadr. Dolaysyla, ferritin mRNAs translasyon urar ve protein sentezlenir. Fakat, bunun tersi bir durum transferin reseptr iin geerlidir. Akonitaz yine demir varlnda transferin reseptrndeki IREe balanamamaktadr ve mRNA yklmaktadr. Bu sebeple transferin reseptr retilmemektedir.
Protein Sentezinin Balama Aamasnda Kontrol

Met-tRNAi tayan eIF2, (315 amino asit), (333 amino asit) ve (472 amino asit) alt birimlerinden olumaktadr. Bu komplekse mRNAa katldktan sonra eIF2 zerinde bulunan GTPnin hidrolizini salar. GTP hidrolizini takiben, eIF2GDP ribozomdan ayrlr ve yeni bir Met-tRNAi ribozoma tanmas iin zerindeki GDPnin GTP ile deitirilmesi gerekir. Bu reaksiyon ise eIF-2B (guanine nucleotide exchange factor) tarafndan katalizlenmektedir. eIF2 alt biriminin Ser51 amino asidinde fosforlanmas eIF2yi substrat olmaktan kompetetif inhibitre dntrr. Bundan dolay eIF-2B, eIF2 zerindeki GDPyi GTP ile deitiremez ve yeni eIF2GTPMet-tRNAi trimerik kompleksinin olumas engellenir ve protein sentezinin tamamen (global) durmasna neden olur.
Yldrm, A., Bardak, F., Karata, M., Tanyola, B., Molekler Biyoloji, 2010. Nobel Yaynevi.
Gen ifadesi, siRNA ve miRNAlar ile de kontrol edilebilir. RNA interferans (RNAi), canl hcrelerde gen aktivasyonunu kontrol eden dier bir sistemdir. siRNA ve miRNA, RNAin iki nemli parasdr. RNA, genlerin direkt bir rndr ve bu RNAlar baka RNAlara balanarak aktiviteleri arttrabilir veya engelleyebilir (rnein, ekilde de grld gibi mRNAdan protein sentezini engelleyebilirler. RNAi, birok karyotta bulunmaktadr ve Dicer denilen ve ift zincirli RNAy 20 ntlik kk fragmentlere kran bir enzim ile balatlmaktadr. ift zincirli engelleyici RNA dier baz proteinler ile birleerek RISC (RNA-tarafndan uyarlan sessizletirme kompleksi) oluturur. RISC daha sonra hedef mRNA ile eleir, eer RISC iindeki RNA mRNA ile mkemmel eleirse siRNA olarak adlandrlr ve mRNAy keserek translasyonu durdurur. Fakat, RISC iindeki RNA mRNA ile tam elemez ise micro RNA (miRNA) olarak isimlendirilir ve yine translasyonu engeller (fakat mRNA bu durumda kesilmemektedir).
Principles of Genetics, D. P. Snustad, M. J. Simmons, 2010
miRNAlarn sentezi
http://bioscience.sjtu.edu.cn/bio_link/biology/RNAipic.htm
SNYAL LETM MEKANZMALARI

Sinyal letimi
Canlln devam, hcrelerin farkllamas, bymesi ve metabolizmann dzenlenmesi hcreler aras haberleme a ile gerekleir. Sinyal iletimi hcreleraras haberleme olarak ta bilinir ve bir sinyalin (uyarnn) iletilmesi ve buna verilen zgl bir cevab kapsar. Bu cevap, gen ifadesinde deiiklik, metabolik enzim aktivitelerinin deitirilmesi, hcre iskeleti yapsnn yeniden dzenlenmesi, iyon geirgenliinde deiiklik, hcre farkllamas, hcre bymesi, DNA sentezi veya hcre blnmesi eklinde olabilir.
Sinyal iletiminde temel ama, evreden veya dier bir hcreden alnan uyarnn spesifik bir cevap oluturmak zere hcre ii bileenlerine iletilmesidir. Hcre yzeyinde gelen uyarnn hcre iine iletilmesine sinyal transdksiyonu olarak da ifade edilir.
Hcresel cevap eitli ekillerde olabilir
SAKALIM
BLNME
FARKLILAMA
APOPTOZS
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. Molecular Biolohy of the Cell, 2002
Hcreleraras Haberleme eitleri A) Hcre-hcre temas ile haberleme. Dorudan membranmembran temas olan hcrelerin varln gerektirir. B) Parakrin haberleme. Hcre d ortama salnan ve komu hcreler zerinde lokal uyar oluturan haberleeme tipidir. C) Sinaptik haberleme. Bir akson terminali ile baka bir sinir hcresi veya effektr bir organ (bez, kas vb) arasndaki haberleme tipidir. Haberleme nrotransmitterler araclyla gerekleir. D) Endokrin haberleme. Kan dolamna salglanan hormonlar araclyla yaplan haberleme tipidir. E) Otokrin haberleme. Bir hcresinin kendi rettii sinyal molekllerinin kendi membranndaki reseptrlere balanmas ile bir uyar oluturmasdr.
Hcreleraras haberleme eitleri
(E) OTOKRN
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. . Molecular Biolohy of the Cell, 2002
Genel anlamda hcresel haberleme 6 temel aamada incelenebilir: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sinyal (haberci) molekln sentezi Sinyal molekln salglanmas Sinyal molekln hedef hcreye iletilmesi Sinyal molekln zgn bir alma (reseptr) ile etkileimi Hcresel cevabn oluturulmas Sinyalin ortadan kaldrlmas ve hcresel cevabn sonlandrlmas
Molekler Biyoloji. Ahmet Yldrm, Fevzi Bardak, Mehmet Karata, Bahattin Tanyola. 2007
Ligand ve Reseptr zel bir sinyal molekllne kar oluturulacak olan hcresel cevap bu sinyal moleklnn hedef hcre yzeyinde, ekirdeinde veya sitozolnde bulunan zgn bir protein etkileimine baldr. Sinyal molekl bir hormon, nrotransmitter, bir byme faktr veya basit bir gaz olabilir. Sinyal molekle ligand da denir. Ligand, reseptre balanan molekldr. Reseptr veya alma ise ligand kabul eden molekldr.
Sinyal iletici molekllerin snflandrlmas

Hidrofobik sinyal molekller 1. Steroid hormonlar -Testosteron, strojen ve progestron -Mineralokortikoidler -Glukokortikoidler 2. Tiroid hormonu 3. Vitamin D3 4. Retinoik asit Basit gazlar 1. Nitrik oksit (NO) 2. Karbon monoksit (CO) Peptid Hormonlar 1. nslin 30.006 dalton 28.01 dalton Cinsiyet hormonlar Tuz ve su dengesini dzenlerler Glukoz retimi uyarrlar Tirozin amino asidinden sentezlenir ve metabolizmann geliimi ve dzenlenmesi Ca2+ metabolizmasn ve kemik geliimini dzenler Vitamin Adan sentezlenir be geliimde nemli rol oynar Kas gevemesi, kan damarlarnn genilemesi ve enzim aktivitelerinin dzenlenmesi Kan damarlarnn genilemesi
A = 21, B = 30
2. Glukagon 29 3. Byme hormonu 191 4. Folikl stimle edici hormon (FSH) = 91, = 118 5. Prolaktin 198 Byme Faktrleri 1. Sinir byme faktr (NGF) 118 2. Platelet kkenli byme faktr (PDGF) A = 125, B = 109 3. Epidermal byme faktr (EGF) 53 4. nterlkin 133 5. Eritropoietin 166
Glukoz almnn dzenlenmesi ve hcre oalmasnn uyarlmas Glukoz sentezinin uyarlmas Genel byme uyarm Oositlerin bymesinin uyarlmas St retiminin uyarlmas Sinir hcrelerinin farkllamas ve sa kalm Fibroblast ve dier baz hcrelerin oalmas Birok farkl tipteki hcrenin oalmas T-lenfositlerin oalmas Eritrositlerin geliimi
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan uyarland.
Hidrofobik sinyal molekller
The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000.
Nitrik Oksidin Sentezi

Nitrik oksid sentaz, nitrik oksidi arjininden sentezlemektedir. NOnun hcre ii hedef molekl guanil siklazdr. Guanil siklaz, siklik GMP sentezini uyarr. cGMP ise kan damalarnn genilemesini salar.
Reseptrlerin Snflandrlmas
1. Hcre ii reseptrler Hidrofobik olan steroid hormonlar, tiroid hormonu, Vitamin D3 ve retinoik asit plazma membrann da difzyon ile hcre iine girebilme yeteneindedirler ve hcre ii reseptrlerine balanrlar. 2. Plazma membrann da yerleik olan reseptrler a) G-protein elikli reseptrler b) Reseptr protein tirozin kinazlar c) Sitozolik protein kinazlar ile ilikili reseptrler d) yon kanal reseptrleri
Hcre ii reseptrler
Steroid hormonlar hcre ii reseptrlere balanarak uyary iletirler
Hcre ii reseptrler (devam)

Tiroid hormonu da steroid hormonlarna benzer ekilde plazma membranndan difze olur ve daha sonra ekirdekte DNAya bal olan reseptrne balanarak transkripsiyonu aktive eder.
Plazma Membrann Da Yerleik Olan Reseptrler a) G protein elikli reseptrler

G proteini elikli reseptr ailesi sinyali hcre ii hedef molekllerine G protein olarak adlandrlan proteinler araclyla iletirler. G protein elikli reseptrler, zar yedi defa geen -sarmal yapsna sahiptirler. Ligandn bu reseptrlere balanmas sitoplazmik tarafta bir yapsal deiikliin olmasna ve G proteinin ayrlmasna neden olur. Uyarlan G proteini sinyali hcre iine doru tar.
G protein elikli reseptrn yaps
G proteinleri, guanin nkleotid balayan proteinlerdir ve alt birimden , ve dan oluurlar. 1970lerde Martin Rodbell ve arkadalar cAMP sentezi iin GTPye ihtiya olduunu buldular. Bu bulgu adenilil siklaz aktivasyonu iin bir guanin nkleotid balayan (bir G protein) kefine yol at. Dinlenim halinden alt birim ve alt birimlerine ve GDPye baldr. Uyarld zaman GDP, GTP ile yer deitirir ve alt birimi ve alt birimlerinden ayrlr. Aktive olan GTP bal alt birim adenilil siklaz uyararak cAMP sentezini balatr. cAMP hcrede transkripsiyonun aktivasyonu ve glikojen ykm gibi birok hcresel olayda nemli rol oynayan ikincil haberci bir molekldr.
cAMP sentezi ve ykm

cAMP, ATPden adenilil siklaz enzimi tarafndan sentezlenir. Ve 5-AMPye siklik AMP fosfodiesteraz tarafndan yklr.
cAMP, protein kinaz Ay aktive ederek gen transkripsiyonunu uyarr
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. . Molecular Biolohy of the Cell , 2002
Glikojen metabolizmasnn cAMP ve protein kinaz A ile kontrol Daha ncede belirtildii zere glikojen hayvanlarda balca karbonhidrat depo ekli olan glukoz polimeridir. Glikojen sentezi glikojen sentaz enzim ile, ykm ise glikojen fosforilaz ile katalizlenir. Glikojen metabolizmasnn dzenlenmesi, epinefrin hormonun etkisini aratran almalar ile aydnlatlmtr. Epinefrin (adrenalin) hormonu tirozin amino asitinden bir seri enzimatik reaksiyon sonucu sentezlenen ve karacierde glikojen ykmn salayan hormondur. Epinefrin plazma membranndaki reseptrne balandktan sonra adenilil siklaz enzim aktivitesi artmakta ve bu da cAMP miktarnda nemli bir arta yol amaktadr. cAMP daha sonra protein kinaz Ay aktive eder. Protein kinaz A ise fosforilaz kinaz fosforile ederek aktive eder, fakat ayn zamanda glikojen sentaz enzimi de fosforile ederek bu enzimi inaktive eder. Fosforilaz kinaz daha sonra inaktif olan glikojen fosforilaz fosforile ederek aktif glikojen fosforilaz dntrr. Aktif glikojen fosforilaz ise glikojenlere fosfat ekleyerek glukoz-1-fosfat olarak koparlmasn salar. Glukoz-1-fosfat, glikolizis yoluna girerek ATP sentezlenmesini salar.
Baz hormonlarn cAMP aracl ile uyardklar sinyal iletimi sonucu verilen baz hcresel cevaplar
Kalsiyum aracl sinyal iletimi cAMP gibi bir ikinci haberci olup kas kaslmas, hcre blnmesi, salg, endositoz, nrotransmitter salnm gibi pek ok hcresel aktivitede rol oynayan bir iyondur. kinci haberci, hcre yzeyindeki reseptrden uyar alp sitozoldeki veya ekirdekteki hedef molekllere ileten molekllerdir. grupta incelenirler: 1. Siklik nkleotidler (cAMP ve cGMP) 2. nositol trifosfat (IP3) ve diasilgliserol (DAG). IP3, ERdaki reseptrlerine balanarak Ca2+ salnmn salar. DAG ise protein kinaz Cyi aktive eder. PKC, hcre farkllamas, byme ve transkripsiyonda nemli rollere sahip bir serin ve treonin kinazdr. 3. Kalsiyum iyonlar (Ca2+). Dinlenim halinde sitozolde kalsiyum konsantrasyonu 10-7 M gibi ok dk bir seviyededir. Plazma membranndaki ve ER membranndaki Ca2+ iyon kanallar sayesinde kalsiyum hcre dna veya ER iine pompalanr. Uyarlma durumunda ise Ca2+ miktarnda nemli bir art gzlenir, bu kalsiyum miktarndaki art kas hcrelerinde kaslmaya neden olur. Kalsiyum iyon kanallar, plazma membrannda voltaja duyarldr, ER membranndaki kanallar ise bir bitki alkoloidi olan ryanodin veya yukarda belirtilen ve bir lipid trevi olan inositol 1,4,5-trifosfat (IP3) tarafndan kontrol edilmektedirler. Ca2+,
b) Reseptr protein tirozin kinazlar

G elikli reseptrlerin aksine, reseptr protein kinazlar enzimatik aktiviteye sahiptirler. Reseptr protein kinazlar, substratlarn tirozin amino asidinde fosforilleyen protein kinazlardr. nsan genomu EGF, NGF ve PDGF ieren 58 reseptr protein tirozin kinaza sahiptir. Bu reseptrlerde, bir N-ucu ligand balama blgesi, bir tekli a-sarmal yapda transmembran blgesi ve bir de protein tirozin kinaz aktivitesine sahip olan C-ucu blgesi vardr.
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. . Molecular Biolohy of the Cell, 2002den .
Reseptr protein tirozin kinazlar ile uyarnn iletilmesinde ilk basamak ligand (hormon veya byme faktr) balanmas sonucu reseptr dimerizasyonudur. Reseptr dimerizasyonunu takiben monomerler birbirlerini karlkl olarak fosforile ederler (otofosforilasyon denir). Aktive olan reseptr daha sonra uyary hcre iindeki dier proteinlere iletir.
Reseptr protein tirozin kinaz aktivasyonu ve otofosforilasyonu
Reseptr protein tirozin kinazlarn dimerizasyonu ve aktivasyonu sonucu uyar nce Ras proteine iletilir. Ras da bir GTP balayan protein olup uyary daha sonra MAP kinaz kinaz kinaza (Raf proteini de denir) iletir. Raf bir serin/treonin kinaz olup MAP kinaz kinaz (ya da MEK olarak da bilinir) denilen dier bir protein kinaz fosforile eder. Aktive olan MEK proteini, MAP kinaz veya ERK denilen proteini hem tirozin hem de treonin amino asitlerinden fosforile eder. ERK ise dier protein kinazlar ve transkripsiyon faktrlerini fosforile eder.
Ras aktivitesinin kontrol

Ras GDP bal forma inaktif durumdadr. Reseptrn dimerizasyonu ve otofosforilasyonu Ras GDP/GTP deiimini uyarmaktadr (guanin nkleotid deiim faktr tarafndan). Aktive olan GTP bal Ras yukarda belirtilen protein kinazlar uyarr. Ras aktivitesi, GTP hidroliz ile sona erdirilir (GTPaz-aktive eden protein tarafndan). Kanser hcrelerinde Ras mutasyona urad iin srekli aktif GTP bal formda kalr ve uyar olmakszn srekli hcre oalmasna neden olur.
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan . Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter . Molecular Biolohy of the Cell, 2002
Ras tarafndan MAP kinaz (ERK) aktivasyonu

Byme faktr reseptrlerinin uyarlmas nce GTP balayan protein olan Ras proteinini aktive eder. Daha sonra uyar Raf, MEK ve ERK kinazlar ile ekirdekteki birok hedef proteine ulatrlr. nsan tmrlerinin %30unda Ras/Raf/MEK/ERK yolunu ar aktivasyonu sz konusudur.
c) Sitozolik protein kinazlar ile ilikili reseptrler Sitokin reseptrleri aracl sinyal iletimi
Birok reseptr isel bir enzimatik aktiviteye sahip olmaktan ok hcre iinde kovalent olmayan balarla bal olduklar protein tirozin kinazlar ile uyary iletiler. Bu reseptr ailesi birok sitokin (interlkin-2 ve eritropoietin) ve baz polipeptid hormon (byme hormonu) reseptrlerini iermektedir. Reseptr protein tirozin kinazlar gibi, sitokin reseptrleri de ligan balayan bir hcre d N-ucu, tek bir sarmal yapda olan transmembran blge ve C-ucu sitozolik blge iermektedir. Fakat, sitozolik C-ucu katalitik aktiviteden yoksundur. Bunun yerine sitokin reseptrleri reseptr olmayan sitozolik protein tirozin kinazlar ile kompleks yaparlar.
The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000dan .
SNYAL LETM YOLLARI VE KANSER

Sinyal iletim yollarnn ve sinyal proteinlerini hedef alan onkogenik mutasyonlar (Ras rneinde olduu gibi) sk rastlanlmaktadr. Sinyal iletiminde meydana gelen deiimler hcrenin oalma veya yaama ilevlerinin kontrolden kmasna yol aar. Bundan dolay onkojenik sinyal iletimi tmr geliimi ile invazyon/metastaz srecince kritik rol oynamaktadr. nsan Genom Projesinin verilerine gre, insan genomundaki yaklak 32.000 genin %20si sinyal iletiminde grev alan proteinleri kodlamaktadr . Daha nce bahsedildii gibi bu proteinler arasnda hcre membrannda yerleen reseptr protein kinazlar, G-proteinler ve sinyali hcre iinde ileten enzimler yer almaktadr.
nceki blmlerde anlatld zere, bu reseptrler byme faktrleri ile balandktan sonra aktif hale geerler ve sitoplazmadaki hedef proteinleri ile etkileerek sinyal iletimini gerekletirirler. RTK aktivasyonunun sonlandrlmasndan ise fosfatazlar sorumludur. Buna gre, fizyolojik koullarda sinyal iletimi tersinir zellik tar ve RTK aracl iletim kontroll yaplr. Karsinogenez srecinde ise, srekli ve kontrolsz RTK aktivitesi sz konusudur.
stirahat halindeki hcrelerde proteinler sitoplazmada inaktif halde bulunurlar. Byme faktrleri veya sitokinler ile hcrenin uyarlmasndan sonra aktif hale gelen bu proteinler, sitoplazmadaki veya nkleustaki hedeflerine ynelirler. Sitoplazmik tirozin kinazlarn srekli aktivasyonu transformasyon, tmr bymesi, motilite ve invazyon art ile anjiyogenez gibi malign fenotipe zg hcresel olaylar hzlandrr. Daha ncede bahsedildii gibi insan tmrlerinin, %30undan ise Ras/Raf/MEK/ERK kinaz sinyal iletim yolu sorumludur.
HCRE DNGS
Hcre dngs veya siklusu, uyarlm bir hcrenin tm ieriini iki katna karmas ve blnerek iki yavru hcre oluturmasn ieren bir sretir. Bakterilerde hcre bymesi ve DNA replikasyonu hcre dngsnn byk blmnde devam eder ve elemi kromozomlar yavru hcrelere plazma zar ile birlikte datlr. karyotlarda ise hcre dngs birbiri ile balantl drt farkl evreden oluur ve daha karmaktr. 1. Hcre bymesi 2. DNA replikasyonu 3. Kromozomlarn yavru hcrelere datlmas 4. Hcre blnmesi
Prokaryotik Hcre Blnmesi
Prokaryotlar organizazyon bakmndan karyotlara gre daha basittir. E. colide hcre blnmesi yaklak 30-40 dk. ierisinde tamamlanmaktadr. Prokaryotik hcrelerin blnmesi genel olarak binary fission ikiye blnme eklinde olmaktadr. Prokaryotik kromozom tek bir DNA molekldr. nce replikasyona urar ve daha sonra kromozomun her bir kopyas hcre membrannn farkl blgesine tutunur. Hcre ulardan ekilmeye balaynca orjinal ve kopya kromozomlar ayrlrlar. Sitolazmannda ikiye ayrlmasyla (sitokinez) genetik ierik bakmndan tamamyla birbirinin ayn olan iki yeni hcre meydana gelir (eer kendiliinden mutasyon olmadysa).
Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm
karyotik Hcre Blnmesi

karyot hcrelerinde hcre dngs yaklak olarak 24 saat srmektedir. Mikroskopta gzlendiinde hcre dngs, mitoz ve interfaz olarak iki temel blmde incelenir. Mitoz (ekirdek blnmesi) evresinde kromozomlar birbirinde ayrlr ve hcre blnmesi ile (sitokinez) sonlanr. Ancak mitoz ve sitokinez yalnz 1 saat srer ve hcre dngsnn %95i interfazda (mitoz aras dnem) de geer.
karyotik Hcre Blnmesi

karyotlarda hcre siklusu ok daha karmaktr ve yukarda da belirtildii zere iki temel blmden oluur: Mitoz ve interafaz. nterfazda nemli fazdan oluur: S faz: Sentez faz, DNA replikasyonu yaplr. RNA transkripsiyon ve protein sentez hzlar bu fazda ok dktr. Tek istisna histon sentezidir. Histonlarn byk bir ksm bu fazda sentezlenir. G1 (gap 1), nterfazn ilk fazdr. M faznn sonundan DNA sentez fazna kadar olan sredir. Byme fazda denir. DNA sentezi iin gerekli proteinleri sentezler, fakat DNA sentezini yaplmaz. Hcre srekli olarak byr. G2 (gap 2), DNA sentezinin tamamlanmasn G2 evresi izler. Mitoza hazrlk iin iin gerekli RNA ve protein sentezlendii evredir. zellikle mikrotbllerin sentezi yaplmaktadr. Hcre bymesi devam eder. G2 faznda protein sentezinin durdurulmas mitoza girii engeller. NTERFAZ = S+G1+G2
Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000
Hcre Siklusu

Hcre siklusu fazlarnn sreleri farkl hcre tipleri iin olduka eitlilik gsterir. Hcre dngs sresi 24 saat olan hzl oalan bir insan hcresinde G1 faz 11 saat, S faz 8 saat, G2 4 saat ve M faz 1 saattir. Dier hcreler rnein maya hcresi tm siklusunu yaklak 90 dakikada tamamlayabilir.
Hcre Dngs Yumurtann dllenmesinden sonraki erken embriyonik hcrelerde hcre siklusu 30 dakika gibi ksa bir sre srmektedir. Bu tip hcrelerde hcre bymesi grlmemektedir. Yumurta sitoplazmas kk hcrelere hzl bir ekilde blnr ve G1 ve G2 fazlar yoktur. DNA sentezi hzl bir ekilde ok ksa olan S faznda gerekleir
Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm. The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000.
Hcre Dngs ve Evreleri
G0 faz
Hzl oalan embriyonik hcrelerin dnda yetikin hayvanlarda baz hcreler blnmeyi tamamyla durdururlar (sinir hcreleri ve kas hcreleri), G0 (quiescent evre) olarak adlandrlan duraan evreye girerler ve ok uzun sreler oalmadan kalabilirler. G0 hcrelerinin bymesi durmu ve protein sentezi hz azalm olsa da metabolik olarak aktiftirler. Yine, deri fibroblastlar blnme iin uyarlncaya kadar (rnein yaralanma sonucu) G0 evresinde tutulurlar. Bu hcrelerin oalmas trombositler tarafndan salnan ve yaralanm dokunun yaknndaki fibroblastlarn oalmasn uyaran platelet kkenli byme faktr tarafndan tetiklenir.
Hcre Dngs Fazlarnn Belirlenmesi

Hcre dngsnn farkl evreleri DNA ieriklerin gre ayrt edilebilir. rnein G1 hcreler diploidtirler yani her kromozomun iki kopyasn ierirler. DNA ierikleri 2ndir. (n, genomun haploid DNA ieriini temsil eder). S evresinde DNA ierii 2nden 4ne kar. Hcreler, bu evrede 2n ile 4n arasnda DNAya sahiptirler. G2 ve M evresindeki hcreler 4n DNA miktarna sahiptirler. Sitokinezden sonra ise DNA miktar 2ne iner. Hcrelerin DNA ierii DNAya balanan floresan boya ile inkbasyon sonras ak sitometrisi (flow cytometry) kullanlarak belirlenebilir.
Hcre Dngs Kontrol Noktalar

Hcre dngsnn ilerlemesi farkl evrelerde yer alan kontrol noktalar ile denetlenmektedir. Birok hcre tipinde en nemli kontrol noktalarndan birisi G1in sonlarnda bulunur ve G1den Sye geii denetler. Bu nokta ilk kez tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiaede bulunmu ve START olarak adlandrlmtr. Mayalar, besin yetersizlii durumunda dngy START noktasnda durdururlar ve dinlenme evresine girerler. Yani, START noktas, hcre iin blnmeyi tamamlamak iin yeterli besinin bulunup bulunmadna karar verme noktasdr. Mayalarn START noktasn geebilmek iin minimum bykle ulamas gerekir. Kk yavru hcreler G1den ana hcreye gre daha uzun zaman kalr ve daha fazla byr. Hayvan hcrelerinde de mayalardaki START kontrol noktasna benzer ekilde ilev gren restriksiyon kontrol noktas bulunmaktadr. Restriksiyon kontrol noktas G1in sonlarnda dr. Hayvan hcrelerinde, hcre dngs mayalarn aksine besin varl ile deil byme faktrlerinin varl ile kontrol edilmektedir.
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan. The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000.
Hcre Dngs Kontrol Noktalar

Dier bir hcre dngs kontrol noktas G2dedir. G2deki kontrol noktas zarar grm DNAya kar duyarldr. Bu noktada hcre siklusu durdurularak zarar grm DNAnn onarlmas iin zaman kazanlr. Bu G2 kontrol noktas replike olmam DNAya duyarldr. Byle bir DNA hcre siklusunu durdurmaya yol aan bir sinyal oluturur. Bylece G2 kontrol noktas S faz tamamlanmadan nce Mitoza girii engeller. Hasarl DNA varlnda, ayn zamanda G1 ve S evrelerindeki kontrol noktalarnda da hcre dngs durdurulur.
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan . The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000.
G1 Evresinde Hcre Dngsnn Durdurulmasnda p53n Rol

Radyasyon tarafndan uyarlan DNA hasar sonucu p53 miktar artmaktadr. Daha sonra p53 hcre dngsn G1 kontrol noktasnda durduran sinyali gndermektedir. p53 bir transkripsiyon faktrdr ve hcre dngsn duraksatacak hedef genlerin uyarlmasna yol aar. p53, Cdk inhibitr olan p21in sentezlenmesine yol aar. p21 baz Cdk/siklin komplekslerini inhibe ederek hcre dngsnn durmasna neden olur. Ayn zamanda dorudan DNA replikasyonunu da inhibe ederler. p21 DNA pol. alt-birimi olan oalan hcre nkleer antijeni (PCNA)ne balanarak DNA replikasyonunu inhibe eder. Bylece hasarl DNAnn replikasyonu engellenir. nsan kanserlerinde p53 kodlayana gen sklkla mutasyona uramaktadr. p53n ilev kayb sonucu hasarl DNA onarlmadan yavru hcreye geer ve kanser geliimine katkda bulunur.
Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000. Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan .
DNA Replikasyonun Bir Defayla Snrlandrlmas

Her bir hcre dngs iin DNA replikasyonunu bir kereyle snrlayan molekler mekanizmada, MCM proteinleri olarak minichromosome maintenance (MCM) denilen balang noktasna balanan proteinler ile salanmaktadr. MCM proteinleri, G1 evresinde DNAya balanrlar. Hcre dngsnn S, G2 ve M evrelerinde ise DNAya balanamamaktadrlar. DNA sentezi balaynca MCM proteinleri DNAdan ayrlr ve bir sonraki G1 evresine kadar DNAya balanamaz ve DNA sentezi tekrar balatlamaz.
Hcre Siklusunu Kontrol Eden Proteinler

karyotik hcrelerin hcre siklusu, protein kinazlar ve siklinler tarafndan kontrol edilmektedir. Hcre dngsn kontrol eden proteinler hakkndaki nemli bilgiler ilk defa kurbaa oositlerinde yaplan almalardan elde edilmitir. Yoshio Masui, Clement Markert, Dennis Smith ve Robert Ecker 1971de hormonlar uyarlm oositlerden elde ettikleri sitoplazmay G2de duran oositlere mikroenjeksiyonla verdiklerinde yumurtalarn M evresine girdiini buldular. Bu bulgu, uyarlm hcredeki bir faktrn G2den Mye geii salandn gsteriyordu. Bu faktr, daha sonra maturation promoting factor (MPF) olgunlamay ilerleten faktr - olarak isimlendirildi. Yandaki ekilde grld gibi kurbaa oositleri G2 evresinde durduruldu ve mayozun M evresine giri progesteron ile uyarld. Mye geen hcrelerin sitoplazmas G2de duran hcrelere mikroenjeksiyon ile aktarldktan sonra bu hcrelerin M evresine girdii grlmtr.
Maturation promoting factor (olgunlamay ilerleten faktr)n yaps

MPF, iki alt-birimden meydana gelmitir: Cdk: cyclin-dependent kinase (siklin baml kinaz), bir protein kinazdr. Siklin: siklin-baml kinazlar aktive ederek hcre dngsn kontrol eden protein ailesidir.
Siklinler
Siklin olarak isimlendirilmelerinin nedeni hcre dngs srasnda dngsel olarak srekli yaplp yklmalardr. 2 temel snfta incelenmektedirler:
G1/S siklinler. G1den S fazna geii kontrol ederler. -Siklin A/CDK2 S faznda aktiftir. -Siklin D/CDK4, siklin D/CDK6 ve siklin E/CDK2 G1den S fazna geii kontrol eder. G2/M siklinler. G2den M fazna geii kontrol ederler. -Siklin B/CDK1 G2 den M faza geii kontrol eden bir G2/M siklinlerindendir.
Siklinler interfaz boyunca biriken ve mitozun sonuna doru ykalan proteinlerdir

Siklinler, ubiquitin-proteozom sistemi tarafndan yklmaktadrlar.
Siklin baml kinazlar (CDK)

Protein kinazlar olup hcre dngsn kontrol etmektedirler. 34 ila 40 kDa arasnda molekler arlklar olup kinaz domaine sahiptiler. CDKlar substrat proteinleri serin veya treonin amino asitlerinde fosforile eden kinazlardr. Fosforile etmek iin tandklar amino asit dizi [S/T*]PX[K/R]dr. Burada S ve T srasyla fosforil edilen serin veya treonindir; P, prolin; K, lizin; R ise arginindir. Farkl siklin baml kinazlar ve balandklar siklinler yandaki tabloda grlmektedirler.
Siklin baml kinazlar, fosforillenme ve siklinlerin balanmas aktive edilmektedirler. Fakat defosforillenme, siklin ykm veya inhibitr proteinlerin balanmas ile de aktiviteleri sona erdirilmektedir. nhibitr proteinler, Cdk inhibitrleri ya da CDI olarak adlandrlrlar. Aadaki tabloda farkl CDIlar ve inhibe ettikleri Cdk/siklin kompleksleri ve etkiledikleri evreler grlmektedir.
MPFnin Reglasyon Mekanizmalar

MPF, 4 nemli mekanizma tarafndan kontrol edilir: 1. Aktive edici fosforilasyon 2. naktive edici fosforilasyon 3. Siklinler ile kompleks oluturma 4. Cdk/siklin kompleksine inhibitr proteinlerin balanmas (CDI)
Byme Faktrleri, Ras/Raf/ERK sinyal yolla ve D-Tipi Siklinler
Yukarda da bahsedildii gibi hayvan hcrelerinin oalmas, genellikle G1 evresinde bulunan restriksiyon noktasnda eitli hcre d byme faktrleri tarafndan dzenlenir. Byme faktrlerinin yokluunda hcreler G0a girer. Hcre dngsne tekrar girmeleri, ancak byme faktrlerinin varlnda ve Ras/Raf/ERK sinyal yolunun aktivasyonu, bunu takiben siklin sentezi ile gerekleir. Siklinler ksa mrl olduu iin byme faktrlerin uzaklatrldnda hemen paralanrlar ve hcre G1 den Sye geemez ve G0 evresine girer.
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan . The Cell, A Molecular Approach, Geoffrey M Cooper, 2000. Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm
Siklinler Ve Kanser Arasndaki liki Siklin D byme faktrlerinin nemli hedef molekllerinden olduu iin bu proteinin reglasyonundaki bozukluklar kanser hcrelerinin karakteristik zellii olan kontrolsz oalmaya neden olur. Lenfoma, meme ve dier bir ok kanserde, siklin D1in srekli sentezi kanser geliimine katk salamaktadr. Benzer ekilde Cdk4,6/siklin Dye balanan Ink4 Cdk inhibitrlerini inaktive eden mutasyonlar kanserde sklkla grlmektedir.
Hcre Molekler Yaklam. Cooper ve Hausmann. eviri Ed. Meral Sakzl, Nee Atabey. 2006dan . Ayegl TOPAL SARIKAYA, .. Fen Fakltesi, Molekler Biyoloji ve Genetik Blm
2001 Physiology or Medicine Nobel dl Leland Hartwell, Tim Hunt ve Paul Nurse adl aratrclara Key regulators of the cell cycle" almalar iin verildi. Genetik ve biyokimyasal yntemleri kullanarak bu molekllerin siklin ve CDK olduklarn tanmladlar. Bu temel keif biyoloji ve tp alannda derin bir etkiye sahip olmutur. CDK ve siklinler DNA sentezini, kromozom ayrlmasn ve hcre blnmesini kontrol ve koordine eden molekllerdir.
GEN TANIMI VE YAPISI

Terminoloji
Gen - Protein ya da RNA kodlayan DNA segmenti olarak tanmlanr. Bu DNA segmenti iine promoter, intron ve ekzonlar (RNA ya da protein kodlayan ksm), kozak sekans, terminasyon sinyali ve poliadenilasyon sinyali dahildir. Genler, biyokimyasal reaksiyonlara protein ya da enzim sentezini kontrol ederek katlmaktadrlar.
Terminoloji
Genom Bir bireyin tm genetik materyalidir. Transkriptom Transkribe edilmi olan tm nkleik asit sekans setidir. Proteome Genom tarafndan kodlanan protein setidir.
Donny Widianto, Gene Structure, faperta.ugm.ac.id/mikro/Bahan_Kuliah_II/GeneStructure.ppt
DNAnn yalnz bir zinciri transkripsiyon iin kalplk yapar.
Farkl genler farkl zincirlerden transkribe edilebilir.
Genden Proteine
karyotik Gen Yaps
Transkripsiyon AAAAA
poli (A)
Translasyon Protein
UTR = untranslated region translasyona uramayan blge.
Prokaryotik Gen Yaps
Promoter UTR
CDS UTR
Terminator
Genomik DNA Transkripsiyon

mRNA
Translasyon Protein
CDS = coding sequence kodlayan blge UTR = untranslated region translasyona uramayan blge.
Promoter
Hangi zincirin kalp olduunu, Transkripsiyon balama noktasn, RNA polimerazn balanma kuvvetini,
1. 2. 3. 4.
RNA polimerazn balanma skln belirler.
Prokaryotik promoter
Tek tip RNA polimeraz vardr. Pribnow kutusu (TATA kutusu) 10 blgesine yerlemitir (6-7 b ierir) 35 sekans -35 blgesine yerlemitir (6 b ierir).
karyotik promoter
3 adet RNA polymerases gen transkripsiyonunda kullanlmaktadr.

- RNA polymerase I, rRNAlar, - RNA polymerase II, polipeptid kodlayan tm
genleri, - RNA polymerase III, tRNA gibi kk sitoplazmik RNAlar transkribe etmektedir.
karyotik promoter

TATA 30a yerlemitir. 100 ve 200da ek blgeler bulunmaktadr. Enhancer (arttrc) veya silencer (susturucu) gibi DNA blgeleri bulunmaktadr (50 kb uzaklkta bile bulunabilirler).
Promoter

Promoters sekanslar nemli oranda deiebilirler. RNA polymerazlar yzlerce farkl promoter tanyabilirler.
Promoter
Gl promoterlar birok promoter arasndan en ok korunmu olan sekanslar ierirler. Promoter blgesindeki mutasyonlar transkripsiyonu byk oranda azaltmaktadr.
nsan beta globin geni
Terminasyon Blgeleri
Terminasyon blgeleri genin sonlarnda bulunan ve transkripsiyonu sonlandran DNA blgeleridir. Yeni sentezlenen mRNA sa tokas eklinde (hairpin) bir yap olutururlar. Bu da RNA polimerazn DNAdan ayrlmasn salar. Tm terminasyon sinyalleri (hem karyotlarda hem de prokaryotlarda) sekonder bir yap olutururlar.
Terminasyon Blgeleri Terminatr blge RNA polimeraz duraksatr ve ayrlmasn tetikler.
DNA kalp zinciri
TRANSKRPSYON
RNA transkripti
HIZLI RNA KATLANMASI
Katlanm RNA zinciri terminasyona yardmc olur
Splice (Kesim) Blgeleri
Yalnz karyotlarda ve baz arkeobakterlerde bulunur. Yeni transkribe edilen RNAdan kodlamayan blgeleri karr. Splicing, ekirdekte heteronkleer (hnRNA) zerinde gerekleir. Heteronkleer RNAya primer-mRNA da denir, transkripsiyon sonra oluan ilenmemi mRNAdr.
Splice Blgeleri
Korunmu splice blgeleri hem ekzon hem de intron tarafnda bulunmaktadr. 3 donr blge ve 5 akseptr blgelerde farkl bazlar mevcuttur.
Kromozomal DNA
5 kesim kava
3 kesim kava
Splice Blgeleri
5 ve 3 kesim yerlerinde korunan bazlar.
5 kesim yeri
atallanma yeri
3 kesim yeri
Alternatif Splicing
Ayn genden farkl rnler elde edilebilir. Ayn hnRNAnn farkl ekilde splice olmas farkl proteinlerin sentezlenmesine yol aar. Farkl organlarda ve ayn hcrenin farkl geliim evrelerinde ayn hnRNA farkl ekilde splice olabilir.
Kozak Sekans (RBS)

Balama kodonun etrafnda bulunan ve mRNAya kopyalandktan sonra protein sentezinin balama yerinin belirleyen sekanstr.
RBS = ribosome binding sequence, ribozom balama sekans
Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002. M.M. Yusupov et al., Science 292:883896, 2001
Poliadenilasyon Sinyali
Poliadenilasyon, poli (A) kuyruunun mRNAya eklenmesidir. Primer transkript, poliadenilasyon sinyali olan AAUAAA (DNAda AATAAAdr) sekansn tanyan bir endonkleaz ile krlmaktadr. Poli (A) kesim yerinden 20 b yukardadr. Poli (A) kuyruu mRNAy ykmdan korumaktadr ve translasyon verimini arttrmaktadr.
CPSF, kesim ve poliadenilat spesifik faktr PAP, poli (A) polimeraz
Poli (A) kuyruu olduka kullanldr. nk poli (dT) ieren manyetik boncuklar ile mRNA kolaylkla saflatrlabilir. Timin ve adeninler arasndaki komplementer baz elemesi mRNAnn manyetik boncuklara balanmasn salar. Dier RNAlar balanamaz.
Komplementer baz elemesi
David Wishart, Gene Structure & Gene Finding Part II
mRNA zolasyonu
Hayvan dokusu Bitki Hcre kltr
Lizis tampon solsyonunda homogenize et ve santrifjle Manyetik Oligo (dT) partiklleri eklenir
Hcre veya dokular paralanr ve baz kimyasal ile lizis edilerek mRNAnn serbest kalmas salanr.
20 dk.
5 dk
Manyetik izolasyon ve ykama
Oligo (dT) boncuklar eklenir ve A-T balanmas iin inkbe edilir. Boncuklar bir mknats ile aaya ekilir, ykanr ve son olarak saf mRNA boncuklardan aktlr.
15 dk.
Akt ve ktr
Saf mRNA
15 dk.
55 dk.
Deneysel olarak karyotik genleri bulmak

Saflatrlan mRNAlar cDNAya dntrlr ve cDNA bir plazmide klonlandktan sonra sekans analizi yaplr. cDNA (komplementer DNA), mRNAdan sentezlenen DNAdr.
ExPASy Proteomics Server (http://expasy.org/tools/dna.html) veya GenBankas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) gibi veribankalar kullanlarak herhangi bir DNA sekansnn protein kodlayp-kodlamad bulunabilir. Aadaki rnekten ExPASy Proteomics Serverdaki Translate tool program kullanlarak rnek DNA sekans 6 farkl erevede incelenmi ve muhtemel protein sekanslar belirlenmitir.
Translate tool program analiz sonular
Elde edilen muhtemel protein sekans GenBankasndaki Blastp program ile daha detayl incelenebilir. Bu incelemeler sonucunda proteinin daha nce kefedilip-kefedilmedii, hangi organizmaya ait olduu ve grevi hakknda bilgilere ulalabilir. Aada da grld gibi nce protein sekans Blastp programna yklenir ve sol alttaki BLAST butonu tklanr.
Aada analiz sonularnn bir ksm grlmektedir. Bu protein, Arabidopsis thalianadaki bir proteine %100 benzemektedir. Sol taraftaki Accession no tklandnda bu protein hakknda daha detayl bilgiye ulalabilir. Sonu, bu proteinin Arabidopsis thalianaya ait bir proteindir ve grevi henz bilinmemektedir. Fakat, aada dier benzerlik gsterdii proteinler incelenirse proteinin grevi tahmin edilebilir.
GENETK MHENDSL
Genetik mhendislii; gen fonksiyonlar hakknda bilgi elde etmek veya gen transferi ile istenilen karakterlere sahip organizmalar elde etmek iin kullanlan tekniklerin tamamn ifade etmektedir.
Genetik Mhendisliinin Uygulama Alanlar

Endstri atklarn ve kirliliin yok edilmesinde Tarmda daha verimli ve direnli (hastalklara, herbisitler, soua, kurakla vs.) bitki trlerinin gelitirilmesinde
Tipta hastalklarn tedavisinde kullanlan ilalarn gelitirilmesinde (insulin, byme hormonu, antikor, interferon alar, vs.) Proteinlerin aktivitelerini, 3 boyutlu yaplarn veya amino asit dizilerini aratrmak iin yeterli miktarda retmek.
Genetik hastalklarn diagnozunda (tehisinde).rnein, fenilketonuri, kanser, orak hcreli anemi. Genetik hastalklarn tedavisinde Mutasyona uram bir geni normal bir gen ile deitirmek.
DNA klonlanmasndaki temel aamalar

1. 2. 3.
4. 5.
DNAy spesifik noktalarda kran enzimler (restriksiyon enzimler). ki DNA fragmentini birletiren enzim (DNA ligaz). DNAnin kendi kendine oalma yetenei olan tayc DNA molekllerin iine konulmas (plasmid ya da viral DNAlar: klonlama vektrleri). Farkl organizmalardan iki veya daha fazla DNA segmentinin birletirilmesi ile oluan DNA moleklne rekombinant DNA denilir. Rekombinant DNAnn oaltlmas iin test tpnden bir hcreye aktarlmas (bakteri). Milyonlarca bakteri hcresi iinden Rekombinant DNAy ieren hcrenin tespiti.
Klonlamnn Temel Aamalar
Restriksiyon Enzimleri
imdiye kadar 230dan fazla bakteriden 1000den fazla spesifik blgelerde DNA sekansn kran restriksiyon enzimleri kefedilmistir. 4 ile 8 bazdan oluan spesifik sekanslar krmaktadrlar. rnein, Hpa II 4 nt oluan bir CCGG sekansn; Not I ise 8 nt oluan GCGGCCGC sekans krmaktadr. Sekiz ntden oluan sekanslarn DNAda bulunma olasl 4 ntden oluan sekansa gre daha az olduu iin elde edilen fragmentler daha byk olacaktr ve ounlukla tercih edilmezler. Eco RI, Bam HI ve Pst I gibi RE ler tandklar sekanslar krdklar zaman 5 ve 3 de tek zincirli ksmlar brakmaktadr (Yapkan ular); Hind II ve Sma I gibi enzimler ise tand sekansn tam ortasndan krdklar iin blunt ular (kt) olutururlar. Gen klonlanmasnda yapkan u oluturanlar tercih edilmektedir nk blunt ularn DNA ligaz enzimi tarafindan tekrar birletirilmesi ok zordur. Fakat baz zaruri durumlar bu tr enzimler kullanlmaktadr.
Klonlama Vektrleri
Klonlanmak istenilen gen bakteri, maya veya karyotik hcrede snrszoalmas ve protein sentezlenmesi iin iine konulan tayc DNAlara klonlama vektrleri denilir. Plazmidler vektrlere bir rnektir: Plazmid: Bakterilerde bulunan ekstrakromozomal (kromozom dnda olan), kendi kendine replike olmas iin orijin ieren ve antibiyotik diren genleri tayan kk molekllerdir. En ok kullanlan yapay plazmidlerden bir tanesi pBR322dir. Bakteri kromozomunda bamsz olarak replike olmas iin orijine (ori) sahiptir. Bu da bir bakteri iinde birden fazla pBR322 olmasn salar. ki tane antibiyotik diren geni. Bir tanesi plazmidi tayan bakteri kolonilerin besiyerinde bu antibiyotiin olmas durumunda oalmasna olanak verir, dieri ise klonlanmak istenilen genin plazmid iine girip girmediini saptamak iin kullanlr. Ayrica gen klonlamak iin birok restriksiyon enzimi yeri mevcuttur. Bu enzimler ile plazmid alr ve ayni enzimlerle krlm olan genin plazmid iine konulmas kolaylam olur. Maksimum 10 kb kadar olan DNA plazmidlere klonlanabilir.
Genetik Mhendisliinin Bitkilerde Kullanm

Zararl bcekler trilyonlar deerinde rn kaybna neden olmaktadrlar. Eer patateste, patates bcei ile mcadele yaplmadnda %47 olan kayp, mcadele ile %1e inmektedir. Benzer ekilde budayda sne mcadelesi yaplmadnda %90a varan kayplar olumaktadr. Bu nedenlede zararl bcekler ile mcadelede, kimyasal yntemlerle (insektisit kullanm) mcadeleye gidilmektedir fakat kimyasallarn maliyeti yksek olmaktadr ve baz bitki trlerinde istenilen sonular elde edilmemektedir. Gnmzz molekler biyoloji teknikleri ile mcadelede rekombinant gen teknolojisi kullanlmaya baslanmtr bu mcadele ynteminde bcekler zerinde toksik etki yapan proteinlerin (insektisidal proteinler) sentezinde sorumlu genler bitkilere aktarlarak transgenik bitkiler gelitirilmeye allmaktadr.
Retrovirus Aracl le Gen Terapisi

Retrovirs genomu (tek zincirli RNA) Rivors transkriptaz RNA genomu dubleks DNAya evirir Pol: Rivors transkriptaz ve entegraz Gag: kapsid proteini. Env: Zarf proteini
LTR: long terminal repeat (DNAnn kromozoma entegrasyonu iin gerekli)

Gag, pol ve env genleri yabanc bir gen ile deitirilir Yardmc bir hcreye transfer edilerek burada DNAnn virs partiklleri iine paketlenmesi salanr Rekombinant virs partiklleri hedef bir hcreyi enfekte eder ve yabanc DNA hedef hcrenin kromozomuna entegre olur.

A.YerlikayaMolekülerBiyoloji2011 (Sy 68 Den Başla) PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

A.YerlikayaMolekülerBiyoloji2011 (Sy 68 Den Başla) PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

MOLEKLER BYOLOJ

Molekler Biyolojiye Gsterilen lginin Baz Nedenleri

Molekler Biyoloji Alanndaki Baz nemli Bilimsel Gelimeler

Vcuttaki organik vcut arlnn %17si

Proteinlerdeki baz amino asitlerin yaps

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Selenosistein, 21. Amino Asit Ve Salk in nemi

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Proteinlerdeki sekonder yaplarn oluumu

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Tersiyer yap, miyoglobin

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Kuarterner yap: Bir ka altbirimin birlemesi ile oluur, hemoglobin

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Baz nesnelerin ve canllarn boyutlar

Floresans mikroskopisi (devam)

Hcreyi Bileenlerine Ayrmak

Hayvan hcre kltrlerinin elde edilii

ekirdek (nkleus) sitoplazma

Plazma membrannn ilevleri

Hcre iin seici geirgen bir bariyer oluturmas

Hcre iskeletini oluturan filament yaplarnn tutunmas

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Membranlarda grlen balca lipid eitleri

Lipid ift tabakasnda baz fosfolipidler ve kolesteroln dalm

Plazma zar proteinlerinin zar iinde hareketini gsteren deney

Membran Proteinleri ntegral proteinler

arasndaki balanmay u gruplara ayrabiliriz:

N-kaderin, sinir hcrelerinde bulunur.

A) selektinlerin yaps ve B) ilevleri

Aralkl balant -gap junction

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

Aralkl balant -gap junction (devam)

HCRE LE MATRKS ARASINDAK BALANTILAR

A) ntegrinlerin yaps ve B) Fokal adhezyon balants.

Hcreleraras ve hcre-matriks arasndaki balantlarn yerleimi

Thibodeau&Patton; Anatomy&Physiology, 1993.

Aktin filamentlerinin polimerlemesi

Aktin filamentleri (devam)

Aktin demeti ve fimbrin

Aktin filamentleri (devam)

Eritrositlerde hcre iskeletinin plazma zar ile balants

Ara Filamentler (devam)

Keratin proteinin ilevinin deneysel gsterimi

Ara filamentleri oluturan proteinler ve bulunduklar hcreler

EKSTRASELLLER MATRKS (HCRE DII MATRKS)

Bazal lamina bir hcre d matriks rneidir.

Bazal Lamina ve Laminin

Bazal lamina eitleri

A)Laminin yaps ve B) bazal laminadaki dier proteinleri ile etkileimi

Thibodeau&Patton; Anatomy&Physiology, 1993.

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

ENDOPLAZMK RETKULUM (ER)

Vander-Sherman-Luciano; Human Physiology, 2001.

GOLG AYGITI APARATI - SSTEM

Nkleer por kompleksin ekirdek zarnda dzenlenii

Lizozomlardaki hidrolitik enzimler

Protein Trafii ve Snflandrlmas

The Cell, A Molecular Approach. Geoffrey M Cooper.

Endoplazmik Retikuluma Hedeflenen Proteinler

The Cell, A Molecular Approach. Geoffrey M Cooper, 2000.