5

Incertidumbredemedicinen
qumicaanaltica.
Rectadecalibracin
CeliaPuglisi*, FernandoKornblit ,
+
+
* DPNM Departamento dePatrones Nacionales deMedida
CEFIS Centro deInvestigacin y Desarrollo en Fsica
INTI Instituto Nacional deTecnologaIndustrial
CC 157 San Martn (1650) Buenos Aires - Argentina
cpuglisi@inti.gov.ar; ferk@inti.gov.ar
1.INTRODUCCIN
La evaluacin de la incertidumbre de medicin
en la qumica analtica ha despertado en los
ltimosaosun marcadointersyhapromovido
muchas discusiones. Se acepta en general que,
para evaluar si un resultado de anlisis es apto
para el propsito al cual se lo destinar, es
indispensable realizar una estimacin de la
incertidumbredemedicin y compararlacon los
requerimientos correspondientes. Son conocidos
los documentos de referencias en cuanto a la
metodologadeevaluacin deincertidumbres de
medicinengeneral (1), yenqumicaanalticaen
particular (2).
Esta metodologa requiere que se identifiquen
todas las posibles fuentes de incertidumbre
asociadas con el proceso de medicin y que se
estime su valor, ya sea por medios estadsticos
(evaluacin de tipo A), o por otros medios
(evaluacin de tipo B). Posteriormente se
combinan estos componentes individuales para
obtener las incertidumbresestndar y expandida
parael procesototal.
El mtodousualmenteutilizadopor losqumicos
analticos paracalcular incertidumbres haceuso
del concepto de comportamiento global del
mtodo, utilizando informacin del tipo de la
precisin o la recuperacin, obtenida de la
val i daci n del mtodo o por estudi os
colaborativos (3), (4), Estametodologa, lejos de
contraponerse, puede incluirse dentro del
alcance de (1) y (2), para modelos de medicin
adecuados. Sin embargo, el anlisis de las
distintas fuentes de incertidumbre permite
evaluar las etapas del procesodemedicin y, por
1.- INTRODUCTION
There is growingrecognition of the importance
of measurement uncertainty to assuring
reliability of chemical analysis. It is generally
acceptedthat inorder todemonstratefitnessfor
purpose of analytical results it is necessary to
evaluate the uncertainty of measurement and
comparethis value with therequirements. The
referencedocumentsprovidingmethodsfor this
evaluation are well known, both for general
measurements (1) and for chemi cal
measurements(2).
This methodology requires the identification of
all possiblesourcesof uncertaintyassociatedto
themeasurement process and an estimation of
their value, either bystatistical methods(TypeA)
or by other means (Type B). Later on the
individual components are combined to
calculate the standard and expanded
uncertainty for thewholeprocess.
The most popular method generally used by
analytical chemists to evaluate uncertainty is
based on theconcept of "global behavior of the
method", usinginformationsuchasprecisionor
recovery, obtainedduringthemethodvalidation
or from collaborative studies (3), (4). This
method is included in theprocedures described
in (1) and (2), using the proper measurement
model, buttheanalysisofthedifferentsourcesof
uncertainties allows to identify variables that
could have a significant effect on the method
performance. In this way, thecritical steps can
beidentify, controlledandimprovedifpossible.
Uncertainty of measurement in
analytical chemistry.
Calibration line
6
lo tanto, distinguir las quepueden ser crticas,
paracontrolarlasymejorarlassi fueraposible.
Un proceso de medicin tpico en la qumica
analtica instrumental puede, por lo general
dividirse en dos etapas, una en la cual la
muestra se somete a un proceso previo que
puede ser de concentracin, de disgregacin,
calcinacin, extraccin, etc., tendienteaaislar
el analito de inters y a separarlo lo mejor
posiblede la matriz, y otra etapa en la cual la
muestraas procesadasesometealamedicin
en algn equipo previamente calibrado. La
calibracininvolucrael establecimientodeuna
relacinentrelarespuestadel instrumento(por
lo general lineal) y uno o ms valores de
referencia. El proceso de medicin completo,
con los componentes de incertidumbre
relacionadas con cadaetapadel mismo, puede
resumirseenel siguienteesquema:
A typical measurement process in instrumental
analytical chemistry can be conveniently
described in terms of an isolation stage and a
measurement stage. The isolation stage can
involve processes like digestion, evaporation,
solvent extraction, etc., to separate the analite
from the matrix. The next stage consists of a
measurement in an instrument properly
calibrated.
The calibration of the instrument requires to
establish a relationship (usually linear) between
theinstrumentresponse whenareferencesample
ismeasured.
Thisprocesshasbeensummarizedinthefollowing
diagram:
Preparacin de
las disoluciones
de calibracin
Dosaje de las
disoluciones de
calibracin
Medicin de la seal
producida por las
disoluciones
Clculo de la recta
de calibracin
Tratamiento
previo de la
muestra
Dosaje de la
muestra
Medicin de la seal
producida por la
muestra
Clculo de la
concentracin
del analito
Componentes
asociados a
pureza
mediciones
volumtrcas
pesadas
Procesos de
certificacin
incertidumbre
asociada al ajuste
(falta de linealidad)
Incertidumbre
asociada,
estimada por
recuperacin
anlisis de CRM
anlisis de muestras
enriquecidas
Incertidumbre combinada
repetibilidad
del volumen
de inyeccin
repetibilidad
del equipo
Components
Asociated to:
4Purity
4Volumetric
measurements
4Weighing
4Certification
process
Preparation of
calibratig
solutions
Dosage
of the calibrating
solutions
Sample
preparation and
pre-treatment
Uncertainty
estimated using:
4recovery data
4analysis of CRM
4analysis of
enriched samples
Dosage of
sample
Repetibility of
the injection
process
Measurement of
the calibration
responses
Repeatability of
the instrument
Measurement of
the sample
response
Calculation of the
calibration curve
Uncertainty associated to
The fitting
(lack of linearity)
Calculation of the
concentration of
analite
Combined uncertainty
7
Los factores mostrados en cuadros grises
representan componentes de incertidumbre que
afectan aalgunas delas variables deentradaque
sedescribenenestetrabajo.
A continuacin se propone un procedimiento
para la evaluacin de la incertidumbre en la
concentraci n del anal i to, combi nando
adecuadamente todas las contribuciones. En
particular, nohasidohastaahorasuficientemente
discutida en la bibliografa la inclusin de las
incertidumbres asociadas a las concentraciones
delasdisolucionesdecalibracin u otromaterial
de referencia utilizado para calibracin, en el
modelo matemtico utilizado para ajustar la
curvadecalibracin.
Un ejemplodeestetratamientopuedeverseen la
NormaISO6143, recientementemodificada, para
el casodelamedicindecomposicindemezclas
degasespor cromatografagaseosa(5).
En el presentetrabajo no sern considerados los
componentes asociados al tratamiento previo de
lamuestra, los cuales deben discutirseparacada
caso en particular y validarse para cada mtodo
especfico.
Los datos experimentales obtenidos para la
confeccin de la curva de calibracin pueden
expresarsecomo:
2.MODELOASOCIADOALAMEDICION
donde las x representan las concentraciones
asignadas a los materiales de referencia y las y
indicanlascorespondientesrespuestasgeneradas
por el equi po o si stema de medi ci n.
Considerando el caso decomportamiento lineal,
la expresin matemtica para la recta de
calibracines:
n
n
y = a + bx
This paper proposes a procedureto evaluatethe
uncertainty in the concentration of the analite,
adequatelycombiningall thecontributions.
Up to now, the inclusion of the uncertainties
associatedtothecalibratingsolutionsor toother
reference materials used for calibration of the
measuring instrument in the mathematical
model used to fit the calibration curve has not
beenconvenientlydiscussedintheliterature.
An example of this calculation can be found in
the ISO Standard 6143, recently modified,
dealingwith theanalysis of gas mixtures by gas
chromatography(5).
The uncertainty components associated to the
isolation stagewill not bediscussed in this case,
as they should be analyzed in each particular
caseandvalidatedforeachparticular method.
The experimental data obtained for the
calculationofthecalibrationcurveare:
2.- MATHEMATICAL MODEL ASOCIATEDTO
THEMEASUREMENT
wherex designatetheconcentration assigned to
the cal i brati on standards and y the
correspondingmeasuredresponses.
Assumingalinearbehavior:
i
i
( ) ( ) ( )
n n
y x y x y x , ,...., , , ,
2 2 1 1
8
dondeel smbolo
_
significapromedio, (por
ejemplo, y . ),
Se denominar e = y
_
a bx al i-simo
residuo respecto de la recta. Esto es, a la
diferencia, endireccindel eje , entreel punto
(x, y)ylarectadecalibracin.
La desviacin estndar residual dada por la
frmulasiguiente:
i i i
i i
_
y
(2)
indica si es correcto el modelo lineal para
ajustar alosdatos, yasuvezcuantifica(conn-2
grados de libertad) la incertidumbre estndar
asociadaatal ajuste.
Luego de obtener la recta de calibracin, para
determinar la concentracin de la muestra
analizadasemidelamismaen formarepetida,
por ejemplo veces ( ), obteniendo
respuestasy ,...,y .
Finalmente, la concentracin incgnita
(resultadodelamedicin)escalculadacomo
m 1 m
o1 om
(3)
wherethesymbol meansaverage,
(E.g. ) and .
_
To check whether or not thefitting is correct, the
residual atxi canbecalculated: e=y
i i
_
a
_
bx
I
This is the amount by which the actual observed
value differs from the fitted value. This is the
difference, in thedirectionof the axe, between the
value (x, y) and the calibration line (the fitted
value). Theresidual standard deviation is given by
thefollowingformula:
y
i i
Thisvalueindicatesif thepostulatedlinear model
to fit thedata is correct and at thesametimethis
quantitycan beusetoevaluate( with n-2degrees
offreedom)thestandarduncertainty associatedto
suchfitting.
After the calibration curve have been obtained
with the above mentioned procedure, the
concentration of an unknown sample can be
measured gettingthe responses of the measuring
instrument.
If thenumber of measured replicates is m
and the obtained responses are , the
concentration of the sample ( result of the
measurement)canbecalculatedas
( ),
y ,...,y
m 1
o1 om
y se obtiene segn la estimacin usual de
cuadrados mnimos, de acuerdo con las
siguientesfrmulas:
(1)
theleastsquareestimatesarecalculated:
; ;
2
x b y a
S
y x y x
b
x

n y x y x
i i
n y x y x
i i
( )
2 2 2
x x
x
S ( )
2 2 2
x x
x
S
2
2

n
e
s
i
e
b
a y
x

0
0
Como a y b se obtienen de la ec.(1), debe
entenderse que los datos de entrada para el
clculodex sonx ,..., x , y ,...yn, y ,...y .
Por lo tanto, paraevaluar laincertidumbredex ,
debern tenerse en cuenta, por un lado, las
incertidumbres(estndar) individualesasociadas
a cada uno de los componentes de entrada:
u(x ),...,u(x ), u(y ),...,u(y ), u(y ),...,u(y ), as
como tambin las correlaciones entre ellos. Por
otro lado deben considerarse los coeficientes de
sensibilidad (1) asociados a cada una de estas
contribuciones, a fin de combinarlas. La
expresin matemtica de estos coeficientes de
sensibilidadseencuentraenel item3.
Se suponen de aqu en adelante las siguientes
hiptesisparael modelo:
(a) Las componentes de i ncerti dumbre
u(y ),...,u(y ), asociadas a los valores de
obtenidoscomorespuestadel instrumentoparala
confeccin de la recta de calibracin son
consideradas todas del mismo orden y se
designancomou . Encasodequeestasuposicin
no se cumpla, la recta de calibracin debera
obtenerse por el mtodo de cuadrados mnimos
ponderados.
(b) Las componentes de i ncerti dumbre
u , asociados a las respuestas del
equipo de medicin al medir la muestra
incgnita, son consideradas todas del mismo
ordenysedesignancomou
Sesuponequeloscomponentesdeincertidumbre
asociados a los diferentes valores de no sern
siempredel mismoorden.
Existensituacionesen lasquelasincertidumbres
asociadasalosmaterialesdereferenciautilizados
para la calibracin u(x ) son funcin de las
concentraciones x . Asimismo, pueden existir
correlaciones entre las incertidumbres de las
disolucionesdecalibracin, debido, por ejemplo,
o n
o
y
1 o1 om
1 n n o1 om
1 n
0y
i
1
1
o1 om
o
o
i
y
x
(y ),...,u(y )
(c) No hay correlaciones entre los componentes
de alasrespuestas e
.
(d) Nohaycorrelacionesentrelasincertidumbres
asociadasalas e yalasvariables .
incertidumbres asociadas
respuestas
y y
y y x
9
The parameters a y b can be calculated using
eq.(1), andthedatausedtocalculatex are
Toevaluatetheuncertaintyassociatedtox, two
aspectsshouldbetakenintoconsideration:
-The individual standard uncertainties
associated to each set of experimental values
- Thecorrelationbetweenthem
o
o
x ,...,
x , y ,...yn, y ,...y .
u(x ),...,u(x ), u(y ),...,u(y ), u(y ),...,u(y ),
I n order to combi ne these i ndi vi dual
contributions, thesensitivitycoefficientsmustbe
consideredandcalculated(seeitem3).
Fromhereon, thefollowingassumptionswill be
made:
(a) The components of uncertai nty
u(y ),...,u(y ), associated to the y values
obtained for thecalibration lineareconsidered
of thesameorder (avalue u , commontoall of
them). In casethis assumption is not valid, the
calibration line should be calculated using
another model, for instance a weighted least
squarefitting.
(b) The components of uncertai nty
u(y ),...,u(y ), associated to the responses
obtainedduringthemeasurementof thesample
arealsoconsidered of thesameorder (a value
u , commontoall ofthem).
(c) There is no correlation among the
uncertainty components assigned to the
responsesvalues( and values).
(d) There is no correlation among the
componentsof uncertaintyassociatedwith ,
and .
The components of the uncertainty associated
with thequantities arenot necessarilyof the
sameorder.
In some cases the uncertainty values u(x)
associated to the concentration x of the
calibration solutions can beproportional to the
concentration, that is to say, the value of the
1
1
n
o1 om
1 n 1 n o1 om
1 n
y
o1 om
0y
o
o
i
i
i
y y
y y
x
x
3.COEFICIENTESDESENSIBILIDAD
x
Se calculan, de acuerdo a la ref. (1), como las
derivadas parciales del resultadodemedicin,
respectodecadaunodeloscomponentesde
entrada, obtenindose:
o
(5)
Y por lo tanto, de la ec. (2) se obtiene el
coeficienterelacionadoconlasvariables y
i
(6)
(7)
Sumando los cuadrados de todas estas
derivadas parciales, y eliminando trminos de
suma nula, se obtiene la siguiente expresin,
queserreemplazadaenlaec. (4):
(4)
10
3.- SENSITIVITY COEFFICIENTS
Accordingto(1)theycanbeexpressedas:
Consi deri ng equati on (3) the sensi ti vi ty
coefficients related to the variables y can be
expressedas
i
Addingthesquareof all thepartial derivativesand
eliminatingthetermswithnullvalue, thefollowing
expression is obtained, which will be substituted
intoequation(4)yieldingthefollowingformula
uncertaintyassociatedwith verydilutedsolutions
couldbebigger thanthecorrespondingvalueofthe
concentrated solution. In some other cases a
correlation could exist between them and a
correlation coefficient, r , should be used to
indicatethedegree between and .
Takingintoaccount theaboveconsiderations, the
uncertaintyin themeasuredconcentration x can
becalculatedusingthefollowingequation:
ij
i j
o
of correlation x x
al uso deun mismo material dereferenciaque
se diluye sucesivamente o por el uso de un
mismo material volumtrico para preparar
di ferentes di sol uci ones de referenci a.
Llamaremos al coeficiente de correlacin
entrex yx.
Aceptando l as hi ptesi s anteri ores, la
expresin general para la incertidumbre de x
puedeescribirseas:
r
ij
i j
o
( )
( ) ( ) ( ) ( )
j
x u
i
x u
j
x
i
x
o
x
j i
j
x
i
x corr
i
x u
n
i
i
x
o
x
y
u
n
i
i
y
o
x
yo
u
m
j
oi
y
o
x
o
x u

,
_

<
+

,
_

+
+

,
_

,
_

2
, 2
2
1
2
2
1
2
2
1
2
2
2
x
i
i
S n
x x
y
b

( )
1
1
]
1

2
1
1
x
i
i
S
x x x
n y
a
( )( )
1
1
1
]
1

1
1
2
0
x
o i
i
S
x x x x
nb y
x
( )
1
1
]
1

,
_

2
2
2
1
2
1
1
x
o
n
i i
o
S
x x
nb
y
x
11
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
A continuacin se calculan los coeficientes
asociados a los componentes de entrada x en
formasimilar (frmulaaproximada):
i
Y por lotanto:
Adems, similarmentea laec. (7):
Por ltimo, loscoeficientesasociadosa sern: y
io
Dedondesededuceunafrmulasimilar alas ec.
(7) y(10), lacual serreemplazadaenlaec. (4)
Reemplazando los coeficientes de sensibilidad
encontrados deacuerdo alas ec. (7), (9) y (12) en
laecuacin(4), seobtiene:
Inasimilar way, thecoefficientsassociatedwith
theother componentsoftheentrydata canbe
calculatedusingthesimplifiedformula:
x
i
Andthen
Usinganexpressionsimilar toequation(7)
Andthecoefficientsassociatedwith will be y
io
An expression similar to equations (7) and (10)
can and intoequation(4) nowbewritten substitute
Substituting coefficientscalculated
in equations (7), (9) and (12) into equation (4)
thefollowingexpressionisobtained:
thesensitivity
( )
2
x
i
i
S n
x x b
x
b

( )
1
1
]
1

2
1
x
i
i
S
x x x
n
b
x
a
( )( )
1
1
1
]
1

2
0
1
1
x
o i
i S
x x x x
n x
x
( )
1
1
]
1

,
_

2
2
1
2
1
1
x
o
n
i i
o
S
x x
n x
x
mb y
x
i
1
0
0

2
1
2
1
mb y
x
m
j oi
o

,
_

( )
( )
( )( )
( )
( )( )
( )( )
( ) ( )

<

1
1
]
1

1
1
]
1

+
+
1
1
]
1

+
+
1
1
]
1

+ +
j i
j i
x
o j
x
o i
ij
i
n
i
x
o i
y
x
o
yo o
x u x u
S
x x x x
S
x x x x
r
x u
S
x x x x
n
u
S
x x
nb
u
mb
x u
2 2
2
1
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
1 1 2
1
1
1
1 1
12
De aqu se deduce el i nterval o de
incertidumbre expandida (1- ) para x ,
llamado, enlostextosestadsticosintervalode
prediccin(verref.3y4por ejemplo)

o
(14)
Este procedimiento es el nico considerado
habitualmente en la bibliografa estadstica y
aplicado al clculo de incertidumbres en este
tipo de mediciones (ref.8 y 9) Sin embargo,
debemos advertir que el alcance de su
aplicacinestlimitadoal cumplimientodelas
hiptesis mencionadas al comienzo de este
punto, l as cual es no si empre pueden
considerarsevlidas.
4.ANLISISDECASOS
x
x
4.1.CasoI
A partir de aqu, a los efectos simplificar el
clculodeu( ), puedendistinguirsediferentes
casos, de acuerdo a consideraciones sobre las
componentesdeincertidumbre asociadosalos
valoresdelavariable .
Analizandoresultadosexperimentales, pueden
considerarseenal menos4casosdiferentes.
Las i ncerti dumbres asoci adas a l a
concentracin de los materiales de referencia
utilizados para la calibracin u(x ) son
despreciablescomparadoscon u yu , yestos
ltimossonconsideradosdelmismoorden.
o
i
y yo
4. CASEANALYSIS
x
4.1. CaseI
x
Analyzi ng experi mental results obtai ned
performing chemical measurements in different
instruments that require a calibration, different
casescanbeconsidered, takingintoconsideration
the uncertainty values associated with the
calibrationstandards( values)
Theuncertainties associated to theconcentration
of the calibration standards, are negligible
comparedto and . Theuncertaintiesinthe
values are considered of thesameorder and are
estimated statistically, by means of the residual
standarddeviation(equation2) of the calibration
line. Substitutinginequation(13) andeliminating
non significant terms , thefollowingexpression is
obtained
u(x)
u u
i
y yo
Theinterval of expanded uncertainty for
also known as prediction interval can be deduce
fromthisexpression
(1- ) x
o
This procedure is usually found in most of the
publications dealing with statistics applied to
uncertainty calculations in this type of
measurements(7,8).
Itisimportanttopointoutthatthismodel canonly
beappliediftheassumptionsmentionedaboveare
valid, whichnotalwaysholds.
( )
( )
1
1
]
1

+ +
2
2
2
2
2
1 1
x
o e
o
nS
x x
n m
b
s
x u
( )
2
2
2 , 2
1 1
x
o e
n
o
o
nS
x x
n m b
s
b
a y
x t

+ + t

13
(15)
y los grados de libertad efectivos - para la
obtencindel intervalodeprediccinsecalculan
a partir de la frmula de Welch-Satterthwaitte
(G.2.benref. 1), (s ) =n-2,
y (s ) = . El intervalodeprediccin entonces
resulta:
e
m-1

teniendo en cuentaque
e
o
Existen situaciones reales en las cuales el
cumplimiento de la hiptesis u = u resulta
muy poco verosmil. De todos modos, para
verificarlo en una situacin de medicin
particular, puederealizarseun test deigualdad
devarianzas, basadoenel cociente:
y yo
F
conn-2gradosdelibertadenel numerador, ym-1
grados de libertad en el denominador. En los
casos en que la igualdad de varianzas sea
rechazada, debierautilizarselaexpresin (15) en
lugar dela(14).
4.2. CasoII
Lasituacinessimilar aladel caso1peroahorala
componente u asociada a la repetibilidad del
sistema al momento de medir la muestra
incgnita, no puede considerarse del mismo
orden que la componente asociada a la recta de
calibracin, u . Por lo tanto, el primero debe
evaluarse independientemente, por ejemplo a
partir de la desviacin estndar s de las
respuestas repetidas generadas por la muestra,
siempre que el nmero de repeticiones m sea
suficiente. La incertidumbre estndar de x se
calculaentoncescomo:
y0
y
o
o
4.2. CaseII
The situation is similar to case 1 but now the
componentu associatedtotherepeatabilityof
the measurement system when the unknown
sample is measured is significantly different
than theoneassociated to themeasurement of
the variables involved in the calculation of the
calibrationline, u . For thisreason, thefirstone
must be evaluated independently, for instance
fromthestandard deviation soof theresponses
generatedbytheunknownsample, providedthe
number ofreplicatesmislargeenough.
Thestandard uncertainty associated to dex is
thencalculatedas:
y0
y
o
and the effective degrees of freedom
necessary to obtain the prediction interval can
be calculated using the Welch-Satterthwaitte
formula (G.2.b en ref. [1]), taking into
considerationthat =n-2, and
Theinterval ofpredictioncanbewrittenas:


-
(s ) (s ) = .
e
m-1
e o
There are many experimental situations in
which the assumption of does not
apply. Anyway, to check this assumption, a test
of equalityof variances canbeapplied, based
ontheratio
u = u
y yo
F
with n-2 degrees of freedomfor thenumerator
andm-1degreesoffreedomfor thedenominator.
For those cases in which the variances are not
equal, eq. (15)shouldbeusedinsteadofeq.(14).
( )
( )
1
1
]
1

+ +
2
2 2 2 2
2
2
1
x
o e e o
o
nS
x x s
n
s
m
s
b
x u
( )
2
2
2 2 2
2 ,
1
x
o e e o
eff
o
o
nS
x x s
n
s
m
s
b b
a y
x t

+ + t

2
2
o
e
s
s
F
There is not a unique procedure to evaluate the
componentofuncertainty .
Itwill beshownthatitisreasonabletoestimatethis
component usingtheresidual standard deviation
.
Theresidual e can beconsideredastheaddition
of two independent components, or in another
words, twodifferent reasonswhytheexperimental
point is not exactly located on the line
definedbytheequation y=a+bx".
a) One of such components is the deviation
arising from the uncertainty in the reference
materials . This deviation affects the position of
the point in the horizontal direction in a
certainamountrelatedtothestandarduncertainty
.
s
u
e
x
i
(x, y)
e
(x, y)
Since b is the slope of the fitted line, be
representstheequivalent deviation in thevertical
direction. [Fig.1].
i i
i-x
i i
i-x
x
14
No hay una forma nica para evaluar el
componentedeincertidumbre .
A continuacin se mostrar por qu es
razonable estimarlo estadsticamente, a partir
deladesviacinestndar residual s .
Puedeinterpretarseel residuo e comolasuma
de dos componentes independientes, o bien
dos causas por l as cual es el punto
experi mental (x , y ) no se encuentra
exactamente sobre la recta de regresin
y=a+bx.
a) Uno de estas componentes es el desvo e
causado por la incertidumbre asociada a los
materiales referencia . Este desvo afecta al
punto (x , y ) en direccin horizontal y es
cuantificadopor suincertidumbreestndar u .
Dado que es la pendiente de la recta de
regresi n, be representa el desv o
equivalenteendireccinvertical. [Fig. 1].
e
i
i i
i-x
i i
x
i -x
x
b
(16)
4.3.CasoIII
y y
A diferencia de los casos anteriores, las
i ncer t i dumbr es asoci ados a l as
concentraci ones de l os materi al es de
referenci a, u(x ), son consi derados
significativos. Adems, se suponen no
correlacionados entre s y todos del mismo
orden. Es posibleentonces asignarles un valor
global u(x ) = u , que puedeser obtenido del
certificado del material de referencia o bien
teniendo en cuentael proceso depreparacin,
comoen el casodeprepararselas disoluciones
de calibracin por dilucin de algn material
dereferencia(EvaluacindeTipoB).
Paraloscomponentesasociadosa ya , valen
las mismas consideraciones que en los casos
anteriores. En funcin de estas hiptesis, y a
partir delaec.(13), seobtiene:
i
i x
o
4.3. CaseIII
y
y
In thiscasetheuncertaintyof thevalues assigned
tothereferencematerials that havebeen used for
calibration, , arenot negligible. Furthermore,
they are not correlated and all of them are
assumed to be of the same magnitude. A global
value , can then be assigned to all of
them, obtained for instance from the certified
value. In case calibration solutions have been
used, preparedbydilutioninthesamelaboratory,
the uncertainty can be calculated following the
stepsofthepreparationprocedure.
Concerning the components associated to and
, the considerations mentioned in the previous
cases hold. Taking into account the previous
considerations, fromeq. (13)canbeobtained:
u(x)
u(x) = u
i
i x
o
( )
( ) ( )
( )
( )
2
2
2 2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1 1
1 1
mb
u
u b u
nS
x x
n
b
mb
u
nS
x x
n
u
nS
x x
n
b
u
x u
oy
x y
x
o
y o
x
o
x
x
o
y
o
+ +
1
1
]
1

+
+
1
1
]
1

+ +
1
1
]
1

+
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
15
b) Por otro lado, el desvo e asociado a la
incertidumbre que afecta a las respuestas del
instrumento(puntoexperimental y) endireccin
vertical, es cuantificado por la incertidumbre
estndar u .
i-y
i
y
Entonces, cada uno de los residuos puede
escri bi rse e =be +e y, como ambas
componentessonnocorrelacionadas,
eslavarianzadee, lacual puedeser estimadapor
la varianza muestral S . Por lo tanto, en esta
situacin, an pueden utilizarse las ecuaciones
(14)o(15)paraestimar el intervalodeprediccin.
Sin embargo, cuando el nmero de puntos dela
recta de calibracin no es grande, la estimacin
estadstica es poco confiable. Son pocas las
aplicaciones delaboratoriodonden superea5, y
por lo tanto los grados de libertad de tal
estimacinsuperena3. Comomtodoalternativo
paracalcular el componente apartir
delaec. (16), esposibleevaluar u , por el proceso
de certificacin como se mencion mas arriba
(TipoB)ycombinar estevalor conunaestimacin
para u , basada en informacin previa sobre el
equipoosistemademedicin.
Si se comprob que la linealidad del sistema es
buena, el componenteu slopuedeser asociado
a la falta de repetibilidad. En tal caso, este
component e podr a ser est i mado
estadsticamenteapartir demedicionesrepetidas
delarespuestadel instrumento.
Por ltimo la estimacin as obtenida de
Puedeser comparadacon S , amodo
deverificacin.
i i -x i -y
i
e
x
y
y
e
.
2
2
b) On the other side, the deviation arising
from the uncertainty of the response y in the
vertical direction is the standard uncertainty
u .
Each oneof theresidues can then bewritten as
and, considering that both
contributionsarenot correlated, is
thevarianceof e, and can be estimated as the
samplevariance . Inthiscase, eq.(14)or (15)
can still be used to estimate the prediction
interval.
If thenumber of calibration points tobeusedto
fit the linear function are not enough, the
statistical evaluationisnotreliable. Asageneral
rule, thelaboratoriesareusingonlyafewpoints
tofitthecalibrationline, usuallybetween3to5.
As an alternative method for calculating
fromeq. (16), u canbeobtained
fromthe referencematerial certificate and this
value can be combined to obtain u , based on
previous information about the measuring
system.
If the linear behavior of the instrument is
established in the working range, the
uncertainty u is only depending on the
repeatability and it can be evaluated from
replicate measurements of the same reference
material
As a verification, the estimation of
thusobtainedcanbecomparedto .
e
e = be + e
S
S
i-y
i i-x i-y
e
e
i
y
i
x
y
y
2
2
e
i-y
e
i-x
b.e
i-x
y=a+ bx
Punto / point (x
i
,y
i
)
e
i
Fig. 1
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
2 2 2
x y
u b u +
Nosedeberaaplicar lasolucinanterior aesta
situacin, puesto que las incertidumbres
asociadas a los valores de estn altamente
correlacionadas (coeficientes de correlacin
cercanos a 1 para datos de la misma fila de la
expresin17).
Para evaluar, en una situacin particular, si
existen diferencias significativas entre series
de mediciones de muestras diferentes, es
posible realizar un Anlisis de Varianza
(ANOVA) con los I
.
J residuos de la recta de
calibracin. Enel ejemploH5delareferencia1,
para una situacin de medicin totalmente
diferente a la tratada aqu, se propone la
realizacin deun ANOVA, previoal clculode
i ncerti dumbre, como herrami enta para
seleccionar el procedimiento de clculo
adecuado.
Si el Anlisis de la Varianza no revela
diferencias significativas entre residuos
correspondientes a grupos de respuestas
diferentes, sepuededar por vlidalaaplicacin
dealgunodeloscasosanteriores. Encambio, si
se revelan diferencias significativas, la
aplicacin decualquieradeellos subestimara
laincertidumbredel resultado.
x
(17)
4.4.CasoIV
Similar al anterior, perodondecadamaterial de
referencia es medido ms de una vez. Si se
utilizan I materiales de referencia para
determinar la recta de calibracin, midiendo
cada una de ellas J veces, se tienen en total
n = I
.
J puntos experimentales, deacuerdo al
siguientediseo, similar al descritoenel punto
1.5. delaref. 3:
4.4. CaseIV
This case is similar to the previous one but now
each reference material is measured more than
once. Consideringthat I referencematerials have
beenusedtogeneratethecalibrationlineandeach
onehasbeenmeasuredJ times, atotal of n=I
.
J
experimental valuesareobtained, accordingtothe
followingpattern, similar to the one described in
theparagraph 1.5. ofref. 3:
The previous treatment does not apply here
becauseinthiscasetheuncertaintiesassociatedto
the values are correlated with a correlation
coefficient close to 1 for all the data of the same
row.
To evaluate if the differences between series of
measurementsof differentsamplesaresignificant,
an ANOVA (Analysis of Variance) test can be
appliedtothe I
.
J residuesofthecalibrationline.
An ANOVA test before the uncertainty analysis is
proposed in example H5 of reference 1. This
proposal is applied to a totally different
measurement situationbutitissuggestedasatool
toselectanappropriatecomputingprocedure.
If this test does not show significant differences
amongtheresiduesarisingfromthemeasurement
of different reference materials, some of the
previous treatments can be applied. If instead
significant differencesarefound, theconsequence
couldbean underestimation of theuncertaintyin
theresult.
The following figures are showing the plot of
residues obtained duringthedetermination of Cu
by atomic absorption spectrometry. Both
measurements have been performed using the
x
16
( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( )
IJ I I I I I
J
J
y x y x y x
y x y x y x
y x y x y x
, ... , ,
... ... ... ...
, ... , ,
, ... , ,
2 1
2 2 22 2 21 2
1 1 12 1 11 1
Fig. 3. Residuos / Residues
-0.02
0.00
0.02
0 20 40
Concentracin /
concentration
Cuando existan diferencias significativas, en
cambio, debern agregarse a la ecuacin 16 los
trminos referentes a las correlaciones cruzadas
entrecomponentesasociadas avalores dex dela
misma filadela matriz de laexpresin 17. Si se
asigna un valor 1 a estos coeficientes de
correlacin (peor caso posible), y seefectan los
clculos adecuados, se obtiene finalmente la
frmula:
(18)
Las dos figuras siguientes muestran grficos de
residuoscorresponden adeterminacionestpicas
detrazas deCu por espectrometra deabsorcin
atmica con llama. Ambos anlisis fueron
realizadosconel mismoprocedimientoyequipo,
y en el mismo laboratorio. En el ensayo
correspondiente a la figura 2, se prepararon 15
disoluciones, de 5 concentraciones diferentes
(triplicados preparados para cada una de las
concentraciones). En el ejemplodelafigura3, en
cambio, se prepararon slo 5 disoluciones y se
midicadaunadeellaspor triplicado.
En el ltimo caso, el ANOVA arroj diferencias
significativas. Sin embargo, puede ocurrir
tambin, en un ensayo en particular, que el
segundo esquema de medicin genere residuos
que no revelen diferencias significativas entre
concentraciones diferentes. Tales situaciones
puedentratarsepor algunodelosprocedimientos
anteriores
When such result is obtained, the cross
correlation terms should be added to eq. 16,
takingaccount of thecorrelation associatedtox
valuesbelongingtothesame rawofmatrix17.
Assigninga value of 1 ( worst situation) to the
correlation coefficients and performing the
required calculations, the following formula is
obtained:
17
sameinstrument , thesamemethod and in the
samelaboratory.
Theresidues of fig. 2 havebeen obtained when
the calibration curve was calculated using 15
different calibration solutions of 5 different
concentrations. (3for eachconcentration).
In the example of fig. 3, 5 solutions have been
preparedandeach oneof themmeasuredthree
times.
In this last example, the ANOVA test shows
significantdifferences.
( )
( ) ( )
( )
2
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1 1
1 1
mb
u
u b
J
u
IS
x x
I
b
mb
u
IS
x x
I
u
nS
x x
n
b
u
x u
oy
x
y
x
o
y o
x
o
x
x
o
y
o
+

,
_

+
1
1
1
]
1

+
+
1
1
1
]
1

+ +
1
1
1
]
1

+
Fig. 2. Residuos / Residues
-0.02
0
0.02
0 20 40
Concentracin /
Concentration
Where .
Thisprocedurehasbeendescribedinref. 5.
5.CONCLUSIONES
Es evidente que los casos precedentes no
abarcan todas las situaciones posibles de
medicin que requieren la confeccin de
rectasdecalibracinenlaboratoriosanalticos.
Un caso no tratado aqu es aqul en que las
incertidumbres en las x no pueden ser
consideradas despreciables y no son todas del
mismo orden, sino, por ejemplo, funciones de
laconcentracindelasolucindereferencia.
En otras si tuaci ones, l a hi ptesi s de
incertidumbre estndar constante, u , para
todoslospuntosdelarectadecalibracin, noes
razonable. En otroscasosesnecesario recurrir
amodelosderegresinnolineales. Cadaunode
estos casos puede ser analizado en forma
similar a la expuesta y la ecuacin (13) puede
servir depuntodepartida.
Por lo antedicho, este enfoque es el inicio de
unaseriedetrabajos deaplicacin adiferentes
y
En forma si mi l ar al caso anterior, el
componente de(18) puedeser
estimadoestadsticamentepor
Donde .
Este ltimo procedimiento de clculo, fue
utilizadoenlaref.5.
Nteseque no es otra cosa que la
varianza de cada uno de los I promedios
. Por lotanto, laltimafrmulaes
equivalenteala(16) si setrabajadirectamente
con las respuestas promedios de cada grupo.
Estoes, conlossiguientesdatosdeentrada:
It is important to notice that the value
is the variance of each of the I average
. Takingthis in consideration, this
formula isequivalent toeq. (16) when theaverage
of the responses are used. This is to say that the
entrydataare:
Theexpression fromeq. (18) can be
estimatedstatisticallyby
2 2 2
x y
u b J u +
5. CONCLUSIONS
Itisevidentthattheabovementionedcasesarenot
including all the possible situations that could
appear in the chemical laboratory when a
calibration curveis calculated fromexperimental
data collected in different instruments and using
differentreferencematerials
As an examplethat has not been discussed here,
we can mention a measurement in which the
uncertainty of the reference materials are not
negligible and not all of them are comparable (
sameorder ofmagnitude)
There are also experimental situations in which
thestandarduncertainty, u for all thecalibration
points cannot be considered constant or other
situations in which non linear regression models
shouldbeused.
Each one of this cases should be analyzed
individually and the eq. (13) can be used as the
basicexpression.
y
18
J y y
j
ij i

J y y
j
ij i

J u
y
2
J u
y
2
( ) ( ) ( )
I I
y x y x y x , ,...., , , ,
2 2 1 1
2 2 2
x y
u b J u +
I
e
s
i
e

2
2
i i i
bx a y e i i i
bx a y e
problemas. Creemos que el analista debe, en la
validacin de un mtodo de ensayo, o an en el
anlisiscotidiano, confirmar quhiptesis delas
mencionadas pueden razonablementecumplirse
y, en funcin deellas, elegir el procedimiento de
clculoadecuado.
6.REFERENCIAS
1.- Guide to the Expression of Uncertainty in
Measurements (BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC,
IUPAP,OIML) 2da. Ed., 1993. ISBN92-67-101889.
2. Quanti f yi ng uncertai nty i n anal yti cal
measurement, EURACHEM/CITAC Guide, 2nd.
edition.
3. Uncertainty of measurement: Implications of its
use in Analytical Science, Analytical Methods
Committee, The Royal Society of Chemistry,
Burlington House, Piccadilly, London.Analyst,
Sept. 1995, vol 120, pg2303
4. Using validation data for ISO measurement
uncertainty estimation, S.L.R. Ellison, V.J.
Barwick,Analyst, June1988, Vol. 123pg. 1387.
5. GasAnalysis- Determinationof thecompositionof
calibrationgasmixtures. NormaISO6143.
6. Drapper,N.R. Smith, H., Applied Regression
Analysis, J. Wiley&Sons1st. ed., 1966
7. Anderson. Practical Statistics for Analytical
Chemistry, VanNostrandReinholdCo.,N.Y.
8. Synek,V, Subrt, P. Marecek, J. Uncertainty of
mercury determinations in biological materials
using an atomic absorption spectrometer AMA
254. AccreedQualAssur (2000) 5:58-66
9. Norma I SO 8466-1: 1990. Water qual i ty
Calibration and evaluation of analytical methods
andestimationof performancecharacteristics.
Part 1: Statistical evaluation of the linear
calibrationfunction.
According to the above discussion, this
approachisthestartingpoint for theanalysisof
di fferent experi mental condi ti ons and
measurementmethodstowhichthiscalculation
schemecanbeapplyandadapted.
The analytical laboratory should decide which
working hypothesis are applicable in the
measurements under consideration and decide
whichcalculationprocedureisadecuate.
6. REFERENCES
1.- Guide to the Expression of Uncertainty in
Measurements (BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC,
IUPAP, OIML) 2da. Ed., 1993. ISBN 92-67-
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