1 INTRODUO

Vivemos o dia-a-dia sem entendermos quase nada do mundo. Pouca ateno damos ao mecanismo que gera a luz do Sol e possibilita a vida; a gravidade que nos cola Terra, que de outra forma, nos lanaria em rotao pelo espao; ou aos tomos do que somos feitos e de cuja estabilidade

dependemos fundamentalmente. Stephen W. Hawking, 1988.

O sculo XX foi caracterizado por um grande desenvolvimento e difuso do conhecimento humano, sendo que o fator mais decisivo neste processo foi o uso dos meios de comunicao. O desenvolvimento de novos modelos de transmisso da informao distncia tambm resultou em um menor tempo entre a descoberta cientfica e o seu uso. Dentre os mais diversos ramos de pesquisa cientifica encontramos aqueles que se dedicaram ao estudo da matria, em suas formas e funes. Ao buscar o domnio sobre a matria, a cincia deparou-se com novos universos e novos paradigmas, que desencadearam novos sub-ramos do conhecimento cientfico. Neste prembulo podem-se imaginar muitos mundos paralelos com suas dimenses fsica e qumica e, dentre esses, o mundo microscpico, onde um infinito nmero de substncias so sintetizadas ou modificadas por intermdio do metabolismo biolgico de animais ou vegetais. Sabe-se que o ecossistema que envolve o planeta Terra uma incessante fbrica destas molculas, as quais possuem as mais variadas formas, tamanhos e funes. Foram alguns cientistas brilhantes como: Aristteles; Lavoisier, Dalton, e

Leonardo da Vinci, que ao se colocarem fora de seu tempo cronolgico, iniciaram a observao desses pequenos fatos ou fenmenos e que fizeram destas simples observaes uma cincia complexa. Mais de cem anos se passaram deste ento e atualmente possumos tecnologia para a manipulao e aplicao de muitas destas biomolculas. Dentre elas, encontram-se os polmeros naturais, que so largamente utilizados pelo homem para a sua sobrevivncia e conforto. Graas aos recentes avanos da tecnologia pode-se isolar, purificar, modificar e otimizar processos envolvendo molculas orgnicas e bioinorgnicas. Assim, so inmeros os monmeros ou polmeros de origem natural que esto sendo aplicados nas indstrias de alimentos, txtil, farmacutica, papeleira, de resinas, tintas, plsticos, couro, membranas orgnicas e outros artigos manufaturados (FINCH & ROBERTS, 1985). Nesse cenrio, uma das matrias-primas naturais de maior interesse sociedade humana tem sido a fitobiomassa, particularmente devido ao seu carter renovvel. Esta biomassa vegetal constituda majoritariamente por polissacardeos (amido, celulose e hemicelulose) e um polmero fenlico (lignina), formando um compsito biodegradvel que pode ser convertido em alimentos, raes, combustveis lquidos e insumos para a indstria qumica (BULOCK & KRISTIANSEN, 1991). Dentre as diversas aplicaes de fibras celulsicas destacam-se as indstrias txteis e de papel e celulose (CAVACO-PAULO, 1997; POMMIER et al., 1989; 1990). De um ponto de vista txtil, o termo fibra tem sido aplicado em um sentido vago, seja para indicar plos unicelulares, como a fibra do algodo, ou feixe de tecidos multicelulares, como a fibra do sisal. A importncia das chamadas fibras txteis remonta ao homem primitivo, e as suas necessidades bsicas de se proteger. Todavia, apesar de sua importncia econmica e social, esse segmento no foi abordado no presente estudo. Por outro lado, a indstria de celulose e papel a mais importante dentre todas aquelas dedicadas qumica de fitobiomassa, sendo que os dois mercados juntos foram responsveis por 3,2% das exportaes brasileiras no ano de 2000,

conforme resenha anual da Gazeta Mercantil (2001). Os mercados de celulose e papel atualmente se encontram fortemente globalizados e neles difundido o uso de fibras celulsicas de pinus e eucalipto. Em um passado no muito distante, tnhamos a Europa e a Amrica do Norte como os principais mercados produtores e consumidores de celulose e papel, mas, embora esta liderana esteja ainda sendo mantida, pases emergentes tm mostrado forte influncia no mercado mundial. Dentre esses podemos citar o Sudeste Asitico (com sua economia em crescimento acelerado) e a Amrica do Sul, onde o Brasil se destaca como maior fornecedor de fibra de eucalipto (madeira dura). Estas variaes esto cada vez mais definindo o futuro dos mercados de celulose e papel, que crescem incessantemente. Atualmente, estimativas publicadas pela Carteira de Exportao do Banco do Brasil (http://www.bcb.gov.br) indicam uma movimentao anual de 100 bilhes de dlares e que dever dobrar at o ano de 2005. Calcula-se que em vinte anos, o consumo de papel e papelo dever ser expandido para aproximadamente 200 milhes de toneladas/ano. Esta viso de mercado transporta o Brasil para uma posio invejvel no contexto mundial. Portanto, transformaes no perfil do setor industrial brasileiro de celulose e papel so previstas para mdio e longo prazo, onde a estratgia bsica a de associao de empresas, com um nico objetivo central: ganhos de escala e de mercado. por isso que a indstria de celulose e papel foi considerada estratgica pelo BNDES, tendo sido a segunda colocada no ranking de grandes financiamentos concedidos por este banco em 1996. Com efeito, as exportaes de celulose de eucalipto cresceram no ano de 2000 em 25% e a de papelo ondulado, em 95%, segundo informe da GAZETA MERCANTIL (2001) em seu caderno especial de final de ano. Para tanto, foi imprescindvel o desenvolvimento tecnolgico da rea para fazer frente aos preos praticados pelos demais pases competidores. Por ser a celulose uma fonte abundante na natureza, sua utilizao biotecnolgica sugere muitas possibilidades baseadas em processos hidrolticos e/ou

fermentativos. Porm, mesmo com toda tecnologia, ainda no conhecemos totalmente os vrios mecanismos que ocorrem durante a degradao da celulose e quais so de fundamental importncia para a biotecnologia industrial. A importncia scio-econmica da biotecnologia pode ser ilustrada pelo valor associado ao seu mercado mundial em 2000, estimado em torno de 6 bilhes de dlares somente no comrcio de enzimas aplicadas a indstria. Esses nmeros representaram um crescimento de 20% em relao a 1999 (GAZETA MERCANTIL, 2001). O mercado brasileiro de enzimas, embora seja tipicamente importador e pequeno frente ao mercado mundial (cerca de US$ 160 milhes), apresenta grande potencialidade, sobretudo considerando-se a enorme disponibilidade de resduos agroindustriais. A eficincia com a qual a celulose hidrolisada depende de mltiplos fatores que envolvem, dentre muitos, as caractersticas do substrato e a natureza do sistema enzimtico. Portanto, para se entender quais os mecanismos relacionados ao processo, necessrio que se conhea a estrutura supramolecular das protenas (enzimas) e do substrato lignocelulsico (fitobiomassa), assim como as modificaes realizadas sobre as propriedades mecnicas das fibras. Utilizam-se para esta finalidade tcnicas analticas de carter fsico e/ou qumico, onde os dados gerados fornecem os subsdios para uma melhor interpretao das interaes que ocorrem entre estes biocatalisadores e a biomassa lignocelulsica. O governo brasileiro, segundo nota divulgada pelo ministro de Cincia e Tecnologia durante o Forum de Biotecnologia e Biodiversidade (Braslia/1999), tem como uma de suas principais polticas apoiar o desenvolvimento biotecngico em nosso pas. Para tal, inclui a biotecnologia como prioridade em seu Plano Plurianual de Governo, denominado Avana Brasil - 2000-2003 (vide http://www.mct.gov.br). Foram mais de 270 milhes de reais adicionais s linhas de fomento, a serem aplicados nos prximos quatro anos com objetivos especficos de conservar recursos genticos e desenvolver produtos e processos biotecnolgicos relevantes para a produo

industrial, agropecuria e relativa sade humana. Sabe-se que o Brasil possui uma imensa biodiversidade e, portanto, cabe ao governo definir o futuro da biotecnologia, pois dele dependem as aes de controle e utilizao de tecnologias que assegurem qualidade ao homem e ao meio ambiente. No entanto, o sucesso dessa iniciativa depende do reconhecimento de que a biotecnologia uma cincia inerentemente multidisciplinar e que seu desenvolvimento induz aos estudos de bioprocessos no mais com um carter especificamente bioqumico ou de cincia pura, mas como uma cincia onde os preceitos de engenharia esto intimamente ligados aos demais ramos do conhecimento humano (BULOCK & KRISTIANSEN, 1991). Finalmente, a sociedade como um todo tem uma importante parcela de responsabilidade ao acompanhar, junto aos seus governos, a criao de novas formas de uso de seus recursos naturais que sejam perfeitamente adaptados s suas necessidades tecnolgicas e culturais. Acreditamos no livre arbtrio dos povos quanto gesto de seus recursos naturais e de tecnologias disponveis para um desenvolvimento slido e sustentvel. No podemos esquecer os riscos que novas tecnologias, quando utilizadas sem os protocolos de estudos adequados, podem oferecer ao homem. Portanto, o desenvolvimento de novas tecnologias somente poder ser aceito pela sociedade quando estiver aliado a um compromisso de no agredir, sob qualquer forma, o direito dos indivduos, a sua liberdade de escolha e o seu compromisso com as geraes futuras.

2 OBJETIVOS

O presente trabalho est voltado ao estudo de aspectos biotecnolgicos e bioqumicos da aplicao de Preparaes Celulsicas de cepas de Trichoderma reesei Recombinado (PCTrR), cujo desenvolvimento foi baseado em quatro etapas: A) na primeira, o objetivo foi de caracterizar o modo de ao cataltica das preparaes celulsicas derivadas de cepas recombinantes de T. reesei e comparar as suas eficincias com o complexo enzimtico secretado por uma cepa industrial de alto rendimento; B) na segunda, nfase foi dada separao e caracterizao do perfil

protico constituinte das preparaes, empregando mtodos de cromatografia lquida de baixa presso e de determinao da atividade especfica presente em cada alquota isolada a partir das PCTrR; C) na terceira, a inteno foi de investigar o modo de ao das PCTrR, em alta carga protica, sobre a composio qumica e estrutural de polpas kraft branqueadas de pinus, com nfase na caracterizao do efeito obtido sobre o grau de polimerizao e a cristalinidade da celulose; D) na quarta e ltima etapa, o objetivo foi de investigar o efeito das PCTrR, em baixa carga protica, sobre as propriedades mecnicas de polpas kraft branqueadas de pinus e de eucalipto, visando avaliar a viabilidade destas como biocatalisadores no processo de fabricao de papel e celulose.

3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 FIBRAS CELULSICAS Os recursos celulsicos disponveis na natureza so estimados em 324 bilhes de metros cbicos (m3), sendo que a produo mundial dessa biomassa gira em torno de 4.1010 toneladas por ano (FAN et al., 1987; DURAN et al., 1995). Sabe-se que 50% desse valor convertido dixido de carbono e esse processo de biotransformao realizado por microrganismos que degradam naturalmente o material lignocelulsico, cuja composio qumica majoritariamente composta por por trs componentes orgnicos de elevada massa molecular, a celulose, a hemicelulose e a lignina (BROWN, 1985; FENGEL & WEGENER, 1989). O termo fibra empregado quando as clulas esclerenquimatosas esto na forma prosenquimatosa, ou seja, o seu comprimento igual a muitas vezes a sua largura. Dessa maneira, de um ponto de vista estritamente histolgico, o termo fibra tem sido usado para designar uma grande variedade de clulas, vegetais ou animais, que se caracterizam por uma forma alongada e parede secundria espessa (AFONSO et al., 1991; BAUER et al., 1973 ). As fibras naturais de celulose tm sido muito utilizadas pelo homem por possurem razovel resistncia mecnica e baixo custo de produo, quando comparados com compsitos sintticos. Esta resistncia deve-se a regies celulsicas cristalinas que esto associadas em filamentos, os quais so envolvidos por uma matriz amorfa que aglutina estas fibras (lignina), mantendo-as juntas e definindo os diversos formatos e estruturas bsicas da fitobiomassa. A compatibilizao da interface entre estes dois elementos feita pela hemicelulose, atravs de ligaes covalentes com o agente aglutinante (lignina) e interaes fsicas com a estrutura bsica da celulose. Na Figura 1, pode-se observar as disposies destes constituintes na fibra (HIGUCHI, 1985).

A celulose compe a maior parte dos tecidos vegetais, perfazendo aproximadamente a metade dos componentes constituintes das madeiras, tanto em gimnospermas (conferas ou madeiras moles) quanto em angiospermas (folhosas ou madeiras duras) (FENGEL & WEGENER, 1989).
FIGURA 1 - REPRESENTAO DE UMA RAMA DE FIBRAS DE CELULOSE DE MADEIRA E A DISTRIBUIO DE SEUS PRINCIPAIS CONSTITUINTES ESTRUTURAIS (ADAPTADO DE FENGEL & WEGENER, 1989)

A sntese da celulose no executada nica e exclusivamente por vegetais, pois tambm encontrada em organismos Eucariontes e Procariontes, incluindo bactrias, protistas, algas e alguns animais. Um exemplo de sntese efetuada por procariontes a bactria gram-negativa Acetobacter xylinum, que produz biofilmes de celulose cujas propriedades vm sendo motivo de uma variedade de aplicaes na indstria mdica, farmacutica e de alimentos (FONTANA et al.,1997; CHANZY, 1990). J os Eucariontes, como as algas, apresentam uma maior diversificao quando comparada com os Procariontes. A Valonia ventricosa e a Boergesenia forbesi tm membranas celulares de natureza celulsica, enquanto que as carapaas Tunician halocythya rooretzi, um tipo de inverterbrado marinho, possuem um teor considervel de celulose (ATALLA, 1993). Curiosamente, os mamferos, incluindo o homem, tambm podem ter a capacidade de sintetizar celulose. MARROM (1979), j discutiam esta possibilidade, porm mantendo uma distncia do enfoque dos botnicos, afirmando que somente sob circunstncias patognicas, como o caso do

escleroderma, ocorre a sntese da celulose nos seres humanos. Na anlise evolutiva do reino vegetal, partindo das algas para as plantas multicelulares mais complexas, a celulose executa o papel preliminar de um material de reforo. Tal papel complementado pela associao hemicelulose e lignina, que define uma maior resistncia do todo, permitindo o desenvolvimento de plantas multicelulares de grande porte (ASHFORD & NEUBERGER, 1980). A quantidade da celulose encontrada em vegetais e outros organismos varia significativamente, desde os 95 a 99% do algodo e os 80 a 85% da fibra de rami at a faixa dos 20 a 25% de vrios tipos de bactrias, protozorios e algas-marinhas (BAUER et al., 1973; NULTSH, 2000). Nas paredes das clulas de vegetais superiores, o teor de celulose varia de 40 a 50%, sendo que fibras vegetais como o algodo podem apresentar teores de at 90 a 100% (BUCHERT & HEIKINHEIMO, 1998; PONER, 1999). Por outro lado, as paredes primrias apresentam at 20% de celulose em sua composio, enquanto que nas paredes secundrias esse valor pode se aproximar de 100%. As caractersticas macro-estruturais mais importantes das fibras esto associadas ao sentido e direo que estas assumem no momento da sua formao, pois destas disposies resultam resistncias mecnicas distintas e propriedades qumicas diversas (Figura 1). Por exemplo, fibras do tronco de rvores no possuem a mesma resistncia trao longitudinal e compresso do que aquelas oriundas do talo de um mesmo vegetal (KEEGSTRA et al.,1973). A morfologia das fibras vegetais tem sido alvo de inmeros estudos desde o sculo passado. Porm, ainda encontramos dificuldades na literatura especializada em esclarecer completamente os mecanismos biossintticos de formao das fibras e de definio de sua ordem estrutural (VICENT, 1999; BROWN, 1985; BROWN et al.,1996). Por exemplo, ainda hoje existem dvidas de como a clula controla e regula a polimerizao das cadeias de glucose, o tamanho das microfibrilas formadas, sua orientao e expanso durante os diferentes ciclos de crescimento da clula (DELMER

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et al., 1985; MARROM, 1979). Segundo VINCENT (1999), o melhor modelo at hoje apresentado para a produo de celulose foi proposto por PRESTON em 1974 e apresenta as enzimas sintetizadoras (Rosettes) arranjadas de maneira hexagonal em ramas de 100 ou mais, encaminhando-se ao redor da membrana celular e deixando para trs uma srie de microfibrilas, cada qual com aproximadamente 40 cadeias de celulose, 5 m de dimetro e 20 m de comprimento (KARR, 1976; KIERMAYER & SLEYTR, 1979; MUELLER, 1982). Em geral, as clulas vegetais so constitudas de membrana celular, lamela mdia, parede primria e/ou secundria e citoplasma (Figura 2), o qual contm substncias solveis e insolveis responsveis pela nutrio das plantas (CHAFE, 1970; NULTSCH, 2000). Observa-se nesta figura a organizao da parede celular de fibras celulsicas, bem como as suas subdivises . A espessura da parede celular varia entre 0,1m e vrios micrometros, no sendo estas to seletivas quanto as membranas celulares (FRY, 1986; VIAN & REIS, 1991).
FIGURA 2 CORTE TRANSVERSAL DA PAREDE CELULAR DE CLULAS VEGETAIS (A), ESTRUTURA MORFOLGICA DE FIBRAS VEGETAIS ORIUNDAS DE MADEIRA (B) (MODIFICADO DE FENGEL&WEGENER,1989)

(A)

(B)

Durante o desenvolvimento da parede secundria, as camadas denominadas de lamelas S1, S2 e S3 se orientam paralelamente umas s outras. No entanto, a

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orientao das microfibrilas que compem as lamelas pode mudar de camada para camada, com alteraes nos ngulos do plano cristalino da celulose. Frequentemente, em paredes celulares muito fortes como no algodo, as microfibrilas esto arranjadas ao longo do eixo das clulas como um parafuso (ROLAND & VIAN, 1979). Por outro lado, alguns autores relataram que, aps a diviso celular, as clulas na regio de crescimento se expandem em apenas uma nica direo (VICENT, 1999).

3.2 ESTRUTURA QUMICA DAS FIBRAS CELULSICAS Como j foi visto no captulo anterior, as paredes das clulas de plantas superiores contm celulose (polissacardeo de elevada massa molecular), hemicelulose (que contm uma quantidade variada de polissacrardeos como as xiloglucanas, arabinoglucanas, rhamnogalactanas e glucomananas) e lignina, um polmero fenlico composto por uma estrutura randmica (TALMADGE et al., 1973; NEVELL, 1985; SARKO, 1986). A Figura 3 apresenta esquematicamente uma tpica distribuio destes materiais na parede celular de Pinus sp. (modificado de GANDINI, 1992).
FIGURA 3 - MOLCULAS DE CELULOSE NA MADEIRA E SUA COMPOSIO AO LONGO DA ESTRUTURA CELULAR

A reatividade qumica e/ou microbiolgica de polissacardeos da

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fitobiomassa orientada basicamente pela sua organizao supramolecular, que resulta em um arranjo espacial que permitir ou no as interaes moleculares. Em referncia estrutura qumica propriamente dita, tem-se que: os grupos hidroxilas podem reagir com agentes de adio, substituio e oxidao; os grupos acetais podem sofrer hidrlise tanto em meio cido como em meio alcalino; e os grupos aldedicos terminais podem ser reduzidos para grupos alcolicos, oxidados carboxilas, ou, quando na presena de lcali, rearranjados para formar grupos terminais alcolicos ou carboxlicos. A reatividade em processos de hidrlise enzimtica de materiais lignocelulsicos inclui tambm propriedades como o tamanho, a forma, a porosidade, o grau de polimerizao da celulose e/ou hemeceluloses, a rea superficial, a associao com compostos no celulsicos e a sua organizao molecular ou ndice de cristalinidade (WONG et al.,1988 ; RAMOS, 2001). A seguir so apresentadas algumas das principais caractersticas qumicas da celulose, das hemiceluloses e da lignina.

3.2.1 Celulose A celulose considerada o composto orgnico de maior importncia na natureza por constituir a base estrutural da parede celular as plantas. Como os vegetais correspondem maior parte dos organismos vivos existentes na crosta terrestre, a celulose tambm o polmero de maior ocorrncia natural (WOOD, 1991). A celulose um homopolmero linear, composto basicamente por unidades de glucose que se unem atravs de ligaes glicosdicas do tipo -(1,4), ou seja, entre os carbonos C1 e C4 da D-glucopiranose. No entanto, a anlise conformacional da celulose indicou que a celobiose (4-O--D-glucopiranosil--D-glucopiranose), e no a glucose, a sua unidade estrutural bsica (ATALLA et al., 1984). Devido a posio (equatorial) das hidroxlas constituintes do anel hemiacetlico, h uma tendncia

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estrutural linearidade destas cadeias, permitindo com que se forme uma rede intra- e intermolecular de ligaes de hidrognio envolvendo principalmente o oxignio hemiacetlico e as hidroxilas ligadas aos carbonos C-3 e C-6 do anel (FENGEL & WEGENER, 1989). Apesar da molcula de glucose possuir grupamentos hidroxlicos nas duas extremidades, o grupamento ligado ao carbono 1 (C1) possui poder redutor, enquanto que o outro terminal (C4) chamado de no redutor (FRANZ & BLASCHEK, 1990). As molculas adjacentes de celulose formam inicialmente as fibrilas elementares, que correspondem a um agregado composto de aproximadamente 40 unidades macromoleculares altamente organizadas entre si. Por sua vez, fibrilas elementares organizam-se entre si formando as microfibrilas, cujo dimetro mdio encontra-se em torno de 20 a 30 nm (BOKER & MILLES,1997; RAMOS, 1992b). Finalmente, a fibra de celulose, tal qual comercializada para a confeco do papel, formada por uma rede de microfibrilas insolveis em gua que apresentam regies cristalinas e amorfas, estruturalmente amalgamadas pela intervenincia de

hemiceluloses e protolignina (BROWN et al., 1996; KIERMAYER & SLEYR, 1979; HERTH, 1983). Detalhes sobre estes polmeros amorfos, que constituem a parede celular da fibra vegetal, encontram-se apresentados no tem 3.2.2 e 3.2.3. De um modo geral, a estrutura de celulose pode ser definida em termos de trs nveis organizacionais (Figura 4) (ATALLA, 1993): a) primeiro nvel: definido pelas ligaes covalentes, correspondendo a um homopolmero de anidroglucose interligado por ligaes do tipo -(1,4); b) segundo nvel: descreve a conformao molecular, que caracterizada pelas distncias interatmicas e seus respectivos ngulos, bem como pelas ligaes de hidrognio intramoleculares; c) terceiro nvel: define a associao das molculas, formando uma estrutura cristalina, que depende das ligaes intermoleculares de hidrognio. Portanto, apesar da celulose ser um polmero relativamente simples, as

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microfibrilas, quando unidas, formam um complexo muito difcil de ser analisado, composto por cadeias lineares interligadas no covalentemente que resultam em um compsito quimicamente estvel e extremamente insolvel (MARCHESSAULT & SUNDARAJAN, 1983).
FIGURA 4 - REPRESENTAO DO MODELO ESTRUTURAL DAS LIGAES DE HIDROGNIO E DA MOLCULA DE CELOBIOSE, SUAS DISTNCIAS INTRAMOLECULARES E A NOMENCLATURA DOS TOMOS DA CELULOSE EM RELAO AOS NGULOS DIHIDRAIS

A massa molecular da celulose representada na forma de seu grau de polimerizao (GP) cujo valor mdio se encontra na faixa de 1.000 a 15.000 unidades de anidroglucose (AnGlc) ou 162.000 a 243.000 unidades de massa atmica (Daltons). A origem e a degradao da amostra, bem como o contedo empregado para a determinao do GP, tm influncia marcante sobre o valor obtido. Por exemplo, nas paredes primrias das clulas vegetais encontram-se -(1,4)-D-glucanas com aproximadamente 6.000 unidades de AnGlc, enquanto que na parede secundria, este nmero aumenta para o intervalo de 13.000 a 16.000 unidades (FENGEL & WEGENER, 1989; FINCH & ROBERTS, 1985). Sabe-se por cristalografia de raios-X que a unidade repetitiva de celobiose possui um comprimento de 10,28 nm. Portanto, o comprimento total de uma cadeia de

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celulose de 10.000 unidades de AnGlc ser de aproximadamente 5 m. Como a unidade cristalina da celulose apresenta um comprimento de aproximadamente 8 a 25 nm (KUGA & BROWN, 1987), presume-se que esta macromolcula participe de vrios cristalitos formando uma espcie de rede neural, onde a poro amorfa corresponderia s interligaes destes blocos construtivos de alta organizao molecular. A complexidade da parede celular, no que tange estrutura supra molecular da celulose, pode ento ser predita ao projetar estas medidas para as dimenses de uma fibra de celulose, cujo comprimento, no caso de fibras de papel, apresenta-se em torno de 1 a 3 mm, ou seja, entre 200 a 600 vezes o comprimento da cadeia usada como modelo nesta simulao. Na forma cristalina, a celulose realiza um nmero grande de ligaes de hidrognio devido a disposio tridimensional das cadeias. KUGA & BROWN (1987) demonstraram que a superfcie de contato entre as unidades fibrilares virtualmente indistinguvel entre os planos no cristal, mas estudos de microscopia tica revelaram que os cristais de celulose polarizam a luz, e que o estudo na passagem desta luz pode determinar a orientao das microfibrilas (MUELLER & BROWN, 1982; PERE et al., 1998). O estudo em difrao de raios-X mostra que a celulose pode ser cristalizada de quatro formas diferentes, designadas como: celulose I, II, II e IV (SARKO, 1986). Nos ltimos dez anos, a literatura descreve a celulose I como sendo formada por molculas de celulose em disposio anti-paralela (FENGEL & WEGENER, 1989). Todavia, somente aps a publicao de SUGIYAMA (1993) que foi definido que as molculas de celulose se organizam de fato paralelamente, ou seja, com uma orientao paralela entre si e em relao ao eixo da microfibrila (ATTALA , 1993; GANDINI, 1992). A celulose II produzida por tratamento alcalino da celulose I (Figura 5), sendo que na indstria txtil este processo chamado de mercerizao. Esta converso, que ocorre com aparente com inverso da polaridade das molculas, no

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totalmente compreendida.
FIGURA 5 - PLANOS CRISTALINOS DE CELULOSE I E II, PERPENDICULARES AO EIXO DA FIBRA (CAVACO-PAULO, 1995)

Admite-se que microfibrilas adjacentes de celulose I apresentam estatisticamente uma disposio anti-paralela e que, na presena de NaOH, h um cruzamento de molculas entre as microfibrilas, motivado pelo aumento da distncia interplanar no retculo cristalino. Assim, com base nesse modelo, a transformao de celulose I em celulose II no implicaria necessariamente na inverso da polaridade das molculas (SARKO, 1986). Outras organizaes moleculares podem ser obtidas a partir da celulose. Por exemplo, o tratamento da celulose I com amnia produz celulose III e IV, e o uso de glicerol sobre a celulose II produz celulose III e IV. No entanto, em qualquer desses casos, as cadeias de celulose assumem uma disposio em camadas, diferindo apenas na organizao das ligaes de hidrognio que se estabelecem entre as diferentes lamelas (CHANZY, 1990). Com base em estudos espectroscpicos, ATTALA et. al. (1984) foram os pioneiros em sugerir que os cristais de celulose I possuem duas fases ou formas alomrficas. Posteriormente, a utilizao de microdifratometria de raios X, espectroscopia Raman e ressonncia magntica nuclear (RMN) de 13C confirmou que a celulose I constituda por dois tipos de malha cristalina: a celulose I, predominante
750mhz
Comment [1]:

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em bactrias (Acetobacter sp.) e algas (Laminaria sp., Valonia sp.) e a I , predominante

nas plantas superiores. A celulose I corresponde fase triclnica e a celulose I , fase

monoclnica (Figura 6) (SUGIYAMA, 1991). Estas duas estruturas aparentemente coexistem dentro de uma nica microfibrila, pois no claro que tenham ocorrncia em regies distintas. No entanto, existem indicaes de que o interior dos cristais contm preferencialmente a fase I e que na superfcie das fibras, prevalece a fase I A
.

abundncia relativa dessas duas fases depende da origem da celulose. Celuloses advindas de algas e bactrias geralmente contm 60 70% fase I , enquanto que a

celulose de vegetais com algodo e rami contm apenas 70 a 40% desta fase, predominando portanto a fase I Tal, o dimorfismo da celulose nativa pode estar
.

associado com a multiplicidade de celulases que ocorrem na natureza (SUGIYAMA, 1993).

FIGURA 6 - REPRESENTAO DE UMA MICROFIBRILA DE CELULOSE, COM DUAS UNIDADES CRISTALINAS DISTINTAS DE CELULOSE: UMA MONOCLINICA E OUTRA TRICLINICA (SUGIYAMA, 1993)

A celulose regenerada (celulose II) contm 90% de fase I quando comparada

com a celulose de tunicina, que considerada pura em fase I . Portanto, a celulose em

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fase I termodinamicamente mais estvel e mais suscetvel hidrlise enzimtica

(NIDETZKY et al., 1994). Dados espectroscpicos tambm tm demonstrado que os dois alomorfos tm pequenas diferenas no arranjo estrutural das ligaes de hidrognio (FRANZ,1990), sendo que a fase I permite a ocorrncia de um nmero

maior de interaes intermoleculares (REINIKAINEN, 1994). Aparentemente, restries termodinmicas impedem a obteno artificial e/ou purificao de celulose em sua fase alomrfica I .

A microfibrila de celulose forma cristais individuais, e estes variam de tamanho conforme a origem da celulose (KUGA & BROWN, 1987; SUGIYAMA, J., 1994; BOKER & MILES, 1997). Com base nas coordenadas atmicas da estrutura de cristais de celulose I, HENRISSAT et al. (1985) propuseram um modelo da superfcie atmica de cristais monoclnicos, constitudo de arranjos 4 X 4 de cadeias de celulose. A anlise desse modelo mostra que cristais equivalentes de celulose apresentam um nmero diferente de resduos de glucose quando avaliadas nas duas faces dos cristais na microfibrila, podendo variar com o tipo de celulose, conforme demonstrado na Figura 7.
FIGURA 7 FACES CRISTALINAS DA CELULOSE I DE ACORDO COM GARDNER & BLACKWELL (1974). NESTE MODELO, AS ESFERAS VERDES REPRESENTAM OS OXIGNIOS DA LIGAO GLICOSDICA E AS ESFERAS VERMELHAS, OS GRUPAMENTOS HIDROXLICOS

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Segundo CHANZY (1990), diferentes valores podem ser encontrados para o tamanho da seo transversal da microfibrila de celulose. Em citao de MUELLER & BROWN (1982), estudos de sntese realizados por ROSS (1991), afirmaram que as cadeias de glucose so arranjadas dentro das unidades fibrilares com uma largura de 1,5 a 3,0 nm. Na Tabela 1, so apresentados os tamanhos das sees transversais das fibrilas de celulose encontrados na natureza.
TABELA 1 - TAMANHO DA SEO TRANSVERSAL DE FIBRILAS DE DIFERENTES ORGANISMOS SINTETIZADORES DE CELULOSE (CHANZY, 1990) Seo Transversal (nm) 20 10 5 3-4

Valonia Tunicina Rami Madeiras

Estudos enzimticos sobre a celulose freqentemente incluem os termos celulose amorfa e celulose cristalina. Entretanto, em nvel estrutural, difcil determinar com exatido a natureza do termo amorfa. Geralmente, considera-se celulose amorfa aquela que possui menor organizao estrutural com arranjo irregular das cadeias de glucose. Mtodos para determinar o ndice de cristalinidade em materiais celulsicos foram indicados por PILZ et al. (1990) e GAMA et al. (1994). A estrutura supramolecular da celulose pode ento ser caracterizada atravs de mtodos que permitam a determinao de sua cristalinidade e grau de polimerizao. A cristalinidade pode ser avaliada por difrao de raios-X (SARKO, 1986; RAMOS et al., 1993; RAMOS, 2001), empregando o mtodo emprico de SEGAL et al. (1959) (Figuras 8 e 9). Neste mtodo, (a) a regio cristalina estimada pela intensidade de difrao no plano (hkl) = (002), correspondente a um ngulo de Bragg (2) de 22,5o, (b) a regio amorfa caracterizada pela intensidade mnima na regio de 2 = 18,5o e (c) o ndice de cristalinidade calculado atravs da seguinte expresso (a) da figura 8.

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FIGURA 8 CRISTAL DE CELULOSE I COM SEUS PLANOS CRISTALINOS (A) E FRMULA DE CLCULO (B)

Nesta figura esto representados os planos ou faces mais importantes de um cristal de celulose I. No estudo da hidrlise enzimtica de pastas kraft de eucalipto RAMOS et al. (1993) verificaram, que a espessura dos cristais nos planos 040 e 002 se mantm aproximadamente constantes durante a bioconverso, mesmo quando o rendimento de hidrlise atinge 90% , indicando que em cada fase da hidrlise, a maior parte das microfibrilas residuais se conservam intactas. No entanto, a interpretao dos dados de difrao de raios-X deve sempre ser muito cuidadosa, principalmente quando este mtodo utilizado para avaliar o efeito de um processo hidroltico e/ou degradativo sobre a celulose. A medida que a superfcie das fibrilas (ou mesmo os cristalitos, em uma menor dimenso) de celulose so atacadas por agentes quer qumicos quer biolgicos, molculas de menor grau de polimerizao so geradas. Estas molculas, durante o preparo da amostra para difrao de raios-X, so suscetveis recristalizao devido a remoo de gua por processos como a liofilizao, muitas vezes mascarando o real efeito causado pelo processo degradativo em estudo (ATALLA, 1984; SJNSTRM,1993). Resumidamente, o grau de organizao da celulose e de outras fibras geralmente expresso em termos do ndice de cristalinidade e das dimenses do cristal de celulose. O ndice de cristalinidade a difrao de raios-X assumem que a celulose

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constituda por uma estrutura difsica e estabelece a definio mais ou menos arbitrria entre elas nos respectivos difratogramas (Figura 9). Desse modo pouco rigoroso, a fase cristalina separada da fase amorfa, sendo que este procedimento o mais freqentemente utilizado em estudos de degradao enzimtica da celulose (WOOD, 1991).
FIGURA 9 - DIFRAO DE RAIOS-X DE POLPA KRAFT BRANQUEADA, COM A IDENTIFICAO DAS INTENSIDADES UTILIZADAS NA RELAO EMPRICA DE SEGAL ET AL. (1959). VALORES EM PARNTESIS INDICAM DIFERENTES PLANOS CRISTALOGRFICOS E SEUS RESPECTIVOS (HKL)
100

(002)

INTENSIDADE RELATIVA (%)

80 60 40 20
I AM I CR (101) (101)

(021) (040)

12

16 20 24 28 NGULO DE BRAGG (2 )

32

36

Recentemente, outros mtodos analticos, tais como a ressonncia magntica nuclear de

13

C no estado slido e a espectrometria no infravermelho (FTIR) do

material compactado em pastilhas de KBr (EVANS et al., 1994), tm sido sugeridos para a determinao da cristalinidade, embora os mtodos espectroscpicos (FTIR e NMR) ainda no atingiram o grau de aceitabilidade usualmente associado difrao de raios-X. A anlise por FTIR geralmente realizada a partir de pastilhas de KBr (Figura 10). Os espectros no infravermelho prximo so geralmente gravados de 4000 a 400 cm-1, com resoluo de 4 cm-1 antes da aplicao da transformada de Fourier. Alternativamente, os espectros de FTIR podem ser gerados a partir de materiais celulsicos utilizando-se da tcnica de reflectncia difusa (ou DRIFT), cuja excecuo dispensa a confeco de pastilhas de KBr e, por conseguinte, a moagem das

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fibras celulsicas. Embora menos comuns, outras regies do espectro do infravermelho, como o infravermelho distante e a espectroscopia Raman, tm tambm sido aplicadas com sucesso na caracterizao de materiais celulsicos.
FIGURA 10- ESPECTROMETRIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER DE POLPA KRAFT BRANQUEADA EM PASTILHA DE KBR A 1% (P/P)

100

Trans mitncia (% )

80 60 40 20 0 500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 -1 Nmero de o nda (cm ) 3.500 4.000

O grau de polimerizao da celulose pode ser determinado por vrios processos, dentre eles a determinao de sua viscosidade intrnseca aps solubilizao em um solvente reativo (cuoxam, cuproetilenodiamina ou cadoxen) e a determinao de sua distribuio em massas moleculares por cromatografia de permeao em gel aps per-carbamilao (VALTASAARI AND SAARELA, 1975). O derivado percarbamilado, obtido por reao com isocianato de fenila em meio contendo piridina, totalmente solvel em tetrahidrofurano e portanto passvel de anlise cromatogrfica (RAMOS, 1992; RAMOS et al., 1993b, 1999b). Uma vantagem fundamental da anlise cromatogrfica reside no fato de que no apenas um valor de referncia obtido, mas sim um perfil de distribuio que pode revelar detalhes importantes de um processo tipicamente degradativo da celulose. A Figura 11 apresenta o perfil cromatogrfico obtido a partir dos derivados tricarbamilados da celulose presente no algodo e em polpas celulsicas branqueadas do tipo kraft. Obviamente, a celulose do algodo apresenta massas moleculares

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superiores aos da polpa kraft pois esta ltima decorrente de um processo quimicamente degenerativo e hidroltico (polpao kraft). A anlise de outros derivados da celulose, tais como o seu produto de nitrao, permitem igualmente com que se determine o seu grau de polimerizao. Porm, neste caso, o derivado obtido menos estvel que aquele obtido pela reao de carbanilao (WOOD et al., 1986).
FIGURA 11- ANLISE DE CELULOSE PER-CARBAMILADA POR CROMATOGRAFIA DE PERMEAO EM GEL, INDICANDO A DISTRIBUIO EM MASSAS MOLECULARES DO POLMERO ORIUNDO DE FIBRAS DE ALGODO HIDRFILO E POLPA KRAFT BRANQUEADA DE PINUS SPP
100

Resposta Normalizada do Detector

algodo
80

60

polpa de Pinus

40

20

10

100

1.000

10.000

Grau de Polimerizao

Quanto as caractersticas fsico mecnicas na regio cristalina, a fibra tem maior resistncia trao, ao alongamento e solvatao. Por exemplo, a resistncia trao na regio cristalina quinze vezes superior ao valor apresentado na regio amorfa, onde a fibra tem sua maior flexibilidade (FINCH & ROBERTS, 1985). Existem vrios tipos de celulose microcristalina disponveis no mercado sendo que as mais comumente empregadas como substrato para ensaios enzimticos so as denominadas de Avicel (Merck) microcristalina e a forma designada de

Sigmacell (Sigma Co.) chamada de pulveriforme.

Na literatura tambm aparecem designaes de celulose como holocelulose, celulose, celulose e celulose. celulose da madeira que foi tratada e

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deslignificada designa-se o termo holocelulose, enquanto que a

-celulose

corresponde frao insolvel em solues concentradas de hidrxido de sdio. Por outro lado, celulose a frao que precipita aps neutralizao da soluo alcalina anterior, sendo que a celulose ser aquela que permanecer na soluo alcalina (POLGLASE, 1995; FRANZ & BLASCEK, 1990).

3.2.2 Hemicelulose O segundo componente majoritrio das fibras celulsicas so as hemiceluloses (POUTANEN et al., 1996). A classificao qumica das

hemiceluloses pode ser feita considerando-as uma famlia de heteropolissacardeos no-amilceos e no-celulsicos dos quais participam pelo menos dois tipos de unidades de acar. Dentre esses, os grupamentos mais importantes so as glucuronoxilanas, as arabinoglucuronoxilanas, as glucomananas, as arabinogalactanas e as galactoglucomananas (VIIKARI et al., 1999). Portanto, o termo hemicelulose no designa um composto qumico definido, mas sim uma classe de componentes polissacardeos presentes em vegetais fibrosos. Em termos gerais, as hemiceluloses participam nas madeiras em 20 a 30 % da composio total, enquanto que nas gramneas estes valores podem variar de 20 a 40 % (FENGEL & WEGENER, 1989). Assim, as hemiceluloses isoladas de madeira so misturas complexas de polissacardeos unidos por diferentes tipos de ligaes, formando estruturas ramificadas e de organizao estrutural relativamente restrita (amorfa). Como no caso da celulose e da lignina, o teor e a proporo dos diferentes componentes encontrados nas hemiceluloses de madeira variam grandemente entre diferentes espcies e, provavelmente, de rvore para rvore em uma mesma espcie e de tecido para tecido em uma mesma rvore ( STEPHEN & DENCE, 1992). Em 1970, KENNETH j sugeria que a hemicelulose estaria ligada

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quimicamente lignina, protejendo a celulose da ao de enzimas e conferindo fibra maior resistncia mecnica ao alongamento e ao estresse (STEPHEN&DENCE,1992). As hemiceluloses apresentam na sua composio monomrica unidades distintas de: a) Pentoses: -D-xilose e -L-arabinose, nas suas formas furanosdicas ou piranosdicas; b) Hexoses: -D-glucose, -D-manose e -D-galactose; c) cido urnico: cido -D-glucurnico; d) Deoxi-acares: (-D-rhamnose e -L-fucose). Nas Figuras 12, 13, 14 e 15 encontram-se representadas as principais

unidades monossacardicas que compem a cadeia das hemiceluloses, bem como as regies de acessibilidade qumica desses heteropolissacardeos.
FIGURA 12 ESTRUTURA DE UMA GALACTOGLUCOMANANA, COM A LIGAO (14) EM EVIDNCIA (BIERMANN, 1996)
D-Glucose D-Manose

HOH2C O HO

O OH HO CH2OH HO
D-Galactose

HO O O OH2C HO OH O

HOH2C O HO

HO O

HO O HO HOH2C
(1 4)

O O

As hemiceluloses so reativas em seus grupos hidroxlicos (OH-) atravs de processos como a metilao e a nitrao, tambm podendo estabelecer ligaes ter ou ster (SUURNKKI et. al, 1996). Por oxidao desses grupos, podem ser obtidos grupos carbonlicos que so facilmente degradados por lcali, mesmo a frio. Se a oxidao for mais severa, formam-se grupos carboxlicos que so mais estveis (ATTALA, 1993; GANDINI, 1992).

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FIGURA 13 ESTRUTURA DE UMA ARABINOGLUCURONOXILANA. A LIGAO -(14), E AS LIGAES -(12) E -(13) DO CIDO 4-O-METIL-GLUCURNICO E DA L-ARABINOSE, RESPECTIVAMENTE EVIDENCIADAS (BIERMANN, 1996)

D -Xilose

O HO
-(1

O O

D -Xilose

O O O
-(1

HO
-(1 4)

O O
3) OH

OH HO O O

2)

OH HO H3 CO CO2H O HOH2 C

O OH

OH
L -Arabinofuranose

cido 4-O -metil-D-glucurnico

As hemiceluloses so praticamente amorfas e por isso apresentam maior acessibilidade e reatividade que as regies cristalinas da celulose. Portanto, as reaes de oxidao e degradao afetam mais rapidamente as hemiceluloses do que a celulose (MARCHESSAULT & SUNDARAJAN, 1983).
FIGURA 14- ESTRUTURA DA O-ACETIL-4-O-METIL-GLUCURONOXILANA. A LIGAO (14) DA CADEIA PRINCIPAL E A LIGAO -(12) DO CIDO 4-O-METILGLUCURNICO ENCONTRAM-SE EVIDENCIADAS (BIERMANN, 1996)

D -X ilos e

O O R R

O OH R = CH 3 CO em C 2 ou C 3 OH O O

O O OH

-(1

4) HO

O OH
-(1 2)

OH O

7 H3CO

HO O CO2 H cido 4- O-metil-D -glucurnico

POLGLASE (1995), relatou que existem indcios de que xilanas e galactoglucomananas podem se tornar cristalinas aps perderem alguns de seus constituintes moleculares. Isso pode ocorrer durante o processo kraft (vide subtem 3.3), quando as xilanas ou galactoglucomananas reprecipitam de volta superfcie das fibras com um maior grau de associao molecular. Nestes casos, a desacetilao

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provavelmente a principal razo para que a estrutura assuma uma forma de maior organizao molecular e/ou estrutural . Alm das xilanas, as madeiras duras contm cerca de 2 a 5% de glucomananas, as quais so compostas por unidades de D-glucopiranose e Dmanopiranose unidas por ligaes -(14). A relao glucose:manose varia entre 1:2 e 1:1, dependendo da espcie de madeira (BIERMANN et al., 1996).
FIGURA 15- ESTRUTURA DA GLUCOMANANA, COM A LIGAO -(14) EM DETALHE (BIERMANN et al., 1996).
D -Glucose

D -Manose

HOH2C O HO

O OH
-(1

HO O O HOH2C HO
4)

HOH2C O HO

HO O O

HO HOH2C HO O

Glucomanana

3.2.3 Lignina O ltimo componente de maior proporo nas fibras celulsicas a lignina, um polmero fenlico de estrutura bastante complexa, que formado por lcoois aromticos em distribuio randmica. Constitui parte das paredes celulares e da lamela mdia dos vegetais, estando intimamente ligada hemicelulose por ligaes covalentes (FREUDENBERG & NEISH, 1968; TAKAY et al., 1983). Devido a suas caractersticas fsico-qumicas, a lignina protege a celulose da ao enzimtica e justifica as propriedades mecnicas da fibra decorrentes da ntima associao entre ela e os polissacardeos da fitobiomassa (FENGEL & WEGENER, 1989). Portanto, trata-se de um dos principais componentes dos tecidos vasculares de gimnospermas e angiospermas. A lignina tem tambm um importante papel no transporte de gua, nutrientes e metablitos, sendo responsvel pela resistncia

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mecnica de vegetais, alm de proteger os tecidos lignificados contra o ataque de microrganismos. Vegetais primitivos como fungos, algas e lquenes no so lignificados . Em 1821, PAYEN (citado por FENGEL & WEGENER, 1989), tratou diferentes amostras de madeiras com cido ntrico, verificando que todas as amostras estudadas continham uma substncia com a mesma composio do amido, que acabou sendo chamada de celulose. Entretanto, como foi observado que o contedo mssico de carbono da madeira era bem maior que o da celulose, Payen denominou o material restante de material incrustante. O termo lignina foi introduzido em 1857 para nomear tal material. Em 1890, alguns pesquisadores verificaram a presena de grupos metoxila na madeira, que sabiam no existir na celulose (FREUDENBERG & NEISH, 1968). Em 1907, Klason foi o primeiro a desenvolver um mtodo para o isolamento da lignina, removendo os polissacardeos por reao com cido sulfrico 72% e permitindo o isolamento de um produto negro, denominado lignina de Klason (FENGEL & WEGENER, 1989). A lignina um polmero natural proveniente da condensao desidrogenativa de trs lcoois precursores: p-cumarlico, trans-coniferlico e trans-sinaplico

(MARROM, 1979; GANDINI, 1992), sendo que a polimerizao radicalar destes lcoois geram unidades p-hidroxibenzlicas, guaiaclicas e siringlicas,

respectivamente (FREUDENBERG & NEISH, 1968). Sua ocorrncia em plantas superiores muito variada, podendo residir entre 20 a 40% para diversos tipos de madeiras (NULTSCH, 2000). A estrutura qumica da lignina bastante complexa e ainda no conhecida completamente. As ligninas de madeiras duras apresentam, em sua composio, alm de grupos guaiacil, propores mais altas de grupos siringil, enquanto que as madeiras moles so mais ricas em grupos guaiacil (HIGUCHI, 1990). Diferentes tipos de ligninas que variam de espcie para espcie e at mesmo dentro de uma mesma espcie, dependendo das variaes nas condies ambientais,

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tais como o clima e as condies do solo. A Figura 16 mostra uma representao da estrutura molecular da lignina de um tipo de madeira dura (faia ou Fagus sp.), de acordo com os estudos de Nimz e colaboradores (HIGUCHI, 1990).
FIGURA 16- MODELO ESTRUTURAL DA LIGNINA DE FAIA (NIMZ, 1974), OS NMEROS DE 1 A 25 INDICAM A PRESENA DOS ANIS AROMTICOS

H2COH CH H2COH CH CH CO

H2 COH H2COH OCH3 HC HC 0.4 O CH2 CH HC H2 COH HC HC CHO CH CH HC CO H2 COH HC HC OCH3 O H3 CO O OCH3 O H3 CO O OCH3 H2 C HC HC O CH2 21 OCH3 O CH H3 CO HC O CH CH CH2 OCH3 H3 CO

6
O

H2 COH CH H3 CO CO

5
O

25
OCH3 O

H3 CO

OCH3 H3 CO 6 H COH H3 CO OCH3 OCH3 2 H2 COH 1 HC O OH C O CH 3 H2 COH H2COH CH O OCH3 H C 12 O CH 4 H2 COH HC OCH3 H COH OCH3 HC O 2 CHO OCH H CO
3 3

15

24
H2 COH CH CH

14
O

22

23
OH

11
O

H2 COH HC C H

O O OCH3 H3 CO

H2 COH H2 COH CH H C CH CO

H3 OC

OCH3 HOCH2 H2 COH C CH

13

OCH3

O CH CO O

10

H3 CO

7
OH

OCH3

HOCH2

O O CH CHO

H2COH CH CO

19
OCH3

18 16
O H2 COH HC CH OCH3 O HOCH2 H3 CO

20
O CH CHO H2 COH HC HC H2 COH CH HC

H2 C HC CH2

CH2 CH CH2

H3 CO

17
H3 CO OCH3 0.5 OH OCH3

9
H3 CO O

OCH3

10
O

H3 CO

24
OCH3 O

25
OH

OCH3 0.1

3.3 INDSTRIA PAPELEIRA

Barnett et al., 1982; Sarkanen and Schverch, 1955; Faix et al., 1992; O comrcio mundial de celulose tem uma dimenso ao redor de 30 milhes Silva, 1995; Faix and Bttcher, 1993; Pil-Veloso et al., 1993
de toneladas, participando a fibra de eucalipto com 17%, sendo que o Brasil responsvel por 52% de tal volume. Portanto, alm de se caracterizar como o principal exportador de celulose de fibra curta de eucalipto, o Brasil um importante fornecedor de papis no-revestidos de impresso e escrita no mercado internacional . O consumo mundial de papel apresentou, nos ltimos cinco anos, uma taxa

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de crescimento anual da ordem de 2,3%. No entanto, pases como Estados Unidos, Canad, Japo e a Europa Ocidental alcanaram valores inferiores ao ndice mundial (1,7%), muito embora representem 71% do consumo total. Em valores reais, a quantidade de papel consumida no Brasil no ano de 1999 atingiu cerca de 213 milhes de toneladas (GAZETA MERCANTIL, 2001). Nas Tabelas 2 e 3 e na Figura 17 encontram-se os valores referentes aos tens de exportao derivados da indstria papeleira, segundo a classificao da Carteira de Exportao do Banco do Brasil MDIC/Secex (BANCO CENTRAL DO BRASIL, 2000).
TABELA 2 EXPORTAES DE PRODUTOS E DERIVADOS DA INDSTRIA PAPELEIRA (BANCO CENTRAL DO BRASIL, 2000) Ano 2000 1999 1998 1997 Papel e manufaturados ( toneladas) 1.224.549 1.329.657 1.217.021 1.329.435 Papel para imprimir e escrever (toneladas) 265.118 420.187 454.556 565.679 Pasta qumica (toneladas) 2.916.506 3.013.247 2.698.129 2.381.515

A principal matria-prima para a produo de papel a madeira, sendo que no Brasil, a madeira mais empregada a de Eucalyptus sp. No entanto, para a obteno do papel propriamente dito, uma srie de processos (polpao) so necessrios para separar das fibras do material lignocelulsico, o que pode ser realizado por processos qumicos, mecnicos ou por uma combinao desses. Na polpao mecnica, devido a utilizao de moinhos de bola rotatrios e jatos de gua, ocorre a perda da resistncia da polpa, resultando em um papel de baixa qualidade, alm de elevados custos operacionais. Apesar das adaptaes como discos de refino a altas presses, estes processos continuam relativamente inviveis (SUURNKKI et. al, 1997).

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TABELA 3 POSIO DOS PRODUTOS BRASILEIROS NO MERCADO MUNDIAL (BANCO CENTRAL DO BRASIL, 2000) Posio no Mercado Mundial em 2000 Consumo de Papel Produtor de Papel Consumo de Fibras Produtor de Fibras Produtor de Celulose e Pastas

9 (4,473 milhes Toneladas) 11 (2,2% da produo Mundial) 8 6 3

FIGURA 17- EXPORTAES BRASILEIRAS DE PRODUTOS DERIVADOS DA INDSTRIA PAPELEIRA

3.500.000 3.000.000 2.500.000

Toneladas

2.000.000 1.500.000 1.000.000 500.000 0 2000 1999 Ano 1998 1997

Pasta Qumica (t)

Papel para imprimir e escrever (t)

Papel e Manufaturados(t)

Processos qumicos de polpao so aqueles que removem grande parte da lignina atravs de reaes que levam despolimerizao desta macromolcula, solubilizando-a no licor de cozimento e liberando as fibras de celulose. O processo deve evitar ao mximo o ataque aos polissacardeos para no ocorrer a despolimerizao da celulose e da hemicelulose, o que acarretaria danos nas propriedades fsico-mecnicas da polpa e no rendimento da polpa para a fabricao do papel (KENNETH, 1970).

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Os processos qumicos industriais mais importantes so os processos kraft e sulfito (FINCH & ROBERTS, 1985). No Brasil e em muitas partes do mundo, o processo kraft o mais amplamente empregado. J nos Estados Unidos, 70% de toda a produo de polpas de celulose so oriundas desse processo qumico e o mesmo acontecendo na Europa, com exceo da Alemanha, onde o processo sulfito o mais empregado. O processo de polpao kraft consiste no cozimento dos cavacos de madeira, a uma temperatura de aproximadamente 170oC, em uma soluo alcalina de sulfeto de sdio, denominada de licor branco. A presena do sulfeto no licor de cozimento oferece algumas vantagens como a rapidez na deslignificao e menor exposio da madeira soluo alcalina, o que permite a produo de polpas mais resistentes em funo da menor degradao de celulose e hemiceluloses. A grande aceitao do processo kraft, segundo SJNSTRM (1993), deve-se a inmeros fatores, muito embora existam fatores negativos, tais como os discriminados na Tabela 4. As espcies ativas envolvidas na deslignificao so os ons sulfeto (S2-) e bissulfeto (HS-), que podem ser inclusive regenerados na caldeira de recuperao a partir do sulfato de sdio, e os ons hidroxila. Os ons sulfeto e bissulfeto, altamente nucleoflicos, reagem exclusivamente com a lignina atravs da quebra de ligaes -aril e -aril ter, formando fenolatos solveis no licor de cozimento (SJNSTRM, 1993). Reaes indesejveis de condensao ocorrem tanto no processo de polpao sulfito como no kraft, principalmente nas posies C-5 das unidades fenlicas da lignina. Alm dessas, ocorrem reaes de formao de subestruturas com grupos cromforos que so parcialmente responsveis pela colorao escura que as polpas apresentam (SJNSTRM, 1993).

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TABELA 4- COMPARAO ENTRE PONTOS POSITIVOS E NEGATIVOS DO PROCESSO KRAFT (SJNSTRM, 1993) PONTOS POSITIVOS Baixa exigncia quanto qualidade da madeira, podendo ser madeiras moles, duras ou at uma combinao destas. Alm disso, esse processo possui grande tolerncia quanto presena de extrativos e cascas; Curto tempo de cozimento; Gerao de calor para as caldeiras com a queima da lignina; Polpa de excelente qualidade e resistncia ; Obteno de alvura elevada aps as etapas de branqueamento; Recuperao parcial dos reagentes qumicos empregados; PONTOS NEGATIVOS Odor desagradvel ocasionado pelos gases derivados do enxofre; Custos enormes para instalao de uma fbrica; Colorao escura da polpa resultante; Baixo rendimento de polpa (45 a 55%)

O baixo rendimento dos processos sulfito, kraft e alcalinos est relacionado com a degradao dos carbohidratos (celulose e hemiceluloses) atravs das reaes com os ons hidroxilas. A solvatao dos carbohidratos pelas fortes solues alcalinas leva ao rompimento das ligaes de hidrognio entre as vrias cadeias, provocando um processo de inchamento da madeira, onde as hemiceluloses so dissolvidas e/ou desacetiladas por hidrlise alcalina previamente sua dissoluo no licor. Ademais, pode ocorrer tambm a despolimerizao terminal da celulose, onde o grupo aldedico terminal da glucose se rearranja, levando em seguida a uma eliminao -alcxi com a formao de uma nova unidade na extremidade da molcula. Essas reaes seguem sucessivamente at a formao de uma unidade terminal resistente despolimerizao (GANDINI, 1992). Ao longo dos ltimos anos, desenvolvimentos significativos vm sendo empreendidos ao processo kraft para reduzir o teor de lignina residual na polpa, sem com isso gerar qualquer alterao de suas propriedades fsico-mecnicas. Quatro princpios foram listados como fundamentais para que este objetivo pudesse ser atingido: reduzir a concentrao de lcali no incio e aumentar esta concentrao no final do processo; manter alta a concentrao de ons HS- no incio do processo de deslignificao; manter baixas concentraes de lignina e ons sdio no licor; e

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controlar a temperatura em nveis baixos, particularmente no incio e no final do cozimento. Tais princpios foram incorporados em um processo denominado de MCC (Modified Continuous Cooking), ou cozimento contnuo modificado. Variaes do cozimento MCC podem ainda ser implementadas com o intuito de otimizar o processo, sendo que delas surgiram os processos EMCC (Extended Modified Continuous Cooking) e ITC (Isothermal Cooking). A primeira modificao advm da adio de parte da carga alcalina do processo diretamente no licor oriundo da lavagem high heat, que ento recirculado, enquanto que a segunda modificao diz respeito conduo de todo o processo em uma temperatura pr-fixada, donde o termo isotrmico (SANTOS et al., 1994).

3.4 TECNOLOGIA ENZIMTICA A aplicao da catlise enzimtica em processos industriais pode ser dividida em quatro campos distintos que so listados a seguir: 1)- na obteno de agentes teraputicos; 2)- como ferramenta para a manipulao de materiais biolgicos; 3)- como reagentes analticos; 4)- como catalisadores industriais. A bioconverso de produtos naturais vem sendo empregada de maneira crescente pela indstria nos ltimos 20 anos. Um indicador deste fato o aumento da produo mundial de enzimas, principal catalisador destes processos, girando em torno de 70.000 t/ano e envolvendo cifras da ordem de US$ 520 milhes (GAZETA MERCANTIL, 1999). Na Tabela 5 encontram-se algumas enzimas de interesse industrial e o seu potencial de uso na manufatura de produtos requeridos pelo mercado consumidor (BULOCK & KRISTIANSEN, 1991; GERHARD & WOLFGANG, 1991).

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TABELA 5 - ENZIMAS CLSSICAS INDSTRIAIS E SUAS FONTES DE USO (GERHARD & WOLFGANG, 1991) Enzima -Amilase Celulase -Glucanase Glucoamilase Lactase Lipase Pectinase Protease Fonte Aspergillus oryzae Bacillus amiloliquefaciens Bacillus tricheniformis Aspergillus sp. Trichoderma reesei Penicillium sp. Aspergillus niger Bacillus subtilis Rhizopus sp. Aspergillus niger Saccharomyces sp. Kluyveromyces marxiamus Aspergillus sp. Mucor sp. Rhizopus sp. Aspergillus niger Bacillus licheniformis Bacillus amiloliquefaciens Endothea parasitica Mucor miehei Usos principais Hidrlise do amido para xaropes aucarados, fabricao de cerveja Txteis Polpa e papel Processamento de frutas e verduras Hidrlise de -glucanas na fabricao da cerveja Produo de xarope de glucose a partir do amido Hidrlise da lactose do leite e do soro do leite Modificao do aroma do queijo e da manteiga Detergentes Extrao e clarificao de sucos de frutas Indstria do couro e detergentes Fabricao de cervejas e po Manufatura do queijo

No segundo perodo ao final dos anos 80, constatou-se um expressivo aumento nas importaes de enzimas(em torno de 500%), o que coincidiu, em 1989, com o lanamento no mercado brasileiro de biodetergentes que as utilizam em suas formulaes. Constatado o xito comercial dos biodetergentes, houve um aumento nas escalas de produo de indstrias como a Novo Nordisk do Brasil (Curitiba, PR), ao mesmo tempo em que foi observada uma sensvel queda na importao de enzimas, resultando em um balano negativo da ordem de U$ 864.000,00 (oitocentos e sessenta e quatro milhes de dlares). A terceira fase veio com a globalizao da economia e a poltica de comrcio exterior menos reguladora, resultando em um aumento no volume de importao e comprovando que a demanda do mercado interno por biocatalisadores realmente encontrava-se reprimida (WISEMAN, 1986; GAZETA MERCANTIL, 2000).

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3.4.1 Tecnologia Enzimtica nos Processos da Indstria Papeleira No incio da dcada de 80, surgiram na indstria papeleira os primeiros estudos utilizando enzimas para tratamento de celulose (VIIKARI, 2000; (RAHKAMO et al., 1998 a,b ; PERE, et al., 1995). Este interesse estava fortemente ligado dificuldade na reduo dos problemas causados no processo de industrializao do papel, principalmente na etapa de branqueamento, e na necessidade de reduzir a sua carga poluente. Estudos envolvendo enzimas tm demonstrado que possvel reduzir a carga txica destes efluentes por via biolgica (por exemplo: organoclorados e dioxinas) (WISEMAN, 1986). Conforme DURN et al. (1995), enzimas podem ser empregadas em diversos estgios da fabricao do papel, dentre eles: (a) na reduo de energia gasta no descascamento da madeira; (b) no pr-tratamento do cavaco antes da polpao e das polpas antes do branqueamento (YAMASHIKI et al. 1990); (c) no biodeslignificao dos cavacos por fungos lignolticos (biopolpao); (d) no biobranqueamento das polpas por xilanases, ligninases e lacases (TENKANEN,1997); e (e) na biorremediao de efluentes industriais. Vrios autores reiteram o fato de que algumas dessas aplicaes j atingiram a escala comercial, como o caso do uso de xilanases no processo de branqueamento, de enzimas oxidativas para processos de delignificao e de celulases para reduo do requerimento de energtico das etapas de refino (RAHKMO et al.,1998a). Uma descrio das enzimas que encontram aplicao na indstria de papel e celulose dada na Tabela 6, juntamente com o efeito esperado sobre os diferentes componentes da polpa e/ou da madeira (KANTELINEN et al., 1997; VIIKARI, 2000). Todos os processos de transformao enzimtica descritos nesta tabela se baseiam nas atividades especficas de determinadas enzimas, assim como no

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aproveitamento de seu produto de ao cataltica (BULOCK & KRISTIANSEN, 1991). Atualmente, so conhecidas e caracterizadas aproximadamente 2000 enzimas, dentre as quais 50 podem ser obtidas biotecnologicamente em grande escala (WISEMAN, 1986; BULOCK & KRISTIANSEN, 1991; VIIKARI, 2000).
TABELA 6 - AO DE ENZIMAS EM DIFERENTES COMPONENTES DA MADEIRA. Componentes Celulose Enzima Celobiohidrolase Endoglucanase Mistura Modificao fisicoqumica Microfibrilao Despolimerizao Despolimerizao Despolimerizao Despolimerizao Decrscimo da estabilidade coloidal Decrscimo na solubilidade Despolimerizao Despolimerizao Aumento da hidrofilicidade Benefcio tcnico Reduo da energia de refino Aumento da flexibilidade das fibras Reduo do ndice de reteno de gua da polpa Melhoria da qualidade das fibras Extrao de lignina Extrao de lignina Aumento na velocidade da mquina de papel (remoo de gomas) Efeito sobre o alongamento das fibras Decrscimo da demanda catinica na mquina de papel Decrscimo na cor Efeito sobre o alongamento das fibras Aumento na velocidade da mquina de papel (remoo de extrativos)

Xilana Endoxilanase Glucomanana Endomananase Acetil esterase Glucomananase Pectina Lignina Extrativa Pectinase Lacase Lipase

Enzimas derivadas de organismos normais e daqueles modificados geneticamente tambm comeam a surgir no mercado mundial. Dentre as muitas aplicaes destacam-se aquelas que tem por finalidade aumentar a produo de enzimas industriais e/ou aumentar a atividade especfica destas enzimas em processos de bioconverso (GERHARD & WOLFGANG, 1991, CAVACO-PAULO et al., 1997).

3.4.2 Tecnologia Enzimtica em Outros Processos Por ser a celulose uma fonte abundante na natureza, sua utilizao biotecnlogica sugere muitas possibilidades atrativas baseadas em processos

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hidrolticos e/ou fermentativos (SADDLER, 1991; HENRIKSSON et al., 1995). Nos anos 90, grandes incentivos foram ofertados para a produo de lcool combustvel a partir de celulose, o que levou inmeros pesquisadores a avanos significativos na descoberta de processos de produo de enzimas, pr-tratamentos, avaliao de substratos e utilizao de sub-produtos que contribussem para a viabilizao econmica do processo. Um marco nesses grandes avanos foi o desenvolvimento de uma Escherichia coli recombinante que converte em etanol tanto pentoses quanto hexoxes oriundas da hidrlise cida de materiais lignocelulsicos pr-tratados (ALTERTHUM et al., 1994). Tal descoberta possibilitou a realizao, em uma etapa nica, da Sacarificao e Fermentao Simultneas (SFS) da fitobiomassa pr-tratada, fato de grande contribuio para a viabilizao econmica da produo de etanol a partir de materiais lignocelulsicos residuais como o bagao de cana (FINCH & ROBERTS, 1985). A validade do mtodo SFS tem sido documentada por muitos autores (GERHARD & WOLFGANG, 1991; WOOD,1991). Tal mtodo baseia-se na suposio de que os acares liberados do substrato pela hidrlise enzimtica so rapidamente fermentados por leveduras ou microrganismo a etanol. A ao de celulases em substratos pode, portanto, prosseguir sem nenhuma interferncia de altas concentraes de acares na mistura de reao. A maioria dos trabalhos publicados neste sentido tem utilizado celulases fngicas para o processo hidroltico (FAN et al., 1987; NEVALAINEN et al., 1991; OKSANEN et al., 1997). Por outro lado, prtratamentos apropriados podem reduzir a quantidade de enzimas necessrias sacarificao enzimtica (RAMOS et al., 1992a). Um dos mtodos de pr-tratamento mais promissores a exploso a vapor, que atenua sensivelmente o carter altamente recalcitrante da lignocelulose nativa (RAMOS, 1992, RAMOS et al., 1993). Durante o pr-tratamento, a estrutura da parede celular lignocelulsica modificada radicalmente pela penetrao de vapor saturado a altas temperaturas. Esta modificao estrutural da parede celular lignocelulsica

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resulta de uma hidrlise cida parcial da hemiceluloses, deixando um resduo celulsico de alta susceptibilidade hidrlise enzimtica (RAMOS & SADDLER, 1994; TENKANEN et al.,1994). As celulases tambm tm tido aplicao crescente na formulao dos ps de lavagem domsticos, por aumentarem o seu poder de ao detergente (LINKO, 1993; CAVACO-PAULO, 1995) e tambm por limparem a superfcie das fibras de algodo (biopolimento), removendo fibrilas soltas, borbotos e partculas de sujeira retidas na superfcie. Isto vai conferir ao produto lavado um tato mais macio e um melhor aspecto, com cores mais vivas (MIETTINEN-OINONEN et al., 1999). O tratamento com celulases tambm usado no amaciamento de fibras ligno-celulsicas, como o linho, o cnhamo e a juta, facilitando o seu processamento industrial (MIETTINENOINONEN et al., 1996; PERE et al., 1996). Entre outras aplicaes, cita-se a utilizao de celulases como aditivo para o crescimento dos fungos celulolticos em resduos celulsicos para a produo de rao animal (BULOCK & KRISTIANSEN, 1991), na indstria txtil em substituio do processo stone-washing (CAVACO-PAULO et al., 1997), na clarificao de sucos, na produo de detergentes (OIJUSLUOMA et al., 1996; MIETTINEN-OINONEN et al., 1999) e na rea farmacutica, no auxlio digestibilidade da celulose em doentes gastroendmicos ou acometidos de colites.

3.5 HIDRLISE ENZIMTICA DE FITOBIOMASSA Como funo principal, as enzimas hidrolticas fragmentam macromolculas que no podem ser assimiladas diretamente pelas clulas, como o caso do amido, da celulose e da pectina; portanto, a absoro atravs da membrana celular se d via seus constituintes de menor massa molar, ou seja, mono e dissacardeos e cidos urnicos (ERIK et al., 1988). A geometria da estrutura cristalina da celulose muito importante nos

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processos de tratamento enzimtico, sendo que as enzimas podero atacar preferencialmente um dos dois tipos de estrutura. Estudos de modelagem sugerem que stios de menor organizao molecular, localizados na superfcie do cristal so mais susceptveis ao ataque enzimtico (COUGHLAN, 1985, BUCHERT et al., 1996). Componentes valiosos so liberados com a remoo enzimtica da parede celular, tais como: aromas, polissacardeos, enzimas e outras protenas, ou ainda, a liberao de protoplastos vegetais para pesquisa gentica e desenvolvimento de vegetais superiores (WISEMAN, 1986). A biodegradao da fitobiomassa tem sido muito estudada h vrias dcadas e um assunto parcialmente elucidado do ponto de vista bioqumico, sendo que na natureza esta funo exercida principalmente fungos e bactrias (VICENTE, 1989). A eficincia com a qual a fitobiomassa hidrolisada depende de mltiplos fatores que envolvem as caractersticas do substrato e a natureza do sistema enzimtico usado. , portanto, importante considerar estes dados na avaliao do processo de bioconverso celuloltica (WOOD, 1989; BUCHERT et al.,1994). Muitos microrganismos como os fungos filamentosos, presentes em grande quantidade na natureza, so capazes de fazer a bioconverso de materiais lignocelulsicos em unidades de fcil assimilao para o seu metabolismo vital (KANTELINEN et al., 1997; WOOD et al., 1978). No caso da biodegradao de polioses, esta ocorre de forma semelhante da celulose, sendo que as enzimas envolvidas na biodegradao so hidrolases especificas que clivam determinados tipos de ligao existentes nos polissacardeos. Assim, as (1,4)-glucanases hidrolisam as ligaes glicosdicas existentes na molcula de celulose, as xilanases rompem ligaes glicosdicas entre unidades monomricas de xilose, as mananases atuam sobre ligaes glicosdicas entre molculas de manose e as glucuronidases, sobre ligaes de cidos urnicos com outros acares. Uma quantidade grande destas enzimas extracelulares, particularmente as celulolticas, so produzidas pelo fungo Trichoderma reesei. Muito tem se investigado

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quanto capacidade destas enzimas em degradar a fitobiomassa, sendo esta apontada como ideal pela complexidade de seu sistema e pelas variaes na sua composio centesimal. Outros fungos celulolticos tambm tm sido estudados com este objetivo, como o caso do Phanerochaete chrysosporium, do Penicillium pinophilum e do Fusarium solani (ERIKSSON et al., 1990). Os sistemas celulolticos dos fungos e de algumas bactrias (Cellulomonas fimi e Thermonospora fusca) so constitudos por enzimas extracelulares que atuam no meio (endoglucanases) ou na extremidade (exoglucanases) da cadeia da celulose. Por seu lado, as bactrias anaerbias degradam a celulose usando enzimas ligadas membrana celular. Estas enzimas esto organizadas em um complexo com diversos componentes designado celulossoma (SRISODSUK, 1994), que inclui tipicamente vrias endoglucanases e exoglucanases, alm de xilanases e outras protenas de funo ainda no totalmente esclarecida. Os sistemas enzimticos de fungos que apresentam os dois tipos principais de glucanases, endo e exo, so designados como completos porque degradam a celulose cristalina eficientemente. Noutros casos, como os fungos do bolor marrom, as exoglucanases esto ausentes. Em seu lugar, estes fungos usam compostos oxidantes, de baixa massa molecular, que degradam as zonas amorfas da celulose com eficincia (KLEMAN-LEYER et al., 1994). Outras enzimas podem eventualmente participar do processo de hidrlise da celulose quando presentes, como as exoglucohidrolases e algumas enzimas oxidativas como a celobiodesidrogenase (CDH) e a celobiono oxi-redutase, que atuam simultaneamente sobre a lignina e celulose (COUGHLAN, 1985; GOYAL et al., 1991). Nesses casos, as lactonas produzidas no estgio oxidativo da digesto da celulose so convertidas em cido celobinico pela lactonase. Outro grupo importante o das hemicelulases, que so divididas em trs grupos: as endo-hemicelulases, que hidrolisam o polmero ao acaso, liberando fragmentos de menor massa molar; as exo-hemicelulases que hidrolisam os fragmentos

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gerados pelas endo-hemicelulases; e as xilosidases, que hidrolisam dmeros a acares mononricos (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990). Dentre os fungos filamentosos de interesse industrial, destacam-se principalmente o Trichoderma sp e Aspergillus sp como modelos de produo de enzimas celulolticas, amilolticas e -glucosidsicas. Estudos com outros fungos tambm tm sido realizados para definir o potencial de produo de enzimas no processo de biodegradao, dentre eles o fungo termoflico Humicola grisea (KOIVULA, 1994). Estes estudos tm sido realizados com o intuito de se obter maiores eficincias de fermentao e altas taxas de produtividade. A produo de enzimas do complexo celuloltico est sujeita induo e represso. O melhor indutor destas hidrolases a prpria celulose, como o algodo e a celulose microcristalina. No entanto, como esses substratos so essencialmente insolveis, a celobiose na realidade o verdadeiro indutor. Por esta razo, a presena de baixos nveis de -glucosidade extracelular recomendada para que a comunicao via oligmero solvel (celobiose) seja facilitada e leve a nveis de induo mais altos do complexo enzimtico. Outros bons indutores para o T. reesei so a lactose e a soforose, enquanto que a glucose reprime ativamente a produo de enzimas do complexo celuloltico, presumivelmente por represso catablica (LINKO, 1993). Avanos tm sido possveis mediante o uso de tcnicas de engenharia gentica e novas linhagens vm sendo desenvolvidas, produzindo enzimas de altas atividades especficas com aplicaes ainda mais diversificadas do que as j existentes (ENARI & NIKU-PAAVOLA, 1987). Assim, as informaes que esto presentes em nvel de genoma podem fornecer muitas respostas sobre sua regulao.O seqenciamento de genes nos fornece dados sobre a protena, seus stios de restrio, a localizao de ntrons e exons, seus cdons de iniciao e de terminao, bem como de regies reguladoras para a transcrio dos genes (CAAT box, TATA box, GC box, e outros). Nesses estudos, a expresso gnica heterloga tem se demonstrado como uma das altemativas mais viveis para aplicaes industriais (SALOHEIMO et al., 1997a)

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3.5.1 Trichoderma reesei O gnero Trichoderma define vrias espcies de fungos que se desenvolvem no solo e est includo nos Deuteromycotina (Fungi Imperfecti). Este gnero tambm pode ser relacionado com o gnero Hypocrea e com o gnero Podostroma, j que a fase assexuada destes fungos no se distingue morfologicamente das encontradas no gnero Trichoderma (EVELEIGH et al., 1985). Nos Fungi Imperfecti, o gnero Trichoderma est incluido no grupo taxonmico dos Hyphomycetes (Moniliales). Os fungos pertencentes aos Hyphomycetes caracterizam-se por formarem condios em um miclio indiferenciado ou sobre conidforos especializados, que podem ser simples ou compostos, solitrios ou agregados (NULTSCH, 2000). O fungo T. reesei considerado um organismo no patognico e as condies utilizadas para a produo de celulases no apresentam o inconveniente da produo de toxinas ou antibiticos (NEVALAINEN et al., 1995 ; 1991). O Trichoderma foi descoberto durante a II Guerra Mundial na sia, pela sua capacidade de destruir os tecidos de algodo das tendas do Exrcito Americano (TEERI, 1997). Em 1950, o grupo de Edwin T. Reese nos Laboratrios do Exrcito Americano identificou o fungo T. viride como sendo o responsvel pela degradao dos tecidos das tendas. Nesta altura, o algodo j tinha sido substitudo pela poliamida no fabrico das tendas, mas o novo interesse neste fungo residia agora na possibilidade da converso da biomassa para aproveitamento energtico (LINKO, 1993). Foram efetuados numerosos estudos no sentido de obter mutantes da T. viride, com o objetivo de aumentar a capacidade de produo de enzimas e maximizar a capacidade hidroltica destas frente a substratos celulsicos. O T. reesei um destes mutantes, sendo-lhe atribudo este nome desde 1977 (WISEMAN, 1986; TEERI et al., 1999). Segundo RIFAI (1969), citado por SALOHEIMO et al. (1993), o gnero Trichoderma possui nove espcies. No entanto, estudos mais recentes consideram a

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existncia de mais de 27 espcies, sendo que T. reesei tido como sinnimo ou subespcie de T. longibrachiarium. O uso especfico do sufixo reesei dedicado a E. Reesei, um dos primeiros e principais investigadores a estudarem o taxon (SALOHEIMO et al., 1993). Segundo EVELEIGH et al. (1985), a espcie tem 6 ou 7 cromossomas com variaes na quantidade de mega pares de base entre 31 e 39 Mpb. Das celulases do T. reesei, a estirpe QM 6A foi a que deu origem a todas as outras por mutagnese fsico-qumica, mediante mtodos como a irradiao com raios ultravioleta, radiao e bombardeamento com eltrons de alta energia. Atualmente, a estirpe mais estudada a QM 9414 e nenhuma das estirpes mutantes conseguidas desde 1978 ultrapassou a sua atividade celuloltica (EVELEIGH et al., 1985; TEERI et al., 1995a). Conhecem-se espcies do gnero Trichoderma com capacidade para produzir outras enzimas como as acetil-esterases, amilases, lacases, mananases, proteases, quitinases, quitobiases, ribonucleases, transglucosidases, xilanases e -galactosidase (EVELEIGH et al., 1985). Outras espcies tm a capacidade de acumular lpidos (BROWN et al., 1996), de degradar o cido asperglico e outros anis heterocclicos e de produzir compostos com atividade antibitica e fungicida (NYYSSNEN & KERNEN, 1985).

3.5.2 Mecanismos de Ao Cataltica em T. reesei O complexo celulsico secretado por fungos filamentosos formado por trs componentes enzimticos majoritrios, as endoglucanases, as celobiohidrolases tambm designadas exoglucanases e as -glucosidases. As endoglucanases (EGs) clivam internamente e preferencialmente as regies menos cristalinas das microfibrilas, enquanto as exoglucanases (CBHs) clivam a celobiose das extremidades livres da celulose e as -glucosidases hidrolisam glucose a celobiose e pequenos oligmeros solveis produzidos pelas endoglucanases e exoglucanases (KOIVULA,

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1994). Na Figura 18 encontra-se representada esquematicamente a ao dos trs grupos majoritrios de enzimas celulolticas do T. reesei. O T. reesei produz uma celobiase (-glucosidase), duas celobiohidrolases (CBH I e CBH II) e pelo menos cinco endoglucanases (EG I, EG II, EG III, EG IV, EG V), sendo que os genes destas enzimas j foram devidamente identificados e isolados (EVANS et al., 1994; BUCHERT et al., 1996; CLARKE, 1999).
FIGURA 18 MODO DE AO DE CELULASES (ENDO E EXOGLUCANASES) E GLUCOSIDADES (CELOBIASES) SOBRE SUBSTRATOS CELULSICOS
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O

HO HO O O O OH

Endoglucanases
O O O
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
O O O OH

HO HO
O O O O O O O O O O O

OH
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
O O O OH

O
O O O O O

O O O O O O O O O O O O

O O O O O O O O O O O O O O O O

O O

O O O

O O O

O O O

O O

O O

O O

O
O

O
O

O
O

O
O

OH

OH

Exoglucanases
HO HO O O O OH

O O

O O

OH

HO

O O

O O O

O O O O

Sinergismo Endo-Exo
HO HO O O

OH
O O O O

O O

OH
O O O O

O O

OH O

O O O

O O

OH O O O O

HO HO

O O

OH

O O

O
OH

O O O

O O HO HO OH O O

O O

HO HO

HO OH

OH

O OH HO HO O O

H2COH HO HO O O HO OH O HO HO H2COH

OH

Celobiases
glucose

celobiose

H2COH HO OH HO O HO

A composio relativa das quatro principais celulases na mistura original de aproximadamente 60% (CBH I), 14% (CBH II), 5% (EG I) e cerca de 1% (EG II) (FAN et al., 1987). Quanto a sua classificao e estrutura molecular, as celulases da T. reesei apresentam homologia em cerca de 60 a 70% na seqncia de seus aminocidos (STAHLBERG et al., 1995). As CBHs tm sido consideradas pelos pesquisadores como as principais enzimas do complexo celuloltico por sua capacidade de hidrolisar celulose microcristalina (NIDETZKY et al., 1994). Duas celobiohidrolases (CBH I e CBH II) j foram identificadas e

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caracterizadas em T. reesei, sendo que a CBH I parece ser a de maior importncia no complexo celuloltico natural, pois constitui aproximadamente 60% da protena produzida pelo fungo. Acredita-se tambm que todas as celobiohidrolases (CBHs) possuam ao cataltica capaz de hidrolisar preparaes celulsicas microcristalinas, pois atuam nas regies terminais das molculas de celulose e promovem a sua despolimerizao gradativa, atravs da remoo de unidades de celobiose terminais (SALOHEIMO et al., 1993; KOIVULA, 1994). Baseado em critrios estruturais e funcionais, a estrutura molecular das CBHs e EGs pode ser dividida em trs diferentes domnios: a) um domnio de ligao celulose (DLC, ou CBD como em cellulosebinding domain); b) um peptdeo de ligao (PL, ou linker); c) um domnio cataltico (DC ou core protein); O domnio de ligao ao substrato (DLC) altamente conservado em celulases fngicas, geralmente apresentando 38 resduos de aminocidos de comprimento (Figura 19). Contendo duas ou trs pontes dissulfeto em uma estrutura em cunha hidrofbica com uma face hidroflica, o DLC est envolvido diretamente na adsoro da enzima ao substrato (TEERI et al., 1996). Alguns autores definem as celulases verdadeiras como aquelas capazes de adsorver fortemente sobre o substrato, atravs de seus DLCs (TEERI & KOIVULA, 1995a).
FIGURA 19 DOMNIO DE LIGAO DAS CELULASES AO SUBSTRATO, COM NFASE DISPOSIO PLANAR DOS TRS RESDUOS DE TIROSINA IDENTIFICADOS COMO Y492, Y493 E Y466

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O mecanismo de adsoro dos DLC celulose no inteiramente conhecido, porm a presena de aminocidos aromticos (triptofano e tirosina) sugere que estes resduos tm um papel fundamental nesta ligao (REINIKAINEN, 1994), definindo a superfcie da celulose a que as enzimas adsorvem preferencialmente. Dois mecanismos foram sugeridos para explicar o efeito favorvel que os DLC apresentam sobre a atividade celulsica (TEERI et al., 1997b): um baseia-se no aumento da concentrao efetiva de enzima na superfcie do substrato; o outro sugere que os DLC esto envolvidos na ruptura de ligaes no covalentes que estruturam a celulose, contribuindo para o aumento da rea superficial semelhana do papel atribudo por E. Reese a um hipottico fator C1. Foi demonstrado que a remoo do CBD, gentica ou enzimaticamente, afeta a atividade enzimtica. A remoo do DLC da enzima CenA, existente na bactria Cellulomonas fimi, reduz a atividade da enzima sobre Avicel em cerca de 2050% e, em celulose bacteriana, em cerca de 80%. Simultaneamente, verifica-se o aumento da atividade sobre Avicel amorfa e carboximetilcelulose (TEERI et al., 1990). No caso das enzimas CBH I e II, a remoo do CBD implica em uma reduo da atividade em Avicel de cerca de 85 e 50%, respectivamente, mas no altera a atividade sobre compostos solveis (TEERI et al., 1998). Os peptdeos de ligao de celulases fngicas no esto obrigatoriamente conservados na seqncia primria, mas so ricos em treonina, prolina e/ou serina. O efeito estrutural destas seqncias sugere uma inibio da formao de uma -hlice, criando ento uma conexo flexvel entre os domnios cataltico (DC) e o DLC. A resoluo da estrutura tridimensional dos domnios catalticos das celulases por cristalografia de raios-X representou um importante marco para o esclarecimento dos seus modos de ao cataltica (SARKO, 1986; PILZ et al., 1990). As exoglucanases possuem um stio ativo em forma de tnel, mais fechado do que o das endoglucanases, o que restringe a sua ao hidroltica s extremidades da cadeia de celulose (Figura 20). Esta caracterstica intramolecular tem sido utilizada para

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distinguir as exo- das endoglucanases (CLAEYSSENS et al., 1990).

FIGURA 20 ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO DOMNIO CATALTICO ATRIBUDO EXOGLUCANASES (A) E ENDOGLUCANASES (B)

A estrutura das endoglucanases do T. reesei ainda no foram totalmente resolvidas, mas a estrutura da Endoglucanase I do Humicola insolens apresenta um sitio ativo em forma de fenda, distinto do das celobiohidrolases, o que aparentemente restringe a sua ao hidroltica ao interior das cadeias de celulose. A Figura 20 procura representar as diferenas na estrutura do domnio cataltico que esto associadas ao tipo de atividade das celulases, seja do tipo endo ou exo (DIVNE et al., 1994; CARRARD, et al. 1999 ; TENKANEN et al., 1999). geralmente assumido que o mecanismo de reao catalisada pelas glucohidrolases, incluindo xilanases e celulases, um mecanismo de reao do tipo cido-base. Duas molculas localizadas no centro do domnio cataltico esto envolvidas nesta reao. Uma atua como catalisador cido (cido glutmico) e promove a protonao do tomo de oxignio da ligao glicosdica. Conforme o mecanismo esta ao resulta na reteno estereoqumica do carbono anomrico (Figura 21A), ou mesmo na sua inverso (Figura 21B) (LINKO, 1993; RTT et al., 1997). A outra (cido asprtico) atua como nucleoflica, podendo interagir eletrostaticamente com o ction intermedirio, no caso das enzimas com reteno de configurao anomrica, ou promovendo a formao de um grupo hidroxlico a partir de uma

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molcula de gua, nos casos em que se d inverso da configurao (STAHLBERG et al., 1995). Este mecanismo foi proposto com base na homologia dos centros ativos destas enzimas com o da lisozima.
FIGURA 21 MECANISMO DE AO DOS CIDOS GLUTMICO E ASPRTICO NO DOMNIO CATALTICO DE EXOGLUCANASES E ENDOGLUCANASES (RTT et al., 1997): (A) RETENO E (B) INVERSO ESTEREOQUMICA DO CARBONO ANOMRICO
A B

Acredita-se que devido a maior dimenso do seu stio ativo, a CBH I tende a permanecer mais tempo ligada celulose do que a CBH II, hidrolisando um maior nmero de ligaes antes da sua dessoro (SRISODSUK, 1994). No entanto, as duas enzimas so distintas quanto ao carter sequencial do seu modo de atuao, embora esta afirmativa necessite de confirmao (WOHLFARHRT et al., 1997). O mecanismo de ao da CBH I e da EG II mantm a configurao dos glicosdeos, enquanto que a ao de CBH II inverte a sua configurao. Os domnios catalticos das celulases e xilanases podem ser classificados em famlias, de acordo com o grau de homologia da sequncia de aminocidos. Atualmente, a classificao de glucanases, incluindo quitinases, amilases, -(1,3)glucanases, alm de xilanases e celulases, inclui 45 famlias de enzimas. Algumas destas famlias contm enzimas com diferentes especificidades. Por exemplo, a famlia

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C inclui endoglucanases e celobiohidrolases e a famlia D contm -(1,3)-glucanases e -(1,4)-glucanases (NIDETZKY et al., 1994). A elucidao do modo de ao cataltica das celulases tem norteado as pesquisas envolvendo a construo de microrganismos capazes de produzir, em alto ttulo, enzimas celulsicas com propriedades variadas que se caracterizam por uma alta atividade especfica. Desta forma, atravs da investigao das propriedades destas enzimas de quarta gerao, o mecanismo de ao sinergstica das celulases poder ser definitivamente elucidado (TEERI et al., 1994; MNTYLA et al., 1998). Os genes de EG I, EG II, CBH I e CBH II podem ser manipulados em T. reesei, resultando em cepas recombinantes onde, nas celulases produzidas, a atividade de qualquer um dos referidos componentes no se encontra presente (SUOMINEN et al., 1993; KARHUNEN et al., 1993; NEVALAINEN et al., 1991). Na Tabela 7 esto representadas as celulases e suas organizaes estruturais. Nesta classificao, o tipo de famlia est associada estrutura de resduos de aminocidos e a sua relao com o seu ponto isoeltrico.
TABELA 7 PROPRIEDADES E ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DAS CELULASES DE T. reesei (BUCHERT & HEIKINHEIMO, 1998) Enzima Famlia Resduos de Massa Ponto aminocidos Molecular Isoeltrico (KDa) (pI) 437 397 218 326 225 497 447 50-55 48 25 (37) (23)
a a

Organizao Estrutural 368 36 34 218 233 166 430 36 44 365 23 36 31 36 56 37 327 33 36

EG I EG II EG III EG IV EG V CBH I CBH II

a

7 5 12 61 45 7 6

4,6 5,5 7,4 2,8-3 3,5-4,2 5,1-6,3

59-68 50-58

Massa molecular calculada a partir da sequncia de aminocidos; Domnio Cataltico Regio de Ligao Domnio de Ligao Celulose

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3.5.2.1 Exoglucanases As Exo-1,4--D-glucanases atuam cataliticamente removendo glucose ou celobiose a partir de uma das extremidades da cadeia de celulose, redutora ou no redutora, conforme o tipo da enzima em questo (SADDLER, 1986). Estas enzimas no atuam sobre celobiose, nem sobre celuloses solveis, por haver um impedimento estereoqumico causado pelos grupos substituintes, seja carboximetlico (em CMC) ou hidroxietlico (em HEC). Alguns autores afirmam que estas enzimas podem causar um aumento do poder redutor de solues de CMC, o que atribudo hidrlise de ligaes nas extremidades da molcula, envolvendo resduos no substituidos (TEERI et al., 1995b; SUURNKKI et al., 1997). As exoglucanases atuam tambm sobre celulose amorfa, produzindo uma gradual reduo do grau de polimerizao. Apresentam uma atividade sobre Avicele outras celuloses com elevada cristalinidade que superior das endoglucanases. Por esse fato, os ensaios de atividade sobre carboximetilcelulose (caracterstico de EGs) e Avicel (caracterstico de CBHs) so habitualmente utilizados na diferenciao desses tipos de enzimas. Neste contexto, a atividade sobre Avicel deve ser entendida como a solubilizao mxima conseguida pelas enzimas, e no como a velocidade inicial de hidrlise (STAHLBERG et al., 1995). A CBH I a enzima produzida em maior quantidade pelo T. reesei, podendo constituir cerca de 60% do total de protena liberada para o meio de cultura (EVELEIGH et al., 1985). Em sua composio foram identificados 497 aminocidos, com uma variao na massa molecular de 59 68 kDa, que apresenta razovel homologia com a EG I (T. reesei) e com endoglucanases de outros fungos como Phanerochaete crysosporium, Humicola grisea e T. viride (HENRISSAT et al., 1985). Seu ponto isoeltrico (pI) encontra-se na faixa entre 3,5 e 4,2, variao esta atribuda diferentes nveis de glicosilao e a ocorrncia de mltiplas isoformas (KLEMANLEYER et al., 1996).

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A anlise qumica da CBH I resultou em diferentes valores de massa molecular, que podem ser explicados pela presena e atuao de proteases nas formulaes. Portanto, nos ensaios em que a massa molecular relativa era inicialmente de 65 kDa, esse valor diminuiu para aproximadamente 58 kDa num estgio de purificao (NEVALAINEN & PENTILL, 1995). A separao das celobiohidrolases por cromatografia de afinidade foi muito aceita por utilizar apenas diferentes concentraes de celobiose para remover as CBHs das colunas de afinidade, enquanto que na separao atravs de resinas de troca aninica (Bio-Gel A), a CBH I fica retida na coluna juntamente com outras enzimas ,sendo eluda da coluna com gradiente de fosfato ou cloreto de sdio. A purificao da CBH I pode ento ser obtida por cromatografia de afinidade em Avicel, mediante um gradiente de pH (BELDMAN et al, 1988). O stio cataltico da CBH I formado por um tnel que se prolonga 40 (ou 400 nm) no interior da protena, acomodando uma nica cadeia de celulose. Compreende 7 substios (A-G), dos quais 4 contm resduos de triptofano, que se admite serem importantes no processo de ligao do domnio cataltico ao substrato. Ao contrrio da CBH II (vide abaixo), a CBH I ataca a celulose a partir da extremidade redutora (TEERI et al., 1995b). uma enzima tipicamente ativa em celulose cristalina, no atuando sobre celulose modificada, carboximetilcelulose (CMC), hidroxietilcelulose (HEC) ou -glucana da cevada (STAHLBERG et al., 1995). A conformao diagramtica da enzima CBH I apresenta a forma denominada de "girino", com um comprimento total de 18 nm. No terminal carboxlico encontra-se no domnio de ligao celulose (DLC), que composto por duas faces distintas: uma chamada de face plana, que contm trs unidades de tirosinas, e outra chamada face desigual, localizada em oposio anterior (Figura 14). Acredita-se que o DLC, alm da adsoro celulose, pode ser tambm responsvel pela desagregao da estrutura intermolecular do polmero (TEERI,

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1997b), pois estudos mostraram que a remoo do DLS elimina a capacidade da enzima em atuar sobre a celulose microcristalina (REINIKAINEN, 1994). As trs regies que compem a CBH I encontram-se representadas na Figura 22 .
FIGURA 22 - ESTRUTURA DIAGRAMTICA DA CBH I ISOLADA DE T. reesei QM9414, COM NFASE NAS DIMENSES DA ENZIMA COMPLETA, DO PEPTDEO DE LIGAO (PL), DE SEU DOMNIO CATALTICO (DC) (HAYN, 1993; TEERI, 1999) E DE SUA INTERAO COM OS BLOCOS CONSTRUTIVOS DA CELULOSE MICROCRISTALINA

A CBH II representa cerca de 20% da protena total liberada pelo T. reesei. Em sua estrutura so encontrados 447 aminocidos, gerando uma massa molecular mdia entre 50-58 kDa. Seu ponto isoeltrico varia entre 5,1 e 6,3 (TEERI et al., 1999). A enzima encontra-se em grande quantidade ligada superficie dos condios e ultrapassa nessa estrutura biolgica a concentrao de qualquer outra celulase. Segundo BELDMAN et al. (1988), a CBH II catalisa a hidrlise da celulose em celobiose e glucose, tendo a celobiose como o primeiro produto da reao mas sendo capaz de convert-la posteriormente glucose. Estes resultados foram porm contrariados por NIDETZKY et al. (1994), ao afirmarem que a celobiose no um bom substrato para a enzima. A atividade sobre Avicel da CBH II duas vezes superior s endoglucanases I ou II, no apresenta atividade xilansica e tem baixa atividade sobre celotriose. Quando se estuda a cintica com substratos de GP de 3 a 6, verifica-se que o Km decresce e a velocidade mxima aumenta medida que o GP se

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aproxima de 6. O primeiro domnio cataltico a ser resolvido foi o da CBH II (Figura 20A). Sabe-se que o stio ativo constitudo por um tnel com 20 (ou 200 nm) de comprimento, contendo pelo menos 4 substios (A-D) de ligao cadeia de celulose. A catlise tem lugar entre os substios B e C por inverso da configurao anomrica, enquanto que a forma em tnel do stio ativo aparentemente limita o ataque enzimtico s extremidades no redutoras. As propriedades catalticas da CBH II so semelhantes s da CBH I, mas foi descrita tambm atividade sobre a -glucana da cevada. De acordo com os resultados de CHANZY (1990), a comparao da CBH II e da CBH I indica que a CBH I uma exoglucanase restrita. Suas dimenses em comparao estrutura cristalina da celulose pode ser vista na Figura 22, enquanto que a Figura 23 ilustra a ao progressiva da CBH I sobre a superfcie da celulose (DIVNE et al., 1994), com a subsequente liberao de celobiose a partir da extremidade superior do tnel localizado no domnio cataltico.
FIGURA 23 ASSOCIAO DA CBH I SUPERFCIE DAS MICROFIBRILAS DE CELULOSE (DIVNE et al., 1994), SUGERINDO AO PROGRESSIVA COM A SUBSEQUENTE LIBERAO DE CELOBIOSE A PARTIR DA EXTREMIDADE DO TNEL

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3.5.2.2 Endoglucanases As endo-1,4--D-glucanases hidrolisam as cadeias de celulose de modo aleatrio. Estas enzimas hidrolisam celulose amorfa e celuloses modificadas quimicamente (solveis) como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose. A celulose microcristalina e o algodo, ambos substratos com elevado grau de cristalinidade, so menos hidrolisados devido ao maior grau de organizao molecular que apresentam. Como j foi mencionado, todas as EGs possuem um domnio cataltico, um peptdeo de ligao (linker) e um DLC, com exceo dada EG III, que s possui o domnio cataltico (DC). Embora no tenha ainda determinada completamente a estrutura das endoglucanases do T. reesei, estudos mostram que a estrutura da EG I do Humicola insolens apresenta um stio ativo em forma de fenda (MACKENZIE et al., 1998). A EG I exibe uma elevada atividade sobre substratos solveis e relativamente baixa sobre celulose cristalina. uma protena constituda por 437 aminocidos, dos quais 363 fazem parte do domnio cataltico que se situa junto ao terminal amnico. Possui uma massa molecular de 50 kDa e um ponto isoeltrico de 4,6. No hidrolisa a celobiose e no sofre inibio por este composto, o que pode ser usado para distingui-la da CBH I. A EG I pode tambm hidrolisar xilanas, ao contrrio das celobiohidrolases (KOTIRANTA et al., 1999). Estudos cinticos demonstraram que endoglucanases como a EG I, sempre que ativas na hidrlise de xilanas, apresentam tambm uma maior afinidade para as ligaes glicosdicas (1-4) da celulose (SIIKA-AHO et al., 1995). A enzima EG I pertence mesma famlia da CBH I (CLARKE, 1999) retendo, de igual modo, a configurao b da celobiose aps o processo hidroltico. uma glicoprotena e, dos carbohidratos que a compe, a manose o de presena majoritria (73%). O gene que codifica para a EG I foi isolado a partir de dois mutantes da espcie T. reesei, sendo que ambos revelaram uma sequncia de bases

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idntica . A EG II, anteriormente designada EG III, uma protena com 397 aminocidos, 48 kDa dos quais 15% so carbohidratos, correspondendo a 47 hexoses (SALOHEIMO et al., 1994). So tambm conhecidas referncias a 6% de carbohidratos e um ponto isoeltrico de 5,5 (GOYAL et al., 1991). A EG II corresponde apenas de 0,5% (p/v) da protena total secretada no extrato enzimtico de T. reesei. A 30 C, a enzima estvel desde pH 3,0 a 8,0 mas, quando a temperatura de 55C, a estabilidade s se verifica entre pH 4,0 e 6,3. Para a celotriose, a atividade mxima observa-se entre o pH 4,0 e 5,0; contudo, quando o substrato CMC, a atividade mxima determinada precisamente a pH 4,8 (KLEYWEGT et al., 1997). Outras endoglucanases de baixa massa molecular foram identificadas e purificadas a partir do sistema celuloltico de T. reesei. Estas enzimas apresentaram atividade de desfibramento em celulose cristalina, alm de uma elevada atividade sobre CMC e substratos cromognicos (BELDMAN et al., 1988). Outros estudos demonstraram que o T. reesei realmente apresenta dois genes que codificam para pequenas protenas de atividade endoglucansica e estes provavelmente correspondem s EGs III e V (SALOHEIMO et al., 1997b). Em um primeiro trabalho, BELDMAN et al. (1988) apresentaram um grupo de enzimas com caractersticas distintas das outras endoglucanases como: baixa atividade quando o substrato CMC e alta atividade com Avicel, designando-as de EG III. Esta enzima foi a segunda EG caracterizada, sendo que treis subespcies j foram purificadas (KUBICEK,1992).Estas liberam como produtos da reao celotriose, celobiose e glucose. Quando em conjunto com as exoglucanases (mas no com as endoglucanases) resulta incremento significativo na capacidade cataltica. Baseado nessas caractersticas, SALOHEIMO (1988) e colaboradores a classificaram como sendo uma endoglucanase. Este pequeno grupo de enzimas possui uma massa molecular entre 20 e 23,5 kDa ( EVELEIGH, et al. 1985).

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A EG IV (BELDMAN et al., 1988) uma enzima aparentemente pouco especfica e pode igualmente catalisar a hidrlise de xilana, levando alguns autores a design-la inicialmente como uma xiloglucanase. Quando atua sobre a xilana, os produtos da reao so principalmente a xilobiose, xilotriose e suas ligaes com arabinose. No catalisa a hidrlise das ligaes entre arabinoses, assim como no catalisa a hidrlise de pequenos xilo-oligossacardeos. Catalisa, no entanto, a hidrlise de xilo-oligossacardeos de maior massa molecular (BELDMAN et al., 1988). Finalmente, SALOHEIMO et al (1994) determinaram a estrutura primria de uma endoglucanase de 25 kDa com base em um gene de T. reesei. Esta enzima, designada de EG V, apresentou menor afinidade ao substrato quando comparada EG I. Ensaios de viscosidade indicaram atividade sobre CMC, ao mesmo tempo em que houve um aumento no poder redutor do meio de reao (BELDMAN at al., 1988).

3.5.2.3 -Glucosidases A -glucosidase, tambm denominada celobiase, possui a principal funo de desdobrar a celobiose gerada pelas CBHs e EGs em glucose. No estritamente uma celulase, mas tem uma funo importante na hidrlise da celulose porque a celobiose tem uma forte ao inibitria sobre endoglucanases e exoglucanases. A caracterizao e correspondente nomenclatura das -glucosidases existentes nos fungo da espcie T. reesei um assunto que ainda no se encontra devidamente esclarecido, havendo diferentes resultados experimentais cuja

interpretao diverge no nmero e caracterizao de -glucosidases que o fungo pode sintetizar. Assim, foram descritos vrios tipos de -glucosidases para a espcie T. reesei, sendo duas destas enzimas segregadas para o exterior da clula. Uma delas tem uma massa molecular relativa de 47 kDa e a outra, 76 kDa (SALOHEIMO et al, 1993). Uma -glucosidase intracelular foi descrita como tendo uma massa molecular relativa de 98 kDa (REINIKANEN, 1994). O pH timo desta enzima 6,8 e o seu

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ponto isoeltrico, 4,4. A partir do sobrenadante de culturas do fungo, JACKSON & TALBURT (1988) isolaram uma -glucosidase com massa molecular relativa de 78,5 kDa e um ponto isoeltrico de 8,35. Esta enzima tambm encontra-se presente na membrana celular. BELDMAN e colaboradores (1988) descreveram uma outra -glucosidase em T. reesei que tem atividade sobre substratos como p-nitrofenil--glucopiranosdeo, p-nitrofenil--xilopiranosdeo, CMC, Avicel e xilanas, mas incapaz de exercer atividade sobre celobiose. A enzima tem massa molecular relativa de 71 kDa, ponto isoeltrico de 8,7 e contm 0,12% de carbohidratos. A sua temperatura tima de 65 a 70C e o pH timo, de 4,6. A baixa atividade especfica desta enzima, assim como a sua elevada massa molecular, levaram alguns autores a sugerir que o processo de isolamento no permitiu com que fosse obtida no estado puro, mas sim como um conjunto de sacaridases que podem somente ser separadas em condies desnaturantes. Tudo indica que pelo menos um tipo de -glucosidade constitutiva em T. reesei e est principalmente localizada em uma zona semelhante ao periplasma das bactrias. Dados obtidos por UMILE & KUBICEK (1986) demonstraram que a maior parte da enzima constitutiva est realmente ligada membrana celular. A -glucosidase, ao degradar a celobiose, tem uma funo fisiolgica importante, diminuindo a concentrao de um potente inibidor das celulases. Outra funo da -glucosidase pode no estar relacionada com a degradao da celulose, mas sim com a formao da parede celular durante a conidiognese. Segundo STUTZENBERGER (1990), citado por NEVALAINEN & PENTILLA (1995), comparando-se a termoestabilidade das -glucosidases de origem bacteriana e fngica, pode-se concluir que no caso das bactrias as diferentes -glucosidases tm uma temperatura tima abaixo daquela que caracterstica do crescimento da espcie que a produz, enquanto nos fungos, se verifica o oposto . -glucosidase isolada da espcie T. reesei evidencia inibio pelo

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substrato

quando

este

celobiose

ou

salicina

(lcool

2-O--D-benzil-

glucopiranosdeo), mas o mesmo no acontece com o nitrofenil--D-glucopiranosdeo. A enzima sofre inibio competitiva na presena de glucose, maltose e frutose, enquanto que o p-nitrofenol um inibidor no competitivo. Outro inibidor conhecido a gluconolactona. Finalmente, o estudo da atuao da -glucosidase revela um mecanismo de reteno da configurao anomrica do produto da reao, a -Dglucopiranose (MATA et al., 1992).

3.5.3 Determinao da Atividade Enzimtica em Preparaes Celulsicas A caracterizao das enzimas celulolticas levanta dificuldades que raramente so encontradas no estudo de hidrolases. A heterogeneidade dos substratos celulsicos, bem como a multiplicidade e complexidade do modo de ao sinergstico dos sistemas celulolticos, esto na origem dessas dificuldades. Portanto, uma grande variedade de substratos, desde celuloses nativas preparaes modificadas, tem sido empregada na caracterizao das enzimas responsveis pela sacarificao da celulose. Por outro lado, diferentes ensaios enzimticos tm sido adotados por diferentes investigadores, o que muitas vezes torna difcil a comparao entre os resultados apresentados na literatura (REINIKAINEN, 1994). Numa tentativa de corrigir esta situao, a Comisso de Biotecnologia da International Union of Pure Applied Chemistry (IUPAC) fez publicar, em 1987, uma srie de procedimentos de referncia (GHOSE, 1987) que foram imediatamente adotados por muitos laboratrios. Os procedimentos recomendados so normalmente utilizados na deteco e rastreio de atividades celulolticas e, em alguns casos, so tambm utilizados em estudos de enzimologia. Os principais substratos utilizados para estas finalidades incluem a carboximetilcelulose (CMC), hidroxietilcelulose (HEC) a Avicel (celulose microcristalina comercial) e o p-nitrofenil--D-glucopiranosdeo (p

NFG),

teis

para

deteco

de

atividades

endoglucansica

(CMCase),

60

celobiohidrolsica

(Avicelase)

-glucosidsica

(PNFGase),

respectivamente

(EVELEIGH, et al. 1991). A atividade especfica sobre papel de filtro recomendada para a medio da atividade celuloltica total, sendo expressa em Unidades de Papel de Filtro (UPF), pois este substrato contm ambas as formas de organizao estrutural da celulose, amorfa e cristalina. A atividade endoglucansica, como j foi dito, medida usando CMC mas substratos alternativos como a hidroxietilcelulose (HEC) vm sendo crescentemente utilizados devido a sua maior solubilidade em gua e facilidade de manuseio. Finalmente, a atividade de -glucosidase deve ser medida atravs da ao sobre pNFG mas a converso de celobiose em glucose muitas vezes mais representativa do processo de sacarificao. Assim, define-se o termo atividade celobisica, que corresponde apenas a uma frao da atividade -glucosidsica total do sistema celulsico. Nos dois primeiros casos (atividades endo e exoglucansicas), o mtodo do cido dinitrosaliclico (DNS) usado na medio dos acares redutores liberados por hidrlise enzimtica, enquanto que no terceiro caso (atividade celobisica), a glucose formada medida pelo mtodo da glucose oxidase (GHOSE, 1987). Todavia, o emprego de mtodos cromatogrficos, como as cromatografias de troca inica e de filtrao em gel (cromatografia de excluso), em muitos casos til para a compreenso dos mecanismos de catlise enzimtica, assim como a utilizao de outros substratos que exibem diferentes propriedades estruturais. A utilizao de diferentes substratos para a caracterizao de enzimas celulolticas tm propiciado indiscutveis progressos no esclarecimento das diferenas de especificidade entre os diversos tipos de celulases, no impedindo no entanto que persistam algumas dvidas na questo essencial da distino entre as atividades endo e exo. Assim, mtodos utilizados para a medio do grau de polimerizao da celulose (viscosimetria capilar em solues de etilenodiamina cprica e cromatografia de excluso a partir de derivados solveis em solventes orgnicos) permitem uma melhor avaliao do processo de despolimerizao, particularmente aquele resultante de aes

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endoglucansicas ( GOYAL, et al. 1991; CLAEYSSENS & AERTS, 1992). Um conhecimento mais profundo destas enzimas tem sido acompanhado da proposta de novas metodologias, que permitem uma aferio mais conveniente de suas propriedades catalticas. Entre outros, deve-se destacar o estudo da despolimerizao de substratos solveis e insolveis por viscosimetria ou cromatografia de excluso (KLEMAN-LEYER, 1992; 1994; RAMOS et al., 1993, 1999), a medio por colorimetria das extremidades redutoras geradas em substratos insolveis (GAMA et al., 1994), e o desenvolvimento de novos mtodos colorimtricos que se utilizam de glicosdeos cujas agliconas correspondem a cromforos de alta absortividade molar. Na Tabela 8 esto apresentados mtodos de ensaios diversos para enzimas celulicas e glucosidsicas sobre diversos substratos segundo CLARKE (1999).
TABELA 8 - MTODOS UTILIZADOS PARA MEDIR ATIVIDADES CELULOLTICAS E GLUCOSIDSICAS EM PREPARAES ENZIMTICAS SUBSTRATOS Carboximetilcelulose Hidroxietilcelulose celulose inchada com cido fosfrico celulose tingida Endo 4-metilumbeliferil--D-celotriosdeo (EG II)1 4-metilumbeliferil--D-celobiosdeo (EG I)1 celo-oligossacardeos solveis Avicel Sigmacell celulose bacteriana Exo 4-metilumbeliferil--D-celobiosdeo2 p-nitrofenil--lactosdeo2 celo-oligossacardeos insolveis Algodo Total papel de filtro p-nitrofenil--glucosdeo O-nitrofenil--glucosdeo 4-metilumbeliferil--D-glucosdeo -Glucosidases salicina esculina celobiose celo-oligossacardeos insolveis Celulases Celulases
1

ENZIMAS

MTODO DE DETECO acar redutor reduo na viscosidade acar redutor colorimetria espectrometria de fluorescncia acar redutor, CLAE acar redutor, CLAE acar redutor espectrometria de fluorescncia espectrometria no ultravioleta acar redutor, CLAE acar redutor, CLAE espectrometria no ultravioleta espectrometria de fluorescncia glucose, acar redutor glucose, CLAE acar redutor

Ensaios realizados na presena dos inibidores de -glucosidases (glucono-1,5-lactona) e celobiohidrolases (celobiose); Ensaio realizado na presena de glucono-1,5-lactona (-glucosidases).

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A reao de carbanilao, seguida de anlise por cromatografia de permeao em gel do derivado solubilizado em tetrahidrofurano, tem sido utilizada como mtodo para determinar a distribuio do grau de polimerizao da celulose. Os primeiros estudos feitos por VALTASSARI & SAARELA (1975) comprovam as vantagens de estabilidade do derivado tricarbanilado em relao ao trinitrato, que era inicialmente empregado para esta funo. A calibrao do mtodo consiste na relao entre o volume de eluio e a massa molecular (MM) de padres monodispersos de poliestireno, gerando massas moleculares aparentes (ou seja, em relao ao poliestireno) que so por sua vez convertidas em grau de polimerizao por calibrao universal. Esta calibrao baseiase na considerao terica de que, sob as mesmas condies experimentais, polmeros que apresentam o mesmo volume de eluio (ou de volume hidrodinmico equivalente) tambm apresentam equivalncia entre as suas viscosidades intrnsecas ([]). Os clculos so baseados na relao [] = K x MM com base nas constantes de

Mark-Houwink (K e ) para o poliestireno e para os derivados tricarbanilados em THF. Uma vez calibrado o sistema analtico, podem ser comparados polmeros de natureza qumica distinta, possibilitando assim a determinao do grau de polimerizao da celulose apesar de no existirem padres comerciais monodispersos de celulose per-carbanilada (WOOD et al.,1986; COLL, 1970). Enfim, todos os mtodos descritos permitem a obteno de informaes complementares para a caracterizao de complexos celulsicos, mas a anlise dos resultados deve ser feita tendo sempre em mente que os substratos so, principalmente no caso das celuloses solveis e dos oligossacardeos e seus derivados cromognicos, muito diferentes dos substratos naturais. Nesses casos, importante considerar que o modo de ao das enzimas tambm ser influenciado por fenmenos associados catlise heterognea (adsoro), como alteraes na rea superficial, distribuio de cargas e porosidade de substratos celulsicos de natureza fibrosa (HORII, F. 1987; TEERI, 1990). Certamente, esses fatores, ligados diretamente s caractersticas

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estruturais do substrato, tm marcada influncia sobre a maneira pela qual as enzimas estabelecem interaes produtivas, ou seja, aquelas que efetivamente resultam em atividade cataltica (MOONEY et al., 1999).

3.6 SINERGISMO A degradao da celulose feita pela ao de trs grupos de enzimas que atuam sinergicamente, as CBHs, as EGs e as -glucosidades. Os diferentes grupos de enzimas atuam de forma cooperativa, causando a hidrlise completa da celulose at glucose (HIGUCHI 1985; ERIKSSON et al., 1990; EVANS et al., 1994). As trs classes de enzimas celulolticas, atravs de suas propriedades complementares, apresentam um alto grau de sinergismo durante a hidrlise da celulose. Este sinergismo decorre da observao de que a atividade efetiva do complexo resulta em taxas de degradao superiores quelas correspondentes somatria das atividades individuais de cada enzima sobre o mesmo substrato. Assim, a atividade hidroltica da mistura superior soma das atividades individuais das enzimas. Este efeito de sinergia, como j foi dito, normalmente observado em substratos celulsicos de alta organizao estrutural, mas no em celuloses solveis e de baixo grau de polimerizao (HENRISSAT et al.,1985). Os modelos preliminares explicativos do fenmeno de sinergia, apresentados por REESE desde 1950, descreviam a sinergia como o resultado das atividades das endoglucanases, designadas Cx, com um fator no cataltico e independente, C1, que seria responsvel pela quebra de ligaes de hidrognio na regio cristalina da celulose, desse modo facilitando a ao das endoglucanases. Todavia, nunca foi encontrada qualquer evidncia experimental do fator C1 e os modelos posteriores abandonaram esse conceito. O estudo dos sistemas enzimticos de Phanaerochate crhysosporium (ERIKSSON et al.,1990) e de T. koningii (WOOD, 1978) conduziram descoberta e caracterizao das celobiohidrolases, bem como da sinergia desta enzima

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com endoglucanases e -glucosidases. Considera-se que as CBHs atuam sequencialmente, sendo que a sua atividade dependente da hidrlise aleatria elicitada pelas endoglucanases, preferencialmente em zonas amorfas. Desse modo, as endoglucanases aumentam a atividade das exoglucanases por aumentarem a disponibilidade de grupos terminais redutores e no redutores. Nem todas as endoglucanases e exoglucanases apresentam o mesmo grau de sinergia e a proporo dos dois tipos de enzima e sua otimizao na reao depende da origem das enzimas utilizadas. Alguns autores (BAKER et al.,1995) sugeriram que as enzimas que atuam sinergicamente poderiam formar um complexo e que nem todas as enzimas estabeleceriam entre si essas interaes. A sinergia acontece, em muitos casos, entre enzimas com diferente origem microbiana (MACKENZIE et al.,1998) sem qualquer padro estrutural evidente e comum entre elas, aos nveis de especificidade da hidrlise, organizao estrutural ou funcional. Este fato sugere que haja alguma interaes entre molculas. Por outro lado, a verificao de que a adio sequencial de endoglucanases e exoglucanases ao meio de reao, com inativao da primeira enzima antes da adio da segunda, mostra que a sinergia no depende da formao desse tipo de complexos (NIDETZKY et al., 1994). Foi tambm sugerido que a associao das enzimas com substratos poderia ser a chave para o fenmeno de sinergia, implicando em interaes entre protenas que favoreceriam um equilbrio dinmico entre a soluo e a superfcie da celulose. Os DLCs das diferentes enzimas poderiam ento estar na origem da preferncia das enzimas por determinadas zonas da superfcie da celulose, sendo responsveis pelos diferentes graus de sinergia apresentados por diferentes combinaes de

endoglucanases e exoglucanases. Um outro aspecto da atividade das enzimas que pode ter relevncia para a sinergia o carter sequencial da hidrlise. As enzimas que hidrolisam apenas uma ligao qumica ao adsorver, seriam mais favorveis sinergia com outras enzimas de ao cataltica complementar (CLARKE,1999).

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Alguns autores detectaram tambm sinergia entre celobiohidrolases. Este tipo de sinergia poderia ser explicado, segundo WOOD (1991), admitindo-se que as celobiohidrolases so especficas a um nvel estereoqumico, cada uma delas preferiria uma das duas possveis configuraes dos resduos celobiosdicos expostos na superfcie da celulose. Outra explicao, tambm no fundamentada

experimentalmente, a de que as duas celobiohidrolases poderiam hidrolisar preferencialmente as celuloses I ou I. Todavia, em relao a qualquer dos tipos de sinergia, subsiste a dvida quanto ao grau de pureza das enzimas utilizadas. A obteno de enzimas puras muito difcil. A contaminao, por exemplo, de uma exoglucanase por uma endoglucanase, ainda que em teores muito baixos, pode alterar significativamente a atividade exibida pela protena (REINIKAINEN et al., 1995). Por outro lado, tambm questionvel se as CBH I so exoglucanases estritas ou se podero apresentar alguma atividade hidroltica no interior da cadeia de celulose. Utilizando uma metodologia de medio do poder redutor de fibras insolveis para medio da atividade endoglucansica (GAMA et al., 1994), STAHLBERG (1995) observou atividade CMCsica em uma amostra de CBH I purificada, sugerindo que as exoglucanases, apesar de preferirem atacar a molcula de celulose a partir de uma extremidade, podero tambm atuar no meio da cadeia. Nesse caso, a sinergia do tipo endo-exo verifica-se tambm em misturas de exoglucanases. Um aspecto essencial relacionado sinergia tem a ver com os substratos utilizados. De fato, a eficincia do ataque enzimtico depende das propriedades estruturais dos substratos, como a cristalinidade (e tipo de malha cristalina), o teor em outros compostos, a rea superficial, a porosidade, o grau de polimerizao, a forma e o tamanho das partculas. A influncia destas propriedades no modo de ao das enzimas capital, podendo estar relacionada com o grau de sinergia verificado, com o carter sequencial da hidrlise e com os parmetros cinticos de cada enzima. A elevada afinidade dos DLCs pelas fibras de celulose levou alguns autores a especular sobre as vantagens de um tratamento das fibras com DLCs purificados. DIN

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(1991) detectaram um efeito de fragmentao de fibras de celulose, no acompanhado de atividade hidroltica, que possui aplicao na modificao de fibras de pastas de papel e de algodo para a indstria txtil. Este tipo de atividade dos DLCs resulta na melhoria da textura de tecidos de algodo e no aumento da rea superficial e fora de ligao das fibras em pastas de papel.

3.7 SEPARAO DE CELULASES POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE BAIXA PRESSO (FAST PROTEIN LIQUID CHROMATOGRAPHY ) A compreenso do mecanismo de ao cataltico de celulases tem aumentado muito nas ltimas dcadas pela utilizao de componentes enzimticos purificados obtidos atravs de processos cromatogrficos seletivos e diferenciados (SALOHEIMO et al., 1993; VIIKARI et al., 1999). No entanto, a baixa seletividade obtida nos processos de purificao de cada componente enzimtico presente no sistema dificulta em muito qualquer concluso sobre a real misso que essas enzimas individualmente possuem no processo de sacarificao da celulose. Por exemplo, muito difcil garantir que a ocorrncia de pequenas quantidades de CBH II em preparaes endoglucansicas no venham a interferir no comportamento dessas ltimas enzimas sobre substratos celulsicos. Esses problemas tem sido gradualmente resolvidos atravs de estudos que empregam a engenharia gentica, onde procura-se clonar cada uma dessas enzimas em vetores capazes de produzi-las em alto rendimento e

facilitando sua subsequente purificao. Enzimas dessa natureza vm gradativamente sendo produzidas para melhor elucidao de suas funes catalticas. Uma outra alternativa que tem sido explorada por outros grupos o uso de sistemas celulsicos destitudos de um ou mais componentes importantes para o seu modo de ao cataltica. Essa estratgia permite com que se verifique, no a ao de um componente isoladamente, mas o que significa t-lo ausente do sistema celulsico como um todo. O mtodo de FPLC foi empregado

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para separao e purificao de celobiohidrolases completas e seu DC, afim de se obter rapidamente e em grande quantidade o DC destas celulases. O uso da FPLC foi registrado por MEDVE (1997) que realizou estudos com a finalidade de purificar as formas isomrficas de celulases de culturas de T. reesei. Nestes experimentos, conseguiu separar CBH I, CBH II e EG II comprovando que a metodologia poderia ser uma excelente ferramenta para isolamento de celulases.

Seguiram-se na mesma linha de ao os trabalhos feitos por SALOHEIMO et al. (1997a) e KOTIRANTA et al. (1999), que obtiveram celulases purificadas utilizando colunas Resource Q e Mono Q (Pharmacia Biotech). Diferenas significativas

apresentadas por este procedimentos analticos esto associadas aos diferentes gradientes de eluio utilizados para isolar as hidrolases. A deteco das protenas em FPLC foi realizada a 280 nm utilizando o conceito espectrofotomtrico de absoro molar neste comprimento de onda. Para o caso especfico das molculas que constituem as protenas, esta associao se d nos centros cromofricos dos seus peptdeos constituintes. As absortividades molares para as celulases so indicados por STAHLBERG (1995) como 78.800 L/mol.cm para CBH I para uma concentrao molar de 64 kg/mol; 92.000 L/mol para CBH II com 53 kg/mol e 78.000 L/mol para EG II com 48 kg/mol.

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4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Preparaes Enzimticas No presente, estudo foram utilizadas duas (02) preparaes comerciais e oito (08) preparaes celulsicas de cepas de Trichoderma reesei Recombinantes (PCTrR). As formulaes industriais (Celluclast 1,5L e Novozym 188 ) foram

gentilmente cedidas pela Novo Nordisk (Denmark). A Novozym 188 declarada pelo

fabricante como uma preparao puramente -(1,4)-glucosidsica produzida pelo fungo Aspergillus niger, enquanto que a Celluclast 1,5L uma preparao celulsica

(mistura exo e endo) produzida pelo Trichoderma reesei. As oito preparaes celulsicas provenientes de fungos modificados geneticamente foram gentilmente cedidas pela Primalco Biotechnology Ltd. (Finlndia), empresa que posteriormente foi incorporada pela Rhm Enzyme Finland Oy. As tcnicas utilizadas para a obteno das PCTrR utilizaram: (a) fermentao convencional das cepas de T. reesei em escala de bancada; (b) eliminao de um ou mais genes do genoma de T. reesei, especificamente aqueles que codificam para componentes enzimticos tidos como majoritrios para o complexo celulsico ( CBH I, CBH II, EG I e EG II), atravs da tcnica de high-frequency one-step gene replacement (nocaute de genes ) (NEVALAINEN, 1993; SUOMINEN et al., 1993; KARHUNEN et al., 1993); e (c) produo das PCTrR. Na Tabela 9 encontram-se apresentados os cdigos empregados neste estudo e suas sinonmias. A terminologia supresso isolada, supresso dupla e supresso tripla foi utilizada para definir a quantidade de genes eliminada do genoma padro, limitao esta definida em relao ao celulsica da cepa original de T. reesei. Portanto, a

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enzima A apresenta ao exocelulsica recessiva para Celobiohidrolase I (CBH I), mantendo as demais atividades especficas.
TABELA 9 - PREPARAES CELULSICAS DE TRICHODERMA REESEI GENETICAMENTE MODIFICADO (ROHM ENZYME FINLAND OY) E DAS FORMULAOES ENZIMTICAS COMERCIAIS (NOVO NORDISK). Cdigo A B C D E F G H Novozym 188

PCTrR Supresso isolada de CBH I Supresso isolada de CBH II Supresso isolada de EG I Supresso isolada de EG II Supresso dupla de CBH I e CBH II Supresso dupla de EG I e EG II Supresso tripla de EG II, CBH I e CBH II Supresso tripla de CBH II, EGI e EG II Preparao -(1,4)-glucosidsica (N188)

Celluclast 1.5L

Mistura de enzimas celulsicas (CL)

4.1.2 Substratos Os substratos utilizados nos ensaios com PCTrR, bem como os das formulaes enzimticas comerciais, foram divididos em dois grupos de interesse: o primeiro, relativo s metodologias padronizadas pela International Union of Pure and Applied Chemistry (GHOSE, 1987) para mensurar as atividades especficas destas hidrolases, e o segundo, relativo aos ensaios de hidrlise controlada realizados para avaliar o modo de ao cataltica das enzimas sob uma mesma carga protica. Todos os substratos listados na Tabela 10 foram obtidos de empresas

especializadas. Estes foram preservados em dessecador temperatura ambiente, enquanto que as polpas Kraft foram mantidas em geladeira com um teor de umidade em torno de 40%. As polpas kraft branqueadas de Pinus taeda e de Eucalyptus grandis foram gentilmente cedidas pela Klabin Fabricante de Celulose e Papel S/A (Telmaco Borba, PR), sendo que a obteno da polpa seguiu o processo kraft convencional e uma

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sequncia de estgios de branqueamento totalmente livres de cloro. Na Tabela 10 encontram-se listados os substratos utilizados nos ensaios de hidrlise, quer seja sob condies padro, quer seja por outras condies de avaliao de suas susceptibilidades hidrlise.
TABELA 10 - SUBSTRATOS UTILIZADOS NOS ENSAIOS DE HIDRLISE E SEUS RESPECTIVOS FABRICANTES Substratos Nome Comercial (Fabricante) Sigmacell (Sigma Co. cat# S5504)

Papel de filtro Whatman no. 1 CELULOSE Avicel (Sigma Co . cat# 11365)

Polpa kraft branqueada de Pinus taeda e de Eucalyptus grandis (Klabin Fabricante de Papel e Celulose SA, Telmaco Borba, PR) XILANAS CELOBIOSE CELULOSE MODIFICADA SUBSTRATOS CROMOGNICOS Xilana de tegumento de aveia (oat spelt xylan) e de madeira de vidoeiro (birchwood) (Sigma Co. cat# X1075 e X1082, respectivamente) Celobiose (Merck cat# 2352) Carboximetilcelulose (CMC) ( Sigma Co. cat# C4146) Hidroxietilcelulose (HEC) (Aldrich Co. cat# 434965) 4-metilumbeliferil--D-celotriosdeo (Sigma Co. cat# M628) 4-metilumbeliferil--D-lactopiranosdeo (Applichem Co. cat# A1274 ) p-nitrofenil--D-glucopiranosdeo (Merck cat# N7006) p-nitrofenil--D-lactopiranosdeo (Merck cat# N1752) p-nitrofenil--D-celotriosdeo (Merck cat# N5759) PROTENA Azocasena (Sigma Co. cat# A2765)

4.2 ENSAIOS 4.2.1 Massa-Seca e Teor de Umidade A determinao da massa seca seguiu a metodologia TAPPI (1996), em seu protocolo T 550. Uma massa de 10,0000 g ( 0,5 mg) de amostra dos substratos foi adicionada a pesa-filtros previamente tarados, e colocadas em uma estufa aquecida a 100C (+/- 5C ) por uma hora. Aps esse perodo, foram esfriados em dessecador e pesados com a mesma preciso. Repetiu-se esta operao at massa constante. A massa seca foi o resultado obtido ao final do ensaio, quando a massa medida

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permanece constante ao longo do tempo. A massa seca (MS) da amostra foi obtido atravs da equao: MS (%) = Massas final da amostra aps secagem (g) . 100 Massa inicial da amostra mida (g)

4.2.2 Teor de cinzas Para a determinao do teor de cinzas, foi utilizada a norma M11/77 da ABCP (Associao Brasileira de Celulose e Papel), sem modificaes. Cadinhos de porcelana com tampas resistentes foram colocados em uma mufla e aquecidos a 575C (+/- 25C) por uma hora. Aps esse perodo, foram esfriados em dessecador e pesados com preciso de 0,1 mg. Ento, amostras absolutamente secas (cerca de 5 g) foram colocadas nos cadinhos e estes foram tampados, levados mufla e aquecidos mesma temperatura de 575C por 1 hora, permitindo-se assim a incinerao inicial. Mantendo a mufla temperatura de 575C, foram retiradas as tampas e as amostras foram calcinadas por 3 horas. Verificando-se a ausncia total de partculas de carvo nas cinzas, os cadinhos juntamente com as tampas foram retirados da mufla, esfriados em dessecador at a temperatura ambiente e pesados com preciso de 0,1 mg. O teor de cinzas (TC) foi calculado segundo a equao: TC (%) = Massa das cinzas (g) . 100 Massa inicial da amostra seca (g)

4.2.3 Lignina de Klason O mtodo utilizado neste ensaio foi desenvolvido por GOMIDE &

DEMUNER (1986). Foram pesados aproximadamente 300 mg de substrato livre de extrativos, com preciso de 0,1 mg. Esta massa foi transferida quantitativamente para

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um tubo de ensaio de cerca de 60 mm de comprimento por 15 mm de dimetro. O material foi ento hidrolisado em banho-maria com 3,0 mL de cido sulfrico 72%, durante 1 h a 30oC. Aps este tempo, a mistura foi diluda a 84 ml com gua e transferida quantitativamente para um frasco de 100 mL, que foi fechado hermeticamente e autoclavado durante 1 h a 118oC. A mistura obtida foi filtrada ainda quente em cadinho de vidro sinterizado, previamente tarado, com papel de fibra de vidro. Em seguida, o cadinho foi seco em estufa a 105oC, por 12 horas, e pesado para quantificao do resduo insolvel, denominado de lignina de Klason (LK). O teor de LK foi calculado segundo a equao:

LK (%) =

Massa final de material insolvel aps secagem (g) .100 Massa inicial da amostra seca (g)

A lignina parcialmente solubilizada em cido foi tambm quantificada por espectrometria no ultravioleta, utilizando o mtodo TAPPI Useful 250.

4.2.4 Anlise de Acares Solveis As anlises de acares foram dividas em duas categorias e as amostras foram analisadas sempre em triplicata: a primeira, referente aos acares redutores totais (ART), utilizaram as metodologias espectrofotomtricas do cido

dinitrossaliclico (DNS) (GHOSE, 1987) e de Somogyi-Nelson (SOMOGYI, 1952; CHAPLIN & KENNEDY, 1994) e, a segunda, atravs de mtodos de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). A opo pelo mtodo analtico empregado nos ensaios dependeu dos nveis de acares gerados durante as hidrlises enzimticas (PCTrR e controles analticos), assim como do mecanismo de ao das enzimas, dos interferentes gerados durante as hidrlises, dos limites de deteco analtica e da necessidade da resoluo

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individualizada dos monossacardeos liberados no processo.

4.2.4.1 Determinao de Acares Redutores Totais (ART) Dois mtodos foram utilizados com esta finalidade: o mtodo do DNS padronizado por GHOSE (1987) e o mtodo de Somogyi-Nelson, segundo o mtodo modificado da referncia original (SOMOGYI, 1952) por CHAPLIN & KENNEDY (1994). A faixa de trabalho sugerida para o DNS foi de 0,22,0 mg de glucose por mililitro de soluo, enquanto que o mtodo de Somogyi-Nelson serviu para faixas de sensibilidade iguais a 10-100 g de glucose por mililitro de soluo. No ensaio do DNS, foram transferidas para tubos de ensaio alquotas de 1,0 ml da amostra e de 5 (cinco) solues padres de glucose com concentraes entre 0 e 2,0 mg/ml. A estes adicionaram-se 3,0 ml da soluo de cido 3,5-dinitrosaliclico (Merck cat# 800141). A soluo foi agitada e colocada em um banho-maria em ebulio por 5 minutos. Adicionou-se ento um volume de 5,0 mL de gua fria, para, depois de bem homogeneizados, os meios de reao serem lidos em espectrofotmetro Varian modelo Cary 100, em comprimento de onda fixado em 550 nm. A

concentrao de acares redutores totais foi determinada comparando-se a absorbncia das amostras contra a concentrao do complexo colorido gerado entre o DNS e a glucose. Os resultados foram expressos em mg de acares redutores totais por mL de soluo amostra. A concentrao de ART liberados durante a hidrlise foi obtida multiplicando-se o valor encontrado pela diluio efetuada sobre as amostras (CHAPLIN & KENNEDY, 1994). No ensaio de Somogyi-Nelson, alquotas de 1,0 ml das amostras sofreram a adio de 1,0 ml de uma soluo aquosa recentemente preparada de tartarato duplo de sdio e potssio, carbonato de sdio, sulfato de sdio e sulfato de cobre (reagente C). A soluo foi agitada e colocada em um banho-maria por 15 minutos. Adicionou-se ento 5,0 ml de gua fria e 1,0 ml de uma soluo de molibdato de amnio, arsenito

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cido de sdio e cido sulfrico (reagente D). Depois de bem homogeneizados, os meios de reao foram lidos em espectrofotmetro Varian modelo Cary 100 em comprimento de onda fixo em 520 nm. A concentrao de acares redutores totais foi determinada interpolando-se a absorbncia das amostras contra uma curva de calibrao constituda com padres de glucose. A concentrao de acares redutores totais foi obtida multiplicando-se o valor encontrado pela diluio da amostra e os resultados foram expressos em mg de ART por mL de soluo (SOMOGYI, 1952; CHAPLIN & KENNEDY, 1994).

4.2.4.2 Determinao de Acares Atravs de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia(CLAE) A cromatografia de afinidade ou troca inica uma tcnica de separao qumica verstil para a determinao de espcies qumicas diversas. O uso desta tcnica se deve a sua sensibilidade e seletividade na separao, deteco e

quantificao de um ou mais carbohidratos em soluo, fornecendo resultados rpidos e exatos e permitindo anlises relativamente complexas em uma nica injeo. A composio qualitativa e quantitativa de carbohidratos foi feita no hidrolisado solvel das reaes de hidrlise cida ou enzimtica. O mtodo cromatogrfico empregado fundamentou-se no fenmeno da troca inica utilizando uma coluna separadora, um sistema supressor qumico (vide tem 4.2.4.2.) e uma unidade de deteco, quer de refratometria diferencial, quer mediante o uso de uma clula de condutividade.

4.2.4.2.1 Anlise dos Hidrolisados cidos e Enzimticos por CLAE Para a anlise dos monossacardeos e dissacardeos liberados por hidrlise cida, empregou-se a cromatografia de troca inica no modo isocrtico. Foi utilizada uma coluna cromatogrfica Aminex HPX-87H (BIO-RAD) a 65C, precedida por uma pr-coluna ction-H (BIO-RAD) para remoo de ctions interferentes (BUCHERT, et

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al. 1993). O sistema cromatogrfico utilizado foi o da Shimadzu Scientific Instruments Inc., com mdulo de bomba modelo LC10AD, amostrador automtico modelo SIL10A, desgaseificador de fase mvel modelo DGU14A, forno de aquecimento de coluna modelo CTO10A, detetor de ndice de refrao modelo RID10A e sistema de aquisio de dados especfico do fabricante (CLASS 10). A fase mvel utilizada foi o cido sulfrico 0,8 mM, a uma vazo de 0,6 mL/min. Os mono e dissacardeos eludos da coluna foram identificados e quantificados por refratometria diferencial atravs da comparao com padres primrios de acares (Figura 24).
FIGURA 24 - CROMATOGRAMA DOS PADRES DE CARBOHIDRATOS E CIDOS ORGNICOS PRESENTES NOS HIDROLISADOS DAS AMOSTRAS DE POLPA CELULSICA

4.2.4.2.2 Anlise Simultnea de Mono e Oligossacardeos por CLAE A anlise quantitativa de carbohidratos oligomricos utilizando CLAE sob condies alcalinas foi feita segundo CHAPLIN & KENNEDY (1994). A cromatografia de nions consistiu em um trocador aninico de base forte, de baixa capacidade, enquanto que a coluna separadora foi um trocador catinico do

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tipo forte, de alta capacidade, na forma H+. O eluente, nesse caso, foi uma soluo alcalina e os nions separados foram detectados na forma de seus cidos fortes em um meio de baixa condutividade. O sistema utilizado foi o da Dionex Corporation modelo DX500, equipado com pr-coluna CarboPac PA-100 e coluna CarboPac PA-1 (4,6 X 250 mm). A anlise foi realizada em gradiente quaternrio, tendo como eluente principal o NaOH 100 mM sob um gradiente complementar de acetato de sdio e gua, para um tempo final de 82 minutos (Tabela 11). A vazo mdia foi de 1,0 mL/min e o detetor utilizado foi o amperomtrico com eletrodo de ouro (PAD). Uma anlise tpica est representada na Figura 25, que inclui oligmeros como G2, G3, G4, G5 e G6.
TABELA 11 GRADIENTE QUATERNRIO UTILIZADO PARA A ANLISE DE OLIGOSSACARDEOS PELO SISTEMA DIONEX Tempo (min) 0,0 23,00 40,00 60,00 60,10 64,00 64,10 67,00 67,10 82,00 A= gua Ultrapura; B=100 mM NaOH; C= 300 mM Acetato de Sdio/100 mM NaOH; D= 300 mM NaOH , Reagente ps coluna = 300 mM NaOH (0,3 ml/min) %A 97,5 97,5 0 0 0 0 0 0 97,5 97,5 %B 2,5 2,5 100 50 0 0 0 0 2,5 5,5 %C 0 0 0 50 100 100 0 0 0 0 %D 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0

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FIGURA 25 CROMATOGRAMA PADRO DE OLIGOSSACARDEOS OBTIDO ATRAVS DO SISTEMA DIONEX

4.2.5 Determinao da Concentrao de Protenas A concentrao de protena nas amostras foi estimada pelos mtodos de LOWRY et al. (1951) e BRADFORD (1976), utilizando albumina de soro bovino (BSA - SIGMA Co. cat# B4287) como padro primrio. O ensaio denominado branco foi preparado utilizando-se o mesmo procedimento analtico onde o volume de amostra foi substitudo por gua destilada. Os resultados obtidos foram expressos em mg de proteina por mL de soluo. Os mtodos consistem basicamente na reao de reduo do reagente de Folin-Cioclateau quando da presena de aminocidos que contenham tirosina. Para o ensaio de LOWRY foram transferidos 0,5 mL da enzima diluda a uma concentrao de aproximadamente 2,5 mg/mL para um tubo de 1,5 mL. Adicionados 1,0 mL do reagente A e 5 mL do reagente C, a mistura foi homogeneizada e, aps 10 minutos, foi adicionado 0,5 mL do reagente Folin 1N.

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Finalmente, a leitura em espectrofotmetro de absoro no ultravioleta (Varian, modelo Cary 100) foi efetuada a 750 nm aps 30 minutos de estabilizao da cor desenvolvida pela reao. Os padres utilizados para fazer a curva de calibrao foram preparados pesando-se 0,025 g de albumina de soro bovino dissolvidos em 50 mL de tampo acetado pH 4,8 (concentrao de 0,5 mg/mL). Cinco outras solues em nveis decrescentes foram preparadas afim de compor a curva de calibrao. Para o mtodo de BRADFORD, foi utilizada como padro uma soluo de albumina de soro bovino a uma concentrao de 5 mg/mL. As concentraes utilizadas no ensaio foram obtidas diluindo esta soluo em tampo acetato pH 4,8. Amostras (100 L) de soluo-padro e dos ensaios de hidrlise enzimtica foram transferidos para tubos de ensaio, onde adicionou-se 1 mL de reagente de BRADFORD. A leitura foi feita em espectrofotmetro de absoro no ultravioleta (Varian, modelo Cary 100) entre 5 a 60 minutos do momento da adio do reagente, em um comprimento de onde ajustado em 595 nm.

4.2.6 Determinao da Atividades Sobre Substratos Mdelo Os ensaios de atividade nas enzimas celulolticas incluram determinaes de atividades especficas, alm de outros ensaios de hidrlise usando substratos no convencionais. A atividade especfica das enzimas foi definida como a quantidade de ligaes -(1,4)-glicosdicas hidrolisadas por unidade mssica de protena (enzima) na unidade de tempo. Vrios mtodos padronizados foram utilizados para determinar as atividades hidroltica das PCTrR. Na Tabela 12 esto representados os mtodos utilizados e internacionalmente aceitos para a determinao de atividades em preparaes celulsicas (GHOSE, 1987).

TABELA 12 - ATIVIDADES DETERMINADAS NAS PREPARAES EM ESTUDO

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Atividade Atividade celulsica total Endoglucansica Exoglucansica Xilansica Preferencial (Exo ou Endo conforme inibidores presentes)

Substrato Papel filtro Whatman n. 1 Carboximetilcelulose (CMC); carboxietilcelulose (HEC) Avicel, Sigmacell xilana de casca de aveia e de madeira dura

Mtodo para a Determinao CLAE acar redutor total acar redutor total CLAE , acar redutor total

espectrofotometria de 4-metilumbeliferil--Dfluorescncia celotriosdeo; 4-metilumbeliferil-D-lactosdeo p-nitrofenil-lactosdeo; espectrofotometria de absoro no ultravioleta p-nitrofenil-celobiosdeo celobiose p-nitrofenil-glucosdeo CLAE espectrofotometria de absoro no ultravioleta

Celobisica -Glucosidsica

Todos os ensaios foram conduzidos em tampo acetato 50 mM a pH 4,8. Uma unidade internacional (UI) de atividade enzimtica correspondeu liberao de 1 mol de equivalentes de glucose por unidade de volume e minuto de reao. Alternativamente, 1 UI/mL pode ser transformada em 1 nkat/mL mediante multiplicao do primeiro por um fator igual a 16,67.

4.2.6.1 Atividade contra Papel Filtro (UPF) Em um tubo de ensaio foi colocada uma tira de papel de filtro Whatman n1 (1,0 x 6,0 cm) pesando aproximadamente 70 mg sobre 1,0 mL de tampo acetato 50 mM, pH 4,8 (NIDETZKY et al., 1994). Foram adicionados a cada tubo de ensaio 1,0 mL de uma soluo das enzimas devidamente diludas em tampo acetato, afim de se obter uma concentrao equivalente a 1 mg de glucose no meio de reao ao final da hidrlise. As enzimas adicionadas ao meio de reao foram pr-condicionadas a 50C.

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Transcorridos 60 minutos de incubao, os tubos de ensaio foram transferidos para um banho-maria fervente e l permaneceram por 5 minutos. Aps remoo do excesso de substrato por centrifugao, os acares solveis foram medidos por CLAE utilizando a metodologia descrita no tem 4.2.4.2.1 . Adicionalmente, foram efetuados ensaios de acar redutor total pelo mtodo do DNS, conforme descrito no tem 4.2.4.1. O clculo para a determinao da atividade contra papel filtro foi obtido atravs da seguinte equao:

UPF/ml =

EqGlc (mg/ml) . Edil . VT (ml) Tempo (min) . 1mol glucose (0,18mg) . VE (ml)

onde Edil representa a diluio efetuada sobre a enzima para atingir os nveis desejados de atividade hidroltica, VT o volume total de reao, VE o volume de enzima adicionado ao meio reacional e EqGlc corresponde aos equivalentes de glucose liberados no meio de reao, conforme a equao abaixo: EqGlc (mg/ml) = [Glc] (mg/mL) + (FCM . [celobiose])

onde FCM o fator de correo mssica que converte um mol de celobiose em dois moles de glucose (FCM = 1,0526).

4.2.6.2 Atividade Endoglucansica sobre CMC A um tubo de ensaio foi adicionado 0,5 ml da soluo de 2% (p/v) do substrato CMC. Foram adicionados a cada tubo de ensaio 0,5 mL de uma soluo das enzimas devidamente diludas em tampo acetato e o meio reacional foi mantido durante 30 minutos a 50C em banho maria. Os acares redutores totais assim liberados foram analisados pelo mtodo do DNS, conforme descrito no tem 4.2.4.1..

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Para efeito de clculo, somente as diluies que aconteceram a libeo de 1 mg/mL de equivalentes de glucose foram considerados. O clculo para a determinao da atividade contra CMC foi obtido atravs da seguinte equao:

CMCU/ml =

ART (mg/ml) . Edil . VT (ml) Tempo (min) . 1mol glucose (0,18mg) . VE (ml)

onde ART corresponde aos acares redutores totais determinados contra uma curva de calibrao de glucose pelo mtodo do DNS, Edil representa a diluio efetuada sobre a enzima para atingir os nveis desejados de atividade hidroltica, VT o volume total de reao e VE o volume de enzima adicionado ao meio reacional.

4.2.6.3 Atividade Endoglucansica sobre HEC A um tubo de ensaio foi adicionado 1,8 ml da soluo de 1% (p/v) do substrato HEC em tampo acetato. Em seguida, a cada tubo de ensaio foram adicionados 0,2 ml de uma soluo de enzima devidamente diluda em tampo acetato e o meio reacional foi mantido durante 10 minutos a 50C em banho-maria. Os acares redutores totais assim liberados foram analisados pelo mtodo de DNS, conforme descrito no tem 4.2.4.1 . Para efeito de clculo, somente as diluies que resultaram na libeo de 1 mg/mL de equivalentes de glucose foram consideradas e o clculo para a determinao da atividade foi obtido atravs da seguinte equao:

UHEC/ml =

ART (mg/ml) . Edil . VT (ml) Tempo (min) . 1mol glucose (0,18mg) . VE (ml)

onde ART corresponde aos acares redutores totais determinados contra uma curva

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de calibrao de glucose pelo mtodo do DNS, Edil representa a diluio efetuada sobre a enzima para atingir os nveis desejados de atividade hidroltica, VT o volume total de reao e VE o volume de enzima adicionado ao meio reacional.

4.2.6.4 Atividade Celobisica A um tubo de ensaio foi adicionado 1,0 ml da soluo de 15 mM do substrato celobiose em tampo acetato 50 mM. Foram adicionados a cada tubo de ensaio 1,0 mL de uma soluo de enzimas devidamente diluda em tampo acetato. O meio reacional foi mantido durante 30 minutos a 50C em banho-maria, donde foram transferidos por 5 minutos para um banho-maria fervente. Aps centrifugao, os acares presentes no meio reacional foram medidos por CLAE utilizando a metodologia descrita no tem 4.2.4.2.1 . Para efeito de clculo, somente as diluies que liberaram cerca de 1 mg/mL de equivalentes de glucose foram considerados. O clculo para a determinao da atividade celobisica foi obtido atravs da seguinte equao:

UCB/ml =

[Glc] (mg/ml) . Edil . VT (ml) Tempo (min) . 2mol glucose (0,36mg) . VE (ml)

onde [Glc] corresponde concentrao de glucose liberada no meio de reao, Edil representa a diluio efetuada sobre a enzima para atingir os nveis desejados de atividade hidroltica, VT o volume total de reao e VE o volume de enzima adicionado ao meio reacional.

4.2.6.5 Atividade Xilansica

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Foi preparada uma suspenso de 0,5 mg/mL de xilanas (Sigma) em tampo acetato 50mM a pH 4,8. A cada tubo de ensaio foram adicionados 0,5 ml de uma soluo des enzima devidamente diluda em tampo acetato e o meio de reao foi mantido durante 30 minutos a 50C em banho-maria, donde foram transferidos por 5 minutos para um banho-maria fervente. Aps centrifugao, os acares presentes no meio reacional foram analisados pelo mtodo de DNS, conforme descrito no tem 4.2.4.1.. Para efeito de clculo, somente as diluies em que foi observada a libeo de 1 mg/mL de equivalentes de xilose foram consideradas e o clculo para a determinao da atividade foi obtido atravs da seguinte equao:

UX/ml =

ART (mg/ml) . Edil . VT (ml) Tempo (min) . 1mol xilose (0,15 mg) . VE (ml)

onde ART corresponde aos acares redutores totais determinados contra uma curva de calibrao de xilose pelo mtodo do DNS, Edil representa a diluio efetuada sobre a enzima para atingir os nveis desejados de atividade hidroltica, VT o volume total de reao e VE o volume de enzima adicionado ao meio reacional.

4.2.6.6 Atividade contra derivados do p-Nitrofenol Adicionou-se em tubos de ensaio 0,25 mL de soluo 4,0 mM de derivados do p-nitrofenol e a esta soluo 0,5 ml de tampo acetato 50mM e 0,25 ml de uma diluio apropriada das enzimas foram acrescidos. O meio de reao foi incubado a 42C durante 10 minutos. Em seguida, acrecentou-se 1,0 mL de carbonato de sdio 1 M para interromper a reao e a concentrao de p-nitrofenol liberado no meio reacional foi determinada no comprimento de onda de 405 nm por espectroscopia no ultravioleta/visvel. A curva de calibrao foi construda com solues padro de pnitrofenol, sendo que, no clculo da concentrao, usou-se uma absortividade molar de

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13700 L/mol.cm (CLAEYSSENS & AERTS,1992).

4.2.6.7 Atividade contra Derivados 4-metil-Umbeliferlicos A atividade sobre glucosdeos 4-metilumbeliferlicos, como o celotriosdeo (MUmbG3) e o lactosdeo (MUmbL), foi determinada utilizando-se uma soluo 1,0 mM em tampo acetato 50 mM, pH 5,0, contendo 0,2 mM de glucono-1,5-lactona como inibidor de atividade -glucosidsica. A 0,25 mL destas solues adicionaram-se 0,25 mL de uma diluio apropriada da enzima e a mistura foi incubada a 50C por 10 minutos. Ao trmino da reao, foi adicionado 1,0 ml de Na2CO3 1M para interromper a reao e as umbeliferonas liberadas foram dosadas espectrofotometricamente a 347 nm (NIKU-PAAVOLA et al., 1986). MUmbG3 foi utilizado como substrato especfico para EG II (KOIVULA, 1994), enquanto que MUmbL serviu para caracterizar a presena de CBH I e EG I. Porm, nesse ltimo caso, a diferenciao entre ao exo (CBH I) e endo (EG I) foi decorrente da conduo do ensaio na presena e ausncia de 1 mM de celobiose, que atua como inibidor competitivo da CBH I.

4.2.6.8 Atividade Proteoltica Na anlise de atividade proteoltica (LEIGHTON et al., 1973), foi utilizada a azocasena a 1% (m/v) preparada em tampo acetato 50 mM pH 7,2. A um tubo de ensaio adicionaram-se 0,25 ml da soluo de azocasena e 0,15 ml de uma diluio apropriada da enzima. A mistura foi incubada a 37C por 60 minutos e, aps este tempo, foram adicionados 1,2 ml de cido tricloroactico (TCA 10%, v/v). Aps centrifugao a 10.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi recebido em outro tubo de ensaio que continha 1,4 ml de NaOH 1N. A atividade proteoltica foi determinada por espectrometria no ultravioleta/visvel a 440 nm, usando como base unidades de atividade conhecida de azocasena.

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4.2.7 Determinao da Distribuio da Massa Molecular da Celulose A distribuio em massas moleculares de amostras de celulose, antes e aps os procedimentos de hidrlise enzimtica, foram determinadas utilizando

Cromatografia de Permeao em Gel (CPG). As amostras foram carbamiladas e seus derivados comparados com as curvas de calibrao, que usaram poliestireno como padro primrio a uma concentrao mdia de 1,0 mg/ml. O objetivo da reao de carbamilao (Figura 26) foi o de derivatizar a celulose para sua posterior solubilizao em tetrahidrofurano (THF). A polpa de celulose (50 mg), seca em dessecador sob vcuo contra P2O5, foi suspensa em piridina (4 mL) e ento reagida com isocianato de fenila (0,5 mL) em tubos reacionais fechados, por um perodo de 48 horas, em um bloco de aquecimento a 80oC com agitao ocasional. Aps este perodo, a mistura resultante foi precipitada em metanol/gua (80:20). O precipitado foi lavado exaustivamente com a soluo metanol/gua, seco em dessecador sob vcuo contra P2O5 e acondicionado em tubos fechados, reservados para posterior anlise por cromatografia de permeao em gel (CPG) (COLL & GILDING, 1970; DANHELKA & KOSSLER, 1976; WOOD et al., 1986).
FIGURA 26- REAO DE CARBAMILAO; CELULOSE REAGINDO COM ISOCIANATO DE FENILA EM PIRIDINA
OH CH2 H O H OH H OH H H O + O H C N H Piridina 80 C
o

OR CH2 H O H OR H OR H H O

(R )

Celulose

Isocianato de Fenila

Celulose Tricarbamilada

As amostras de celulose percarbamiladas foram analisadas em equipamento da marca Shimadzu, modelo LC10AD, com uma coluna de guarda e quatro colunas Tosoh TSK Gel (7.8 x 300 mm) com limites de excluso equivalentes a 4 x 107 (TSK

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6000 HXL), 4 x 105 (TSK 4000 HXL ), 6 x 104 (TSK 3000 HXL ) e 1 x 103 (TSK 1000 HXL) unidades de massa atmica, dispostas em srie em um forno de aquecimento mantido a 45C. A fase mvel utilizada foi o THF a uma vazo de 1 ml/min. e o volume de injeo foi correspondente a 20 L. Um mnimo de trs amostras foram injetadas para cada replicata e o eluato do sistema foi monitorado por um detetor de absoro no ultravioleta Shimadzu SPD10A em comprimento de onda fixado em 254 nm.. Um cromatograma tpico pode ser visto na Figura 27.
FIGURA 27 CROMATOGRAMA DE PERMEAO EM GEL DE UMA SOLUO PADRO CONTENDO QUATRO PADRES MONODISPERSOS DE POLIESTIRENO
2,0E+08 1,8E+08

43000 427000 6400 8420000

Resposta do detetor

1,6E+08 1,4E+08 1,2E+08 1,0E+08 8,0E+07 6,0E+07 4,0E+07 2,0E+07 0,0E+00 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 1,0E+08

Massa molecular (u.m.a.)

Os resultados foram tratados por software especfico de CPG para aquisio e tratamento de dados, sendo que a curva de calibrao foi efetuada sobre a anlise de padres monodispersos de poliestireno de massa molecular entre 2500 e 8420000 u.m.a., respectivamente (Tabela 13,Figura 27). A partir dos respectivos volumes de reteno apresentados pelos padres, foi possvel traar uma curva padro (Figura 30), cujo fator de disperso, em ajuste polinomial, foi de apenas 0,0306. Os parmetros universais utilizados para a calibrao (coeficientes de Mark-

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Houwink) foram aqueles propostos por VALTASAARI & SAARELA (1975), onde Kp= 1,18.10-4 e p = 0,74 para poliestireno em THF e Kc= 2,01.10-5 e c= 0,92 para os derivados carbanilados de celulose em THF.
TABELA 13- PADRES DE POLIESTIRENO UTILIZADOS NA CURVA DE CALIBRAO SOBRE A QUAL FOI DETERMINADO O DO GRAU DE POLIMERIZAO DAS POLPAS CELULSICAS Massa Molecular (uma) 8420000 5480000 3840000 1800000 1300000 900000 791000 600000 400000 220000 Volume de reteno (mL) 21,314 21,416 21,739 22,583 23,346 23,597 23,865 24,257 24,692 25,48 Massa Molecular (uma) 184000 110000 98900 43000 17300 10300 5000 2500 537 92 Volume de reteno (mL) 25,979 26,576 26,84 28,305 30,105 31,331 32,49 34,357 36.130 40,175

A expresso matemtica utilizada nos clculos est apresentada pela equao: log M = - 0,00028708 x3 + 0,01579371 x2 0,4885546 x + 8,59838088
FIGURA 28- CURVA DE CALIBRAO BIMODAL UTILIZADA NA ANLISE DE GRAU DE POLIMERIZAO DAS POLPAS, CUJA DISPERSO EM TORNO DA MDIA FOI DE 0,0306
1E +8 1E +7

Massa Molec ular

1E +6 1E +5 1E +4 1E +3 1E +2 15 20 25 30 35 Volume de Eluio (mL) 40

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O clculo da massa molecular foi procedido pelo mtodo de calibrao universal, orientado pela seguinte equao : (RAMOS, 2001).
ln Mc = (1 + p ) ln Mp + ln( Kp / Kc ) 1 + c

Assim, baseados na curva de calibrao dos padres de poliestireno, foi possvel calcular o comprimento mdio da cadeia (MMn) (ou mdia aritmtica das massas moleculares, MMN) e a mdia ponderada das massas moleculares, (MMM) da celulose per-carbamilada, sendo que o grau de polimerizao (GP) foi calculado pela relao GP = MM/519 onde o denominador corresponde massa molecular de uma unidade de anidroglucose per-carbamilada. Por fim, a razo MMM/MMN foi utilizada como medida da polidispersidade da polpa, que representa o desvio padro da distribuio em torno de seu ponto central (YAU et al., 1979).

4.2.7.1 Anlise Espectrofotomtrica de IVTF das Polpas e Polmeros Gerados por Carbamilao Para anlise qualitativa por IVTF (Espectrofotometria na regio do Infravermelho com Transformada de Fourier (RAMOS et al., 1993), foram preparadas pastilhas em KBr com concentrao em torno de 1 a 2% das polpas e dos polmeros gerados por carbamilao. As anlises de IVTF foram realizadas em equipamento BOMEM MB100, interfaceado com um PC 486 sob ambiente DOS. Os espectros foram gravados de 4000 a 400 cm-1, com resoluo de 4cm-1. Para cada espectro foram coletados 32 interferogramas antes da aplicao da transformada de Fourier.

4.3 DIFRATOMETRIA DE RAIOS-X O preparo da amostra foi realizado a partir de uma suspenso de fibras em gua, a qual foi filtrada de modo a se formar um disco de fibras superpostas de superfcie a mais regular e homognea possvel. A amostra assim preparada foi seca

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em dessecador sob vcuo e P2O5 como agente secante e posteriormente transferida para uma placa de vidro com auxlio de cola de silcio (graxa de vcuo). Uma leve prensagem, mediante superposio com outra placa de vidro, garantiu uma maior homogeneidade superficial para aquisio dos difratogramas. Os difratogramas de raios-X das polpas foram obtidos em um equipamento Rigaku, no laboratrio de Difratometria de Raios-X do Departamento de Fsica da UFPR, utilizando um gerador de voltagem de 40 kV e uma corrente de 20 mA. A fonte de radiao utilizada foi a linha alfa do cobalto (CoK = 0,179 nm com filtro de Ni). O ndice de cristalinidade da celulose foi determinado de acordo com o mtodo emprico de Segal et al. (1959), conforme a Equao

CrI (%) = [(I 0 0 2 I a m ) / I 0 0 2 ] x 100

onde CrI o ndice de cristalinidade, I002 a intensidade mxima do pico no plano (002) (plano de maior orientao molecular ou cristalinidade) e Iam a intensidade de difrao no ngulo de Bragg 2 = 18o, correspondente contribuio devida regio amorfa.

4.4 ANLISE DAS PREPARAES ENZIMTICAS POR FPLC Para a separao e identificao dos componentes presentes nas PCTrR e posterior anlise de suas propriedades catalticas, foi utilizado um mtodo cromatogrfico especfico denominado de Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC, Pharmacia Fine Chemicals). Essas corridas cromatogrficas utilizaram um equipamento provido dos seguintes mdulos operacionais: duas bombas P-500, detetor de absoro no ultravioleta ajustado em 280 nm, controlador modelo LCC-500 Plus e registador modelo REC 102. A coluna cromatogrfica utilizada foi a Resource Q (4

cm x 2 cm), eluda conforme o gradiente de eluio descrito na Tabela 10. Como fase

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mvel do sistema, foram utilizados tampo fosfato pH 7,0 (A) e tampo fosfato pH 7,0 com adio de cloreto de sdio 1 M (B). Para que o sistema cromatogrfico tivesse a eficincia esperada, foi necessrio fazer uma dessalinizao prvia das amostras, utilizando uma pr-coluna Econo-Pac 10 DG (BioRad ). A condutividade das amostras preparadas para injeo foram tambm ajustadas para evitar interferncias no processo de migrao cromatogrfica. Alquotas de 2,0 mL de uma soluo previamente dessalinizada contendo aproximadamente 5 mg/mL de proteina foram injetada no sistema cromatrogrfico (TOMAZ & QUEIROZ, 1999). A calibrao e os clculos de controle analtico do mtodo foram feitos utilizando a enzima comercial Celluclast 1,5L . Com base nos resultados inicialmente

obtidos para esta enzima, foi estabelecido o gradiente de eluio utilizado experimentalmente e apresentado na Tabela 14.
TABELA 14 PROGRAMAO UTILIZADA COMO GRADIENTE DE ELUIO NAS ANLISES CROMATOGRFICAS POR FPLC Volume de eluio(ml) Inicial 12 37 49 73 74 86,0 %A 100 100 83,0 83,0 60,0 %B 0,0 0,0 17,0 17,0 40,0 2,0 Vazo ml / min

0,0 100,0 0,0 100,0 Mtodo de regenerao da coluna Inicial 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0

2,0

*(A)-tampo fosfato pH 7,0 ; (B)-tampo fosfato pH 7,0 com adio de cloretode sdio 1 M.

O eluato da coluna cromatogrfica foi recolhido em alquotas de 2,0 ml atravs de um coletor de fraes da marca Gilson Microcol, modelo TDC 80. As alquotas assim obtidas foram analisadas isoladamente e, aps a confirmao de suas

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propriedades, foram agrupadas em cinco grandes fraes em que os principais componentes do sistema celulsico de T. reesei foram separados. Cada frao derivada da anlise por FPLC teve a sua concentrao em protenas determinada pelo mtodo de Lowry (vide tem 4.2.5), assim como foi tambm determinada a atividade endoglucansica presente em cada uma delas, utilizando HEC como substrato conforme descrito no tem 4.2.6.3 .

4.4.1 Anlise Condutivimtrica Conforme descrito acima, todas as amostras a serem cromatografadas por FPLC foram dosadas, antes da anlise, em um condutivmetro da EDT Instruments, modelo BA330. Os procedimentos de calibrao e leitura das amostras seguiram as recomendaes do fabricante, conforme descrito no manual do equipamento. A unidade de medida foi definida como KS.

4.4.2 Anlise Monoclonal As fraes provenientes do FPLC foram separadas em grupos e analisadas atravs do uso de anticorpo monoclonal para identificar a presena de CBH II (NIEVES et al., 1991). A tcnica consistiu na adio de 2,0 l das fraes enzimticas diludas a uma membrana de nitrato de celulose seca. Em seguida, adicionou-se soluo tampo TBS pH 8,0 (10 mM Tris/HCL, 150 mM NaCl) e soluo do anticorpo monoclonal CBH II (Mab 8) em uma concentrao de 1,1 mg/ml. A membrana foi ento incubada sob agitao e temperatura ambiente por no mnimo 1 hora e em seguida lavada e seca ao ambiente. A presena de manchas e sua intensidade relativa nos locais onde foram aplicadas as enzimas indica a presena de CBH II. A sensibilidade deste mtodo foi calculada em 2,5 ng/ l. Os anticorpos monoclonais foram cedidos pela VTT Biotechnology (Finlndia).

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4.4.3 Determinao da Presena de Domnio Cataltico Livre na Frao Correspondente CBH I A cromatografia de afinidade molecular foi usada para avaliar a extenso em que a enzima CBH I encontrava-se hidrolisada em seus domnios cataltico (DC) e de ligao ao substrato (DLC). Para tal, foi utilizada a coluna denominada de Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia Fine Chemicals). O volume de amostra injetada no FPLC foi de 2,0 mL, usando o mesmo sistema descrito anteriormente porm sob condies distintas de eluio gradiente, conforme descrito na Tabela 15. Neste procedimento, o coletor de fraes foi programado para coletar alquotas de 0,5 mL, que foram utilizadas para separar o DC livre da enzima que no sofreu protelise. A soluo B composta de soluo de acetato de sdio 5 mM adicionado de sulfato de amnio 500mM . Ambas foram controladas atravs da sua leitura

condutivimtrica, que foi de 23,1 KS para a soluo B, enquanto a soluo A composta somente do tampo foi de 144 S.
TABELA 15 PROGRAMA UTILIZADO COMO GRADIENTE DE ELUIO PARA CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE ANINICA (FPLC) Volume de eluio (ml) Inicial 5 5,1 11,0 Inicial 7,0 %A 100 100 0 0 100 100 %B 0 0 100 100 0 0 0,5 0,5 Vazo (ml/min)

Mtodo de regenerao da coluna

4.5 HIDRLISE DE CELULOSE MICROCRISTALINA Para a determinao da atividade das enzimas sobre celulose microcristalina (atividade avicelsica), incubou-se em banho-maria a 50C por 2 horas uma mistura contendo 1 mL de uma suspenso a 1% (m/v) de Sigmacell em tampo acetato 50

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mM, pH 4,8 com 1 mL de uma diluio da enzima contendo 200mg de protena/g de substrato. Em seguida, ferveu-se o meio de reao por 10 minutos para inativar a enzima. O meio reacional foi ento centrifugado e dele recolheu-se 0,5 mL para anlise de acares solveis pelo mtodo do DNS, conforme descrito no tem 4.2.4.1 . O restante foi submetido anlise por CLAE conforme o tem 4.2.4.2.1.

4.6 AVALIAO DO EFEITO DO TRATAMENTO ENZIMTICO SOBRE AS PROPRIEDADES DE POLPAS CELULSICAS COMERCIAIS

4.6.1 Hidrlise Enzimtica Foram realizados ensaios de tratamento enzimtico sobre polpas kraft branqueadas oriundas do processamento de Eucalyptus sp. (madeira dura ou folhosa) e Pinus sp. (madeira mole ou confera). As hidrlises das polpas foram realizadas utilizando tempos e cargas proticas diversas para que estas diferenas permitissem avaliar a ao das PCTrR e das preparaes comerciais sobre os substratos. Das condies de hidrlise foram mantidas constantes: (a) a consistncia das polpas em 5% (m/v); (b) a temperatura (45C); e (c) a agitao do meio de reao em 150 rpm. J as cargas proticas e os tempos de hidrlise foram os seguintes: para ensaios de sacarificao, usou-se uma carga de 40 mg de protena/g de substrato e um tempo de hidrlise de 4 horas, enquanto que para a modificao das propriedades polpas kraft, foi usada uma carga de 4 mg de protena/g de substrato e um tempo de 2 horas de hidrlise. As hidrlises foram controladas analisando-se o ttulo de protenas (mtodo de Lowry) das solues de trabalho, antes e depois das reaes. Por outro lado, o ensaio de sacarificao contou com a adio de uma carga exgena de glucosidases para evitar o acmulo de celobiose no meio.

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O meio reacional aquoso dos tratamentos enzimticos foi

testado para

acares redutores totais (mtodo DNS) e carboidratos mono- e oligmeros (mtodo CLAE), enquanto que as fibras parcialmente hidrolisadas foram lavadas

exaustivamente com gua e reservadas para as anlises do grau de polimerizao e para a preparao de corpos de prova que serviram para a avaliao das propriedades mecnicas da polpa. Estes procedimentos esto descritos na prxima seo.

4.6.2 Ensaios das Propriedades Mecnicas dos Corpos de Prova Todos os testes efetuados neste tem utilizaram os corpos de prova preparados conforme a norma TAPPI T 205, bem como as recomendaes de calibrao e aceitabilidade dos resultados previstas na norma TAPPI T 400.

4.6.2.1 Gramatura e Espessura Um nmero representativo de folhas (sete no mnimo), formadas segundo a norma TAPPI T 205, foram cortadas e suas dimenses medidas, sendo que cada folha no possuiu tamanho menor que 500 cm2. Um escalmetro digital foi utilizado para medir a espessura do papel e a variao aceita foi inferior a 0,2%, para uma escala de 0,5 mm. A folha circular de papel foi pesada em uma balana de preciso analtica e a sua gramatura foi determinada em relao rea do corpo de prova (g/mm2), com base na norma TAPPI 410 om-98.

4.6.2.2 Resistncia ao Rasgo O ndice de resistncia ao rasgo foi determinado no aparelho Elmendorf (Regmed S&A) seguindo os procedimento da norma TAPPI T 414 om-98. Os valores mdios obtidos no equipamento para uma folha ou corpo de prova foram expressos como ndice de rasgo (IR), cuja clculo utilizou a seguinte equao:

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IR (mN.m2/g) =

9,807 . Lr . 16 G.N

onde G a gramatura da folha ou corpo de prova, N o nmero de amostras e Lc a leitura corrigida do aparelho (Lc = -0,122 + 0,9759 . fora).

4.6.2.3 Resistncia a Trao e ao Alongamento Estes ensaios foram realizados com os corpos de prova em equipamento de testes universal Instron, equipado com um sistema microprocessado e

computadorizado de coleta de dados. A norma utilizada foi a TAPPI T 4949 om96. A distncia entre garras no corpo de prova foi de 100 mm, a velocidade do teste de 25 mm/min e a capacidade de carga de 100 ou 1000 N. A energia de deformao dos corpos de prova foi calculada utilizando a seguinte equao:

IR (J/m2) =

10000 . A L . La..G

onde A a rea sobre a curva de fora vs. deformao, L o comprimento da amostra (cm) e La largura da amostra (cm) e G a gramatura da folha ou corpo de prova.

4.6.2.4 Resistncia ao Arrebentamento (Estouro) As folhas de papel foram submetidas a uma presso atravs de uma membrana de borracha com 30,5 mm de dimetro em equipamento Mullentester, de acordo com a norma TAPPI T 403 om-97. Durante o ensaio, a membrana sofreu um aumento na presso de maneira constante e foi inchando at o momento em que a

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folha no resistiu e se rompeu. O ndice de arrebentamento (IA) foi determinado pela equao: IA (kPa.m2/g) = 98,022 . L . f G

onde L a leitura do arrebentamento (Kgf/cm2), f o fator de correo de leitura e G a gramatura da folha ou corpo de prova.

97

5 RESULTADOS E DISCUSSO

Trabalhos com enzimas (hidrolases) provenientes de cepas recombinantes tm crescido muito nas ltimas dcadas, mas a compreenso de seus mecanismos de expresso e de seus modos de ao cataltica ainda no foi totalmente esclarecidas. (SUOMINEN et al., 1993; KARHUNEN et al., 1993). Portanto, os resultados relatados neste estudo tiveram o objetivo de elucidar o modo de ao de enzimas desta natureza. Preparaes enzimticas derivadas de cepas recombinantes de Trichoderma reesei,foram portanto investigadas com o objetivo de ter elucidados os seus modos de ao cataltica sobre substratos celulsicos de natureza variada, dados considerados crticos avaliao de suas potencialidades para o emprego nas indstrias de papel e celulose. importante ressaltar que os experimentos de manipulao gentica e de fermentao para a produo das enzimas foram realizados pela Primalco Ltd Biotec (atualmente, Rhm Enzyme Finland Oy, Espoo, Finlndia), que gentilmente nos forneceu o material para o desenvolvimento do projeto.

5.1 CARACTERIZAO

DAS

ENZIMAS

DERIVADAS

DE

CEPAS

RECOMBINANTES DE Trichoderma reesei As sees que se seguem apresentam os resultados obtidos com as preparaes celulsicas a que denominamos de PCTrR, ou seja, Preparaes Celulsicas de cepas de T. reesei Recombiantes.

5.1.1 Avaliao do Teor Protico nas Preparaes Enzimticas As anlises da concentrao de protenas nas preparaes celulsicas comerciais, e naquelas provenientes de T. reesei modificado geneticamente (PCTrR), foram realizadas segundo dois mtodos distintos denominados de Lowry e Bradford (vide tem 4.2.5.). No entanto, apesar de aceitos internacionalmente, estes

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mtodos foram inicialmente validados segundo as normas do Environmental Protection Agency (protocolo no. 821-B-93-001) para que no existissem dvidas quanto a interferncia de estabilizantes e/ou aditivos utilizados durante a produo dos complexos enzimticos. Uma amostra comercial das celulases de T. reesei (Sigma) foi utilizada como padro externo s metodologias de Lowry e Bradford e os resultados obtidos nas curvas de calibrao apresentaram desvio padro relativo menor que 0,3%, quando comparados albumina de soro bovino padro (BSA). Portanto, com base nestes resultados, optou-se pelo BSA para confeco das curvas de calibrao nos ensaios de teor protico. No entanto, deve-se salientar que os resultados obtidos nestas metodologias so comparativos e no absolutos porque a composio qumica estrutural dos aminocidos do BSA, particularmente no que tange presena de hidroxilas fenlicas, no igual quelas presentes nas PCTrR.
TABELA 16 TEOR PROTICO SEGUNDO OS MTODOS DE LOWRY E DE BRADFORD DAS PCTrR E DAS FORMULAOES ENZIMTICAS COMERCIAIS LOWRY Cdigo A B C D E F G H Novozym 188 (-glucosidase)

BRADFORD DPR 1,35 1,42 0,96 0,57 1,45 1,02 0,98 0,65 0,23 0,34 Concentrao, mg/ml 20,60 27,40 126,30 45,10 67,60 49,00 36,60 42,30 38,90 167,30 DPR 7,51 5,34 6,61 3,57 4,58 6,42 5,81 2,50 5,73 2,94

Concentrao, mg/ml 21,00 27,00 127,00 41,00 67,00 47,00 37,00 41,00 39,60 168,50

Celluclast 1.5L

DPR, desvio padro relativo

Uma vez estabelecido o padro analtico primrio (BSA) efetuou-se a validao das duas metodologias.

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Na Tabela 16 encontram-se expressas as mdias obtidas entre cinco anlises que realizadas em momentos distintos e que apresentaram variaes compatveis com os limites estabelecidos na validao da metodologia. As varincias aceitas para estes ensaios tiveram como base um desvio padro relativo de 1,5%, sendo que quaisquer valores superiores a este limite no foram considerados vlidos. Por esse motivo, o teor de protenas neste estudo foi preferencialmente determinado pelo mtodo de Lowry. A concentrao de protenas nas PCTrR variou de 21,00 a 127,00 mg/ml, enquanto que as formulaes comerciais Celluclast 1.5L

e Novozym 188

apresentaram teor protico de 168,50 e 39,60 mg/ml, respectivamente. Afim de facilitar a visualizao, estes valores encontram-se representados na Figura 29. Celluclast 1.5L apresentou o maior ttulo de protenas em relao s demais

preparaes celulsicas. O principal motivo desta superioridade no teor protico reside no fato de que, no caso da cepa industrial, o processo de fermentao em larga escala seguido por etapas sucessivas de concentrao e estabilizao a que as PCTrR no foram submetidas, com exceo da enzima C , segundo informaes prestadas pelo fabricante. Assim, as PCTrR, por terem sido produzidas em processos fermentativos dissemelhantes, apresentam variaes em seus respectivos nveis proticos que no podem ser meramente interpretadas como decorrncia direta da manipulao gentica. Conforme DURND (1995), as modificaes nas condies de fermentao de linhagens mutagnicas alteram o rendimento na produo de protenas, sendo exemplo tpico a secreo de quantidades superiores a 40 g/L sob condies otimizadas de cultivo.

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FIGURA 29 GRFICO COMPARATIVO DO TEOR DE PROTENAS CONTIDO NAS PCTrR E NAS PREPARAES INDUSTRIAIS UTILIZADAS COMO REFERNCIA
Celluclast 1,5 L Novozym 188 Enz H Enz G Enz F Enz E Enz D Enz C Enz B Enz A 0 27,00 21,00 50 100 150 200 39,60 41,00 37,00 47,00 67,00 41,00 127,00 168,50

Concentrao (mg/ml)

Vale ressaltar que a principal finalidade destes ensaios foi a de estabelecer uma metodologia padro, desde o incio dos trabalhos, que representasse a concentrao real das enzimas nas formulaes originais e nas diluies requeridas para os tratamentos enzimticos. A fidedignidade destes valores obviamente limitante e fundamental para a avaliao das atividades especficas presentes nas preparaes.

5.1.2 Estudo Comparativo Sobre Atividades Enzimticas Conforme descrito na literatura (FAN et al., 1987), o modo de ao de endo e exoglucanases depende da natureza e estrutura supramolecular do substrato, do sinergismo apresentado entre as enzimas e das condies experimentais utilizadas no processo de hidrlise. Portanto, atravs da investigao do modo de ao das PCTrR sobre substratos de propriedades qumicas distintas, buscou-se esclarecer a importncia relativa e o real modo de ao destas enzimas. Os estudos iniciaram com a avaliao da ao hidroltica das PCTrR sobre substratos modelo, com a finalidade de elucidar o modo de ao cataltica para ento

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compar-la com as informaes existentes na literatura especializada. Dentre os substratos utilizados nesse estudo encontram-se a carboximetilcelulose (CMC), a hidroxietilcelulose (HEC), o papel de filtro Whatman no. 1 (UPF), a xilana de endoderma de aveia

(XEA), dois tipos de celulose microcristalina comercial

(Sigmacell e Avicel ) e a xilana da madeira de vidoeiro (XMV), alm de celobiose, azocasena e derivados p-nitrofenlicos (PNF) e 4-metilumbeliferlicos (MUmb). A avaliao dos rendimentos de hidrlise sobre esses substratos foi tambm comparada com a preparao celulsica comercial denominada Celluclast 1.5L , utilizada neste

caso como referncia. Portanto, a anlise do modo de ao endoglucansica foi avaliada sobre os substratos celulsicos hidrossolveis (CMC e HEC), a ao exoglucansica sobre celulose microcristalina (Sigmacell e Avicel), a ao hemicelulsica sobre xilanas (XEA e XMV) e a ao celobisica sobre celobiose e pnitrofenil derivados. A anlise da ao proteoltica nas PCTrR foi realizada porque estas formulaes foram geradas em processos fermentativos no necessariamente otimizados para limitar a produo de proteases no meio. Vrios autores relataram que baixos nveis de atividade proteoltica podem acarretar a separao dos domnios cataltico (DC) e de ligao ao substrato (DLC) presentes nas celulases. Destituda de sua capacidade de adsorver sobre o substrato, enzimas como a celobiohidrolase I (CBH I) sofrem uma alterao considervel de suas propriedades catalticas, reduzindo os ndices de sacarificao que lhes so comumente atribudos (BUCHERT et al., 1996). Como descrito na seo 5.2 , estes resultados foram fundamentais para justificar alguns dos dados obtidos, em relao ao perfil de ao cataltica das PCTrR. As Tabelas 17, 18 e Figura 30 trazem os resultados de atividade enzimtica, expressos em Unidades Internacionais e obtidos atravs das metodologias descritas no captulo 3.2.7.. Nos casos em que substratos de maior acessibilidade foram utilizados no ensaio, uma unidade internacional (UI) representa a liberao de 1,0 mol de anidroglucose a cada minuto de reao, sendo que no caso especfico das xilanas, este valor foi expresso em relao massa molar de anidroxilose (GHOSE, 1987).

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TABELA 17- ATIVIDADES ESPECFICAS PARA PF, CMC, HEC, XEA E XMV DAS PCTrR E DAS FORMULAES INDUSTRIAIS (GHOSE,1987) CDIGO A B C D E F G H -G CL * ild no detectado PF UI/mg 0,47 0,45 0,57 0,56 0,19 0,58 0,015 0,19 ild 0,86 CMC UI/mg 28,61 11,72 5,91 8,17 32,40 0,67 13,51 12,40 ild 19,25 HEC nkat/mg 14,94 12,49 16,59 10,86 33,61 6,12 13,88 3,22 ild 30,09 XEA UI/mg 11,31 3,82 1,92 5,20 19,15 1,06 31,50 17,31 ild 2,42 XMV UI/mg 3,20 1,22 0,06 1,67 2,11 5,29 4,88 5,91 ild 1,57

As PCTrR, designadas como A, B, C, D, E, F, G e H, apresentaram diferenas fundamentais em suas atividades celulsicas, quando comparadas com a preparao comercial Celluclast 1.5L . Por outro lado, como era de se esperar, a

preparao comercial Novozym 188 (atividade celobisica) no apresentou nenhuma

atividade sobre PF, CMC, HEC, XEA e XMV.

FIGURA 30 - ATIVIDADE SOBRE CMC (A) E ATIVIDADE SOBRE HEC (B) DAS PREPARAES CELULSICAS

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SUOMINEN et al. (1993), em publicao sobre enzimas geradas a partir da manipulao gentica de CBH I e II e de EG I e II em T. reesei, indicaram que a ausncia ou supresso de EG II causou uma reduo de 60% na atividade sobre HEC quando comparada com as enzimas da cepa original, no ocorrendo o mesmo para a atividade sobre PF. Outro dado interessante foi que a supresso dupla de CBH I e II no causou decrscimo algum na atividade contra HEC, ao passo que inibiu totalmente a atividade sobre PF. A determinao da atividade endoglucansica presente nas PCTrR foi ensaiada contra dois tipos de substratos, a hidroxietilcelulose (HEC) e a carboximetilcelulose (CMC), ambas oriundas de modificao qumica da celulose que, dependendo de seu grau de substituio, confere solubilidade em meio aquoso ao derivado. De um modo geral, diferenas foram observadas quanto ao modo de ao das enzimas sobre esses substratos. Quando utilizado o substrato mais solvel (HEC), os ndices de atividade especfica, ou seja aquelas condies analticas padronizadas por GHOSE (1987), foram numericamente superiores aos do CMC, sugerindo que as celulases apresentam uma maior acessibilidade e/ou seletividade estereoqumica sobre esse substrato (FRANZ & BLASCHEK, 1990). No entanto, um estudo comparativo entre os dados obtidos revela que as tendncias observadas foram relativamente equivalentes em ambos os casos, ou seja, pouca atividade contra ambos foi observada naquelas preparaes enzimticas destitudas de atividade endoglucansica, quando estas foram ensaiadas nas mesmas condies analticas (EVALAINEN, 1993). As preparaes enzimticas A (CBH I-) e B (CBH II-), em que todas as endoglucanases de T. reesei encontravam-se presentes, demonstraram uma atividade especfica sobre CMC duas vezes maior do que aquela observada sobre HEC (Figura 30). Porm, em ambos os casos, a enzima A apresentou pelo menos o dobro da atividade detectada na enzima B. Por outro lado, a supresso dupla de ambas as celobiohidrolases acarretou uma perda irreversvel da atividade contra HEC, fato

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observado tanto na enzima F quanto na enzima H. Em quase todos os casos, as atividades das PCTrR sobre HEC e CMC foram inferiores quelas detectadas em Celluclast 1.5L . Os maiores valores absolutos de

atividade endoglucansica foram registrados para a enzima E frente aos substratos HEC e CMC . Na literatura especializada encontram-se observaes preliminares de que uma dupla supresso de CBHs em T. reesei acarreta um aumento considervel na expresso gnica de endoglucanases (KARHUNEN et al., 1993), porm os ensaios comprobatrios so realizados em condies analticas distintas. Tal reao pode estar associada a uma tentativa do microrganismo em compensar a ausncia das CBHs, o que ainda no foi comprovado(NEVALAINEN & PENTILL, 1995). Sendo assim, a supresso do gene que codifica para a CBH I aparentemente parece ser mais crtica (pois representa 60% em preparaes comerciais celulsicas). Nestes estudos a enzima A tambm apresentou atividade endoglucansica superior quela detectada nas outras enzimas, incluindo Celluclast 1.5L .

Comparadas as performances das preparaes A, E e G, a auseia de CBH I causou uma aumento relativo das atividades sobre CMC e HEC. Por outro lado, a supresso de EG I (enzimas C e F) acarretou uma reduo significativa nos valores de hidrlise para CMC, sendo que o efeito causado pela sua remoo (enzimas C, F e H) foi superior ao observado quando a EG II estava ausente (enzimas D, F e H). Com relao enzima G, os valores obtidos sobre CMC foram mais significativos do que aqueles obtidos sobre HEC, sendo que para este ltimo, a comparao com Celluclast 1.5L indicou uma reduo na faixa de 35%. Aparentemente, a ao endoglucansica da enzima G foi preferencial ao substrato mais solvel, sugerindo que a endoglucanase EG I apresenta uma maior acessibilidade e/ou seletividade estereoqumica sobre este substrato (FRANZ & BLASCHEK, 1990). Esta afirmativa pode ter maior sustentao quando se observa a enzima D, cuja monossupresso em EG II reduz em 50% a sua atividade sobre HEC, em comparao CMC. A anlise dos resultados de atividade sobre PF, em comparao com a

105

Celluclast 1.5L , demonstrou que as preparaes destitudas das enzimas CBH I e

CBH II (A e B) sofreram um decrscimo de atividade em torno 53%, enquanto que para a enzima E, a reduo nos nveis de atividade atingiu em cerca de 99% (Figura 31). Por outro lado, a equivalncia observada em relao supresso isolada de CBH I (A) e CBH II (B) foi surpreendente pois atribui-se CBH I uma importncia maior do que aquela associada CBH II na hidrlise de substratos como o PF (NEVALAINEN & PENTILL,1995). Esta observao foi a primeira a sugerir que as celobiohidrolases destas preparaes poderiam estar presentes na forma de seus domnios catalticos livres (DC), uma decorrncia direta dos nveis de atividade proteoltica detectados pelo mtodo da azocasena (vide tabela 18 ). Ambas supresses isoladas de EGs (enzimas C e D), assim como a completa ausncia de ambas (enzima F), resultou em valores semelhantes para atividade PFsica. A modo anlogo ao pargrafo anterior, conclui-se que presena de atividade celobiohidrolsica nas preparaes, ainda que na ausncia das EGs I e II, garantem o sinergismo necessrio para a hidrlise do papel de filtro. Estes dados, somados ao fato de que a enzima E (supresso dupla em CBH I e II) apresentou a menor atividade contra PF, corroboram as indicaes da literatura de que as celobiohidrolases representam as principais enzimas para a sacarificao deste tipo de material celulsico (REINIKAINEN et al.,1995).
FIGURA 31 - ATIVIDADE DAS PREPARAES ENZIMTICAS SOBRE PAPEL FILTRO (GHOSE,1987)

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O estudo da atividade especfica das PCTrR sobre xilanas comerciais pode ser visto na Figura 32. Em geral, foi detectada uma diferena considervel na habilidade das enzimas em hidrolisar xilanas de diferentes origens, como XEA e XMV, provavelmente devido diferenas qumicas e/ou estruturais existentes entre essas hemiceluloses. A xilana de vidoeiro (XMV) rende quase que exclusivamente xilose como produto de sua hidrlise cida, enquanto que a xilana de endosperma de aveia (XEA) contm quantidades apreciveis de outros monossacardeos como glucose e arabinose. No entanto, a XEA apresenta maior solubilidade em gua e/ou solues cidas diludas, o que pode justificar uma maior acessibilidade apesar de sua grande heterogeneneidade (ROBBERS et al., 1997). A atividade xilansica do complexo enzimtico respondeu de maneira muito significativa manipulao gentica, principalmente quando da remoo do gene que codifica para CBH I. De acordo com a Tabela 17, a atividade da enzima A sobre XEA foi de 11,31 UI/mg, enquanto que a B apresentou uma atividade de apenas 3,82 UI/mg. Por outro lado, a enzima E apresentou uma atividade sobre XEA de 19,15 UI/mg, o que representa um aumento de atividade xilansica da ordem de cinco a seis vezes em comparao com Celluclast 1.5L .

FIGURA 32 - GRFICO COMPARATIVO ENTRE AS ATIVIDADES XILANSICAS DAS PCTrR E DE CELLUCLAST 1.5L . XEA, REPRESENTADO POR CINZA CLARO E XMV, POR CINZA ESCURO

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Considerando-se que endoglucanases como a EG I de T. reesei apresentam uma alta atividade -(1-4)-xilansica, estes dados confirmam o fato de que a supresso genmica de ambas as celobiohidrolases acarretou um aumento na expresso de endoglucanases, conforme demonstrado nos estudos de SUOMINEN et al. (1993). Em continuao s observaes descritas acima, ambas as PCTrR deficientes em EG I (enzimas C e F) apresentaram os menores ndices de atividades sobre XEA, sendo que as enzimas B (CBH II-) e D (EG II-) recaram sob um nvel de atividade intermedirio. Por outro lado, a maior atividade sobre XEA foi detectada na enzima G, que corresponde a uma supresso tripla em EG II, CBH I e CBH II. Portanto, este dado reitera o fato de que a EG I apresenta alta atividade xilanoltica. Por outro lado, a XMV no demonstrou ser um substrato adequado para EG I. Apesar de mais ativas sobre XEA, as preparaes A e B (supresses isoladas de CBH I e CBH II) apresentaram um decrscimo equivalente de atividade em funo da mudana do substrato xilansico. No entanto, este dado no foi confirmado pela atividade xilansica da enzima H (supresso tripla em EG I, EG II e CBH II), que apresentou alto poder hidroltico sobre xilanas nas condies experimentais utilizadas nestes ensaios. interessante observar que a enzima F (EG I e II-) foi a nica a apresentar atividade contra XMV maior do que aquela apresentada sobre XEA, pois esta enzima contm atividade majoritariamente celobiohidrolsica e a eventual ocorrncia de maiores ndices de EG III nesta preparao no teriam causado maiores influncias porque essa enzima no atua sobre substratos desta natureza (Matti Siika-Aho, comunicao pessoal). Existe uma tendncia a se acreditar que a enzima EG I possui uma afinidade maior ao substrato de aveia do que ao de vidoeiro, porm estudos mais especficos para confirmar precisariam ser realizados. A determinao da atividade -glucosidsica foi medida baseando-se no princpio da proporcionalidade estequiomtrica da reao enzimtica contra PNFG (p-

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nitrofenilglucosdeo), com a subsequente liberao de PNF (p-nitrofenol) no meio de reao. Todas as enzimas apresentaram atividade sobre PNFG consideravelmente superior quela observada para a Celluclast 1.5L (Tabela 18), fato este provavelmente

relacionado a um efeito complementar da manipulao gentica sobre o complexo celulsico secretado por T. reesei. No entanto, a comparao direta com Celluclast 1.5L deve ser feita com cautela porque os estudos genticos no tiveram origem na

cepa industrial correspondente. Infelizmente, a falta de uma amostra do complexo secretado pela cepa de origem no nos permitiu ensaiar um estudo comparativo mais realstico.
TABELA 18 - ATIVIDADES ENZIMTICAS SOBRE SUBSTRATOS CROMOFRICOS DEMONSTRADAS PELAS PCTrR E FORMULAES INDUSTRIAIS CDIGO A B C D E F G H -G PNFG UI/mg 1, 25 1, 33 0, 41 0, 79 0, 79 0, 70 0, 83 0, 85 ild PNFL UI/ mg 1, 22 0, 78 0, 37 0, 75 1, 24 0, 84 0, 92 0, 78 Ild PNFLc UI/mg 0, 94 0, 61 0, 14 0, 74 0, 95 0, 37 0, 77 0, 38 ild AZC UT / mg 0, 38 0, 39 0, 08 0, 22 0, 18 0, 21 0, 37 0, 20 0, 02

CP ild 1, 39 0, 79 ild ild no detectado PNFL ensaio sem a presena de D-glucono-1,5--lactona PNFLc ensaio na presena de D-glucono-1,5--lactona e celobiose

A atividade exoglucansica (CBH) de cada PCTrR foi tambm medida comparando a atividade sobre PNFL na ausncia e na presena de inibidores endoglucansicos (celobiose) e -glucosidsicos (D-glucono-1,5--lactona). Somente as preparaes CL, F e H apresentaram diferenas significativas entre essas medidas, da ordem de 0,4 UI/mg. De fato, estas so as enzimas que apresentam a maior concentrao de celobiohidrolases, cabendo valores apenas parciais de atividade

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quelas enzimas em que a atividade celobiohidrolsica no foi muito pronunciada (Figura 33).
FIGURA 33 - ANLISE COMPARATIVA ENTRE AS ATIVIDADES SOBRE PNFL. A ATIVIDADE NA AUSNCIA DE CELOBIOSE ENCONTRA-SE REPRESENTADA EM BRANCO, ENQUANTO QUE A DETERMINADA NA SUA PRESENA FOI REGISTRADA EM CINZA ESCURO

Dois substratos microcristalinos tambm foram utilizados para determinar a atividade exoglucansica das PCTrR: Avicel e Sigmacelll .

Diferentemente dos ensaios realizados com substratos de alta acessibilidade s enzimas, a determinao da atividade sobre celulose microcristalina no permitiu com que os resultados fossem expressos em unidades internacionais porque os nveis de sacarificao obtidos foram muito inferiores ao requerido para os clculos. A unidade internacional foi ento prejudicado pela incapacidade de algumas enzimas em liberar quantidades apreciveis de glucose e celobiose a partir de estruturas de maior organizao estrutural. Nestes casos, o ensaio foi realizado a uma carga protica constante e igual a 200 mg/g de substrato e a atividade hidroltica foi descrita como o rendimento de hidrlise, expresso em equivalentes de glucose e obtido aps 2 horas de incubao a 45C e 150 rpm. Os resultados indicaram que cada enzima apresentou um ndice de

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sacarificao caracterstico, sugerindo diferenas em seus modos de ao sobre substratos de alta organizao molecular. De um modo geral, a supresso isolada de apenas um dos genes que codificam para as principais celulases de T. reesei acarretou um decrscimo considervel na atividade do complexo sobre Avicel e Sigmacell (vide Celluclast

1.5L ), mas a extenso da hidrlise em todos os casos no diferiu substancialmente

quer entre os substratos, quer entre as enzimas ensaiadas. Das quatro monossupresses (enzimas A, B, C e D), a enzima D foi a que demonstrou a melhor performance, muito embora as diferenas possam ser interpretadas como inseridas no erro do procedimento experimental (Figura 34). A enzima F foi a que apresentou maior atividade sobre celulose microcristalina, uma decorrncia direta de seu alto teor em celobiohidrolases. Por outro lado, as preparaes enzimticas G e H, das quais foram suprimidos pelo menos trs genes que codificam para as principais enzimas do complexo, apresentaram baixa eficincia hidroltica contra ambas, Avicel e Sigmacell . Da mesma forma, a enzima E foi

responsvel por ndices de sacarificao anlogos s enzimas G e H.

FIGURA 34 - GRFICO COMPARATIVO ENTRE AS ATIVIDADES DAS PCTrR E DE CELLUCLAST 1.5L SOBRE DOIS TIPOS DE CELULOSE MICROCRISTALINA. AS BARRAS ESCURAS INDICAM A HIDRLISE DE AVICEL , ENQUANTO QUE AS BARRAS TRANSPARENTES, DE SIGMACELL

Hidrlise (%, m/m)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A B C D E F G H CL

111

O comportamento de ambas as preparaes destitudas de CBH I e CBH II foi certamente congruente com a constatao de que substratos microcristalinos requerem este tipo de atividade para que sejam sacarificados a uma extenso mensurvel. No entanto, a baixa atividade cataltica da enzima H foi relativamente surpreendente porque esta preparao contm CBH I em alto ttulo. Portanto, duas possibilidades poderiam justificar este comportamento anmalo: ou a supresso tripla comprometeu radicalmente o sinergismo necessrio para a sacarificao de celulose microcristalina, ou a CBH I no se encontra presente na preparao em sua forma ntegra, ou seja, com a capacidade de adsorver ao substrato e com isso exercer sua ao hidroltica caracterstica, via terminais redutores da cadeia. Na verdade, essa ltima hiptese estaria de acordo com a atividade proteoltica detectada em todas as preparaes enzimticas, conforme descrito abaixo. Complementando este estudo, foram realizadas as medidas da atividade proteoltica sobre o substrato azocasena (AZC), sendo que os valores experimentais foram tambm representados em UT/mg (Tabela 18, Figura 35). Todas as preparaes enzimticas apresentaram uma atividade proteoltica residual, que variou de 0,38 UT/mg na enzima B a 0,02 UI/mg em Celluclast 1.5L . Como o peptdeo de

interligao entre os domnio cataltico (DC) e o domnio de ligao ao substrato (DLC) suscetvel protelise (TEERI et al., 1999), tais resultados sugerem que praticamente todas as PCTrR devem apresentar um teor varivel de DC livre. Sendo este o caso, deve-se tambm reconhecer que quantidades proporcionais de DLC livre devero estar presentes nestas preparaes. Estudos de KUBICEK-PRANZ (1991) indicaram que uma protelise parcial um fenmeno comum nas celulases de Trichoderma, no significando que este efeito altere a atividade celulsica do complexo. Em sua reviso bibliogrfica Kubicek (1992) apresenta evidncias muito fortes de que a atividade proteoltica de celulases ocorre naturalmente. As proteases que esto envolvidas na degradao de celulases so induzidas por um pH extracelular

112

inferior a 4 e uma baixa carga protica ( 0,1 mg / ml ). Diferentes celulases so atacadas de maneiras diferentes, por exemplo, enquanto o ataque a CBH I inicia pela remoo exclusivamente do domnio-AB , a CBH II atacada simultaneamente nos seus dois terminais , dificultando a ao destas enzimas sobre celulose cristalina.. A protelise pode causar efeitos adversos na qualidade das preparaes celulsicas em escala piloto ou comercial. Conforme declarado anteriormente, as condies de fermentao das PCTrR para produo de enzimas no foram otimizadas afim de minimizar a secreo de atividade proteoltica no meio. Desta forma, foi identificada em carter prioritrio a necessidade de estudos mais avanados para investigar a ocorrncia de DC livres nas PCTrR, pois tal constatao poderia ter uma influncia considervel sobre a interpretao de suas atividades especficas e eventuais aplicaes no biopolimento e/ou modificao superficial de fibras celulsicas comerciais. Tal estratgia teve como base a anlise das PCTrR por cromatografia de bioafinidade, conforme descrito na prxima seo deste trabalho.
FIGURA 35 - GRFICO DEMONSTRATIVO DAS ATIVIDADES PROTEOLTICAS PRESENTES NAS PCTrR E NA PREPARAO INDUSTRIAL UTILIZADA COMO REFERNCIA

Celluclast 1,5 L Enz H Enz G Enz F Enz E Enz D Enz C Enz B Enz A -

0,02 0,2 0,37 0,21 0,18 0,22 0,08 0,39 0,38 0,10 0,20 0,30 Concentrao, mg/ml 0,40 0,50

113

5.2

CARACTERIZAO

DAS

PREPARAES

CELULSICAS

POR

CROMATOGRAFIA DE TROCA INICA (FPLC) Nesta seo encontram-se apresentados os dados referentes padronizao e validao da metodologia de FPLC. Esta anlise cromatogrfica foi utilizada como instrumento para fracionar os componentes proticos constitutivos das PCTrR, sendo que a preparao comercial Celluclast 1.5L foi utilizada com a finalidade de calibrar o

sistema. Este procedimento, realizado a posteriori para analisar as fraes proticas constituintes das PCTrR, foi acompanhado por vrios ensaios de atividade especfica, conforme descrito abaixo.

5.2.1 Padronizao do Sistema Cromatogrfico Utilizando Celluclast 1.5L

A padronizao da metodologia de FPLC foi inicialmente validada com Celluclast 1.5L , quando a estratgia de fracionamento das alquotas foi padronizada

para o sistema cromatogrfico. A cada alquota fracionada foram dosadas a carga protica, a atividade sobre HEC e a atividade monoclonal para CBH II. O sistema cromatogrfico foi ento otimizado afim de se obter a menor superposio possvel entre os diversos grupos de celulases, sendo que a validao da metodologia foi realizada atravs da repetio dos ensaios e da determinao de seus ndices de reprodutibilidade (vide tem 4.2.6). Atividades especficas complementares foram tambm realizadas em paralelo para melhor caracterizar o perfil de eluio do sistema cromatogrfico. Finalmente, uma vez padronizada e validada a metodologia, as PCTrR foram cromatogradas. Em um detalhamento maior do procedimento padro estabelecido a partir da CL, as amostras foram inicialmente dessalinizadas em uma coluna ECONOPAC 10 G e diludas para uma concentrao protica final de 3-5 mg/ml de soluo tampo. Cabe ressaltar que esta coluna composta por um gel de poliacrilamida que proporciona elevados rendimentos no processo de dessalinizao sem que haja

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interferncia na atividade biolgica das enzimas, pois esta exclui somente molculas com massa molecular menor que 6 kD e acredita-se que as protenas constituintes das PCTrR possuem massa molecular mnima de 23 kD. No entanto, estudos recentes indicaram que a EG V (pI =2,8-3) poderia ser parcialmente retida por esta coluna, mesmo possuindo uma MM na faixa de 23 kDa (Matti Siika-aho, comunicao pessoal). Como resultado desta validao para CL, tivemos a elaborao de uma seqncia de eluio com a coleta de alquotas de 2,0 ml a cada minuto, gerando um total de 44 alquotas (Vt= 88mL) por ensaio que por sua vez continham separadamente os componentes proticos. A distribuio das fraes com relao aos grupos de enzimas estabelecidos nesse estudo esto representados na Figura 36.
FIGURA 36 CROMATOGRAMA DA PREPARAO COMERCIAL CELLUCLAST 1,5L POR FPLC, COM A IDENTIFICAO DAS FRAES FORMADAS A PARTIR DAS ALQUOTAS ELUDAS DA COLUNA

A (280 nm)

gradiente

F1 F2 F3
0 8 16

F4
24 Volume, mL

F5
32 40

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Inicialmente, foram dosadas em cada alquota eluda o teor de protenas pelo mtodo de Lowry (vide tem 4.2.5), a atividade sobre HEC (vide 4.2.6.3) e a reatividade contra anticorpos monoclonais desenvolvidos para CBH II (vide tem 4.4.2). Alternativamente, a atividade das alquotas que constituram as fraes endoglucansicas foi determinada contra o substrato cromognico 4-metilumbeliferilcelotriosdeo (MUmbG3), visando a deteco seletiva de EG II na presena de quaisquer outros componentes do sistema celulsico de T. reesei. Na Figura 37 encontram-se relacionadas a atividade sobre HEC e o teor de protenas determinado em cada alquota de 2 ml que constitui o perfil de eluio da enzima. O desvio padro relativo a estas anlises sugere que os valores entre 0,1 e 0,2 UI/ml no devem ser considerados absolutos pois esto fora do limite de confiabilidade do mtodo.
FIGURA 37 ANLISE DAS FRAES DE FPLC PARA A CELLUCLAST 1.5L: COMPARAO ENTRE O TEOR DE PROTENAS (BARRAS) E A ATIVIDADE SOBRE HEC (LINHA)
3 2,5 2
mg/ml

7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0

UI/mg

1,5 1 0,5 0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

(1,0) Frao
43

Foi observado que a concentrao de protenas varia ao longo da eluio, enquanto que a atividade especfica sobre HEC (endoglucanases) limitou-se s primeiras fraes coletadas. Portanto, a frao F1 foi a que apresentou maior atividade

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sobre HEC, enquanto que as fraes F2, F3 e F4 apresentaram atividade endoglucansica em nveis bem inferiores. Finalmente, nenhuma atividade sobre HEC foi detectada na frao F5, sugerindo que esta corresponda exoglucanase de menor pI em T. reesei, a CBH I. Outra importante observao feita sobre o perfil de eluio da CL foi a de que as alquotas que representam a enzima CBH I (frao F5) corresponderam a mais de 57% do teor protico total da amostra, o que est perfeitamente de acordo com o trabalho publicado por TENKANEN et al. (1999). No entanto, importante observar que este resultado diz respeito exclusivamente ao teor protico, no havendo qualquer elemento para garantir que a banda de eluio da CBH I no pudesse estar parcialmente contaminada com outro componente protico existente no complexo celulsico de T. reesei. Na Tabela 19 esto listados os teores proticos das cinco fraes compostas a partir das alquotas de 3 a 34, juntamente com suas respectivas atividades endoglucansicas. As fraes F1 e F3 foram aquelas que apresentaram os maiores quociente entre a atividades HEC e o teor proteco, caracterizando volumes de eluio majoritariamente endoglucansicos.
TABELA 19 PROTENAS E ATIVIDADE HEC PARA CELLUCLAST 1.5L NAS FRAES COLETADAS APS O FPLC

Alquotas 3-9 10-11 12-16 17-27 28-34

Frao 1 2 3 4 5

Protenas (mg/ml) 2,304 0,476 1,868 2,88 7,14

Atividade sobre HEC (UI/mg) 12,09 5,96 11,34 3,14 2,71

A presena de EG II nas fraes F1, F2 e F3 foi determinada mediante ensaio contra o substrato cromognico 4-metilumbeliferil-celotriosdeo (MUmbG3). Segundo CLAEYSSENS et al. (1990), o MUmbG3 pode ser considerado especfico

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para EG II porque esta enzima a nica capaz de clivar sua ligao heterosdica, liberando a aglicona para anlise espectrofotomtrica. No entanto, -glucosidases como as presentes no complexo enzimtico de T. reesei tambm so capazes de exercer esta ao cataltica, razo pela qual o ensaio foi conduzido na presena de glucono-1,5-lactona, um forte inibidor de atividade -glucosidsica. O ensaio, com CL, revelou uma atividade mdia de 1,35 nkat/ml na frao F1, 0,71 nkat/ml na frao F2 e valores inferiores a 0,09 nkat/ml nas demais alquotas. Sendo assim, a EG II est restrita s duas primeiras fraes do FPLC, sendo que a maior parte desta enzima encontra-se na frao F1. Embora no tenha sido realizado nenhum ensaio especfico, a enzima EG III deve ter apresentado uma baixa afinidade pela coluna Resource Q e, por conseguinte,

um baixo volume de reteno. Tal comportamento cromatogrfico justificvel pela prpria caracterstica estrutural da enzima, que possui uma pequena massa molecular (25 kDa), um alto ponto isoeltrico (pI de 7,4) e pouca afinidade pela fase estacionria por ser destituda do DLC (Tabela 7). Por outro lado, estando ambas EG II e EG III restritas s fraes F1 e F2 do perfil de eluio, a atividade endoglucansica das fraes F3 e F4 foi atribuda s vrias formas isomrficas da enzima EG I. Esta hiptese tambm justificvel mediante uma anlise das propriedades da enzima que, com massa molecular de 55 kDa e pI de 4,6 (Tabela 7), teria a tendncia de eluir na regio intermediria do gradiente de eluio. Outra observao importante o fato de 40% do total da atividade endoglucansica da enzima controle CL estar concentrada nestas fraes. Para confirmao dos dados referentes separao cromatogrfica dos componentes proticos, foram tambm realizados ensaios de atividade monoclonal para a deteco de CBH II em todas as fraes coletadas do FPLC. Estes ensaios indicaram a presena de CBH II nas alquotas 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 24, sendo que as alquotas com maior intensidade foram as de 10 a 14. Na Figura 38 encontram-se os resultados da atividade monoclonal para cada alquota de CL.

118

Como pode ser visto nas atribuies enzimticas de cada frao isolada, a CBH II pode ser encontrada em pelo menos duas fraes das seis isoladas e isto caracteriza a falta de resoluo que o sistema apresenta para esta enzima em

especfico. Tal comportamento cromatogrfico est associado: (a) presena de vrias formas isomrficas (ou isoenzimas) da CBH II dentre as celulases secretadas por T. reesei e (b) proximidade que a CBH II e a EG I apresentam em seus pontos isoeltricos, massa molecular e/ou raio hidrodinmico (vide Tabela 7). De fato, no h qualquer registro na literatura de protocolo nico de anlise capaz de segregar a CBH II do restante do complexo enzimtico de maneira inequvoca, o mesmo se aplicando para as enzimas EG II e EG III, encontradas principalmente na frao F1 do protocolo de anlise (alquotas de 3 a 9).
FIGURA 38 REPRESENTAO DA QUANTIDADE DE CBH II EXISTENTE EM CADA ALQUOTA ELUDA POR FPLC A PARTIR DE CELLUCLAST 1.5L CADA QUADRADO REPRESENTA UM INCREMENTO RELATIVO DE ANTICORPO SENSIBILIZADO

2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16. 18. 20. 22.

NDICES DE PRESENA 24. 26. 28. 30. 32. 34. 34. 38. 40. 42. 44.

GRFICO DE TENDNCIA

Aumento na concentrao

A anlise das fraes mostra que no volume final de eluio da corrida cromatogrfica, as alquotas de 28 a 34 (frao F5) no apresentaram qualquer indcio de atividade endoglucansica (HEC) ou presena de CBH II, embora uma quantidade considervel de protenas tenha sido detectada. Tal observao, juntamente com a avaliao dos pI das enzimas, levou-nos a definir esta regio como os volumes de
II CBH II CBH II, EG IDC CBH I, CBH IDC desconhec ido

EG II, EG III
EG I, EG

119

reteno que caracterizam a eluio da CBH I e, eventualmente, de seu respectivo domnio cataltico. Os ensaios de atividade especfica para confirmar esta regio como de ao especfica de CBH I sero discutidos na prxima seo, juntamente com as PCTrR. Segundo os resultados obtidos nesta etapa de validao do mtodo, foi definido que: (a) a frao F1 a regio de maior probabilidade de se encontrar EG II e EG III; (b) a frao F2 representa a regio de maior probabilidade de se encontrar EG II e CBH II; (c) a frao F3 concentra as enzimas EG I e CBH II; (d) a frao F4 majoritariamente composta pela enzima EG I; e (e) a frao F5 encerra o principal componente do sistema celulsico, ou seja, a CBH I. A etapa final da padronizao do sistema cromatogrfico foi a dosagem na F5 do teor de domnio cataltico livre de CBH I (vide tem 4.4.3). Estas anlises pretendiam confirmar se a CBH I estava completa ou se, por ao proteoltica do meio, havia sido parcialmente convertida em DC livre. Esta validao foi feita utilizando as alquotas de 31 a 34 e, como na fase anterior, as primeiras medidas a serem efetuadas foram as determinaes de teor protico (vide tem 4.2.5).

5.2.2 FPLC das PCTrR e Atividades Especficas Presentes nas Fraes Coletadas Nesta seo encontra-se avaliada a cromatografia de troca inica (FPLC) das PCTrR e as atividades especficas de cada frao obtida, depois do procedimento de validao para a Celluclast 1.5L . O procedimento de validao da metodologia foi

descrito em 5.3.1 e suas condies cromatogrficas, no tem 4.4. Os trabalhos foram desenvolvidos em quatro etapas que envolveram: a obteno inicial dos cromatogramas das PCTrR, usando a metodologia validada; a separao das fraes onde a probabilidade era maior de se encontrar os distintos grupamentos celulsicos; a confirmao do perfil cataltico mediante a determinao das atividades especficas de cada frao; e a anlise da frao F5 para confirmao da presena de DC livre da

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CBH I nas preparaes. O processo inicial de preparao das amostras (dessalinizao) foi acompanhado de medies condutivimtricas, feitas com as diluies das PCTrR antes destas serem cromatografadas. A mdia entre as leituras obtidas para cada diluio encontra-se expressa na Tabela 20.
TABELA 20 VALORES DE CONDUTIVIDADE ELTRICA NAS DILUIES DAS ENZIMAS PARA O FPLC Enzima Enzima Medida condutivimtrica (KS) Medida condutivimtrica (KS) A B C D 19,8 19,6 21,8 22,6 E F G H 21,5 21,3 22,7 22,5

O resultado das leituras nas diluies das amostras ficou entre 19,6 e 22,2 KS, com um desvio padro relativo de 5,37% em torno da mdia. Tais amostras foram consideradas apropriadas para a anlise cromatogrfica, pois os limites de aceitao do mtodo foram de 17 e 24 KS para uma fase mvel com condutividade eltrica inicial de 22,0 KS. As Figuras 39 e 40 apresentam os cromatogramas obtidos por FPLC para as PCTrR. Iniciando pela visualizao do perfil protico, possvel observar que existem diferenas significativas na composio das respectivas preparaes. Estas variaes representam o efeito da manipulao gentica sobre o complexo celulsico de T. reesei, muito embora no tenha sido possvel utilizar o controle mais adequado para estes ensaios. Dentre tantas observaes experimentais que se podem fazer sobre os perfis obtidos, percebe-se que a enzima A apresenta claramente a ausncia de CBH I (Figura 40), enquanto que o distribuio protica nas outras fraes eludas apresentou uma correlao aceitvel com a expectativa gerada pela estratgia de manipulao gentica (Figuras 39 e 40).

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FIGURA 39 - CROMATOGRAMAS DAS PCTRR QUE SOFRERAM SUPRESSO DE ENDOGLUCANASES

Obviamente, dados exclusivamente relacionados com protenas precisam ser analisados com cuidado, pois os cromatogramas obtidos certamente revelam a presena de outras protenas e/ou enzimas que no foram investigadas nesse estudo.

122

FIGURA 40 - CROMATOGRAMA DAS PCTRR QUE SOFRERAM SUPRESSO DE CELOBIOHIDROLASES

Para que as atividades em todas as fraes pudessem ser expressas em temos de atividade especfica (UI/mg ou nkat/mg), foram dosadas as suas respectivas concentraes em protenas segundo o mtodo de Lowry. A comparao entre as vrias fraes proticas existentes nas PCTrR pode ser vista na Figura 41, onde os dados de protenas encontram-se normalizados, enquanto que as respectivas atividades especficas sobre HEC encontram-se discriminadas na Tabela 21 e na Figura 42. interessante observar que a remoo de CBH I, sendo a principal enzima presente no complexo enzimtico produzido pelo fungo, naturalmente acarreta um

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aumento percentual na contribuio associada aos outros componentes enzimticos como, por exemplo, as endoglucanases EG I, II e III. Enquanto que a frao F1 da enzima A respondeu por 56,5% de seu teor protico, esta mesma frao foi responsvel por apenas 19,9% do teor protico da enzima B, justificando a expectativa de que a remoo de CBH I acarreta uma alterao significativa na composio protica das preparaes (Figura 41). No entanto, mesmo estando bem caracterizada a ausncia de CBH I na enzima A (SUOMINEN et al., 1993), ainda houve deteco de alguma protena residual na frao F5, evidenciando a ocorrncia de outras protenas de comportamento cromatogrfico equivalente CBH I nesta frao. Uma especulao sobre a natureza destas protenas pode ser endereada EG V, uma endoglucanase minoritria que apresenta pI inferior CBH I (Tabela 7), mesmo porque a atividade sobre HEC no foi monitorada nos volumes isolados a partir da alquota 34. Obviamente, outros fragmentos proticos podem ter igualmente contribudo para a composio destas fraes, como domnios de ligao ao substrato e peptdeos de natureza desconhecida.
FIGURA 41 - RELAO PERCENTUAL DO TEOR DE PROTENAS EM CADA FRAO DERIVADA DAS PCTRR E CELLUCLAST 1.5L (CL) POR FPLC

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TABELA 21 ATIVIDADE SOBRE HEC NAS FRAES COLETADAS APS O FPLC. Frao A 1 2 3 4 5 30,3 7,5 20,8 8,5 0 B 29,6 9,3 16,2 9,1 0 C Atividade sobre HEC (nkat/ml) D E F 2,6 0 16,3 9,1 0 39,3 12,8 41,7 16,6 10 5,5 0 0 0 0 G 4,6 0 19,2 17,3 0 H 0 0 0 0 0

22,0 0 0 0 0

Comparando-se as enzimas A e B nas Tabela 21 e Figura 42, percebe-se que a monossupresso de apenas uma celobiohidrolase, seja CBH I ou CBH II, no interfere consideravelmente sobre a distribuio de atividade endoglucansica nas fraes isoladas por FPLC. Tal observao seria tambm aplicvel enzima E, no fosse a pequena atividade endoglucansica detectada na frao correspondente CBH I (frao F5). Interessantemente, este comportamento anmalo da frao F5 no foi exclusivo da enzima E, pois o controle CL (Celluclast 1.5L) tambm apresentou atividade residual sobre HEC nesta frao. Portanto, como a atuao da CBH I sobre substratos solveis dificilmente detectvel, pois se restringe s unidades de anidroglucose existentes a partir do terminal no redutor at a primeira unidade hidroxietlica substituda, a deteco de atividade sobre HEC na frao F5 deve estar relacionada presena de alguma contaminao ainda no identificada nestas fraes.
FIGURA 42 - ATIVIDADE SOBRE HEC DETERMINADA NAS FRAES DERIVADAS DAS PCTRR E CELLUCLAST 1.5L (CL) POR FPLC (DADOS NORMALIZADOS)

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Considerando-se as atribuies feitas sobre a eluio de Celluclast 1.5L , foi

observado que a da enzima F (supresso dupla em EG I e EG II) apresentou atividade contra HEC apenas na frao F1 sugerindo que a EG III encontra-se majoritariamente restrita esta frao. Por outro lado, a monossupresso de EG I na enzima C tambm aumentou o teor protico e a atividade contra HEC na frao F1. Finalmente, a ausncia de EG II na enzima D aumentou consideravelmente as medidas de atividade nas fraes F3 e F4, donde conclui-se que estas fraes contm a maior parte da EG I presente no sistema celulsico de T. reesei. despeito das diferenas marcantes em suas constituies proticas, as duas enzimas em que EG I foi suprimida por manipulao gentica apresentaram o mesmo perfil cataltico contra HEC. Tratando-se de uma supresso simples (enzima C) e de uma supresso dupla (enzima F), esta observao tem trs decorrncias imediatas: (a) que a enzima EG III, constante na frao F1 do FPLC, de grande importncia nas preparaes onde EG I foi eliminada, apesar de ser uma enzima destituda do domnio de ligao celulose; (b) ambas, EG II e III, esto definitivamente concentradas na frao FI do processo; e (c) os nveis de EG III ou de outro componente endoglucansico do sistema aumentaram na enzima onde ambas, EG I e II, foram eliminadas. Como discutido anteriormente, as observaes feitas acima podem tambm ser deduzidas a partir do perfil de eluio da enzima H por FPLC pois, sendo uma supresso tripla em EG I, EG II e CBH II, todo o teor protico registrado nas fraes de F2 a F4 representam constituintes proticos de natureza no celulsica, podendo inclusive envolver a presena de outras hidrolases como xilanases e mananases. Obviamente, a frao F1 no foi citada nesta anlise porque contm a enzima EG III, enquanto que a frao F5, de natureza no endoglucansica, contm quase que exclusivamente a CBH I.

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A enzima H apresentou 28% de outras protenas em sua constituio que no a CBH I, apesar de representar uma preparao que sofreu uma trplice remoo de EG I, EG II e CBH II (Figura 41). Interessantemente, esta enzima no apresentou qualquer atividade contra HEC nas fraes eludas, mesmo naquelas tradicionalmente associadas atividade endoglucansica (Figura 42). Portanto, o perfil de eluio da enzima H d o testemunho definitivo de que outras protenas, enzimas ou no, podero estar interferindo com o mtodo. A expresso da atividade endoglucansica em relao ao teor protico (ou nkat/mg), para cada uma das fraes eludas consecutivamente da coluna de FPLC, demonstrou que a frao F2 apresentou, particularmente para as enzimas B e E, a maior atividade especfica sobre HEC (Figura 43). Desta forma, conclui-se que apenas a enzima EG II presente na frao F2 apresentou-se em maior ndice de pureza, e que todas as outras fraes continham outras protenas e/ou enzimas que no apresentavam atividade sobre HEC. O nico resultado contraditrio a esta observao foi

proporcionado pela enzima C, que contm EG II mas que no apresentou qualquer atividade especfica como propriedade da frao F2.
FIGURA 43 - ATIVIDADE ESPECFICA RECUPERADA POR FRAO ELUDA DO FPLC

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Os resultados confirmam, em todos os casos, as expectativas de que os experimentos de manipulao gentica com T. reesei foram bem sucedidos.

5.2.3 Avaliao da Presena do Domnio Cataltico Livre no Intervalo de Eluio de CBH I A ocorrncia de DC livre na frao F5 do perfil de eluio cromatogrfico foi determinada por anlise cromatogrfica complementar em Phenyl Sepharose, cujo princpio de separao baseia-se na interao hidrofbica das protenas com a fase polimrica de que a coluna constituda (fase estacionria). Nesse caso, a deteco de CBH I e seu DC foi realizada atravs de medidas de teor protico e de atividade exoglucansica nas alquotas coletadas a partir da estratgia de eluio, conforme descrito no item 4.2.6.7 . O comportamento equivalente entre a CBH I e seu domnio cataltico (DC) na coluna Resource Q (FPLC) foi possvel devido a equivalncia existente entre os seus pontos isoeltricos e a proximidade que caracteriza as suas massas moleculares. No entanto, estes componentes proticos apresentam volume de reteno diferenciado em Phenyl Sepharose porque o domnio de ligao ao substrato (DLC) aumenta a afinidade da CBH I pela matriz. Portanto, a banda com menor volume de eluio corresponde ao DC da CBH I, enquanto que a segunda banda corresponde presena de sua forma integral (Figura 44). A anlise do CBH I DC foi realizado somente na F% do perfil cromatogrfico obtido por FPLC. Os resultados obtidos em Phenyl Sepharose por interao hidrofbica (vide tem 4.4.3), indicaram a existncia de nveis variveis de CBH I preparaes enzimticas, que continham CBH I.
DC

em todas as

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FIGURA 44 PERFIL DE ELUIO DA FRAO F5 (CBH I) DA ENZIMA CELLUCLAST 1.5L EM PHENYL SEPHAROSE
gradiente

A (280 nm)

4 6 Volume, mL

Uma decorrncia direta desta observao foi exatamente a constatao de que, na maioria das enzimas estudadas exceto na CL, a frao que continha o CBH I encontrava-se com altas cargas de DC livre, ou seja, da enzima desprovida de seu domnio de ligao ao substrato (DLC), o que certamente deve influenciar a interpretao dos dados de atividade enzimtica obtidos a partir das preparaes enzimticas originais. Os resultados para esta frao F5 permaneceram na mesma faixa de trabalho validada para os ensaios com a coluna Resource Q. Estas fraes de CBH I analisadas em uma nova corrida cromatogrfica, porm, utilizam o conceito de interao hidrofbica separando o domnio cataltico da enzima inteira. Muitas das dvidas que surgiram no comportamento das PCTrR, como por exemplo a atividade quase que proporcional entre as enzimas A e B frente a papel filtro, puderam ser explicadas pelo teor de domnio cataltico presente no preparado enzimtico. A determinao da atividade exoglucansica teve como princpio a hidrlise do 4-metilumbeliferil-lactosdeo (MUmbL) na presena e na ausncia do principal inibidor das celobiohidrolases (celobiose). Desde que realizado sempre na presena de excesso de gluconolactona, que inibe a ao das -glucosidases sobre o substrato, este

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ensaio assegura a deteco da atividade residual de outros componentes enzimticos no celobiohidrolsicos na frao F5 (e.g., EG I), pois na presena de altas concentraes de celobiose, ambas CBH I e seu DC so incapazes de exercer qualquer atividade cataltica. Portanto, a diferena entre as atividades sobre MUmbL, na presena e na ausncia de celobiose, fornece a leitura da atividade exoglucansica presente na frao. Todas as enzimas derivadas de cepas recombinantes de T. reesei (PCTrR) apresentaram altos teores de protenas no volume de reteno tipicamente atribudo ao DC livre em Phenyl Sepharose, sendo que em dois casos a estrutura integral da CBH I no foi sequer detectada pelo mtodo de Lowry. Porm, a mesma avaliao analtica, quando realizada em funo da atividade especfica das fraes isoladas sobre MUmbL, demonstrou que a extenso da protelise de CBH I foi ainda maior do que o ndice previsto pelo mtodo de Lowry. Por exemplo, a frao F5 da enzima B apresentou 100% de CP com base nos clculos de atividade especfica, ao passo que apenas 78,6% deste componente foram detectados mediante ensaios de teor protico, conforme demonstrado na Tabela 22. No entanto, a curva de calibrao estabelecida para o mtodo enzimtico revelou um limite de deteco (ou sensibilidade) mnimo de 0,6 nkat/mL, o que representa algo em torno de 10% a atividade exoglucansica total estabelecida como referncia no mtodo. Assim, apesar de a frao F5 da enzima B apresentar 100% de DC com base na atividade diferencial sobre MUmbL, possvel que os nveis de atividade na banda de eluio de CBH I no tenham sido suficientemente altos para permitir deteco dentro dos limites de sensibilidade do mtodo. Um outro exemplo relativo questo do limite de sensibilidade do mtodo enzimtico diz respeito ao controle CL, ou Celluclast 1.5L. Com base no teor protico, esta enzima comercial apresenta praticamente 22% de seu componente celobiohidrolsico CBH I como DC livre. No entanto, verificada a atividade enzimtica sobre MUmbL das fraes eludas da coluna de Phenyl Sepharose,

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conclui-se que no h qualquer evidncia de protelise nesta preparao, apesar de que os limites de deteco do mtodo devam ser respeitados. Assim, apesar de ter apresentado uma atividade proteoltica residual, e de corresponder a uma preparao com pelo menos dez anos de sua data de fabricao, a amostra de Celluclast 1.5L usada neste estudo no apresenta qualquer alterao de seu principal componente enzimtico, o que reitera a sua apropriao para ensaios de sacarificao total de substratos celulsicos pr-tratados (RAMOS et al., 1997).
TABELA 22 - DETERMINAO DO TEOR DE DOMNIO CATALTICO (DC) LIVRE NA FRAO F5 (CBH I) DAS PCTrR Enzima Mtodo de Lowry % de CBHIDC livre em F51 78,61 99,99 84,12 94,22 92,59 99,99 Atividade sobre MUmbL com celobiose (nkat/mL)2 F5.1 F5.2 ild4 0,07 ild ild ild ild 0,03 ild 0,08 ild 0,01 ild sem celobiose (nkat/mL) F5.1 F5.2 ild 0,48 0,31 ild 0,36 ild 0,45 0,12 0,54 ild 0,38 ild % de DC livre em F53 100 100 85,96 100 100 ild

CL B C D F H
1

O teor de DC livre (%) corresponde razo percentual entre os teores proticos presentes nas bandas de eluio da CBH I e de seu DC; 2 F5.1 corresponde banda de eluio do DC da CBH I, enquanto que F5.2 representa a enzima integral; 3 O teor de DC livre (%) corresponde razo percentual das atividades diferenciais sobre MUmbL. ild = abaixo do limite de deteco do mtodo

Considerando-se que a CBH I encontrava-se majoritariamente como DC nas PCTrR, qual teria sido o efeito causado pela ao proteoltica sobre o modo de ao cataltica da enzima. Sabe-se que a adsoro, atravs do DLC, uma propriedade essencial das celulases e que a sua remoo por protelise compromete a efetividade com que a enzima exerce a sua atividade sobre celulose microcristalina. No entanto, a protelise no altera a estereoqumica do domnio cataltico (DC) e, portanto, no modifica o seu mecanismo de ao. Assim, o fato das enzimas B, C, D, F e H apresentarem a CBH I na forma de DC livre deve ter reduzido a eficincia com que exerceram as suas aes hidrolticas e isto se justifica por terem sofrido reduo e/ou

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eliminao da capacidade de adsoro ao substrato de seu principal componente enzimtico. Esta talvez tenha sido a razo para a equivalncia observada entre a acessibilidade sobre papel de filtro e celulose microcristalina das monossupresses A e B (Figura 45).
FIGURA 45 - DOMNIO CATALTICO (DC) LIVRE RECUPERADO APS ANLISE CROMATOGRFICA DA FRAO F5, COM BASE EM PROTENA TOTAL (BARRAS ACINZENTADAS) E NA ATIVIDADE DIFERENCIAL DA FRAO CONTRA MUmbL (BARRAS TANSPARENTES) NA PRESENA E NA AUSNCIA DE CELOBIOSE

5.3

AVALIAO

DO

PERFIL

DE

HIDRLISE

DAS

PREPARAES

CELULSICAS EM ESTUDO Os primeiros ensaios de hidrlise utilizando as PCTrR sobre fibras celulsicas foram realizados utilizando ttulo protico de 40 mg de protena por grama de substrato celulsico deslignificado. A definio da carga enzimtica nestas hidrlises foi muitas vezes superior aos valores preconizados para processos industriais, que no excedem 1 mg de protena por grama de substrato (PERE et al., 1999), porque esta condio de ensaio visava observar com maior preciso a ao sinergistica entre as endoglucanases e exocelobiohidrolases sobre a fibra kraft deslignificada. Nestes ensaios, foi tambm adicionado s preparaes celulsicas um excesso de -glucosidases (Novozym 188) para que se pudesse obter a cintica da

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reao sem a interferncia inibitria da celobiose (RAMOS et al., 1992b). A opo de se trabalhar com polpas kraft deslignificadas de pinus como substrato para os ensaios de sacarificao esteve relacionada com a grande acessibilidade desse material celulsico, seu teor em lignina virtualmente negligvel e sua relativa homogeneidade, devida a uma constituio quase que exclusivamente formada por fibras longas. As preparaes comerciais Celluclast 1.5L e Novozym

188 foram utilizadas como referncia aos ensaios realizados com as PCTrR, mas as enzimas G e H, que representam supresses triplas no genoma de T. reesei, no foram utilizadas porque no se encontravam disponveis naquele momento. A composio de carbohidratos da polpa kraft de pinus foi investigada atravs da anlise dos produtos de hidrlise cida derivados do procedimento de determinao da lignina de Klason (vide tem 4.2.3). Os resultados deste ensaio comprovaram que as polpas no continham qualquer lignina residual, e que os seus constituintes polissacardicos eram basicamente compostos por 91% (m/m) de glucanas e por 8% de mananas (originalmente presentes como glucomananas). Devido alta atividade hemicelulsica presentes nas PCTrR (vide 4.1), algumas preparaes foram capazes de remover quase toda a hemicelulose da polpa, pois, em alguns casos, a quantidade total de pentoses presentes nos hidrolisados de Klason correspondeu ao seu rendimento terico integral. Entretanto, no foi possvel identificar com clareza qual das PCTrR foi mais eficiente nesse processo, muito embora espere-se que preparaes ricas em atividade endoglucansica

(particularmente, EG I) apresentem uma maior eficincia na hidrlise de hemiceluloses, em comparao com aquelas predominantemente exoglucansicas ou celobiohidrolsicas (RAHKAMO et al., 1998b). As condies de hidrlise enzimtica foram de 4 (quatro) horas de incubao a uma temperatura de 45C, agitao de 150 rpm, carga protica de 40 mg/g de polpa kraft e consistncia de 2% (p/v) em tampo acetato pH 4,8. A quantidade de Novozym 188 (4 mg de protena/g de polpa) adicionada aos meios de reao aparentemente

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evitou os efeitos inibitrios associados ao acmulo de celobiose, porque em nenhum momento este acar foi detectado em uma concentrao superior a 0,8 mg/ml (Tabela 23). A nica enzima a apresentar altos nveis de celobiose no meio de reao foi a Celluclast 1.5L e isso deve ter sido devido a sua elevada atividade exoglucansica, representada neste caso pelo alto teor de CBH I que possui em sua constituio protica. Na Tabela 23 esto apresentados os resultados obtidos a partir da anlise cromatogrfica dos hidrolisados derivados de ensaios com 4 horas de durao. Por convenincia, os clculos de rendimento de hidrlise foram efetuados utilizando o mtodo de Somogyi-Nelson (vide tem 4.2.4.1).
TABELA 23 RENDIMENTOS DE HIDRLISE OBTIDOS A PARTIR DA SACARIFICAO ENZIMTICA DA POLPA KRAFT BRANQUEADA DE PINUS Rendimentos de hidrlise (mg/ml) Acares A B C D E F CL N188 (Glc)2 0,15 0,62 0,31 0,76 ild 0,58 2,05 0,16 Glc 0,91 2,18 1,62 2,32 0,32 1,99 2,92 0,35 Xyl 0,05 0,07 0,07 0,07 0,03 0,07 0,06 0,04 Man 0,05 0,06 0,03 0,05 0,05 0,04 0,05 0,01 Teor de hidrlise Glucose (%) 5,24 13,19 9,20 14,40 1,80 12,13 23,01 1,53

*Aucares redutores totais foram calculados pelo mtodo de Somogyi-Nelson e

confirmados por CLAE, sempre expressando o total de hidrlise obtido em relao massa seca da polpa. (Glc)2 - celobiose; Glc - glucose; Xyl - xilose; Man - manose.

De um modo geral, a liberao de acares redutores totais (ART) pelas PCTrR foi sempre inferior ao observado para Celluclast 1.5L. A remoo do gene que codifica para CBH I (enzima A) produziu um total de 1,17 mg/ml de acares redutores, sendo portanto 77,2% menos eficiente do que a Celluclast 1.5L para a sacarificao do substrato. Por outro lado, a remoo de CBH II no foi to crtica para o processo hidroltico quanto a observada para CBH I, pois sua ausncia decresceu a capacidade do preparado enzimtico em liberar acares redutores totais (ART) em

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aproximadamente 42,7% (dado equivalente a um total de 2,.96 mg/ml em ART). Quando ambas CBH I e II foram removidas do sistema celulsico do fungo T. reesei, a produo correspondente de ART decresceu para apenas 1,53% (m/m) em relao ao peso seco do substrato, ou 93,4% menos eficincia hidroltica do que a Celluclast 1.5L. Isso correspondeu aproximadamente ao mesmo ndice de hidrlise obtido quando a Novozym 188 foi utilizada como controle.

Comparando a enzima A (destituda de CBH I), a enzima B (destituda de CBH II) foi capaz de produzir duas vezes mais glucose a partir da polpa kraft a uma razo glucose:celobiose prxima quela observada para a enzima destituda de EG II (enzima D). A mais alta relao glucose:celobiose, de 6,07:1, foi observada como resultado da hidrlise da polpa com a enzima A, enquanto que a mais baixa das razes detectadas foi observada para a Celluclast 1.5L (1,42:1). Portanto, sempre que a capacidade da enzima em produzir celobiose decresceu, particularmente devido ausncia de exoglucanases (CBHs), o rendimento de hidrlise decresceu e a relao glucose:celobiose aumentou. Consequentemente, a supresso de ambos os genes que codificam para CBH I e CBH II do genoma do T. reesei (enzima E) resultou em uma preparao enzimtica que no pode hidrolisar mais do que 2% (m/m) do substrato em um total de 4 horas de hidrlise. Nenhuma celobiose foi detectada no hidrolisado dessa enzima e isso no foi devido apenas ao fato de ser deficiente em CBHs, mas tambm por apresentar alta atividade contra celobiose, ou seja, altos ndices de atividade glucosidsica. A enzima C, que no apresentava EG I em sua composio, tambm levou a um alto ndice de glucose:celobiose no meio, sendo de 5,22:1 a razo detectada por cromatografia lquida. As maiores eficincias hidrolticas foram derivadas das PCTrR em que ambas CBH I e EG I encontravam-se presentes. Assim, as enzimas destitudas de CBH II e EG II resultaram nos maiores ndices de liberao de ART (13,2 e 14,4%,

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respectivamente), enquanto que as enzimas destitudas de EG I puderam hidrolisar apenas 9,2% da massa seca do substrato em 4 horas de hidrlise. Portanto, a enzima EG I aparentemente apresentou um sinergismo com CBH I superior ao apresentado pela enzima EG II. Interessantemente, a enzima destituda de ambas EG I e EG II tambm foi capaz de hidrolisar mais de 12% do substrato. Ao invs de invalidar as interpretaes anteriores, esse resultado leva possibilidade de que o sinergismo entre CBH I e CBH II parcialmente compensa a ausncia de atividade endoglucansica no meio de reao. Em um segundo experimento, foram determinadas as diferenas no modo de ao das enzimas com relao ao efeito que essas apresentam sobre o grau de polimerizao (GP) da polpa de celulose. Para tanto, foi utilizado o mtodo de carbamilao (vide tem 4.2.7.1) das polpas parcialmente hidrolisadas seguido de anlise por cromatografia de permeao em gel. Esse mtodo, inicialmente proposto por KOSSLER et al. (1981) e posteriormente padronizado por RAMOS et al. (1993), apresenta a vantagem de revelar a distribuio em massas moleculares da celulose ao longo da conduo do ensaio enzimtico. Este dado, somado investigao do efeito da hidrlise sobre o ndice de cristalinidade da polpa, permite a avaliao direta do efeito das enzimas sobre a estrutura supramolecular da celulose (MILLER et al.,1991). Como as condies experimentais incluram a adio de um excesso de celobiase ao meio reacional, oligossacardeos de menor massa molecular foram aparentemente convertidos celobiose e glucose imediatamente aps terem sido produzido pela ao sinergstica das endo e exoglucanases, particularmente pelo fato dessas no se encontrarem reprimidas no meio de reao. Essa foi uma das razes que justificaram a inexistncia de polissacardeos de baixa massa molecular nos perfis de eluio cromatogrfica realizados por permeao em gel, assim como as anlises efetuadas no hidrolisado enzimtico por cromatografia lquida. A efetiva carbamilao das polpas celulsicas parcialmente hidrolisadas foi comprovada atravs de anlises espectrofotomtricas com transformada de Fourier na

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regio do infravermelho (IVTF), onde o aumento da intensidade de absoro em regies atribudas aos grupamentos moleculares dos carbamatos caracterizaram a sua eficincia e seletividade. Exemplos das bandas utilizadas para avaliar a eficincia do processo de derivatizao encontram-se representados na Tabela 24. A intensidade de absoro na regio de 3.350 cm1 foi grandemente atenuada aps o processo de carbamilao e isto foi atribudo ao fato de que a substituio dos grupos hidroxlicos presentes na cadeia de celulose reduziram consideravelmente a capacidade da macromolcula em formar ligaes de hidrognio quer intra ou intermoleculares.
TABELA 24 - GRUPAMENTOS QUMICOS ALTERADOS NA CARBAMILAO E SUAS DEFORMAES ESPACIAS CAUSADAS POR ENERGIA ESPECTROFOTOMTRICA NA REGIO DO INFRAVERMELHO Grupamento Qumico Nmero Ao provocada de onda ( cm-1) Aminas secundrias 3.325 deformaes axiais da ligao NH Carbonilas presentes nas uretanas 1.700 deformaes axiais de C=O substitudas Uretana substituda ligada anel aromtico 1.650 deformaes axiais da ligao N Uretanas substitudas ou carbamatos 1.330 deformaes axiais da ligao C-N Aromaticidade 1.420 vibraes esqueletais em anis 1.505 aromticos 1.600 Amidas 1.050 vibraes simtricas de COC 1.230 vibraes assimtricas de COC Anis aromticos substitudos 690 vibraes de C-H em anis 760 aromticos monossubstitudos

A regio da impresso digital do polmero (800-2000 cm1), que congrega a maioria dos sinais descritos na Tabela 24, sofreu um aumento considervel em suas intensidades de absoro, caracterizando particularmente a natureza aromtica do substituinte ligado s hidroxilas primrias e secundrias da celulose. Portanto, a anlise por espectrometria no infravermelho permitiu uma clara observao da eficincia obtida no processo de carbamilao, confirmado atravs do desaparecimento

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da banda de absoro caracteristicamente atribuda hidroxilas primrias e secundrias. Na Figura 46 esto apresentados os espectros da polpa kraft branqueada antes e aps ter sofrido o processo de per-carbamilao.
FIGURA 46 ESPECTROS NO INFRAVERMELHO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA DE PINUS (A) E DO DERIVADO CARBAMILADO OBTIDO A PARTIR DESTA MESMA POLPA

Po lpa AO

C arbam ila to AO

500

1.000

1.500

2.000

2.500
-1

3.000 )

3.500

4.000

Nmero de onda (cm

A anlise por cromatografia de permeao em gel demonstrou que o GP da celulose foi afetado de diferentes formas pela ao da PCTrR (Tabela 25), havendo indcios do acmulo de oligmeros de massa molecular inferior 100 unidades de anidroglucose no meio de reao, independentemente das propriedades das enzimas ensaiadas (Figuras 47, 48 e 49). A preparao Celluclast 1.5L foi a mais ativa no processo hidroltico, mas

apresentou baixa capacidade de reduzir o GP mdio da celulose presente no substrato em estudo (Tabela 25 e Figura 47). O GP mdio decresceu em apenas 7% em resultado do processo hidroltico, apesar de que 23% da massa seca do resduo tenha sido hidrolisada acares solveis, enquanto que a polidispersidade foi pouco afetada pelo tratamento da polpa com Celluclast 1.5L . Por outro lado, o tratamento da polpa com

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Novozym 188

no demostrou efeito algum sobre a distribuio de massas

moleculares da celulose. A polidispersidade decresceu em todos os tratamentos enzimticos realizados com as PCTrR. Molculas de alta massa molecular foram gradualmente consumidas pela ao sinergstica das enzimas e a distribuio da populao original de molculas gradativamente se deslocou em direo menores massas molares, descrevendo um leve aumento da polidispersidade (Tabela 25).
TABELA 25 EFEITO DO TRATAMENTO ENZIMTICO SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAO E CRISTALINIDADE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA DE PINUS Preparao GPm/GPn Cristalinidade(%) GPm GPn controle 6,57 82,2 1597 31 243 4 6,24 82,3 Novozym 188 1605 46 257 9 6,65 84,0 Celluclast 1.5L 1492 56 224 18 A 5,48 84,3 1108 23 202 6 B 5,71 84,5 1306 21 228 6 C 5,68 84,5 1260 22 221 6 D 5,81 84,5 1302 23 224 3 E 5,69 84,0 1108 87 194 11 F 5,96 84,0 1320 20 221 5

GPm mdia ponderada do grau de polimerizao; GPn mdia aritmtica do grau de polimerizao; GPm/GPn polidispersidade da amostra; - desvio padro entre as amostras analisadas.

A ausncia de uma das celobiohidrolases, quer seja CBH I (enzima A) ou CBH II (enzima B), causou efeito deletrio menor sobre a hidrlise do que aquele verificado quando ambas as enzimas se encontravam ausentes (enzima E) (Tabela 23, Figura 48). Por outro lado, apesar de suas diferentes capacidades de liberar acares redutores do substrato, ambas as enzimas destitudas de CBH I (A) ou CBH I e II (E) resultaram em mudanas similares na distribuio em GP da celulose (Figura 48). Ambas decresceram o GP mdio da populao original em aproximadamente 31%. Em contraste, a enzima destituda de CBH II (B) no foi capaz de gerar a mesma alterao do perfil de distribuio de massas moleculares e a mdia do GP do substrato no pode ser reduzida em mais de 18%. Portanto, a presena de CBH I, assim como nas enzimas

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B (CBH II-), C (EG I-), D (EG II-) e F (EG I/II-), aumentou a eficincia do sistema celulsico produo ou liberao de acares redutores, enquanto que sua ausncia causou um considervel acmulo de molculas de celulose de tamanho intermedirio. Polpas parcialmente hidrolisadas derivadas da ao cataltica da enzima B apresentaram um GP mdio prximo aos observados para as enzimas deficientes de atividade endoglucansicas (C, D e F) (Figuras 46 e 47). Esses resultados sugerem que a CBH II apresenta alguma atividade endoglucansica sobre a polpa kraft deslignificada, razo pela qual o perfil de GP dos hidrolisados derivados de cada uma dessas enzimas apresentou-se muito equivalente e/ou similar. No entanto, em enzimas como a F, outros componentes minoritrios de natureza endoglucansica, como as endoglucanases EG III, IV e V, podem ter tambm contribudo para a atividade global do sistema celulsico, sendo portanto interferncias cuja avaliao direta no foi possvel nesse ensaio.
FIGURA 47 - EFEITO DAS PREPARAES COMERCIAIS SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAO DA POLPA KRAFT. O CONTROLE CORRESPONDE POLPA NO HIDROLISADA
1E +5 100

8E +4

controle

80

R E S P O S TA D O D E T E TO R

6E +4

60

4E +4

40

C elluclas t 1.5L
2E +4 20

0E +0

10

100 1.000 G R AU D E P O L IME R IZ A O, G P m

10.000

Comparado com as enzimas destitudas de atividade celobiohidrolsica, o efeito da remoo de ambos os genes que codificam para as endoglucanases EG I e II

P E R DA D E MAS S A (% )

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no afetou grandemente a capacidade das enzimas em reduzir o GP da celulose (Figura 49). No entanto, a enzima C destituda de EG I, acarretou uma alterao um pouco maior na distribuio em graus de polimerizao do substrato e produziu uma quantidade menor de acares redutores, quando comparada com a enzima deficiente em EG II (enzima D).
FIGURA 48 - EFEITO DAS PREPARAES DEFICIENTES EM ATIVIDADE CELOBIOHIDROLSICA SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAO DA POLPA KRAFT. O CONTROLE CORRESPONDE POLPA NO HIDROLISADA
1E +5 100

E
8E +4
R E S P O S TA D O D E T E TO R

controle

80
P E R DA D E MAS S A (% )

6E +4

60

4E +4

40

2E +4

20

0E +0

10

100 1.000 10.000 G R AU D E P O L IME R IZ A O, G P m

FIGURA

49 - EFEITO DAS PREPARAES DEFICIENTES EM ATIVIDADE ENDOGLUCANSICA SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAO DA POLPA KRAFT. O CONTROLE CORRESPONDE POLPA NO HIDROLISADA
1E +5 100

8E +4

controle F

80

R E S P O S TA D O D E T E TO R

6E +4

C D

60

4E +4

40

2E +4

20

0E +0

10

100 1.000 G R AU D E P O L IME R IZ A O, G P m

10.000

P E R DA D E MAS S A (% )

141

O efeito de cada preparao enzimtica sobre o GP da celulose foi tambm avaliado em relao faixas distintas de massas moleculares, distribudas ao longo do histograma que descreve o perfil de anlise cromatogrfica por permeao em gel (Figuras 50). Para as faixas de GP definidas na Figura 47, no foram observadas diferenas considerveis entre o perfil derivado dos tratamentos enzimticos com as preparaes C, D, F e B. Apesar da enzima Celluclast 1.5L ser capaz de hidrolisar mais de 23% do

substrato, o tratamento enzimtico aparentou pouco efeito sobre a contribuio de molculas de alta massa molecular na distribuio, ou seja, aquelas que apresentam GP mdio superior a 5.000 unidades de AnGlc (Figura 50). Como resultado do processo hidroltico, houve um aumento de aproximadamente 12% na quantidade relativa de oligmeros dentro na faixa de 500 a 100 unidades de AnGlc e isso esteve aparentemente associado com um desaparecimento equivalente de molculas de maior massa molecular, na faixa compreendida entre 2.500 a 1.000 unidades de AnGlc.
FIGURA 50 DISTRIBUIO DO GRAU DE POLIMERIZAO (GP) DA CELULOSE EM POLPA KRAFT DE PINUS APS O TRATAMENTO ENZIMTICO COM AS PCTRR E PREPARAES COMERCIAIS. OS VALORES DE GP ESTO REPRESENTADOS PELA MDIA PONDERADA EM RELAO S MASSAS (GPM )
100

QUANT IDADE R E L AT IVA (% )

80

60

40

20

N188

CL

> 5000 1000-500

5000-2500 500-100

2500-1000 100-10

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Por outro lado, a enzima rica em atividade endoglucansica (E) reduziu a contribuio relativa de molculas de celulose com o GP superior a 2.500 em mais de 40%, sem resultar em um ndice de hidrlise superior a 2%. Simultaneamente, oligmeros na faixa de 50 a 100 unidades de AnGlc acumularam a mais de 43% da populao total de molculas de celulose. Um comportamento similar foi observado quando a hidrlise foi realizada com as enzimas destitudas de CBH I. Portanto, a falta de CBH I resultou em acmulos maiores de molculas dentro de uma faixa de GP compreendida entre 1000-500 e 500-100 unidades de AnGlc, sendo que esta ltima tornou-se a frao preponderante em ambas as hidrlises realizadas com as enzimas CBH I- (A) e CBH I/II- (E). A anlise por cromatografia de permeao em gel dos resduos parcialmente hidrolisados apresentou muito pouca evidncia do acmulo de molculas de celulose com GP inferior 100 unidades de AnGlc, sendo que a nica exceo a essa regra foi a enzima E, em que o aumento de 1,5% foi demostrado nesta populao de molculas (Figuras 47 a 49). Pequenos oligmeros com GP inferior a 10 unidades no foram detectados em nenhum dos casos, assim como oligmeros solveis com GP inferiores a seis tambm no puderam ser detectadas por CLAE. Os produtos preponderantes nesses casos foram, portanto, glucose e celobiose. A despolimerao da celulose facilmente observada nos estgios iniciais de hidrlise de vrios tipos de substratos celulsicos, o que tem sido primariamente atribudo ao ataque randmico de endoglucanases s regies mais acessveis do substrato. Esta ao cataltica na verdade a base para o sinergismo que ocorre entre os componentes presentes em preparaes celulsicas de diferentes origens (sinergismo endo/exo). Por outro lado, as exoglucanases apresentam uma maior eficincia na hidrlise contra substratos de alta disponibilidade de terminais redutores e no redutores. Portanto, exoglucanases geram um decrscimo apenas gradativo no GP do substrato e isso est associado remoo de unidades terminais de celobiose (RAMOS et al., 1993). Alguns autores tm correlacionado essas mudanas com o

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comprimento e a largura dos cristalitos de celulose, pois os planos de difrao, particularmente aqueles que descrevem o seu comprimento, parecem ser afetados mais significativamente pelo tratamento enzimtico. Os tratamentos enzimticos realizados nesse estudo tambm foram avaliados segundo seu efeito sobre o ndice de cristalinidade (CrI) da celulose, conforme determinado por difrao de raios-X de acordo como o mtodo descrito por Segal et al. (1959) (Figura 51).
FIGURA 51 EFEITO DO TRATAMENTO ENZIMTICO SOBRE A CRISTALINIDADE DA CELULOSE, DETERMINADO POR DIFRATOMETRIA DE RAIO-X

C rI (% )

N o v o z y m 1 8 8

8 2 .3

C e llu c la s t 1 .5 L

8 4 .0

C B H I - C B H II - C B H I/II -

8 4 .3

8 4 .5 8 4 .0

E G I - E G II -

8 4 .5

8 4 .5 8 4 .0

E G I/II -

12

16

20

24

28

32

36

n g u lo d e B ra g g

O CrI do material no tratado apresentou-se em torno de 82,3%, enquanto que as polpas parcialmente hidrolisados apresentaram ndices um pouco superiores, da ordem de 84 a 85%. Assim, conclui-se que no houve qualquer diferena significativa entre os ndice de cristalinidade de polpas parcialmente hidrolisadas, quaisquer que

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tenham sido as enzimas utilizadas para a hidrlise. Da mesma forma, nenhum dos tratamentos enzimticos ocasionou mudanas significativas no estado de organizao estrutural da polpa original, sendo que os padres de difrao de raios-X foram coletivamente atribudos celulose do tipo I, provavelmente envolvendo a

coexistncia de ambas as sub-fases dessa forma cristalina (sub-fases I e I ). PERE et al. (1995) investigaram os efeitos do tratamento enzimtico de fibras celulsicas com componentes purificados do sistema celulsico de T. reesei, sendo que as enzimas utilizadas corresponderam s CBH I, CBH II, EG I e EG II. Vrias observaes importantes foram feitas a partir de seus resultados experimentais: (a) comparado com as endoglucanases EG I e II, ambas as celobiohidrolases no foram eficientes em hidrolisar os carbohidratos presentes na polpa; (b) a endoglucanase EG I foi mais efetiva na hidrlise da polpa do que a endoglucanase EG II, apesar da atividade especfica da EG II ter sido superior quela detectada na EG I; (c) ambas as endoglucanases causaram decrscimo na viscosidade da polpa e foram capazes de solubilizar praticamente todo o seu componente hemicelulsico; (d) a celobiohidrolase CBH II causou um decrscimo viscosidade da polpa mais significativo do que aquele observado com a celobiohidrolase CBH I; (e) a enzima EG II causou um decrscimo significativo nas propriedades mecnicas das fibras, mesmo quando utilizada em baixas relaes enzima:substrato (baixas cargas proticas); e (f) nem todos os componentes enzimticos presentes em T. reesei apresentam ao deletria sobre as propriedades mecnicas de polpas kraft. De um modo geral as concluses obtidas neste trabalho mostram-se equivalentes quelas obtidas por PERE(1995), levando a uma interessante concluso de que, apesar da diferena dos sistemas utilizados em cada uma dessas investigaes, as interpretaes mecansticas apresentaram-se suficientemente congruentes. Destes resultados preliminares prevalece a observao de que a determinao do modo de ao cataltica de enzimas recombinantes pode ser uma etapa importante para comprovao da aplicabilidade desses biocatalisadores em processos industriais. Por

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essa razo, ensaios foram programados para investigar o efeito de tratamentos enzimticos anlogos aos descritos at o momento sobre as propriedades de fibras kraft para a confeco do papel. Tais ensaios tiveram como objetivo a comprovao da validade de pelo menos alguns dos modelos envolvidos nesse estudo para aplicaes diretamente associadas melhoria das propriedades processuais de fibras kraft derivadas de pinus e eucalipto.

5.4 EFEITO DAS PREPARAES CELULSICAS SOBRE AS PROPRIEDADES MECNICAS DE FIBRAS KRAFT BRANQUEADAS A determinao do modo de ao cataltica de enzimas modificadas pode ser uma etapa importante para comprovao da aplicabilidade desses biocatalisadores em processos industriais. Por essa razo, ensaios foram elaborados para avaliar as modificaes causadas por tratamentos com as PCTrR sobre fibras kraft derivadas de Eucalyptus grandis e Pinus taeda, constitudos em corpos de prova, fornecidos pela Klabin do Paran (Telmaco Borba, PR). As condies de hidrlise foram: tempo de 2 horas, temperatura de 45C, agitao de 150 rpm, consistncia de 5% (m/v) e carga protica de 4 mg/g de polpa kraft deslignificada. A inteno foi a de se obter o mnimo de sacarificao e um ganho real sobre as propriedades mecnicas da folha produzida a partir da polpa ensaiada. A anlise dos acares liberados em funo do tratamento enzimtico das polpas, e o subsequente clculo da perda de massa dele decorrente, foi realizada conforme descrito no tem 4.2.5.2.2. Na Tabela 26 encontram-se expressos os resultados destes processos hidrolticos, sendo que para as anlises realizadas no sistema DIONEX, os acares arabinose, galactose, celotriose, celotetraose, celopentaose e celohexaose foram detectados em ndices inferiores ao limite de quantificao do mtodo (0,004 mg/ml).

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TABELA 26 TRATAMENTO ENZIMTICO DE POLPAS KRAFT BRANQUEADAS Rendimentos de hidrlise Enzima (Glc)2 (mg/ml) 0,004 0,01 0,015 0,031 nd nd nd nd 0,2 polpa de eucalipto Glc Xyl (mg/ml) (mg/ml) 0,115 0,125 0,11 0,09 0,051 0,047 0,105 0,042 0,041 0,04 0,075 0,62 0,079 0,082 0,15 0,15 0,115 0,21 Total* (%) 2,17 1,88 1,01 1,93 1,11 1,7 1,69 1,72 9,32 (Glc)2 (mg/ml) 0,018 0,037 0,054 0,07 0,004 0,056 nd 0,018 0,84 polpa de pinus Glc Xyl (mg/ml) (mg/ml) 0,15 0,105 0,175 0,091 0,082 0,054 0,145 0,038 0,17 0,074 0,12 0,73 0,078 0,044 0,095 0,155 0,12 0,15 Total* (%) 2,44 2,73 1,72 2,65 0,77 0,29 2,04 2,31 15,85

A B C D E F G H CL

* Rendimento de hidrlise, expresso em relao ao peso seco da polpa, foi baseado na determinao de acares redutores totais pelo mtodo Somogyi-Nelson; (Glc)2 - celobiose; Glc glucose; Xyl - xilose; Man manose; nd inferior ao limite de deteco.

Os ndices de sacarificao promovidos pelas PCTrR ficaram na ordem de 2% (intervalo entre 1,01 e 2,17 %) em relao massa seca do substrato, atendendo expectativa de que a carga protica e o pequeno tempo de reao no provocariam uma perda de massa expressiva dentre as polpas kraft branqueadas. Apesar desta observao, diferenas sutis puderam ser observadas dentre os rendimentos hidrolticos obtidos sobre polpas de pinus e de eucalipto (Tabela 26). A mdia de hidrlise das PCTrR sobre a polpa de eucalipto foi de 1,65% com um desvio padro de 0,40 unidades, enquanto que para a polpa de pinus, estes valores foram de 1,870,9% com desvio padro de 0,90 unidades. Em geral, todas as enzimas apresentaram menor acessibilidade polpa de eucalipto do que polpa de pinus, incluindo o controle Celluclast 1.5L (CL) que, conforme se poderia antecipar, sempre apresentou o maior poder de sacarificao sobre ambos os substratos. Os ndices de hidrlise apresentados na Tabela 26 demonstraram-se congruentes com a natureza das enzimas ensaiadas e com os resultados previamente obtidos sobre substratos modelo. Por exemplo, enzimas destitudas de atividade

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celobiohidrolsica e, portanto, ricas em atividade endoglucansica (enzima E), apresentaram acessibilidade restrita sobre as polpas celulsicas. No entanto, as pequenas diferenas entre os ndices de sacarificao, decorrentes do baixo tempo de hidrlise utilizado no ensaio, acabaram por comprometer a realizao de um estudo comparativo mais conclusivo acerca da acessibilidade das enzimas. Na Tabela 27 encontram-se registrados os dados referentes ao efeito dos tratamentos enzimticos sobre o grau de polimerizao (GP) da celulose, sendo que o GP inicial das polpas de eucalipto e de pinus foi de 1677 e 1341 unidades de AnGlc, respectivamente.
TABELA 27 AVALIAO DO GRAU DE POLIMERIZAO DAS POLPAS KRAFT APS TRATAMENTO ENZIMTICO COM AS PCTrR E CELLUCLAST 1.5L (CL) Tipo Controle A B C D E F G H CL DPm 1341 1114 1254 1251 1296 1272 1247 1212 1307 1262 Eucalipto DPn 171 162 172 162 187 194 180 185 203 183 P 7.85 6.87 7.27 7.74 6.94 6.56 6.93 6.54 6.42 6.89 DPm 1677 1472 1484 1474 1546 783 1528 1431 1582 1608 Pinus DPn 306 232 202 198 236 98 261 214 256 241 P 5.47 6.34 7.34 7.43 6.56 8.00 5.86 6.69 6.18 6.68

Efeitos interessantes foram observados em relao a mudanas no GP da celulose, mesmo nos casos em que baixos ndices de hidrlise foram detectados. Em contraste, muitas das enzimas foram capazes de hidrolisar consideravelmente o substrato sem que essa ocorrncia estivesse necessariamente associada a um decrscimo equivalente do GP da celulose (Tabela 27). Este foi, por exemplo, o caso da Celluclast 1.5L, que hidrolisou 15,85% da polpa de pinus e 9,32% da polpa de eucalipto sem causar nenhum efeito expressivo sobre o GP mdio e/ou polidispersidade da celulose presente nos substratos. RAMOS et al. (1993)

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demonstraram efeito semelhante da Celluclast 1.5L sobre polpas kraft deslignificadas de pinus, cuja interpretao foi devida remoo rpida e eficiente de camadas superficiais da estrutura supramolecular da celulose, evitando assim o acmulo de oligmeros de baixa massa molecular e mantendo o GP mdio do substrato relativamente constante. Preparaes enzimticas completas, que apresentam alto grau de sinergismo entre as suas enzimas constituintes, geralmente apresentam este perfil de ao sobre substratos celulsicos fibrosos, sendo que a remoo eficiente de oligmeros exige a ao celobiohidrolsica de enzimas como a CBH I e a CBH II. Apesar de ter hidrolisado apenas 1,1% do substrato, a enzima E (supresso dupla de CBH I e II) resultou em um efeito expressivo sobre o GP da celulose. Tal comportamento foi imediatamente atribudo alta atividade endoglucansica desta enzima que, juntamente com sua deficincia em celobiohidrolases, motivou o acmulo de oligmeros de baixa massa molecular no meio de reao. Curiosamente, o efeito da enzima E sobre o GP da polpa de pinus foi menos significativo e isto uma forte indicao que o GP da celulose no o principal fator que define a acessibilidade da enzima ao substrato. Sabe-se que outros fatores estruturais relacionados ao substrato podem ter igual ou maior influncia sobre a acessibilidade, como por exemplo o seu volume de poros, grau de cristalinidade e rea superficial disponvel para interaes produtivas com as enzimas (SADDLER, 1986; WOOD, 1991; RAMOS et al., 1993). Caracterizados os ndices de sacarificao e graus de polimerizao das polpas parcialmente hidrolisadas, folhas de papel ou corpos de prova, formados em condies padronizadas que definiram uma gramatura de 100 cm2 /g e uma espessura de 0,22 mm, foram testados para com suas principais propriedades mecnicas, quais sejam, suas resistncias ao rasgo, ao arrebentamento (ou estouro), trao e elongao. Destes dados, foram ento calculados os ndices que se encontram representados na Tabela 28, cujos controles foram sempre correspondentes s polpas no hidrolisadas, submetidas condies experimentais absolutamente equivalentes. Cabe ressaltar que os corpos de prova foram preparados sem que as polpas

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tivessem passado por qualquer etapa preliminar de refino, opo esta tomada para evitar que os reais efeitos causados pelas enzimas pudessem ser eventualmente mascarados. Esta observao tambm justifica a baixa qualidade dos corpos de prova obtidos, mesmo para o caso das polpas originais, pois o desenvolvimento de propriedades adequadas confeco de um papel de boa qualidade depende de uma etapa de refino para aumentar o grau de entrelaamento entre as fibras.
TABELA 28 - PROPRIEDADES MECNICAS DE CORPOS DE PROVA PREPARADOS A PARTIR DE POLPAS CELULSICAS SUBMETIDAS OU NO AO TRATAMENTO ENZIMTICO COM AS PCTrR E CELLUCLAST 1.5L Pinus Eucalipto Tipo S IT IA IR S IT IA IR Controle A B C D E F G H CL N188 1,05 0,86 1,00 1,14 1,01 1,19 1,26 1,04 1,08 0,98 1,34 9,5 14,4 12,3 12,5 13,4 17,0 16,6 12,9 11,3 14,4 13,6 0,52 0,31 0,56 0,48 0,52 0,60 0,49 0,53 0,48 0,43 0,62 6,9 1,7 5,3 6,7 4,8 4,0 2,8 5,4 7,3 2,9 7,0 0,86 0,86 0,85 0,86 0,85 0,88 0,85 0,97 0,85 0,86 0,85 11,6 9,0 5,6 11,8 9,2 11,2 8,5 13,2 10,0 6,3 9,8 0,17 0,15 0,19 0,22 0,21 0,23 0,13 0,32 0,17 0,09 0,11 1,78 0,91 1,37 0,98 1,48 1,61 1,09 1,67 1,24 0,92 1,05

S, ndice de resistncia ao alongamento, expresso em percentagem (%); IT, ndice de resistncia trao, expresso em (KN/m)/(m2/g); IA, ndice de resistncia ao arrebentamento, expresso em (kPa)/(m2/g); IR, ndice de resistncia ao rasgo, expresso em (mN)/(m2/g)

A ao das PCTrR sobre polpas kraft branqueadas indicaram que as propriedades de resistncia trao e ao rasgo foram as que mais se alteraram em decorrncia do tratamento enzimtico. Uma hiptese aventada para o efeito da reduo do ndice de rasgo a gradativa reduo da espessura da parede celular, muito embora o tempo utilizado para hidrlise no tenha sido aparentemente suficiente para exercer tal alterao morfolgica na fibra. Por outro lado, estes ndices tambm so influenciados por outros fatores, como o colapso das fibras, de forma que muito difcil atribuir uma correlao direta entre as modificaes observadas e o real efeito que as motivou. Por outro lado, o efeito das PCTrR sobre a resistncia trao est

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relacionado ao superficial exercida pelas enzimas sobre as fibras celulsicas, cujo resultado imediato a fibrilao e o subsequente aumento do grau de interligao das fibras que constituem o papel. O tratamento das polpas com Celluclast 1.5L gerou um comprometimento significativo de suas propriedades para a confeco dos corpos de prova. No caso das polpas de eucalipto, todas as propriedades mecnicas dos corpos de prova foram comprometidas em comparao com o controle, enquanto que, para o caso da polpa de pinus, apenas a resistncia trao apresentou algum efeito favorvel. Estes resultados certamente esto associados aos maiores ndices de sacarificao promovidos pela Celluclast 1.5L. Porm, nenhuma correlao pode ser estabelecida entre estes efeitos e aqueles observados sobre o GP da polpa em decorrncia do tratamento enzimtico. Algumas das PCTrR foram capazes de aprimorar as propriedades mecnicas dos corpos de prova, induzindo considerao de que algumas delas podero apresentar potencial para aplicao no tratamento de fibras kraft em processos industriais. Curiosamente, a enzima que resultou nas melhores propriedades dos corpos de prova de fibras de eucalipto no foi a mesma que apresentou o melhor efeito sobre fibras de pinus. Nas Figuras 52 e 53 encontram-se representadas as variaes causadas pelas PCTrR sobre as propriedades das polpas kraft para a fabricao do papel. Para facilitar a visualizao dos dados, as polpas no tratadas foram utilizadas como referncia e os deslocamentos do eixo das abcissas representam quanto a propriedade em questo foi alterada. Com base na Figura 40, observa-se que a enzima E gerou bons resultados sobre as propriedades da polpa de pinus, muito embora a extenso dessas mudanas no tenha sido to pronunciada quanto aquelas decorrentes da ao da enzima G sobre a polpa de eucalipto (Figura 43). No entanto, todas as PCTrR, exceto a H, apresentaram um efeito negativo sobre a resistncia ao rasgo dos corpos de prova, ao mesmo tempo em que todas, sem exceo, apresentaram um efeito positivo sobre a resistncia trao. Considerando-se o rasgo como uma das principais propriedades do

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papel, a enzima H pode ser eleita como a de melhores resultados sobre a polpa de pinus. Por outro lado, os tratamentos enzimticos apresentaram uma influncias variveis sobre a resistncia ao arrebentamento (ou estouro) dos corpos de prova, assim comosobre as suas respectivas resistncias ao alongamento.
FIGURA 52 EFEITO DAS PCTrR SOBRE AS PROPRIEDADES MECNICAS DE CORPOS DE PROVA PRODUZIDOS A PARTIR DE POLPAS KRAFT BRANQUEADAS DE PINUS
150,00

100,00

% em relao ao controle

50,00

(50,00)

(100,00)

(150,00) alongamento, % trao, kN/m arrebentamento, kPa rasgo, mN

No caso dos corpos de prova derivados de polpa de eucalipto, os melhores resultados foram os derivados do tratamento com a enzima G, que representou ganhos em quase todas as propriedades medidas exceto a resistncia ao rasgo (Figura 43). Curiosamente, esta foi a nica enzima capaz de aumentar a resistncia trao em relao ao controle. O amplo favorecimento gerado pela enzima G sobre a resistncia ao arrebentamento dos corpos de prova no foi passvel de uma justificao imediata. Assim, o efeito parece ter sido gerado por uma certa sinergia entre vrios fatores que

C1 .5 L

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influenciam, direta ou indiretamente, esta propriedade. Da mesma forma, no nos foi possvel justificar o efeito deletrio que as preparaes A e F apresentaram sobre a resistncia ao arrebentamento.
FIGURA 53 EFEITO DAS PCTrR SOBRE AS PROPRIEDADES MECNICAS DE CORPOS DE PROVA PRODUZIDOS A PARTIR DE POLPAS KRAFT BRANQUEADAS DE EUCALIPTO

150,00

100,00

% em relao ao controle

50,00

A
(50,00)

L .5 C1

(100,00)

(150,00) alongamento, % trao, kN/m arrebentamento, kPa rasgo, mN

As enzimas E e F geraram efeitos equivalentes sobre a resistncia trao dos corpos de prova, significando que a ao superficial das enzimas proporciona um maior grau de interligao entre elas. Porm, a enzima F causou um efeito maior sobre o rasgo do que a enzima E, evidenciando a ao progressiva das endoglucanases sobre as cadeias de celulose que esto dispostas na superfcie da fibra. Dado o devido tempo, espera-se que o resultado deste modo de ao cataltica acarrete uma diminuio na espessura da parede celular, diminuindo ainda mais a resistncia ao rasgo em efeito j descrito por outros autores como peeling (BETRABET & PARALIKAR, 1977, 1978; RAMOS et al., 1993).

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O tratamento de polpas celulsicas com preparaes purificadas de EG I j foi estudado por outros autores e os resultados obtidos foram considerados promissores (PERE et al., 1999). Nesta tica, o comportamento apresentado pela enzima G corrobora a hiptese de que esta enzima, juntamente com a EG III, possa apresentar a capacidade de modificar favoravelmente as propriedades das fibras e, por conseguinte, as propriedades do papel delas derivado. No entanto, dentre as duas endoglucanases, qual que efetivamente estava sendo responsvel pelos efeitos decorrentes do tratamento de fibra de eucalipto com a enzima G? Para responder este questionamento, duas preparaes purificadas de EG I (VTT Biotechnology) e EG III (IndiAge, Genencor) foram selecionadas e submetidas ao mesmo procedimento experimental anteriormente descrito para as PCTrR. Paralelamente, fruto da presena de considervel atividade proteoltica nestas preparaes, uma amostra do domnio cataltico derivado da EG I tambm foi inserido no planejamento experimental, pois parte da EG I provavelmente se encontra, na enzima G e em todas as PCTrR que as contm, na forma de seu DC livre. Estes resultados encontram-se descritos na Tabela 29.
TABELA 29 - PROPRIEDADES MECNICAS DE CORPOS DE PROVA PREPARADOS A PARTIR DE POLPAS DE EUCALIPTO, SUBMETIDAS OU NO AO TRATAMENTO ENZIMTICO COM ENDOGLUCANASES PURIFICADAS DE T. reesei Enzima controle EG I EG III EG IDC S 0,9 1,05 1,03 0,95 IT 14,1 21,2 19,5 16,9 IA 0,39 0,59 0,53 0,42 IR 2,33 3,74 2,54 2,46 Total* (%) --0,48 0,85 1,17

S, ndice de resistncia ao alongamento, expresso em percentagem (%); IT, ndice de resistncia trao, expresso em (KN/m)/(m2/g); IA, ndice de resistncia ao arrebentamento, expresso em (kPa)/(m2/g); IR, ndice de resistncia ao rasgo, expresso em (mN)/(m2/g); * Rendimento de hidrlise calculado com base nas anlises por CLAE.

As trs preparaes enzimticas purificadas, descritas na Tabela 29, resultaram em ndices de sacarificao bastante reduzidos em relao ao controle.

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Porm, a enzima EG III (IndiAge), que destituda do domnio de ligao ao substrato (DLC), apresentou rendimentos de hidrlise superiores EG I, enquanto que o EG IDC forneceu rendimentos ainda maiores as duas anteriores. Ao invs de interpretar os dados registrados luz do modo de ao cataltica destas enzimas, provvel que as variaes observadas estejam ligeiramente fora dos limites de confiabilidade do mtodo, no constituindo portanto diferenas estatisticamente significativas. Comparada ao controle, a enzima EG I representou ganhos em todas as propriedades medidas a partir dos corpos de prova, inclusive a resistncia ao rasgo (Tabela 29). Por outro lado, tanto a enzima EG III (IndiAge) quanto o domnio cataltico livre da EG I (EG IDC) tambm resultaram em efeitos favorveis sobre as propriedades mecnicas dos corpos de prova, em comparao com o controle. Portanto, o comportamento favorvel da enzima G no foi um resultado exclusivo da enzima EG I, mas sim da ao sinergstica entre esta endoglucanase e outros componentes endoglucansicos eventualmente presentes na preparao (EG III e EG IDC). Porm, os ensaios descritos na Tabela 29 confirmaram que, dentre estas enzimas, a EG I a que proporciona os melhores ganhos nas propriedades mecnicas dos corpos de prova de polpa de eucalipto.

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6 CONCLUSO

As preparaes enzimticas derivadas de cepas recombinantes de T. reesei apresentaram propriedades que as qualificam como biocatalisadores diferenciados para processos de bioconverso. O nocaute dos genes das PCTrR resultou em diferenas nos valores mdios obtidos nas atividades especficas segundo GHOSE (1987). Em comparao com o controle (CL) a enzima A reduziu sua atividade em torno de 50% para os substratos HEC, UPF e XMV, sendo que o resultado mais significativo foi contra XEA. A enzima B manteve as mesmas tendncias que a anterior diferindo nos substratos CMC e derivados de xilanas. As enzimas C e D tambm resultaram em valores decrescentes para endo e exo-glucansicos, o destaque foi observado para o substrato xilansico proveniente de aveia para a enzima D. As duplas e triplas supresses (Enz E, F, G e H) resultaram em valores antagonicos quando comparados entre si e o contole. Por exemplo, a ao sobre PF foi praticamente inexistente na Enz G enquanto para a Enz H este valor foi muitas vezes superior. Para PF o maior resultado foi observado para a Enz F. Os substratos modificados quimicamente resultaram valores numericamente superiores em CMC e HEC para a Enz E, para XEA foi a Enz G e para XMV foi a Enz H. Um importante destaque deve ser feito ao fato dos ensaios para CMC e HEC serem realizados em condies padres de ensaio que neste caso em especfico no so iguais, o que significa que os valores resultantes para as PCTrR no podem ser tomados como absolutos. Finalmente para os substratos cromofricos os maiores valors numricos foram aqueles obtidos nos ensaios com as Enz. B e E. A supresso do gene que codifica para a enzima CBH I que corresponde a cerca de 60% da protena secretada pelas cepas industriais de T. reesei acarretou um aumento proporcional nas atividades xilansicas e endoglucansicas do complexo enzimtico. Efeitos semelhantes foram tambm observados quando da supresso de CBH II, somente que a um nvel inferior quantificado para a CBH I .

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O mtodo cromatogrfico de baixa presso, desenvolvido para caracterizao das PCTrR demonstrou ser eficiente na separao dos seus principais constituintes proticos. Estes ensaios por FPLC, isolaram na frao 5 a CBH I, enquanto que a EG II foi purificada na frao 2. As demais enzimas tiveram suas concentraes variando ao longo da eluio, conforme seu ponto isoeltrico e estrutura isomrfica. Por outro lado, todas as preparaes celulsicas derivadas de cepas recombinantes

demonstraram, por cromatografia de interao hidrofbica, conter a maior parte de seu principal componente celobiohidrolsico (CBH I) na forma de seu respectivo domnio cataltico (DC) livre. A ocorrncia do CBH IDC livre provavelmente decorreu da atividade proteoltica residual presente nas preparaes. Nos ensaios de hidrlise com polpas kraft foram observados efeitos interessantes em relao a mudanas no grau de polimerizao da celulose, mesmo nos casos em que baixos ndices de hidrlise foram detectados. Estes efeitos caracterizam de modo particular as preparaes enriquecidas em atividade endoglucansica. Em contraste, muitas das preparaes foram capazes de gerar muitos terminais redutores ao meio sem que essa ocorrncia estivesse necessariamente associada a um decrscimo equivalente do grau de polimerizao da celulose. Neste caso, a presena de altos ndices de sinergismo se mostraram necessrios para facultar maior eficincia no processo de remoo progressiva das cadeias de celulose presentes na superfcie das fibras. Todas as preparaes celulsicas derivadas de cepas recombinantes apresentaram ndices de sacarificao iguais ou inferiores a 2% (m/m), nas condies do ensaio. A ausncia de CBH I reduziu drasticamente as propriedades hidrolticas do sistema celulsico de T. reesei, pois tanto nas supresses duplas como nas supresses isoladas, resultou nos menores ndices de liberao de glucose a partir de uma variedade de substratos celulsicos utilizados como modelo. Estas tambm demostraram maior capacidade de acumular molculas de grau de polimerizao intermedirio, significando que esta enzima tem uma funo importante na remoo desses oligmeros do meio de reao.

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Polpas kraft branqueadas de pinus e eucalipto foram selecionadas para estudos afim de analisar a viabilidade das PCTrR no biopolimento de fibras celulsicas comerciais. Estas apresentaram diferentes acessibilidades aos substratos testados, sugerindo que opes biotecnolgicas neste mbito devero ser tomadas com cuidado para que o efeito desejado seja efetivamente observado no processo. Os testes fsico-mercncos efetuados com polpas kraft branqueadas demonstraram que possvel alterar as propriedades das polpas para a confeco do papel sem maiores efeitos sobre o grau de polimerizao e o ndice de cristalinidade da celulose. Algumas das preparaes celulsicas derivadas de cepas recombinantes foram capazes de aprimorar as propriedades mecnicas dos corpos de prova, induzindo considerao de que estas podero apresentar potencial para aplicao no tratamento de fibras kraft branqueadas em processos industriais. A Enz G apresentou um maior ganho nas propriedades de alongamento, trao e rasgo para as fibras de eucalipto, enquanto que para as fibras de pinus este efeito aconteceu somente para a trao. Curiosamente, a enzima que resultou nas melhores propriedades dos corpos de prova de fibras de eucalipto no foi a mesma que apresentou o melhor efeito sobre fibras de pinus. O comportamento favorvel da supresso tripla, designada como enzima G (destituda de EG II, CBH I e CBH II), no foi um resultado exclusivo da enzima EG I que a preparao contm, mas sim da ao sinergstica entre esta endoglucanase e outros componentes endoglucansicos presentes na preparao (EG III e EG IDC). Porm, dentre estas enzimas, a EG I a que proporciona os melhores ganhos em propriedades mecnicas nos corpos de prova derivados de polpa de eucalipto.

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